一、小鼠PC-1基因在大肠杆菌中的表达和纯化（论文文献综述）
任元雪[1]（2021）在《狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达及初步应用》文中提出研究背景:狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起狂犬病在人和动物间发生,造成宿主100%的死亡,严重威胁公共卫生安全。狂犬病病毒颗粒内部核心组成为核蛋白与病毒RNA结合形成核衣壳复合物,其中核蛋白除作为狂犬病病毒颗粒的重要组成部分之外,还承担着调控病毒复制,激活宿主免疫的功能,也可用于体外检测、病毒分型等。获得高纯度的核蛋白是开展基础科研和应用研究的基础,目前已有学者使用真核系统对核蛋白进行重组表达,但成本较高,操作复杂,也难以获得大量的核蛋白,其他学者使用原核系统对核蛋白进行表达,多以包涵体的形式出现,有人尝试使用融合标签或对其中部分序列进行截短表达,但难以获得具有生物学活性的核蛋白。本实验在CTN-1株的基础上对核蛋白编码序列进行优化,采用不同的表达条件促进核蛋白的可溶性表达,以期获得高产量、高纯度的具有生物学活性的核蛋白,并对其进行初步应用。研究方法:1、提取狂犬病病毒CTN-1株病毒总RNA,RT-PCR扩增出狂犬病病毒CTN-1株全长N基因,并在基因两端添加NdeI和XhoI位点,构建重组质粒pET-43.1a-NP。在大肠杆菌BL21（DE3）株诱导表达,使用SDS-PAGE和Image Lab软件分析其表达结果。2、重组质粒pET-43.1a-NP在大肠杆菌中未有表达,对N基因序列进行优化,通过替换稀有密码子,调整GC含量,优化mRNA的二级结构,人工合成基因后构建pET-43.1a-CTN-NP（Opti）表达质粒。通过改变诱导条件,优化诱导时间,提高核蛋白的表达产量。按照最佳表达条件大量诱导大肠杆菌,裂解和超声破碎诱导后菌液,离心后分别收集上清和沉淀,对沉淀使用盐酸胍溶解,使用固定化Ni2+螯合层析纯化。通过改变缓冲液的配方,在低温下对重组核蛋白进行复性。3、为了获得狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,对其诱导温度、IPTG浓度和诱导时间进行摸索。对可溶性表达的重组狂犬病病毒CTN-1株核蛋白使用Ni2+螯合层析纯化,通过电泳分析其纯化效果并进行Western Blot验证其反应原性。将可溶性的核蛋白、复性的核蛋白、阴性对照、阳性对照免疫小鼠,采集小鼠血清,用狂犬病核蛋白抗体检测试剂盒检测重组核蛋白免疫原性。4、以本研究所表达的具有反应原性和免疫原性的核蛋白为基础,通过对狂犬病病毒CTN-1株核蛋白最适包被浓度、包被温度、包被时间、封闭液和封闭条件以及二抗浓度的优化,初步建立可检测狂犬病病毒抗体的间接ELISA方法,并用已知样本初步验证该方法的实用性和重复性。研究结果:1、通过构建狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白的重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,SDS-PAGE电泳发现诱导后菌液与诱导前菌液表达无明显差别,需要进一步对基因序列进行优化以提高表达产量。2、对狂犬病病毒CTN-1株N基因进行优化,优化序列与原始序列相比GC含量提升至51.5%,61个稀有密码子全部进行了替换,N基因的密码子适应指数（CAI）值由0.19提升至0.95。经过软件分析,优化后序列的mRNA二级结构更稳定。3、优化后狂犬病病毒CTN-1株N基因在大肠杆菌中诱导表达,在50 kD左右出现明显蛋白条带,表达产量明显提升。为了进一步提高核蛋白表达产量,对诱导时间和大肠杆菌OD值进行优化,发现当OD600为0.5、诱导5 h时为最佳表达条件,产量可达到32.3%。大肠杆菌大量诱导表达后,核蛋白以包涵体表达,使用基于Ni2+的螯合层析进行纯化,纯化后蛋白纯度为95.8%。通过对诱导剂使用浓度、诱导温度和诱导时间的优化,可以实现在16℃条件下过夜诱导,得到可溶性表达的核蛋白,进行纯化后获得了高纯度的核蛋白。4、狂犬病病毒CTN-1株重组核蛋白经Western Blot检测,在50 kD左右出现明显条带,说明核蛋白能够被核蛋白的特异性抗体结合,具有良好的反应原性。将重组核蛋白免疫小鼠后采集血清,抗体效价可达到1:320,证明核蛋白具有良好的免疫原性。5、已知血清样本的验证结果提示,本研究所建立的间接ELISA定性检测结果的阴阳性符合率为100%,批内与批间OD450值的变异系数均低于10%。研究结论:本实验在狂犬病病毒CTN-1株核蛋白原始序列表达产量较低的情况下,通过对狂犬病病毒CTN-1株核蛋白进行密码子优化,构建了重组表达质粒pET-43.1a-CTN-NP（Opti）,并通过降低诱导温度和延长诱导时间等条件实现了核蛋白在大肠杆菌表达系统中大量的可溶性表达。Western Blot和动物试验结果显示,本实验所表达的核蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。在此基础上,本研究初步建立了可检测抗狂犬病病毒抗体的间接ELISA方法。
贾芳[2]（2021）在《布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究》文中认为布鲁氏菌病（布病）作为一种全球性的人畜共患病,严重影响着流行地区居民的身体健康和经济发展,因此,布病的防控工作受到越来越多国家的重视。目前,免疫预防是控制布病的主要手段之一。由于现有的动物疫苗存在毒性残留和干扰常规血清学检测等缺点,制备高效、安全的毒力基因缺失活疫苗成为控制布病的新趋势。bvfA（Brucella virulence factor A）基因是布鲁氏菌（Brucella）特有的赋予其在宿主胞内建立复制生态位的毒力基因。但bvfA基因在布鲁氏菌中具体生物学功能尚未明确,特别是bvfA基因在布鲁氏菌感染靶细胞过程中的功能尚处于空白。方法:本研究利用开放性读码框预测软件确定编码BvfA蛋白的基因序列,利用PCR技术测定bvfA基因在临床布鲁氏菌分离株中的分布频率,利用基因同源重组和细菌接合转移原理构建B.abortus S19△bvfA菌株及其回补株,模拟细胞内环境条件检测B.abortus S19△bvfA菌株的应激能力;CCK-8法评估B.abortus S19△bvfA菌株在TM4睾丸支持细胞中的增殖能力,LDH法检测B.abortvs S19ΔbvfA菌株对TM4睾丸支持细胞的损伤性,用ELISA方法评价B.abortus S19△bvfA菌株的免疫原性和免疫反应性,用组织细菌计数法评估B.abortus S19△bvfA菌株对布鲁氏菌强毒株攻击的免疫保护性;HE组织切片染色展示B.abortus S19△bvfA菌株与其它布鲁氏菌对组织损伤的区别。用Illumina Hiseq测序和液相色谱-串联质谱技术在转录组、蛋白质组和代谢组水平上联合分析bfA基因在布鲁氏菌中的作用及其在布鲁氏菌感染宿主时的作用。结果:（1）获得了大小为336 bp的bvfA基因序列,将bvfA基因提交到Genbank中获得基因序列号（MN651999）;确定bvfA基因在临床布鲁氏菌分离株中100%保有。（2）B.abortus S19△bvfA菌株较它的亲本株和回补株生长速度慢;在热刺激、高盐、高渗、强酸和抗菌素条件下,B.abortus S19△bvfA菌株生长均受到抑制,仅在氧化压力下生长良好（p<0.05）。（3）在12 h、24 h和48 h时,B.abortus S19△bvfA菌株入侵TM4睾丸支持细胞富集到的菌落数分别是B.abortus S19菌株的90%、95%和96%;在12 h、24 h和48 h时,TM4睾丸支持细胞感染B.B abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后的死亡率分别是13.39%和7.14%,14.97%和12.40%,33.8%和31.2%。（4）免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株小鼠血清中抗体效价1～3周均呈上升趋势,4周趋于平稳,两者抗体水平无显着性差异（P>0.05）。血清中IFN-γ含量在1周～2周升高,IL-2在1周～4周升高,IL-4在2周～3周升高。B.abortvs S19△bvfA菌株和.abortusS19菌株免疫小鼠血清抗体与BvfA蛋白反应的抗体效价分别是2.16和4.21（2周）,2.16和4.52（3周）。免疫B.abortus S19△bvfA菌株小鼠脾载菌量是B.abortus S19菌株的86%（1周）、93%（2周）和84%（4周）。小鼠免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后攻强毒株B.melitensis 16M,脾载菌量是未免疫攻强毒株B.tmeliensis 16M的0.03%和2.9%（1周）,0.75%和0.33%（2周）。小鼠免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后攻强毒株B.abortus 2308,脾载菌量是未免疫攻强毒株B.abortus 2308的9.8%和6.5%（1周）,6.8%和6.8%（2周）。（5）转录组学和蛋白质组学技术关联分析显示,B.abortuAs S19△bvf菌株RNA聚合酶中的rpoA、rpoC和rpoB基因表达量下调;蛋白质组学和代谢组学技术关联分析显示,B.abortus S19△bvfA菌株和B.S19菌株蛋白质组和代谢组差异主要表现为ABC转运、嘌呤代谢和氨酰-tRNA生物合成。（6）转录组学和蛋白质组学技术关联分析显示,分别感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞之间的差异表现为逆行神经信号通路;蛋白质组学和代谢组学技术关联分析显示,感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞之间的差异表现为逆行神经信号通路,矿物质吸收和鞘脂信号通路。结论:（1）bvfA基因参与了 B.abortus S19菌株在宿主细胞中的增殖和对宿主细胞内环境的适应。B.abortu sS19△bvfA菌株在感染早期（12h）对TM4睾丸支持细胞的损伤强于其他布鲁氏菌。小鼠腹腔注射B.abortus S19△bvfA菌株1周即能引起免疫应答,且具有很好的免疫保护效果。B.S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性及病理损伤均小于B.abortus S19菌株。（2）bvfA基因主要参与B.abortus S19菌株RNA聚合酶的转录、ABC转运、嘌呤代谢和氨酰-tRNA生物合成;bvfA基因能干扰宿主细胞的矿物质吸收、鞘脂信号通路和线粒体中NADH泛醌氧化还原酶复合体的功能。感染B.abortus S19△bvfA菌株的TM4睾丸支持细胞CatSper2表达量高度下调,推测CatSper通道可能是布鲁氏菌引起不育的主要靶点,P53表达量增加,推测bvfA基因能抑制TM4睾丸支持细胞的凋亡。
李喜海[3]（2021）在《丝状真菌里氏木霉异源表达Insulin Glargine的初步研究》文中指出2019年全世界约4.63亿20岁以上的成人患糖尿病,相当于11个人中有1个为糖尿病患者。对糖尿病人来说胰岛素类药物是必不可少的救命良药。Insulin Glargine（IG,长效胰岛素类药物）作为重要的胰岛素类药物可以有效地延长胰岛素在人身体中的作用时间,并且具有巨大的商业价值,仅在2017年赛默飞公司的IG类药物的销售额就达到了 67.2亿美元。糖尿病患者数量的快速增长及胰岛素商业价值的快速增加对IG的高水平生产提出了新的挑战,需要对IG的生产系统进行优化。丝状真菌里氏木霉是一个潜在的异源蛋白生产的优秀宿主。一方面里氏木霉能够分泌大量胞外蛋白,据报道,里氏木霉的胞外蛋白产量最高可达到100 g/L;另一方面里氏木霉也可以生产不同种类的蛋白,在生产工业用酶等方面具有广泛的应用。尤其值得注意的是,在里氏木霉中以纤维二糖水解酶Ⅰ（CBH1,即Cellobiohydrolase Ⅰ）的催化结构域作为载体蛋白已经成功生产了哺乳动物小分子蛋白。为了改善里氏木霉异源蛋白生产情况,也可使用纤维二糖水解酶Ⅱ（CBH2,即Cellobiohydrolase Ⅱ）等不同载体蛋白进行蛋白表达尝试。另外,利用具有高分泌能力的信号肽（如CBH1信号肽、黑曲霉葡糖淀粉酶信号肽以及泡盛曲霉α-淀粉酶信号肽等）也能一定程度上提升异源蛋白的产量。本论文以丝状真菌里氏木霉为IG表达分泌系统,采用不同表达策略,研究了 IG蛋白在里氏木霉中的表达分泌情况。具体研究内容如下:（一）利用强启动子和信号肽在里氏木霉中直接表达分泌IG的尝试。使用里氏木霉强组成型启动子Pcdna1、高效CBH1分泌信号肽构建了 IG蛋白表达菌株S1r;使用Pcdna1、CBH1信号肽、改良胰岛素C肽和His标签构建了 IG蛋白表达菌株S1HCr。菌株转录水平检测显示,上述IG蛋白表达菌株均转录表达了 IG基因,但发酵液中未能检测到IG蛋白。为了查找IG蛋白不能分泌的原因,对S1r和S1HCr菌株的非折叠蛋白响应（UPR响应）、内质网相关蛋白降解途径（ERAD途径）以及蛋白折叠监护元件等相关基因的转录水平进行分析。结果显示,S1r菌株UPR响应相关基因pdi1和bip1分别是对照菌株的7.3倍和6.4倍,S1r与S1HCr菌株在一定程度上激活了 ERAD降解途径,同时S1r与S1HCr菌株蛋白折叠监护元件也表现出表达上调。上述结果表明,IG蛋白在合成分泌过程中可能没有完成正确折叠,引发UPR响应,发生了细胞内降解,因而造成发酵液中检测不到。（二）利用三种载体蛋白（CBH1、CBH2和人工合成蛋白LA20）与IG融合的方法促进IG在里氏木霉中的表达。以CBH1为载体蛋白,选用CBH1信号肽构建IG表达菌株,菌株命名为S1C1r（CBH1信号肽-CBH1载体蛋白）。以CBH2为载体蛋白,分别选用CBH1信号肽、CBH2信号肽构建IG表达菌株,菌株命名分别为S1C2r（CBH1信号肽-CBH2载体蛋白）和S2C2r（CBH2信号肽-CBH2载体蛋白）。