一、细胞外基质蛋白1在肿瘤中的表达及意义（论文文献综述）
陈凯[1]（2021）在《miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究》文中指出一、研究背景肝细胞性肝癌（HCC）是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,目前在最致命肿瘤中致死率排名第二。在过去的几十年,针对肝癌已经有了众多治疗手段,如精准的肝段切除术,肝移植术,肝动脉栓塞化疗及肝癌射频消融术等,但是肝癌患者的预后仍然不令人满意,据统计,肝癌患者5年总生存率低于20%。肝癌起病隐匿,肿瘤进展快,容易复发和肝内转移都是导致肝癌预后较差的可能原因。因此,探究肝癌进展,转移的分子学机制有利于寻找潜在的肝癌治疗分子靶点,开发可能的早期肝癌诊断标志物对肝癌的系统治疗非常重要。微小RNA（miRNA）是以由一类进化保守的,由约22个核苷酸组成的非编码小RNA,微小RNA可结合在靶基因信使RNA（m RNA）的3?端的非翻译区（UTR区）通过降解信使RNA或抑制信使RNA翻译的方式发挥转录后调控作用。研究显示微小RNA几乎参与了肿瘤细胞发生发展的全部过程,包括细胞的干性,肿瘤发生,细胞的增殖,细胞的凋亡,细胞的迁移和侵袭,细胞的转移等等。也有越来越多的研究显示各种肿瘤中均有不同微小RNA的异常表达,包括肝癌。例如,miR-876被发现在胆管癌（CCA）中表达降低,并能通过抑制BCL-XL的表达诱导细胞的增殖;miR-589被发现在肝细胞性肝癌中表达增高并能通过STAT3信号通路来促进细胞的干性和化疗抵抗。然而,在肝细胞性肝癌中异常表达和对诊断或者预后有指示作用的miRNA仍然缺乏有待进一步研究。骨膜蛋白（POSTN）,也称为成骨细胞特异性因子2,是一大小为93.3k Da的细胞外基质（ECM）蛋白。POSTN能通过和众多其他蛋白如纤维结合蛋白,胶原蛋白及腱生蛋白等互相联系进而对细胞外基质进行改造。POSTN对胶原纤维的发生,细胞粘附,细胞迁移和上皮间质转换等都有重要作用。目前研究发现多种肿瘤中亦有POSTN的异常表达,包括头颈部肿瘤,肺癌,神经纤维瘤,乳腺癌,结直肠肿瘤及肝细胞性肝癌等,对肿瘤细胞的生存,上皮间质转换,血管生成和肿瘤微环境的形成都有重要作用。例如:研究发现胰腺癌细胞能刺激间质细胞分泌POSTN,进而促进肿瘤基质成绩和上皮间质转化进而促进肿瘤进展。然后,在肝细胞性肝癌中POSTN的表达及调控机制的研究尚少,有待进一步研究。在本文中,我们通过对TCGA数据库中异常表达的miRNA进行筛选,鉴定出了一异常表达的miRNA,即miR-876。我们还进一步探求了其细胞功能和对下游靶基因的调节机制。我们还在众多临床肝细胞性肝癌的临床组织标本中监测了miR-876和其靶基因POSTN的表达,分析了他们的表达和肝细胞性肝癌患者的临床病理参数和预后的关系。我们的研究提示miR-876及POSTN在肝细胞性肝癌中异常表达,可能作为一潜在的诊断性分子标志物和治疗靶点。二、研究方法1.分析49对肝癌及对应的癌旁样本的TCGA数据库,分析异常表达的miRNA,筛选出表达差异倍数最高的前20个微小RNA。2.收集了从2006年到2010年在西南医院肝胆科因患原发性肝细胞性肝癌而行原发性肝癌切除术的共计127例患者的组织样本,本研究说包含的所有病人术前均未接收放疗或者化疗。所有患者术后均定期性影像学（即超声或CT）即血液AFP检测。本研究团队及西南医院临床研究中心完成患者的预后随访,随访为结合到我院复查情况,定期（每2-3月）电话随访。3.采用实时定量PCR的方法检测了肝癌组织样本中miR-876和POSTN的表达水平;采用免疫组化（IHC）方法在原发性肝细胞性肝癌组织样本中检测了样本中POSTN及EMT标志物（E钙粘蛋白,N钙粘蛋白,波形蛋白）的表达情况,并在肝癌合并肝硬化样本中检测了POSTN的表达。4.