同时,构建了以人工合成蛋白LA20为载体蛋白结合CBH1信号肽表达IG的菌株S1CLr（CBH1信号肽-LA20）。经摇瓶发酵和qPCR检测发现,上述菌株均在转录水平成功表达载体蛋白和IG蛋白。经SDS-PAGE和质谱鉴定发现,S1C2r、S2C2r和S1CLr菌株发酵液中没有检测到IG的分泌。然而,S1C1r成功检测到载体蛋白CBH1和IG蛋白分泌,尤其是对S1C1r菌株进行1L发酵罐培养,IG蛋白分泌量明显提升。进一步检测UPR响应、ERAD途径及蛋白折叠监护元件等基因表达情况发现,S2C2r、S1CLr菌株UPR响应相关基因bip1的转录量分别是对照菌株的2.2倍和3.3倍,pdi1的转录量分别是对照菌株3.4倍和3.6倍,蛋白折叠监护元件相关基因slp1、emp65的转录量都在不同程度得到了提升,同时,ERAD降解途径相关基因转录水平也发生了上调,说明该菌株中UPR响应得到了激活,而且诱发了 ERAD途径。而S1C2r菌株中UPR响应未被激活,却诱发了 ERAD途径。这些结果说明,S1C2r、S2C2r和S1CLr没有检测到IG蛋白分泌,可能是由于IG发生了胞内内质网相关的蛋白降解,导致发酵液中无法检测到IG蛋白。值得注意的是,S1C1r菌株中UPR响应相关基因pdi1转录量提升了 2.9倍,且ERAD途径未被激活,一定程度上说明CBH1载体蛋白促进了 IG蛋白的折叠分泌。以上结果说明,不同的载体蛋白的选用对IG的表达分泌产生重要影响。之后,构建菌株SAC1r和SGC1r,经摇瓶发酵和qPCR检测发现,上述菌株均在转录水平成功表达载体蛋白CBH1和IG蛋白,但SAC1r菌株中IG蛋白基因转录量与SGC1r相比较低。经SDS-PAGE分析和质谱鉴定发现,SAC1r菌株发酵液中没有检测到IG蛋白,但SGC1r发酵液中成功检测到IG蛋白。进一步检测UPR响应、ERAD途径及蛋白折叠监护元件等基因转录水平发现,SGC1r菌株的UPR响应被强烈激活,bip1基因提升了 6.8倍,pdi1基因提升了 4.8倍;蛋白折叠监护元件emp65转录量提升了 11倍。SGC1r菌株的UPR途径和蛋白折叠监护被激活,可能促进了胞内IG蛋白的折叠。（三）利用三种报告蛋白（黑曲霉β-葡萄糖苷酶BGLA、里氏木霉内切葡聚糖酶EG2和EG3）分别与IG蛋白融合的策略提高里氏木霉IG表达分泌菌株的筛选效率。以BGLA为报告蛋白,选择以BGLA-IG蛋白的基因表达顺序构建菌株,命名为BgIr（BGLA-IG蛋白）;以IG蛋白-BGLA的基因表达顺序构建菌株,命名为IBgr（IG蛋白-BGLA）。以EG2为报告蛋白,以EG2-IG蛋白的基因表达顺序构建菌株,命名为E2Ir（EG2-IG蛋白）;以IG蛋白-EG2的基因表达顺序构建菌株,命名为IE2r（IG蛋白-EG2）。以EG3为报告蛋白,以EG3-IG蛋白的基因表达顺序构建菌株,命名为E3Ir（EG3-IG蛋白）;以IG蛋白-EG3的基因表达顺序构建菌株,命名为IE3r（IG蛋白-EG3）。使用七叶苷葡萄糖显色平板,成功筛选出分泌BGLA报告蛋白4株菌株,分别命名为:BgI-2-18、BgI-2-12;IBg-193、IBg-280。使用CMC葡萄糖平板,成功筛选出分泌EG2的菌株9株,分泌EG3报告蛋白的菌株18株;进一步测量计算平板透明圈与菌落直径之比,筛选出报告蛋白分泌量更高的E2Ir菌株6株、E3Ir菌株5株、IE3r菌株5株。通过对筛选菌株的摇瓶发酵和qPCR检测发现,筛选出的菌株中均成功转录报告蛋白基因,除菌株IBg-280外也都成功转录IG蛋白基因。对发酵液SDS-PAGE分析发现,除IE3r菌株外其余筛选菌株均成功分泌报告蛋白,但未检测到明显的IG蛋白条带。进一步对部分菌株的UPR响应与ERAD途径基因的转录情况进行分析,发现使用报告蛋白表达IG蛋白可能使菌株的UPR与ERAD途径被激活,从而对IG蛋白的分泌产生影响。本部分研究成功构建了报告蛋白与IG蛋白融合表达分泌菌株,为后继菌株发酵优化和IG蛋白鉴定及深入的蛋白分泌机制分析奠定了良好基础。
张杰[4]（2021）在《酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的酶学性质、催化机理及应用探究》文中指出酒酒球菌（Oenococcus oeni）是葡萄酒发酵过程中应用最多的一类乳酸菌,除了可以降低葡萄酒的酸度外,其所产的β-葡萄糖苷酶还可以将葡萄酒中糖苷键合态的香气化合物转化为游离态的香气物质而显着提升葡萄酒的香气水平。作为一种纤维素酶,β-葡萄糖苷酶广泛应用于生物质能源转化、食品和医疗等领域,目前,研究人员己对微生物来源的β-葡萄糖苷酶作了大量研究,但这些β-葡萄糖苷酶主要是来源于黑曲霉和酵母菌,而对于酒酒球菌来源的β-葡萄糖苷酶的研究较少,关于其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质和催化机理也缺乏必要的阐释。因此,为深入了解和阐释酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的酶学性质和催化机理,本论文首先对酒酒球菌来源的β-葡萄糖苷酶进行了同源分析;其次,通过基因克隆和异源表达技术分离得到了来自酒酒球菌SD-2a的重组β-葡萄糖苷酶BGL0224,并研究了该重组酶的酶学性质、结构和催化机理;此外,以商业β-葡萄糖苷酶作为对比,分析了重组β-葡萄糖苷酶BGL0224对赤霞珠葡萄酒品质特性的影响。主要研究结果如下:（1）酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的同源分析。通过筛选得到了来自酒酒球菌的35个β-葡萄糖苷酶,这些β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列长度在129～752之间,等电点在4.84～9.30之间,相对分子质量在15 k Da～84 k Da之间。35个β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中共检索到了6个不同的保守结构域,出现最多的是Bgl B保守结构域。35个β-葡萄糖苷酶被分为3个进化分支,不同分支之间β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列长度和Motif组成不同。分支I和II中的β-葡萄糖苷酶属于GH1家族,而分支III中的β-葡萄糖苷酶则属于GH3家族。（2）酒酒球菌SD-2a中β-葡萄糖苷酶的异源表达和纯化。酒酒球菌SD-2a中有三个编码β-葡萄糖苷酶的基因被成功克隆,分别是OEOE-1569、OEOE-1210和OEOE-0224。相较于p ET-28a,表达质粒Pcold I更适合表达酒酒球菌SD-2a中的β-葡萄糖苷酶基因。Pcold I质粒不仅可以成功表达所有的三个β-葡萄糖苷酶基因,而且其对OEOE-0224和OEOE-1210两个基因的表达还避免了包涵体的困扰。重组β-葡萄糖苷酶BGL0224活性显着高于BGL1569和BGL1210,通过对重组酶BGL0224的分离纯化,酶的比活力达到5.92μkat/mg,纯度提高了147.98倍,回收率为14.58%。LC-MS/MS结果表明BGL0224的相对分子质量为55151.84 Da,等电点为6.14。（3）重组酶BGL0224的酶学性质表征。重组酶BGL0224由480个氨基酸残基组成,属于糖苷水解酶第一家族,为细胞内的亲水性蛋白,且不含信号肽。重组酶BGL0224的最适反应温度为50℃,最适反应p H为5.0,热稳定性和p H稳定性良好;0～20%的乙醇浓度对酶活有显着的促进作用,尤其当乙醇浓度为12%时促进作用最强;K+,Na+和Hg+对重组酶BGL0224的活性基本没有影响,Ba2+和Li+对酶活略有促进作用,其余金属离子和添加剂对酶活均有抑制作用,尤其是Triton-X100和Tween-80,对酶活性的抑制作用超过了80%。重组酶BGL0224在260～280 nm处有标准紫外吸收峰;当激发波长为339 nm时,该酶在440 nm处有最大荧光发射波长;该酶的化学结构中四种化学键的运动强烈,分别是O-H键、N-H键、C=C键和C-O键;该酶化学结构中碳原子的化学位移值在30 ppm至160 ppm之间,氢原子的化学位移值在0.03 ppm到10.25ppm之间。重组酶BGL0224催化标准底物p-NPG的Vmax值为382.81±7.76μM/min/mg,Km值为0.34±0.04 m M,Kcat值为351.88 S-1,Kcat/Km值为1034.94 S-1?μM-1。（4）重组酶BGL0224的催化机理探究。重组酶BGL0224对七种底物均有一定的催化作用,除作用于对硝基苯基β-D-吡喃葡糖醛酸苷和对硝基苯基β-D吡喃木糖苷的最适反应温度分别为45℃和40℃外,催化其余5种底物时的最适反应温度均为50℃,重组酶BGL0224催化七种底物的最适反应p H均为5.0。该重组酶催化对硝基苯基β-D吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基β-D吡喃半乳糖苷、对硝基苯基β-D吡喃木糖苷、对硝基苯基β-D纤维二糖苷、对硝基苯基β-D-吡喃葡糖醛酸苷、对硝基苯基α-D吡喃葡萄糖苷和对硝基苯基α-D吡喃半乳糖苷七种底物的Km分别为:0.34、0.95、1.10、0.43、1.87、1.42、1.70 m M,Vmax分别为:382.81、270.88、256.43、359.54、24.17、39.27、39.64μM/min/mg,Kcat/Km分别为:1034.94、262.09、214.28、768.58、11.88、25.42、21.43 S-1?μM-1,活化能Ea分别为:23.70、28.72、34.26、25.83、76.96、67.09、73.89 k J/mol。七种底物对重组酶BGL0224蛋白基团的荧光猝灭机制均为静态猝灭,猝灭常数Kq分别为8.07、5.25、4.93、7.51、0.93、1.10、0.78×1012 L?M-1,结合常数Kb分别为:8.09、4.53、3.94、7.62、0.73、0.83、0.73×104 L?M-1。以β-葡萄糖苷酶Bgl A的晶体结构为模板构建了BGL0224的三维结构模型,模型符合立体化学的能量规律。分子动力学模拟结果表明复合物体系“BGL0224-p NPG”在40 ns后趋于稳定,体系的结合能为-202.00±20.72k J/mol。氢键和π-π相互作用是重组酶BGL0224与底物p-NPG结合过程中的重要驱动力,二者之间的相互作用遵循双位移反应机制,谷氨酸残基Glu178和Glu377在整个催化过程中起着至关重要的作用。（5）重组酶BGL0224对赤霞珠葡萄酒品质特性的影响。主成分分析中两个主成分的方差之和占总方差的80.20%,说明电子鼻可以很好的区分经过不同处理的赤霞珠葡萄酒。在酒精发酵之前添加重组β-葡萄糖苷酶BGL0224可以显着提升赤霞珠葡萄酒的“芳香指数”。在所有的酒样中一共检测到了78种香气化合物,其中CK组、A1组、A2组、B1组和B2组酒样中分别检测到了47种、62种、63种、63种和49种香气化合物。在酒精发酵之前添加重组酶BGL0224可以显着增加赤霞珠葡萄酒中的中链脂肪酸乙酯、长链脂肪酸乙酯和萜烯类化合物的浓度,也提升了赤霞珠葡萄酒的“热带水果味”、“甜水果味”和“花香味”,同时抑制了“柑橘味”的感官特征。赤霞珠葡萄酒中的“热带水果味”与中链脂肪酸乙酯和长链脂肪酸乙酯呈正相关,与短链脂肪酸乙酯和其他酯类呈负相关;“花香味”与萜烯类化合物呈正相关,与短链脂肪酸乙酯和醇类化合物呈负相关。
吴元庆[5]（2020）在《代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究》文中研究表明虾青素和β-胡萝卜素是两种重要的类胡萝卜素,均具有多种生物活性,被广泛用于水产业、畜牧业、医药保健业等。化学合成产品安全性不符合人体要求,直接从生物体提取产率低、成本高。随着生物技术的发展,构建高产微生物细胞工厂受到重视,多种微生物已能异源合成虾青素和β-胡萝卜素,其中大肠杆菌应用最多。本研究即是遗传改造工程大肠杆菌,使其高产这两种类胡萝卜素。首先,筛选不同来源的β-胡萝卜素羟化酶（Crt Z）基因和β-胡萝卜素酮化酶（Crt W）基因,优化设计了九个虾青素人工操纵子,转化入高产β-胡萝卜素的大肠杆菌ZF237T,获得九株重组ZF237T菌株,虾青素的产量从0.49 mg/L到8.07 mg/L。随后,基于产虾青素的操纵子,设计构建了Crt Z和Crt W的融合蛋白质,结果表明Crt Z在融合蛋白质的N-端时更有利于虾青素的生产,将不同的肽linker引入融合蛋白质,这一现象更明显,虾青素的产量也被提高,其中最优菌株ZF237T/Crt ZAs-（GS）1-WBs虾青素产量与菌株ZF237T/Crt ZAs-WBs和ZF237T/crt ZBsWPs相比分别提高了127.6%和40.2%,碳源优化后,该菌株虾青素产量达到26.16 mg/L。其次,在菌株ZF43Δgdh A中敲除zwf,所得菌株ECW1的生物量降低26.2%,β-胡萝卜素产量和胞内含量分别提高5.1%和32.5%。在菌株ECW1中敲除基因簇pts HIcrr,所得菌株ECW2的β-胡萝卜素产量提高61.8%,为197.44 mg/L,但β-胡萝卜素胞内含量降低。胞内辅因子含量测定表明,菌株ECW2胞内NADPH限制了其β-胡萝卜素胞内含量,随即,围绕NADPH的供给,多种组合被实施以提高菌株的β-胡萝卜素胞内含量,获得最优菌株ECW4/p5C-nad K,高细胞密度发酵,β-胡萝卜素最高产量2,579.1 mg/L。对菌株ECW1和ECW2进行了比较转录组学分析。zwf的敲除下调了菌株ECW1的嘌呤从头合成和核糖体大亚基合成途径,上调了菌株的TCA循环和回补途径而下调了糖酵解和磷酸戊糖途径大部分基因的表达,这些因素造成菌株ECW1生物量的下降;另一方面,zwf的敲除上调了ppc、pck、NADPH和异源途径相关基因的表达,这对提高菌株胞内β-胡萝卜素含量有利。zwf和pts HIcrr的双敲除下调了菌株ECW2中心碳代谢、能量代谢、辅因子代谢,使菌株的代谢网络达到一个新的平衡,协调了菌株碳流,有利于菌株的生物量和β-胡萝卜素的生产,而NADPH、MEP途径及异源途径相关基因的表达被显着下调是菌株ECW2的β-胡萝卜素产量下降的主要因素。最后,验证zwf的敲除提高了菌株ECW1的葡萄糖运输蛋白质基因pts G和gal P的相对转录水平后,通过启动子替换在菌株ECW1中过表达这两个基因,调整发酵方式,均提高了β-胡萝卜素产量和胞内含量。随后,将过表达引入菌株ZF43Δgdh A中,过表达pts G时,菌株β-胡萝卜素产量和胞内含量均提高。最后,利用过表达pts G和gal P的菌株生产芳樟醇,过表达pts G时菌株产量最高。证明大肠杆菌中过表达pts G有助于提高萜类化合物的生产。本文采用代谢工程策略,显着提高了工程大肠杆菌类胡萝卜素的产量,探寻了一般规律及菌株对改造的遗传响应,发现了新的可提高大肠杆菌萜类化合物产量的遗传改造位点。研究结果对其他天然产物的异源合成具有一定的指导意义,所得高产菌株具有一定的工业应用潜力。
唐静[6]（2020）在《茯苓细胞色素P450基因PcCYPs的克隆及功能分析》文中指出Poria cocos（Schw.）Wolf为多孔菌科真菌,其干燥菌核茯苓是一种常见的真菌类药材,其主要活性成分包括茯苓三萜、茯苓多糖等,具有多种药用功效。目前,以松木为培养料的人工栽培是获取茯苓的主要方式,大量的茯苓需求在一定程度上加剧了森林资源的破坏,而寻求新的方式获取茯苓酸以及其它活性成分成为实现茯苓产业可持续发展的研究热点之一。利用合成生物学技术通过生物发酵是实现这一目标的重要途径。细胞色素P450（cytochrome P450）广泛分布于生物体内,参与从能量代谢到次生代谢物的代谢以及生物体的发育调控。目前,基于茯苓基因组和转录组数据推导的可能参与茯苓酸合成的部分催化酶基因已被确认,但仍有许多细胞色素P450氧化酶基因及其功能未被确认。本研究基于前期构建的茯苓菌核和菌丝转录组文库中发现的具有差异表达的细胞色素P450家族基因信息,克隆了PcCYP1和PcCYP3,并通过生物信息学分析、超表达技术、RNAi技术、真核表达技术对两个基因可能的功能进行了研究,为后期深入研究PcCYP1和PcCYP3的功能特性奠定了基础。取得的具体研究成果如下:1.从茯苓菌丝中克隆得细胞色素P450基因PcCYP1、PcCYP3以及PcCYP1的选择性剪切体PcCYP2的CDS序列,并进行了序列分析。PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3的CDS长度分别为1590bp、1542bp、1581bp,分别编码529、513、526个氨基酸,均具有多个磷酸化位点。PcCYP1、PcCYP2第1-17氨基酸序列为信号肽,亚细胞定位于线粒体中,为分泌型不稳定的亲水蛋白,PcCYP3经跨膜区预测显示在N端存在跨膜区,亚细胞定位于质膜上,是稳定的亲水膜蛋白。PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3与担子菌Coprinopsis cinerea的CYP502距离最近,且都含有CYP450保守结构域Fxx Gx Rx Cx G、Exx R、PER、AGx DTT。定量PCR结果显示,选择性剪接变体PcCYP2不同时期的表达量差异显着,因此推测PcCYP2可能对茯苓生长发育具有调控作用。2.成功构建了超表达载体p Blue Script SK-PcCYPs,通过PEG介导的原生质体转化方法成功转化到茯苓菌株GIM5.219中,并通过平板抗性筛选和抗性基因hph的扩增检测,分别获得了PcCYP1、PcCYP2和PcCYP3超表达菌株各3株。结合超表达菌株的PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3表达量、菌落生长形态,三萜产物含量、菌丝活力等分析可知,PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3超表达能使菌丝生长速率、茯苓酸含量、菌丝活力显着增加,但总三萜的含量与对照相比无差异。3.成功构建了沉默表达载体p Blue Script SK-PCIT-PcCYPs,并获得茯苓PcCYP1沉默表达转化子1株,茯苓PcCYP3沉默表达转化子6株,其中目的基因表达量显着降低的转化子其菌丝生长速率以及茯苓酸含量均显着降低,因此,进一步验证PcCYP1、PcCYP3对菌丝生长和茯苓酸的合成具有调控作用。4.构建了分泌型真核表达载体p PICZα-PcCYPs和胞内表达载体p GAPZC-PcCYPs,并转化到毕赤酵母X33菌株中进行异源表达,经SDS-PAGE分析,PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3初步实现了在毕赤酵母中分泌表达,但表达量较低,为下一步开展体外酶促反应打下了基础。以上研究初步揭示PcCYP1、PcCYP2、PcCYP3参与到茯苓的生长发育以及茯苓酸的合成,为后期通过体外催化功能分析深入揭示其功能奠定基础,同时为研究其它茯苓未知功能的CYP450基因提供了一种思路。
陈晓洁[7]（2020）在《重组气肿疽梭菌CctA基因在大肠杆菌中的表达及免疫原性初步研究》文中研究说明目的:气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）是最具致病性的梭菌之一,主要引起气肿疽,也称为黑腿病,该病具有高致死率,在全球范围内造成畜牧业生产的重大损失。气肿疽梭菌细胞毒素（CctA）是其产生的五种毒素中最典型的致病性毒素,具有细胞毒性和溶血活性,是主要的保护性抗原,在致病性中起着主导作用,成为黑腿病疫苗的一个有价值的候选抗原。本试验通过对气肿疽梭菌CctA全长基因进行生物信息学分析,构建截短CctA基因原核表达质粒并诱导蛋白表达,制备亚单位疫苗免疫豚鼠,建立间接ELISA方法检测豚鼠体内抗体水平,对亚单位疫苗的免疫效果进行初步分析。方法:1.根据公布的CctA基因序列设计特异性引物并合成。利用生物信息学分析软件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,对CctA蛋白的结构和功能、糖基化位点、优势抗原表位等进行预测。2.根据生物信息学分析结果,合成CctA全长基因去除信号肽及部分序列的片段。将截短CctA基因经pMD19-T克隆后插入原核表达载体pET-28a（+）,转化至BL21（DE3）pLysS感受态细胞,利用IPTG诱导蛋白表达,并分析其反应原性。3.表达的蛋白经甲醛灭活后与Al（OH）3佐剂混合配制疫苗。将豚鼠分为亚单位疫苗一次免疫和二次免疫组、商品化灭活疫苗一次免疫组、空白对照组,疫苗免疫组豚鼠每只肌肉注射1ml,每组6只。制备气肿疽梭菌强毒菌液,计算其半数致死量。免疫21d进行攻毒保护试验,记录豚鼠免疫保护情况。通过建立间接ELISA方法,检测免疫豚鼠体内抗体水平。结果:1.PCR扩增出CctA全长基因约为970bp,与预期相符。经生物信息学分析表明,CctA蛋白是一种亲水性蛋白;结构域分析显示,该蛋白无跨膜区,有信号肽存在,有1个杀白细胞素成孔超家族蛋白;含有4个N-糖基化位点,1个O-糖基化位点,以及多个磷酸化位点,其中二级结构为混合型,无规卷曲最多,有22个优势的B细胞抗原表位。2.PCR扩增出截短CctA基因大小为853bp,与预期相符。本试验成功构建了重组表达质粒,IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析显示,得到大小为35KDa的包涵体蛋白,大小与预期相符。Western blot结果表明蛋白反应原性良好。3.制备的强毒菌液半数致死量为0.5×106CFU。攻毒试验结果显示,气肿疽梭菌灭活苗免疫组对豚鼠的保护率为83%;亚单位疫苗一次及二次免疫对豚鼠的保护率均为66.7%。建立间接ELISA方法检测免后豚鼠体内抗体水平,分析表明,气肿疽梭菌灭活苗免疫组与亚单位疫苗免疫一次组相比有极显着差异（p<0.01）;同亚单位疫苗免疫二次组比较,显示差异显着（p<0.05）;亚单位疫苗免疫一次与免疫二次组无显着性差异（ns）;三组免疫组与对照组比较都显示出极显着性差异（p<0.001）。结论:本试验分析了CctA蛋白的特性,使截短CctA基因成功在大肠杆菌表达系统中表达,配制的亚单位疫苗免疫一次也可达到一定保护效果,而灭活苗刺激机体产生的保护性抗体明显高于亚单位疫苗。还需进一步优化实验方案,提高亚单位疫苗的免疫效果。
魏可[8]（2020）在《中华乌塘鳢重要免疫相关基因的分子克隆、基因表达及功能研究》文中提出中华乌塘鳢（Bostrychus sinensis）隶属于鲈形目（Perciformes）、塘鳢科（Eleotridae）、乌塘鳢属（Bostrychus）,系河口咸淡水暖水性小型鱼类,具有生命力强、生长快、喜穴居等特点。生理学研究表明,中华乌塘鳢耐干露能力强,干露20h不死亡,非常适合活体运输远销。近年来,广西、广东、福建等沿海地区掀起了一股养殖中华乌塘鳢的热潮,使其成为重要的人工养殖对象。随着养殖面积的不断增加,包括肠炎病、赤皮病、弧菌病、寄生虫病等各种养殖疾病也相继出现,对中华乌塘鳢养殖业造成较大的经济损失。因此,开展中华乌塘鳢养殖病害方面的研究,对于促进养殖业的可持续健康发展具有重要的意义。本研究从台州患病中华乌塘鳢体内分离出1株优势菌,通过回归感染、组织病理切片、生理生化及分子生物学等手段,对患病中华乌塘鳢开展病原学、免疫学等方面的研究,为该病的诊断和防治提供参考。利用中华乌塘鳢在感染副溶血弧菌后脾脏进行转录组测序分析和建立cDNA文库,然后筛选了以下4个重要的先天免疫基因进行分析:1.中华乌塘鳢超氧化物歧化酶（BsCu/Zn-SOD与BsMn-SOD）基因的克隆及mRNA表达分析本研究克隆获得中华乌塘鳢超氧化物歧化酶基因家族的两个亚型,即BsCu/Zn-SOD和BsMn-SOD的编码基因（Coding sequence,CDS）序列,其中Cu/Zn-SOD基因的开放阅读框包含465bp核苷酸,编码154个氨基酸;Mn-SOD基因的开放阅读框包含678bp核苷酸且编码225个氨基酸。序列分析显示,Cu/Zn-SOD基因无信号肽,为胞内蛋白;Mn-SOD基因在N端含有27aa线粒体靶向序列。正常组织分布检测显示,BsCu/Zn-SOD与BsMn-SOD基因在检测的脑、皮肤、肌肉、鳃、头肾、脾脏、肝脏、外周血、心脏中均有分布,BsCu/Zn-SOD基因在肌肉中分布最广泛,而BsMn-SOD基因主要在肌肉中分布。在副溶血弧菌和聚肌胞苷酸Poly（I:C）刺激下,BsCu/Zn-SOD与BsMn-SOD基因在肝脏、脾脏、外周血和头肾四个组织中的表达量均显着上调。2.中华乌塘鳢过氧化氢酶（BsCAT）基因的克隆、mRNA表达及功能分析本研究克隆获得中华乌塘鳢过氧化氢酶基因（BsCAT）的CDS序列,BsCAT基因的开放阅读框包含1578bp核苷酸,编码525个氨基酸。序列分析显示,BsCAT基因与其它硬骨鱼类具有较高的同源性,尤其是过氧化氢酶近端活性位点与过氧化氢酶近端血红素配体签名序列都非常保守和三个氨基酸催化位点His75,Asn158和Tyr358。正常组织分布检测显示,BsCAT基因在健康的中华乌塘鳢的脑、皮肤、肌肉、鳃、头肾、脾脏、肝脏、外周血、心脏中均有分布,但在肝脏中的表达量最高。在副溶血弧菌和Poly（I:C）感染下,实时荧光定量显示,BsCAT基因在肝脏、脾脏、外周血和头肾四个组织中的表达量均显着上调。纯化的重组BsCAT蛋白分析表明其最佳温度和pH分别为15℃和pH 7.0。3.中华乌塘鳢溶菌酶（BsLysG与BsLysC）基因的克隆、mRNA表达及功能分析本研究克隆获得中华乌塘鳢溶菌酶基因家族的两个亚型,即BsLysG和BsLysC的CDS基因及基因组序列,其中BsLysG基因的开放阅读框包含591bp核苷酸,编码196个氨基酸,其基因组总共包含5046bp核苷酸,四个内含子五个外显子组成;BsLysC基因的开放阅读框包含465bp核苷酸且编码154个氨基酸,其基因组总共包含2493bp核苷酸,3个内含子4个外显子组成。序列分析显示,BsLysG含有3个保守的催化位点Glu72,Asp85和Asp102及GLMQ基序(Gly97,Leu98,Met99 and Gln100),没有预测到信号肽,是一种胞内蛋白;BsLysC也包含两个保守的催化位点Glu52和Asp69;同时含有8个保守的Cys,形成4对二硫键。N端具有信号肽,为一种分泌蛋白。正常组织分布检测显示,BsLysG和BsLysC基因在检测的脑、皮肤、肌肉、鳃、头肾、脾脏、肝脏、外周血、心脏中均有分布,BsLysG和BsLysC基因均在脾脏中表达量最高,在副溶血弧菌和Poly（I:C）侵染下,BsLysG和BsLysC基因在肝脏、脾脏、外周血和头肾四个组织中的表达量均显着变化,但两种基因在组织中的免疫反应的时间和程度有一定的组织和时空差异性。纯化的重组BsLysG蛋白在35°C和pH 5.5下具有最佳活性;BsLysC蛋白在50°C和pH 6.0下具有最佳活性。4.中华乌塘鳢Hepcidin基因的克隆、mRNA表达及功能分析抗菌肽是许多物种（包括植物,无脊椎动物和脊椎动物）先天免疫系统的重要组成部分。它们在保护这些生物免遭微生物入侵方面起着重要作用。本研究克隆获得中华乌塘鳢Hepcidin基因CDS序列及基因组序列,其中BsHep基因开放阅读框包含273bp核苷酸,编码90个氨基酸;基因组总共含有507bp核苷酸,由3个外显子和2个内含子组成。结构预测显示,BsHep基因有信号肽24AA、前肽40AA和成熟肽26AA组成,成熟肽中包含8个保守的Cys,形成4对二硫键。正常组织分布检测显示,Hepcidin基因在检测的脑、皮肤、肌肉、鳃、头肾、脾脏、肝脏、外周血、心脏中均有分布,其在肝脏中表达量最高,在脾脏和外周血中次之。在副溶血弧菌和Poly（I:C）侵染下,Hepcidin基因在肝脏、脾脏、外周血和头肾四个组织中的表达量均显着上调。通过合成hepcidin多肽,分析结果表明它具有较强的的抗菌活性。