采用Kaplan-Meier曲线分析（单因素）和Cox回归（多因素）方法分析了影响HCC患者预后的危险因素及独立危险因素,并进一步分析了miR-876和POSTN共表达对HCC预后的影响。5.采用了生物信息学及双荧光素酶报告基因实验研究了miR-876可能的调控靶基因,并进一步采用实时定量PCR及Western Blotting（WB）方法进行验证。6.Mi R-876的具体体内生物学行为在裸鼠实验中进行检测,最终成瘤效果以活体成像方式进行检测验证。7.采用WB方法分析了miR-876的表达对EMT标志物的影响,并在人肝星状细胞系LX-2中检测了纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,胶原蛋白-I的表达。采用transwell小室侵袭实验研究了miR-876对肝癌细胞系的侵袭能力的影响。三、研究结果1.通过对49对肝癌患者的TCGA数据库进行分析,我们筛选出了表达差异倍数排名前20的高表达及低表达miRNA,进一步筛选鉴定出miR-876。2.我们发现miR-876在肝癌细胞系及肝癌组织中低表达。首先,我们发现miR-876在人正常肝细胞系L02中表达高,而在肝癌细胞系SMMC-7721,Hep G2,Huh-7及HCC-LM3中表达较低;接下来我们在50对肝癌及癌旁样本中检测了miR-876的表达,发现miR-876在肝癌组织/癌旁组织的比率62%有降低,16%变化不明显,而仅有22%表达升高。3.miR-876的低表达和肝硬化、癌栓及肝癌TNM分期相关。我们在127例HCC组织样本中检测了miR-876的表达,分析了其表达水平和HCC患者临床病理参数的相关性。发现miR-876的表达和肝硬化（P=0.026）、肝癌癌栓形成（P=0.031）及TNM分期（P=0.021）相关。而和其他病理参数,如患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、乙肝、AFP水平、肝Child分级未发现显着相关性。我们还进一步在肝硬化及癌栓患者中检测了miR-876的表达水平,发现miR-876在肝硬化组织样本中表达较非肝硬化患者显着低（P=0.0294）,而其在有肝癌癌栓患者中表达亦显着低（P=0.0367）。4.miR-876抑制细胞侵袭、EMT及细胞纤维化。我们通过构建了miR-876过表达及干扰细胞株,通过transwell细胞侵袭实验发现过表达miR-876的肝癌细胞侵袭力减弱,而干扰miR-876后侵袭力增强,进一步通过WB实验发现过表达miR-876后N-钙粘蛋白及波形蛋白表达减弱,而干扰miR-876后E-钙粘蛋白表达亦减弱。在人星状细胞系LX-2中干扰miR-876表达后发现α-SMA及胶原蛋白-I表达减弱。5.miR-876靶向POSTN,并抑制其表达。我们通过生物信息学分析发现POSTN的3?UTR存在2个能与miR-876种子区结合的序列,进一步双荧光素酶报告基因实验发现野生型p GL3 POSTN荧光素酶质粒和miR-876共转染入293细胞后其萤火虫荧光信号/海肾荧光素酶荧光信号比值显着性降低,进一步WB实验证实当干扰miR-876后HCC细胞POSTN表达升高,而过表达组POSTN显着降低。我们进一步在127例肝癌临床组织标本中同时检测了miR-876和POSTN的表达,发现两者表达呈显着负相关,R值为-0.477,相关线性方程为y=-0.486x+0.394。6.miR-876通过POSTN抑制EMT及细胞纤维化。首先,我们发现过表达POSTN的肝癌细胞侵袭力增强,并促进了EMT标志物及纤维化标志物的表达。其次,我们在过表达POSTN的基础上转染了miR-876,发现共转染miR-876后抵消了侵袭力增加及EMT及纤维化标志物蛋白的表达。7.miR-876在体内动物实验下减弱HCC细胞肿瘤成瘤能力及抑制肿瘤进展。