曲武[9]（2019）在《红树林沉积物中微生物群落结构研究及琼胶酶基因资源的调查与利用》文中研究说明红树林沉积物中的微生物多样性丰富且具有重要的生态学功能和应用价值。但是,现有研究对红树林沉积物中的微生物群落及功能基因的认知还存在若干问题,如研究缺乏系统性和代表性、测序深度不足、筛选到的功能基因应用价值不高等。本研究旨在对红树林沉积物中的微生物群落结构、关键性环境驱动因子和包括琼胶酶基因在内的多糖降解相关的功能基因进行详细的调查,并以琼胶酶为研究目标,通过对筛选得到的琼胶酶基因进行异源表达、纯化和初步改造,从而获得具有应用价值的新型琼胶酶。首先,本文在不同时空维度下对红树林沉积物中5种微生物（细菌、古菌、真菌、固氮微生物和反硝化微生物）的群落结构及其影响因子进行了详细的调查。主成分分析等四种分析结果证明地点和深度作为空间性维度对红树林沉积物中多种微生物的群落结构具有明显的影响,而作为时间性维度的季节却对5种微生物的群落构成均无显着性的影响（ANOSIM,Adonis;p≤0.05）。这证明红树林沉积物中微生物呈现明显的地区性分布和分层性分布,但其中典型微生物的群落结构不会随时间而发生明显变化,即其在不同的时间下呈现出较强的稳定性。此外,通过线性方程拟合等方法,本文确定了影响红树林沉积物中多种微生物群落组成的关键性环境驱动因子,其中沉积物粒径是细菌、古菌、真菌和反硝化细菌的关键性驱动因子,而盐度是固氮微生物的关键性驱动因子。这意味着沉积物粒径和盐度可以通过最大程度地影响微生物群落从而间接参与到红树林的生态功能中来。同时,该群落结构分析结果也为后续功能基因资源的调查提供了基础性数据。其次,本文对红树林沉积物环境总DNA进行超深度测序,对其中微生物所蕴含的多糖降解相关酶基因资源进行调查与分析,同时选定琼胶酶为本部分实验的目的基因,在所获得的数据集中进行注释分析。结果证明,红树林沉积物微生物组中琼胶酶基因资源从丰度、多样性和序列新颖性等方面与其他环境样本相比都具有明显优势。同时,对部分筛选到的琼胶酶进行原核表达的结果表明,红树林沉积物中存在具有良好活性的琼胶酶,此结果为未来琼胶酶相关的工业生产提供了大量的酶基因资源。此外,本部分研究还对琼胶酶中的信号肽进行了预测与统计,结果发现与已发现的424个琼胶酶相比,红树林来源的琼胶酶具有信号肽的比例明显较低,这可能表明琼脂糖在红树林沉积物微生物中的利用是高度协作化的。最后,本研究在测序数据集中拼接出了6个微生物基因组草图,发现其中Cluster4具有琼脂糖及其他多种多糖的降解功能基因,并推测了琼脂糖在其中的代谢途径。该部分内容证明了红树林沉积物微生物作为琼胶酶基因来源的潜力十分巨大,同时筛选得到若干具有应用潜力的琼胶酶基因。最后,本研究对所获得的琼胶酶基因中的agaM1和agaM2两条基因进行表达后的纯化,酶学性质分析结果表明重组琼胶酶rAgaM1稳定性更强、更具应用前景。在随后的实验中,通过PCR对agaM1基因3’端180 bp的序列进行截短并重新表达获得截短的重组琼胶酶AgaM 1（Truncated recombinant AgaM 1,trAgaM1）。以trAgaM1为核心酶工具,本部分研究构建并基于底物利用率和寡糖产量优化了一种生产方法,该方法可以获得聚合度为4至12的多种聚合度的新琼寡糖,同时通过高密度发酵等方式对trAgaM1的表达量进行了优化,将其总酶活产量提高了 842倍。本部分实验一定程度地解决了以往琼胶酶酶解产物的聚合度和多样性较低的问题,也为高聚合度寡糖的生产提供了新的方法。
王闯[10]（2019）在《在重组大肠杆菌中构建丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于甲醇和甲醛合成1,3-丙二醇》文中研究说明甲醛（Formaldehyde）是重要的一碳化合物（one-carbon compound,C1）代谢中间体,例如:甲醇（Methanol）,甲烷（Methane）和甲酸（Formate）。这些一碳化合物都可以被转化为甲醛,然后通过中心代谢途径转化为细胞生长所需的物质和能量。目前,甲醇和甲醛的吸收利用主要通过核酮糖单磷酸（RuMP）途径。但是,在合成甲基营养菌中,由于RuMP途径中的甲醛受体（Ru5P）的再生效率低,从而制约了甲醇和甲醛的吸收利用。为了实现甲醇和甲醛一碳化合物的利用以及避免利用RuMP途径,本论文通过筛选高活力的2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶,用于甲醛的固定,并通过结合另外三个酶构建了丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于生产1,3-丙二醇（1,3-PDO）。此途径相较于其它1,3-PDO合成途径,具有以下优势:1)一碳化合物直接转化为1,3-PDO的前体,开辟了一条新的一碳生物代谢途径,具有更高的底物利用效率;2)丙酮酸作为甲醛的受体,不需要依赖于甘油,从而避免了外源添加辅酶B12作为甘油脱水的辅助因子;3)途径相比较高丝氨酸依赖的1,3-PDO合成途径,更简短,也更简单,从而避免了复杂的调控。并通过对代谢途径的体内外的研究和途径的优化,使得1,3-PDO产量得到提高。本论文具体研究结果如下:1.挖掘潜在应用价值的醛缩酶用于甲醛的固定:为了避免甲醇和甲醛一碳化合物的利用过于依赖RuMP途径,以及Ru5P再生的问题。通过挖掘潜在应用价值的醛缩酶,我们筛选到了高活性的2-氧代-4-羟基丁酸醛缩酶（KHB）,此酶可以催化甲醛和丙酮酸生成2-氧代-4-羟基丁酸,用于甲醛的固定。并将其应用到新的1,3-丙二醇生物合成途径中。2.甲醛和丙酮酸体外合成1,3-PDO:为验证新提出的代谢途径能否用于1,3-PDO生成。我们首先对此进行体外试验,证实了此代谢途径可以利用甲醛和丙酮酸为底物用于生产1,3-PDO,得到35.3±0.4 mg/L1,3-PDO（无优化）。此外,根据支链-α-酮酸脱羧酶（KDC）对丙酮酸的酶活测定和体外数据的分析,表明KDC与副产物乙酸和乙醇的生成关。3.在重组大肠杆菌中构建新1,3-PDO生物合成途径:为实现甲醇和甲醛在大肠杆菌中合成1,3-PDO,通过利用多基因共表达的策略在重组大肠杆菌中构建了一种丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于1,3-PDO合成。通过对蛋白的表达分析,发现途径中的蛋白表达量都比较好,为后续的研究提供了材料基础。4.甲酵或甲醛和葡萄糖体内合成1,3-PDO:通过利用菌株BP3进行批次发酵和补料批次发酵,以甲醛和葡萄糖作为共底物,分别得到35.0±1.5 mg/L 和 298.3±11.4 mg/L 1,3-PDO。通过利用菌株 BP4 进行补料批次发酵,以甲醇和葡萄糖作为共底物,得到3.8mg/L1,3-PDO。证实了此代谢途径可以利用甲醇或甲醛和葡萄糖体内合成1,3-PDO。5.代谢途径的优化:为了对胞内竞争消耗甲醛的途径进行弱化,降低甲酸副产物的生产量。通过利用CRISPR-Cas9技术敲除野生型大肠杆菌中的甲醛脱氢酶A基因（frmA）,构建了菌株BP3AfrmA和BP4△frmA。并对菌株采用补料批次发酵,1,3-PDO的产量分别提高了70.4%（508.3±9.1 mg/L vs 298.3±11.4 mg/L）和 760%（32.7±0.8 mg/L vs 3.8 mg/L）。证实了通过敲除frmA基因可以提高1,3-PDO的产量。
二、小鼠PC-1基因在大肠杆菌中的表达和纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠PC-1基因在大肠杆菌中的表达和纯化（论文提纲范文）
（1）狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达及初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 一、引言 |
| 1.1 狂犬病病毒核蛋白的结构与功能 |
| 1.2 狂犬病病毒核蛋白的应用 |
| 1.3 狂犬病病毒核蛋白表达概述 |
| 1.4 实验目的与意义 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 核蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.2 核蛋白密码子优化 |
| 2.2.3 优化后核蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 |
| 2.2.4 通过优化表达条件促进核蛋白的可溶性表达和纯化 |
| 2.2.5 重组核蛋白的反应原性和免疫原性检测 |
| 2.2.6 间接ELISA检测方法的建立 |
| 三、结果 |
| 3.1 核蛋白在大肠杆菌系统中的表达 |
| 3.1.1 PCR扩增N基因 |
| 3.1.2 pET-43.1a-NP表达质粒构建 |
| 3.1.3 重组pET-43.1a-NP质粒鉴定 |
| 3.1.4 在大肠杆菌中表达重组pET-43.1a-NP质粒 |
| 3.2 核蛋白密码子优化 |
| 3.2.1 核蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.2.2 核蛋白密码子优化 |
| 3.3 优化后核蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 3.3.1 重组pET-43.1a-CTN-NP (Opti)质粒构建 |
| 3.3.2 重组pET-43.1a-CTN-NP (Opti)质粒的鉴定 |
| 3.3.3 重组pET-43.1a-CTN-NP (Opti)质粒在大肠杆菌中的表达 |
| 3.3.4 重组核蛋白表达诱导条件的优化 |
| 3.4 优化诱导条件实现重组核蛋白可溶性表达 |
| 3.4.1 IPTG浓度对重组可溶性表达的影响 |
| 3.4.2 诱导温度对重组核蛋白可溶性表达的影响 |
| 3.4.3 诱导时间对重组核蛋白可溶性表达产量的影响 |
| 3.4.4 可溶性表达条件下重组核蛋白的表达和纯化 |
| 3.5 重组核蛋白的免疫学活性检测 |
| 3.5.1 重组核蛋白的Western Blot鉴定 |
| 3.5.2 重组核蛋白的免疫原性鉴定 |
| 3.6 间接ELISA检测方法的初步建立 |
| 3.6.1 最适核蛋白包被浓度的确定 |
| 3.6.2 最适包被温度和包被时间的确定 |
| 3.6.3 封闭剂的选择和最佳封闭时间的确定 |
| 3.6.4 酶标二抗工作浓度的确定 |
| 3.6.5 阴阳性检测临界值的确定 |
| 3.6.6 间接ELISA检测方法的初步验证 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、创新性与不足 |
| 七、参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号与缩略语说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 布鲁氏菌病及其流行病学概况 |
| 1.1.1 布鲁氏菌病概述 |
| 1.1.2 布病流行病学特点 |
| 1.2 布鲁氏菌毒力因子研究进展 |
| 1.2.1 脂多糖 |
| 1.2.2 Ⅳ型分泌系统 |
| 1.2.3 BvrR/BvrS双组分调控系统 |
| 1.2.4 外膜蛋白 |
| 1.2.5 布鲁氏菌毒力因子在生殖疾病中的作用 |
| 1.2.6 布鲁氏菌毒力基因作为候选疫苗保护性抗原的研究 |
| 1.3 布鲁氏菌对宿主免疫反应的调节 |
| 1.3.1 布鲁氏菌与TLRs的识别 |
| 1.3.2 布鲁氏菌对先天免疫反应的调节 |
| 1.3.3 布鲁氏菌对适应性免疫反应的调节 |
| 1.3.4 布鲁氏菌OMPs的免疫反应 |
| 1.4 组学技术在布鲁氏菌疾病中的应用进展 |
| 1.4.1 转录组学 |
| 1.4.2 蛋白质组学 |
| 1.4.3 代谢组学 |
| 1.5 研究意义及技术路线 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.5 技术路线 |
| 第二章 临床布鲁氏菌分离株bvfA基因的分布频率及B.abortus S19ΔbvfA菌株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床布鲁氏菌分离株bvfA基因的检测 |
| 2.2.2 B.abortus S19△bvfA菌株的构建 |
| 2.2.3 B.abortus S19△bvfA/bvfA回补株的构建 |
| 2.2.4 GFP标记B.abortus S19及bvfA基因缺失株和回补株 |
| 2.2.5 bvfA基因的原核表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 毒力基因在临床布鲁氏菌分离株中的分布频率 |
| 2.3.2 B.abortus S19ΔbvfA菌株构建结果 |
| 2.3.3 B.abortus S19△bvfA/bvfA回补株构建结果 |
| 2.3.4 GFP标记B.abortus S19及bvfA基因缺失株和回补株结果 |
| 2.3.5 bvfA基因原核表达结果 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 bvfA基因对B.abortus S19菌株及其宿主生物学特性的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞系和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 B.abortus S19△bvfA菌株的生长曲线测定 |
| 3.2.2 B.abortus S19△bvfA菌株体外应激水平检测 |
| 3.2.3 B.abortus S19△bvfA菌株与TM4睾丸支持细胞的相互作用 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 bvfA基因缺失减弱了B.abortus S19△bvfA菌株体外增殖活性 |
| 3.3.2 bvfA基因缺失影响了布鲁氏菌的体外应激水平 |
| 3.3.3 B.abortus S19△bvfA菌株入侵和在TM4睾丸支持细胞内增殖能力减弱 |
| 3.3.4 布鲁氏菌没有影响TM4睾丸支持细胞的增殖活性 |
| 3.3.5 B.abortus S19△bvfA菌株对早期感染的TM4睾丸支持细胞杀伤力强 |
| 3.3.6 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠毒力降低 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 B.abortus S19△bvfA菌株的免疫原性和免疫保护性 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株与试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株制备 |
| 4.2.2 制备血清 |
| 4.2.3 抗体水平检测 |
| 4.2.4 细胞因子水平检测 |
| 4.2.5 BvfA蛋白与B.abortus S19AbvfA菌株免疫小鼠血清反应性检测 |
| 4.2.6 B.abortus S19△bvfA菌株免疫保护性检测 |
| 4.2.7 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性和病理损伤研究 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 B.abortus S19△bvfA菌株免疫小鼠血清抗体水平 |
| 4.3.2 B.abortus S19△bvfA菌株免疫小鼠血清细胞因子水平的变化 |
| 4.3.3 BvfA蛋白具有区分疫苗免疫和野生毒株感染的能力 |
| 4.3.4 B.abortus S19△bvfA菌株具有针对强毒株攻击的免疫保护作用 |
| 4.3.5 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性较低 |
| 4.3.6 B.abortus S19AbvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的病理损伤减小 |
| 4.4 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 组学分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株和细胞系 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细菌总RNA的提取 |
| 5.2.2 转录组测序 |
| 5.2.3 细菌总蛋白质的提取 |
| 5.2.4 Label free蛋白组学技术 |
| 5.2.5 细菌总代谢物的提取 |
| 5.2.6 LC-MS非靶代谢组学技术 |
| 5.2.7 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 转录组质量评估结果 |
| 5.3.2 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株转录组轮廓分析 |
| 5.3.3 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株转录组学研究 |
| 5.3.4 布鲁氏菌菌体蛋白质的浓度与质量结果 |
| 5.3.5 B.abortus S19△bvfA菌体和B.abortus S19菌体总蛋白质组学研究 |
| 5.3.6 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株代谢组学研究 |
| 5.3.7 转录组学与蛋白质组学技术关联分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.3.8 蛋白质学与代谢组学技术关联分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 小结 |
| 第六章 组学通路下bvfA基因对B.abortus S19感染TM4睾丸支持细胞的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和细胞系 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 细胞样本准备 |
| 6.2.2 转录组测序和转录组质量评估 |
| 6.2.3 蛋白质和代谢产物的提取 |
| 6.2.4 Label free蛋白组学技术和LC-MS非靶代谢组学技术 |
| 6.2.5 平行反应监测和Westen blot对蛋白表达量验证 |
| 6.2.6 统计分析和可视化 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 RNA质量分析 |
| 6.3.2 转录组学揭示bvfA基因在B.abortus S19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.3 蛋白质组学揭示bvfA基因在B.abortus S19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.4 代谢组学揭示bvfA基因在B.abortusS19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.5 转录组学与蛋白质组学关联分析感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株TM4睾丸支持细胞差异表达基因功能 |
| 6.3.6 蛋白质组学与代谢组学关联分析感染B.abortus S19△bvfA菌株B.abortusS19菌株TM4睾丸支持细胞差异表达基因功能 |
| 6.3.7 感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞差异蛋白质验证 |
| 6.4 讨论 |
| 小结 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（3）丝状真菌里氏木霉异源表达Insulin Glargine的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胰岛素及其生产历史 |
| 1.1.1 胰岛素简介 |
| 1.1.2 胰岛素的生产历史 |
| 1.1.3 胰岛素类似物 |
| 1.2 胰岛素蛋白表达形式 |
| 1.2.1 双链表达形式 |
| 1.2.2 单链表达形式 |
| 1.3 丝状真菌里氏木霉-良好的蛋白合成分泌底盘细胞 |
| 1.4 本论文研究意义及主要内容 |
| 第二章 里氏木霉分泌表达IG蛋白尝试 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 PCR引物 |
| 2.1.3 主要实验仪器和试剂 |
| 2.1.4 主要培养基和培养条件 |
| 2.1.5 分子生物学操作方法 |
| 2.1.6 S1r、S1HCr基因表达盒密码子优化 |
| 2.1.7 S1r、S1HCr基因表达盒构建 |
| 2.1.8 里氏木霉的遗传转化 |
| 2.1.9 转化子的筛选鉴定 |
| 2.1.10 发酵液中IG蛋白测定 |
| 2.1.11 AKTA纯化 |
| 2.1.12 生物信息学软件及分析 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 密码子优化结果 |
| 2.2.2 S1r及S1HCr菌株构建 |
| 2.2.3 IG蛋白基因的表达水平检测 |
| 2.2.4 S1r菌株和S1HCr菌株发酵液SDS-PAGE分析 |
| 2.2.5 S1HCr菌株AKTA纯化分析 |
| 2.2.6 S1r和S1HCr菌株UPR响应相关基因的转录分析 |
| 2.2.7 S1r和S1HCr菌株ERAD途径相关基因的转录分析 |
| 2.2.8 S1r和S1HCr菌株蛋白折叠监护相关基因的转录分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 利用载体蛋白融合策略在里氏木霉中表达IG |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 PCR引物 |
| 3.1.3 主要实验仪器和试剂 |
| 3.1.4 主要培养基和培养条件 |
| 3.1.5 分子生物学操作方法 |
| 3.1.6 各基因表达盒密码子优化 |
| 3.1.7 S1CLr、S1C2r、S2C2r、S1C1r、SAC1r、SGC1r基因表达盒构建 |
| (1) S1CLr基因表达盒构建 |
| (2) S1C2r、S2C2r表达盒构建 |
| (3) S1C1r、SAC1r、SGC1r基因表达盒构建 |
| 3.1.8 里氏木霉的遗传转化 |
| 3.1.9 转化子的筛选鉴定 |
| 3.1.10 发酵液中IG蛋白测定 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 S1CLr、S1C2r、S2C2r、S1C1r表达菌株构建 |
| 3.2.2 S1CLr、S1C2r、S2C2r、S1C1r菌株中IG蛋白和载体蛋白基因转录水平检测 |
| 3.2.3 S1CLr、S1C2r、S1C1r、S2C2r菌株的发酵液Tricine-SDS-PAGE分析及蛋白质谱分析 |
| 3.2.4 S1CLr、S1C1r、S1C2r、S2C2r菌株蛋白分泌相关基因的转录分析 |
| 3.2.5 S1C1r菌株1L发酵罐培养及质谱分析 |
| 3.2.6 SAC1r、SGC1r表达菌株构建 |
| 3.2.7 SAC1r、SGC1r菌株中IG蛋白和载体蛋白基因表达水平检测 |
| 3.2.8 S1C1r、SAC1r、SGC1r菌株中发酵液Tricine-SDS-PAGE分析及蛋白质谱分析 |
| 3.2.9 SGC1r和SAC1r菌株蛋白分泌相关基因的转录分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 利用报告蛋白融合策略在里氏木霉中表达IG |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 所用菌株和质粒 |
| 4.1.2 PCR引物 |
| 4.1.3 主要实验仪器和试剂 |
| 4.1.4 主要培养基和培养条件 |
| 4.1.5 分子生物学操作方法 |
| 4.1.6 BgIr、E2Ir、E3Ir基因表达盒构建 |
| 4.1.7 IBgr、IE2r、IE3r表达盒构建 |
| 4.1.8 BgIr、IBgr、E2Ir、IE2r、E3Ir、IE3r六种载体分别转化里氏木霉 |
| 4.1.9 转化子的筛选鉴定 |
| 4.1.10 发酵液中IG蛋白测定 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 各菌株表达盒构建 |
| 4.2.2 BgIr、IBgr菌株七叶苷葡萄糖筛选平板分析 |
| 4.2.3 E2Ir、IE2r菌株CMC葡萄糖筛选平板及圈径比分析 |
| 4.2.4 E3Ir、IE3r菌株CMC葡萄糖筛选平板及圈经比分析 |
| 4.2.5 BgIr、IBgr、E2Ir、E3Ir及IE3r基因表达菌株PCR验证 |
| 4.2.6 BgIr、IBgr菌株中黑曲霉bglA和IG蛋白基因的表达水平检测 |
| 4.2.7 E2Ir菌株中里氏木霉eg2和IG蛋白基因的表达水平检测 |
| 4.2.8 E3Ir、IE3r菌株中里氏木霉eg3和IG蛋白基因的表达水平检测 |
| 4.2.9 IBgr、BgIr菌株发酵液SDS-PAGE分析 |
| 4.2.10 部分E2Ir菌株发酵液SDS-PAGE分析 |
| 4.2.11 E3Ir、IE3r菌株发酵液SDS-PAGE分析 |
| 4.2.12 IBgr、BgIr菌株UPR及ERAD途径相关因子的表达水平检测 |
| 4.2.13 E2Ir菌株UPR及ERAD途径相关因子的表达水平检测 |
| 4.2.14 E3Ir菌株UPR响应相关因子的表达水平检测 |
| 4.2.15 IE3r菌株UPR响应相关因子的表达水平检测 |
| 4.3 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士学位期间已发表(待发表)的学术论文 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的酶学性质、催化机理及应用探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 β-葡萄糖苷酶简介 |
| 1.1.1 β-葡萄糖苷酶的分类 |
| 1.1.2 β-葡萄糖苷酶的理化性质 |
| 1.1.3 β-葡萄糖苷酶酶活的测定方法 |
| 1.1.4 β-葡萄糖苷酶的结构与功能 |
| 1.1.5 β-葡萄糖苷酶的一般催化机制 |
| 1.2 不同来源的β-葡萄糖苷酶研究进展 |
| 1.2.1 动物来源的β-葡萄糖苷酶 |
| 1.2.2 植物来源的β-葡萄糖苷酶 |
| 1.2.3 微生物来源的β-葡萄糖苷酶 |
| 1.3 β-葡萄糖苷酶在食品工业中的应用 |
| 1.3.1 茶叶增香 |
| 1.3.2 果汁增香 |
| 1.3.3 葡萄酒增香 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 研究内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的同源分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 序列获取 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 理化性质分析 |
| 2.2.2 保守结构域和Motif分析 |
| 2.2.3 同源关系分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 酒酒球菌SD-2a中β-葡萄糖苷酶的异源表达和纯化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 基因组DNA的提取 |
| 3.2.2 目的基因的克隆表达 |
| 3.2.3 重组酶BGL0224 的分离纯化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 重组β-葡萄糖苷酶BGL0224 的酶学性质表征 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 BGL0224 的生物信息学分析 |
| 4.2.2 BGL0224 的基本理化性质 |
| 4.2.3 BGL0224 的结构初步表征 |
| 4.2.4 BGL0224 的酶促反应动力学参数 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 重组β-葡萄糖苷酶BGL0224 的催化机理探究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料与试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 温度和p H对BGL0224 催化七种底物的影响 |
| 5.2.2 BGL0224 催化七种底物的动力学参数和活化能 |
| 5.2.3 七种底物对BGL0224 的猝灭机制和结合能力 |
| 5.2.4 BGL0224 催化底物p-NPG的分子模拟 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 重组β-葡萄糖苷酶BGL0224 对赤霞珠葡萄酒品质特性的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料与试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 电子鼻分析 |
| 6.2.2 GC-MS分析 |
| 6.2.3 感官评价分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论、创新点和展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 萜类化合物的天然生物合成途径 |
| 1.2.1 异戊二烯单元的生物合成途径 |
| 1.2.2 萜类化合物生物合成的下游途径 |
| 1.3 萜类化合物合成的生物技术 |
| 1.3.1 天然宿主萜类化合物的生物合成 |
| 1.3.2 异源微生物合成萜类化合物 |
| 1.3.3 萜类化合物的无细胞体系合成 |
| 1.4 类胡萝卜素 |
| 1.4.1 类胡萝卜素的概述 |
| 1.4.2 β-胡萝卜素 |
| 1.4.3 虾青素 |
| 1.5 选题背景及研究内容 |
| 1.5.1 大肠杆菌中组合生物合成调控虾青素生产 |
| 1.5.2 大肠杆菌碳代谢扰动提高β-胡萝卜素的生产 |
| 第2章 虾青素操作子的构建和表征 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌的CaCl_2转化法感受态细胞的制备与转化 |
| 2.2.2 大肠杆菌电转化感受态的制备和电转化 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.2.4 DNA片段的PCR扩增 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 DNA片段的纯化和回收 |
| 2.2.7 DNA片段的切胶回收 |
| 2.2.8 DNA片段的酶切反应和连接反应 |
| 2.2.9 菌液PCR |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.2.11 菌株的培养及摇瓶发酵 |
| 2.2.12 AX的定量检测 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 大肠杆菌生产AX初探 |
| 2.3.2 AX操纵子的优化再设计与构建 |
| 2.3.3 优化的AX操纵子发酵表征 |
| 2.3.4 优化的AX操纵子表达分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 β-胡萝卜素羟化酶与β-胡萝卜素酮化酶的融合 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重叠延伸PCR |
| 3.2.2 同源建模 |
| 3.2.3 菌株的碳源优化发酵 |
| 3.2.4 高效液相色谱检测 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 融合蛋白质的设计与构建 |
| 3.3.2 融合蛋白质中添加肽linker对AX生产的影响 |
| 3.3.3 菌株ZF237T/Crt Z_(As)-(GS)_1-W_(Bs)发酵碳源的优化 |
| 3.3.4 融合蛋白的同源建模 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 中心碳代谢扰动与NADPH供应提高β-胡萝卜素生产 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 大肠杆菌中I-Sce I介导的λ-red重组系统无痕敲除基因 |
| 4.2.2 大肠杆菌中的MAGE技术 |
| 4.2.3 大肠杆菌生理参数的测定 |
| 4.2.4 辅酶Ⅰ和II胞内含量检测 |
| 4.2.5 菌株ECW4/ p5C-nad K的高细胞密度发酵 |
| 4.2.6 定量测定 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 中心碳代谢途径的阻断对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.2 PTS系统失活对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.3 中心碳代谢扰动菌株的生理参数测定 |
| 4.3.4 菌株ECW1和ECW2 的还原力分析 |
| 4.3.5 增加NADPH的供应对β-胡萝卜素生产的影响 |
| 4.3.6 菌株ECW4/p5C-nad K的高细胞密度发酵 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 菌株ECW1和ECW2 的转录组分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌种 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 溶液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 菌株培养 |
| 5.2.2 转录组学 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 基因表达水平相关性分析 |
| 5.3.2 基因差异表达分析 |
| 5.3.3 菌株ECW1与ZF43ΔgdhA的比较转录组学分析 |
| 5.3.4 菌株ECW2转录组学分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 过表达葡萄糖运输蛋白对萜类化合物的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌种、质粒和引物 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.1.5 溶液 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 大肠杆菌基因组上过表达基因 |
| 6.2.2 β-胡萝卜素的生成 |
| 6.2.3 芳樟醇的生成 |
| 6.2.4 β-胡萝卜素和芳樟醇的测定 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 zwf的敲除对基因ptsG和 galP转录的影响 |
| 6.3.2 菌株ECW1中过表达ptsG、galP对 β-胡萝卜素生产的影响 |
| 6.3.3 在菌株ZF43ΔgdhA中过表达ptsG和 galP |
| 6.3.4 葡萄糖运输蛋白基因的过表达对芳樟醇合成的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）茯苓细胞色素P450基因PcCYPs的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 茯苓研究进展 |
| 1.2.1 茯苓简介 |
| 1.2.2 茯苓主要药用活性成分研究现状 |
| 1.2.3 茯苓酸生物合成途径研究进展 |
| 1.3 真菌细胞色素P450研究概况 |
| 1.3.1 细胞色素P450介绍 |
| 1.3.2 细胞色素P450的命名 |
| 1.3.3 细胞色素P450的结构和功能研究 |
| 1.3.4 CYP450在真菌中的研究现状 |
| 1.4 真菌基因功能研究方法 |
| 1.5 真菌CYP450异源表达研究进展 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 细胞色素P450(PcCYPs)的克隆及序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 酶和生化试剂 |
| 2.1.3 培养基和培养条件 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 RNA提取 |
| 2.2.2 第一链cDNA的合成 |
| 2.2.3 PcCYPs的扩增 |
| 2.2.4 PCR产物回收 |
| 2.2.5 目的基因PcCYPs与克隆载体的连接、转化、验证 |
| 2.2.6 PcCYPs的序列比对及系统进化树构建 |
| 2.2.7 PcCYPs的基础生物信息学分析 |
| 2.2.8 PcCYP1不同剪切体的表达量分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 茯苓PcCYPs的克隆 |
| 2.3.2 PcCYP1、PcCYP3 序列分析 |
| 2.3.3 PcCYPs系统发育分析 |
| 2.3.4 PcCYPs基本特性分析 |
| 2.3.5 PcCYP1和PcCYP2 的表达分析 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 第三章 PcCYPs基因超表达载体构建及其表达分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 目的基因PcCYPs的获取 |
| 3.2.2 目的片段的切胶回收 |
| 3.2.3 目的基因与p TOPO-Blunt平末端载体的连接、转化、验证 |
| 3.2.4 质粒的提取 |
| 3.2.5 超表达载体p Blue Script SK和重组T载的双酶切、回收、连接 |
| 3.2.6 p Blue Script SK-PcCYPs载体的验证 |
| 3.2.7 PEG介导的原生质体转化 |
| 3.2.8 超表达转化子的鉴定 |
| 3.2.9 荧光定量PCR检测转化子超表达效率 |
| 3.2.10 茯苓超表达转化子中总三萜含量的测定 |
| 3.2.11 茯苓酸含量测定 |
| 3.2.12 茯苓超表达转化子的液体发酵 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 目的基因的获取 |
| 3.3.2 重组载体超表达载体的构建 |
| 3.3.3 PEG介导的原生质体转化及筛选验证 |
| 3.3.4 PcCYPs超表达菌株的表达量分析 |
| 3.3.5 PcCYPs超表达菌株菌落形态及日生长速率的观察 |
| 3.3.6 PcCYPs超表达对总三萜以及茯苓酸含量的影响 |
| 3.3.7 PcCYPs超表达菌株发酵培养 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 第四章 PcCYPs沉默载体构建与表达研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试菌株 |
| 4.1.2 主要化学试剂和培养基 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PcCYPs沉默设计 |
| 4.2.2 PcCYPs上游片段和下游片段的获取 |
| 4.2.3 PcCYPs基因沉默载体的构建 |
| 4.2.4 PEG介导的PcCYP1、PcCYP3 基因沉默载体的茯苓原生质体转化 |
| 4.2.5 沉默转化子的鉴定 |
| 4.2.6 PcCYPs基因沉默转化子的荧光定量PCR检测 |
| 4.2.7 茯苓酸的HPLC分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PcCYPs-up和 PcCYPs-down的获取 |
| 4.3.2 PcCYP1与PcCYP3 基因沉默载体的构建 |
| 4.3.3 沉默转化子基因表达量分析 |
| 4.3.4 沉默转化子菌落生长速率及形态的观察 |
| 4.3.5 PcCYP1、PcCYP3 沉默对茯苓酸的影响 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 PcCYPs在毕赤酵母中的表达分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌种和质粒 |
| 5.1.2 试剂药品 |
| 5.1.3 培养基和贮存液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 真核表达载体pPICZαC-PcCYPs、p CAPZC-PcCYPs构建 |
| 5.2.2 毕赤酵母X33-pPICZαC-PcCYPs、X33-pGAPZC-PcCYPs重组菌株的构建、筛选以及诱导表达 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组表达载体pPICZαC-PcCYP1、 pPICZαC-PcCYP2、pPICZαC-PcCYP3 的构建 |
| 5.3.2 重组表达载体pGAPZC-PcCYP1、 pGAPZC-PcCYP2、pGAPZC-PcCYP3 的构建 |
| 5.3.3 酵母重组子的获取与鉴定 |
| 5.3.4 蛋白表达分析 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）重组气肿疽梭菌CctA基因在大肠杆菌中的表达及免疫原性初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 气肿疽梭菌研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 传染源 |
| 2.2 传播途径 |
| 2.3 易感动物 |
| 2.4 流行现状 |
| 3 主要毒力因子 |
| 3.1 细胞毒素 |
| 3.2 鞭毛蛋白 |
| 3.3 透明质酸酶 |
| 3.4 神经氨酸酶 |
| 3.5 DNAse |
| 4 临床症状及病理变化 |
| 5 诊断方法 |
| 6 疫苗研究进展 |
| 7 小结 |
| 第二章 试验内容 |
| 试验一 CctA全长基因的扩增及生物信息学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料及试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 CctA全长基因的扩增 |
| 2.3 CctA蛋白的相关生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 气肿疽梭菌CctA全长基因PCR扩增结果 |
| 3.2 CctA蛋白的结构和功能预测 |
| 3.2.1 CctA蛋白的理化性质分析 |
| 3.2.2 CctA蛋白氨基酸序列的亲疏水性分析 |
| 3.2.3 CctA蛋白的结构预测 |
| 3.2.4 CctA蛋白糖基化及磷酸化位点的预测 |
| 3.2.5 CctA蛋白的二级、三级结构预测 |
| 3.2.6 CctA蛋白潜在抗原表位的预测 |
| 4 讨论 |
| 试验二 截短CctA基因在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验菌株及载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要培养基及试剂的配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 截短CctA基因的扩增 |
| 2.2 重组pMD19-T-CctA克隆质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.1 PCR产物的纯化 |
| 2.2.2 目的基因与pMD19-T载体连接 |
| 2.2.3 连接产物的转化 |
| 2.2.4 重组克隆质粒的提取 |
| 2.2.5 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.3 重组pET-28a(+)-CctA表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.3.1 重组克隆质粒与表达载体pET-28a(+)的双酶切与回收 |
| 2.3.2 目的片段与表达质粒pET-28a(+)的连接 |
| 2.3.3 重组表达质粒的转化 |
| 2.3.4 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.4 重组蛋白的诱导表达及扩大培养 |
| 2.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.6 重组蛋白Western blot反应原性检测 |
| 2.7 包涵体蛋白的复性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 截短CctA基因扩增结果 |
| 3.2 CctA基因重组克隆质粒的PCR鉴定 |
| 3.3 CctA基因重组表达质粒的酶切鉴定 |
| 3.4 重组表达菌的诱导表达 |
| 3.5 重组蛋白大量诱导结果 |
| 3.6 重组蛋白的纯化 |
| 3.7 重组蛋白的Western blot分析 |
| 3.8 包涵体蛋白复性结果 |
| 4 讨论 |
| 试验三 重组CctA免疫原性初步研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种、佐剂及主要实验试剂 |
| 1.2 主要试剂与培养基配制 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 主要耗材及仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组蛋白的灭活检验及疫苗配制 |
| 2.2 动物免疫试验 |
| 2.3 攻毒保护试验 |
| 2.3.1 攻毒用强毒的制备 |
| 2.3.2 攻毒用强毒菌液的毒力测定 |
| 2.3.3 攻毒试验 |
| 2.4 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.4.1 ELISA反应条件的筛选 |
| 2.4.2 最佳反应条件的确定 |
| 2.4.3 阴阳性判定标准确定 |
| 2.5 间接ELISA方法检测抗体水平 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 灭活检验结果 |
| 3.2 攻毒用强毒的毒力测定结果 |
| 3.3 攻毒试验结果 |
| 3.4 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.4.1 ELISA检测方法最佳条件的确定 |
| 3.4.2 阴阳性判定标准确定 |
| 3.5 间接ELISA检测抗体水平结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 简介 |
| 导师评阅表 |
（8）中华乌塘鳢重要免疫相关基因的分子克隆、基因表达及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstacct |
| 第1章 综述 |
| 第1节 中华乌塘鳢及研究进展 |
| 第2节 鱼骨先天免疫防御机制 |
| 2.1 鱼类免疫防御机制 |
| 2.2 超氧化物歧化酶 |
| 2.3 过氧化氢酶 |
| 2.4 溶菌酶 |
| 2.5 Hepcidin |
| 第2章 中华乌塘鳢致病菌的分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 病原菌分离 |
| 2.1.3 人工感染试验 |
| 2.1.4 病原菌形态与理化特性检测 |
| 2.1.5 16SrDNA序列测定和分析 |
| 2.1.6 药敏试验 |
| 2.1.7 主要器官的组织病理观察 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患病症状 |
| 2.2.2 病原菌 |
| 2.2.3 人工感染实验 |
| 2.2.4 生理生化鉴定结果 |
| 2.2.5 16SrDNA序列分析 |
| 2.2.6 药敏试验结果 |
| 2.2.7 主要器官的组织病理观察 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 中华乌塘鳢超氧化物歧化酶(BsCu/Zn-SOD与 BsMn-SOD)基因的克隆及mRNA表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物及菌株 |
| 3.1.2 实验器材及试剂 |
| 3.1.3 中华乌塘鳢脾脏基因组的提取 |
| 3.1.4 中华乌塘鳢各组织总RNA的提取及c DNA合成 |
| 3.1.5 BsCu/Zn-SOD与 BsMn-SOD基因的CDS序列分子克隆获得 |
| 3.1.6 BsCu/Zn-SOD与 BsMn-SOD基因序列的生物信息学分析 |
| 3.1.7 BsCu/Zn-SOD与 BsMn-SOD基因的组织差异性表达 |
| 3.1.8 免疫刺激后BsCu/Zn-SOD与 BsMn-SOD基因的表达变化 |
| 3.1.9 副溶血弧菌刺激后BsCu/Zn-SOD与 BsMn-SOD基因的酶活性变化 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 中华乌塘鳢Cu/Zn-SOD和 Mn-SOD基因CDS序列克隆分析 |
| 3.2.2 中华乌塘鳢Cu/Zn-SOD和 Mn-SOD氨基酸序列的同源性分析 |
| 3.2.3 中华乌塘鳢Cu/Zn-SOD和 Mn-SOD基因的系统进化分析 |
| 3.2.4 中华乌塘鳢Cu/Zn-SOD和 Mn-SOD基因结构分析 |
| 3.2.5 中华乌塘鳢Cu/Zn-SOD和 Mn-SOD基因的组织特异性分布表达 |
| 3.2.6 免疫刺激后中华乌塘鳢Cu/Zn-SOD和 Mn-SOD基因的表达 |
| 3.2.7 BsSODs酶活性测定 |
| 3.3 .讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 中华乌塘鳢过氧化氢酶(BsCAT)基因的克隆、mRNA表达及功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 中华乌塘鳢BsCAT基因的CDS序列分子克隆获得 |
| 4.1.3 中华乌塘鳢BsCAT基因序列分析及进化树构建 |
| 4.1.4 中华乌塘鳢BsCAT基因的组织差异性表达 |
| 4.1.5 中华乌塘鳢过氧化氢酶蛋白纯化表达 |
| 4.1.6 中华乌塘鳢过氧化氢酶纯化蛋白的最适温度和pH值测试 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 BsCAT基因的序列分析 |
| 4.2.2 中华乌塘鳢BsCAT基因氨基酸序列的同源性分析 |
| 4.2.3 中华乌塘鳢BsCAT基因表达分析 |
| 4.2.4 中华乌塘鳢重组BsCat的表达和纯化 |
| 4.2.5 中华乌塘鳢重组rBsCAT的酶活性 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 中华乌塘鳢溶菌酶(BsLysG与 BsLysC)基因的克隆、mRNA表达及功能分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 中华乌塘鳢BsLysG与 BsLysC基因的CDS和基因组序列分子克隆获得 |
| 5.1.3 中华乌塘鳢BsLysG与 BsLysC基因序列的分析 |
| 5.1.4 中华乌塘鳢BsLysG与 BsLysC基因的表达分析 |
| 5.1.5 中华乌塘鳢BsLysG与 BsLysC蛋白纯化表达 |
| 5.1.6 中华乌塘鳢rBsLysG与 rBsLysC酶活性测定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 BsLysG与 BsLysC基因的序列分析 |
| 5.2.2 中华乌塘鳢BsLysG与 BsLysC基因氨基酸序列的同源性分析及进化树构建 |
| 5.2.3 中华乌塘鳢BsLysG与 BsLysC基因表达分析 |
| 5.2.4 中华乌塘鳢r BsLysG与 r BsLysC表达和纯化 |
| 5.2.5 中华乌塘鳢重组rBsLysG和 rBsLysC的蛋白活性检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 中华乌塘鳢Hepcidin基因的克隆、mRNA表达及功能分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 中华乌塘鳢Hepcidin基因CDS和基因组序列分子克隆获得 |
| 6.1.3 中华乌塘鳢Hepcidin基因序列的分析 |
| 6.1.4 中华乌塘鳢Hepcidin基因的表达分析 |
| 6.1.5 中华乌塘鳢Hepcidin肽的生物合成 |
| 6.1.6 中华乌塘鳢Hepcidin合成肽的抗菌活性检测 |
| 6.1.7 BsHep肽的免疫调节作用 |
| 6.1.8 鱼类存活率测定 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 BsHep基因的序列分析 |
| 6.2.2 中华乌塘鳢BsHep基因的同源性分析 |
| 6.2.3 中华乌塘鳢BsHep基因的系统进化分析 |
| 6.2.4 中华乌塘鳢BsHep基因的表达分析 |
| 6.2.5 BsHep肽的抗菌活性 |
| 6.2.6 BsHep肽的免疫调节和体内保护 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的学术论文及研究成果 |
（9）红树林沉积物中微生物群落结构研究及琼胶酶基因资源的调查与利用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 红树林生态系统简介 |
| 1.2 红树林沉积物中微生物群落多样性 |
| 1.2.1 微生物群落结构研究方法 |
| 1.2.2 红树林沉积物中细菌多样性 |
| 1.2.3 红树林沉积物中古菌多样性 |
| 1.2.4 红树林沉积物中真菌多样性 |
| 1.2.5 红树林沉积物中固氮与反硝化微生物多样性 |
| 1.2.6 目前红树林沉积物中微生物多样性研究的不足 |
| 1.3 红树林沉积物中功能基因的筛选 |
| 1.3.1 纯培养筛选 |
| 1.3.2 宏基因组克隆文库筛选 |
| 1.3.3 高通量测序筛选 |
| 1.4 琼胶酶、琼胶及降解产物研究概况 |
| 1.4.1 琼脂糖及琼胶简介 |
| 1.4.2 琼脂糖降解产物及其生物活性 |
| 1.4.3 琼脂糖的降解方法 |
| 1.4.4 琼胶酶降解产物的聚合度 |
| 1.4.5 琼胶酶研究现存的不足 |
| 1.5 红树林沉积物微生物组中琼胶酶的研究进展 |
| 1.6 本文的研究目的与意义 |
| 第二章 红树林沉积物中微生物群落多样性及驱动性因子 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 红树林沉积物样品采集 |
| 2.1.2 环境理化因子的测定 |
| 2.1.3 环境总DNA的提取 |
| 2.1.4 目的基因的扩增 |
| 2.1.5 高通量测序及数据处理 |
| 2.1.6 数据统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 沉积物样品描述 |
| 2.2.2 环境因子的相互关系 |
| 2.2.3 红树林沉积物中细菌与古菌群落结构及环境驱动因子 |
| 2.2.4 红树林沉积物中真菌群落结构及环境驱动因子 |
| 2.2.5 红树林沉积物中固氮与反硝化微生物群落结构及环境驱动因子 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 高丰度微生物在红树林沉积物中潜在的生态作用 |
| 2.3.2 时空维度对红树林沉积物中微生物群落结构的影响 |
| 2.3.3 微生物群落的显着影响因子及关键性驱动因子 |
| 2.3.4 蓝细菌门中细菌的多样性与环境影响因子 |
| 2.3.5 红树林沉积物中功能基因的冗余性 |
| 第三章 红树林沉积物微生物组中琼胶酶的调查与筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 红树林沉积物的富集与采集 |
| 3.1.2 沉积物样品环境微生物总DNA的提取与环境因子测定 |
| 3.1.3 沉积物样品16S rRNA基因多样性测定 |
| 3.1.4 沉积物样品总DNA宏基因组测序、数据处理和注释 |
| 3.1.5 潜在琼胶酶最适温度与信号肽预测 |
| 3.1.6 嵌合体修正 |
| 3.1.7 基因组草图组装与物种注释 |
| 3.1.8 潜在琼胶酶基因的表达与酶活测定 |
| 3.1.9 沉积物样品中琼胶酶活性测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 沉积物样品描述 |
| 3.2.2 琼胶富集后沉积物中微生物群落的变化 |
| 3.2.3 宏基因组测序数据概览 |
| 3.2.4 红树林沉积物中的碳水化合物活性酶基因 |
| 3.2.5 红树林沉积物微生物组中琼胶降解相关基因 |
| 3.2.6 琼胶酶活性预测与验证 |
| 3.2.7 潜在琼胶酶信号肽的预测与统计 |
| 3.2.8 红树林沉积物中微生物基因组草图的拼接 |
| 3.2.9 多糖在获得的微生物基因组中的降解方式 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 红树林沉积物来源琼胶酶的重组表达、纯化及酶学性质 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 红树林沉积物来源琼胶酶基因的克隆与表达 |
| 4.1.2 重组琼胶酶的诱导表达及纯化 |
| 4.1.3 最适作用温度与最适pH及稳定性的测定 |
| 4.1.4 化学试剂对酶活影响测定 |
| 4.1.5 底物特异性测定 |
| 4.1.6 重组琼胶酶动力学测定 |
| 4.1.7 重组琼胶酶水解产物分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 重组琼胶酶rAgaM1和rAgaM2的酶活性分析 |
| 4.2.2 rAgaM1的底物特异性和酶促动力学分析 |
| 4.2.3 rAgaM1的水解产物分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 rAgaM1的截短及其在多聚合度新琼寡糖生产中的应用 |
| 5.1 材科与方法 |
| 5.1.1 agaM1基因的截短、克隆、表达与纯化 |
| 5.1.2 trAgaM1酶活性质及动力学参数测定 |
| 5.1.3 底物利用率的测定 |
| 5.1.4 摇瓶中trAgaM1表达的单因素优化 |
| 5.1.5 发酵罐中trAgaM生产的初步探究 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 trAgaM1的纯化与酶学性质鉴定 |
| 5.2.2 多种聚合度新琼寡糖生产方法的优化 |
| 5.2.3 rtAgaM1在摇瓶中的发酵优化 |
| 5.2.4 trAgaM1在发酵罐中生产的初步研究 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 总结、不足与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附件1 沉积物微生物总DNA提取步骤 |
| 附件2 PCR扩增产物纯化步骤 |
| 附件3 大肠杆菌感受态制备与重组载体质粒转化 |
| 附件4 本文所用溶液的配制方法 |
| 附件5 大肠杆菌中质粒提取方法 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）在重组大肠杆菌中构建丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于甲醇和甲醛合成1,3-丙二醇（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 甲醇一碳化合物潜在的生物利用价值 |
| 1.2 甲醇生物利用的研究 |
| 1.3 甲醛代谢途径的研究 |
| 1.3.1 甲醛异化途径—谷胱甘肽(GSH)依赖的甲醛脱毒途径 |
| 1.3.2 甲醛同化途径—核酮糖单磷酸途径(RuMP)及其应用 |
| 1.4 醛缩酶的研究进展及其潜在的生物应用价值 |
| 1.5 1,3-丙二醇简介及其合成方法 |
| 1.6 生物法合成1,3-丙二醇的研究进展 |
| 1.7 本论文研究思路及研究意义 |
| 第二章 挖掘具有潜在应用价值的醛缩酶用于甲醛固定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂的配制 |
| 2.2.2 实验菌株与质粒 |
| 2.2.3 实验引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 数据库及分析软件 |
| 2.3.2 大肠杆菌TOP10和BL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 2.3.3 胶回收 |
| 2.3.4 质粒提取 |
| 2.3.5 目的基因的获取 |
| 2.3.6 重组质粒的构建 |
| 2.3.7 alac基因的定点突变 |
| 2.3.8 表达和克隆菌株的构建 |
| 2.3.9 菌株培养条件及基因的诱导表达 |
| 2.3.10 2-氧代-4-羟基丁酸的定性和定量 |
| 2.3.11 分析方法 |
| 2.3.12 醛缩酶的酶活测定 |
| 2.3.13 蛋白纯化及其步骤 |
| 2.3.14 分析方法 |
| 2.3.15 KHB的Km值测定方法 |
| 2.3.16 KHB的甲醛耐受性研究 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 2-氧代-4-羟基丁酸的制备,定性和定量 |
| 2.4.2 重组质粒的构建 |
| 2.4.3 醛缩酶的蛋白表达及酶活力的测定 |
| 2.4.4 KHB的纯化 |
| 2.4.5 KHB的Km值测定 |
| 2.4.6 KHB的甲醛耐受性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 甲醛和丙酮酸体外合成1,3-丙二醇 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验菌株和质粒 |
| 3.2.2 实验引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 目的基因的获取 |
| 3.3.2 重组质粒的构建 |
| 3.3.3 菌株培养条件及基因的诱导表达 |
| 3.3.4 由甲醛和丙酮酸体外生产1,3-PDO |
| 3.3.5 KDC的酶活测定 |
| 3.3.6 分析方法 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 菌株E.coli-KDC和E.coli-DhaT的蛋白表达 |
| 3.4.3 由甲醛和丙酮酸体外合成1,3-PDO |
| 3.4.4 KDC的酶活测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 构建丙酮酸依赖的—碳代谢途径用于体内生产1,3-丙二醇 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 代谢途径的分析 |
| 4.3 实验材料与仪器 |
| 4.3.1 实验菌株与质粒 |
| 4.3.2 实验引物 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 目的基因的获取 |
| 4.4.2 新1,3-PDO生物合成途径的构建 |
| 4.4.3 菌株培养条件及基因的诱导表达 |
| 4.5 实验结果与讨论 |
| 4.5.1 重组质粒的构建 |
| 4.5.2 重组菌株BP3和BP4的蛋白表达 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 甲醇或甲醛和葡萄糖体内合成1,3-丙二醇 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.3 实验菌株和质粒 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 批次发酵和补料批次发酵方法 |
| 5.5 实验结果与讨论 |
| 5.5.1 BP3批次发酵和补料批次发酵合成1,3-PDO |
| 5.5.2 BP4补料批次发酵合成1,3-PDO |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 代谢途径的优化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 实验菌株与质粒 |
| 6.2.2 实验引物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 CRISPR-Cas9技术构建E.coli BL21(DE3)△frmA菌株 |
| 6.3.2 大肠杆菌CRISPR-Cas9操作说明 |
| 6.3.3 pREDCas9转入E.coli BL21(DE3)感受态 |
| 6.3.4 pGRB-sg-frmA质粒构建 |
| 6.3.5 构建donor dsDNA |
| 6.3.6 制备E.coli BL21(DE3)-pREDCas9感受态 |
| 6.3.7 pGRB-sg-frmA质粒和donor dsDNA电转入E.coli BL21(DE3)-pREDCas9 |
| 6.3.8 消除pGRB-sg-frmA质粒 |
| 6.3.9 消除pREDCas9质粒 |
| 6.3.10 制备E.coli BL21(DE3)△frmA感受态 |
| 6.3.11 补料批次发酵方法 |
| 6.3.12 ~(13)C-甲醛同位素标记 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 构建E.coli BL21 (DE3)△frmA菌株 |
| 6.4.2 补料批次发酵合成1,3-PDO |
| 6.4.3 利用~(13)C-甲醛同位素标记物验证代谢途径的可行性 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 论文主要结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 导师和作者简介 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 附件 |
四、小鼠PC-1基因在大肠杆菌中的表达和纯化（论文参考文献）
- [1]狂犬病病毒CTN-1株全长核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达及初步应用[D]. 任元雪. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究[D]. 贾芳. 宁夏大学, 2021(02)
- [3]丝状真菌里氏木霉异源表达Insulin Glargine的初步研究[D]. 李喜海. 山东大学, 2021(09)
- [4]酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的酶学性质、催化机理及应用探究[D]. 张杰. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]代谢工程改造大肠杆菌高产类胡萝卜素的研究[D]. 吴元庆. 天津大学, 2020(01)
- [6]茯苓细胞色素P450基因PcCYPs的克隆及功能分析[D]. 唐静. 华中农业大学, 2020
- [7]重组气肿疽梭菌CctA基因在大肠杆菌中的表达及免疫原性初步研究[D]. 陈晓洁. 石河子大学, 2020(08)
- [8]中华乌塘鳢重要免疫相关基因的分子克隆、基因表达及功能研究[D]. 魏可. 浙江海洋大学, 2020(01)
- [9]红树林沉积物中微生物群落结构研究及琼胶酶基因资源的调查与利用[D]. 曲武. 厦门大学, 2019(08)
- [10]在重组大肠杆菌中构建丙酮酸依赖的一碳代谢途径用于甲醇和甲醛合成1,3-丙二醇[D]. 王闯. 北京化工大学, 2019(06)