HCC细胞其miR-876过表达的HCC细胞被注入裸鼠肝包膜下,进行动物实验,1月后行活体成像检测,我们发现对照组（无干预的HCC细胞）成瘤数量多,活体成像荧光强度强,而实验组行miR-876过表达后,裸鼠原位肝脏成瘤明显减少,活体检测荧光信号弱,表明在体内实验条件下,miR-876能抑制HCC的成瘤及肿瘤进展。8.POSTN和肝组织EMT及肝硬化相关。我们进一步在127例肝癌组织中检测了POSTN的表达,发现同miR-876类似,POSTN表达和肿瘤数量、肝硬化、肝癌癌栓形成及TNM分期相关,而和其他临床标识物未发现明显相关性,进一步非参数检验验证了肝硬化或肿瘤癌栓组HCC患者的POSTN表达明显增高。IHC实验发现POSTN主要表达与肝癌间质,部分肝癌细胞亦有表达,POSTN高表达的样本N钙粘蛋白及波形蛋白表达增高,而E钙粘蛋白表达降低。而在肝癌伴肝硬化标本中发现POSTN亦有强表达。9.miR-876和POSTN和肝癌患者术后预后相关。进一步KM单因素生存分析发现肿瘤大小（P=0.037）、肝硬化（P=0.041）、肝癌癌栓状态（P=<0.01）、TNM分期（P=0.001）、miR-876低表达（P=0.022）及POSTN高表达（P=0.012）均是影响HCC患者预后的危险因素,多因素回归分析发现肝癌癌栓（风险比=2.530,95%CI区间=1.433-4.468,P=0.001）及POSTN的表达（风险比=1.717,95%CI区间=1.008-2.926,P=0.047）是影响肝癌预后的独立危险因素。进一步共表达分析提示miR-876低表达和POSTN高表达的HCC患者预后较之于miR-876低表达和POSTN高表达更差。四、研究结论综上所述,我们从公开的TCGA数据库中鉴定出了肝癌中一显着性低表达的miRNA,即miR-876。并探索了其对细胞的功能,即能抑制细胞侵袭,EMT和纤维化。而miR-876这些功能是通过调控POSTN的表达实现的。miR-876在体内动物实验下能抑制肝癌的成瘤及进展;我们还在众多肝癌临床标本中从m RNA及蛋白水平证明了miR-876和POSTN的异常表达和肝癌的EMT水平,纤维化水平及进展相关,而miR-876和POSTN的异常表达和HCC的预后相关,而联合miR-876和POSTN检测可能更好预测HCC的预后以及作为潜在的治疗靶点。
赵馨旭[2]（2021）在《Bit1在胃癌中的生物学功能及其影响胃癌进展机制初步探讨》文中研究表明背景:2018年《CA:A Cancer Journal for Clinicians》杂志报道的全球最新癌症数据显示:恶性肿瘤中,胃癌发生率列第5位,病死率列第3位。胃癌易发生远端转移。因此,寻求新的胃癌生物标志物,探究其潜在分子机制,对早期胃癌诊断、改善患者预后有重要意义。失巢凋亡效应分子Bit1在多种肿瘤中表达异常,可发挥抑癌或促癌两种相反的作用。已有研究通过免疫组化法初步显示:Bit1在正常胃组织中低表达,而在胃癌组织、非典型增生组织中表达增强,提示Bit1可能参与胃癌发生发展。但目前为止,尚无Bit1对胃癌细胞生物学功能影响及其在胃癌中具体机制的相关研究。目的:本课题旨在探究Bit1在胃癌组织中的表达及临床意义,首次阐明Bit1在胃癌中的生物学功能,初步探讨Bit1高表达胃癌中Bit1影响胃癌进展的潜在作用机制,为探索以Bit1为靶点的胃癌相关研究提供新思路。方法:1.通过Western blot、WES、RT-q PCR、组织芯片免疫组化法、生物信息学方法明确胃癌组织中Bit1的表达情况与临床意义。2.Western blot实验筛选内源性高表达Bit1的胃癌细胞系BGC-803;通过慢病毒转染BGC-803细胞,干预其内源性Bit1表达;通过细胞划痕、Transwell实验分析不同Bit1表达水平对胃癌细胞侵袭及迁移能力的影响;通过CCK-8细胞增殖实验分析沉默Bit1对胃癌细胞增殖能力的影响;TUNEL实验及流式细胞术分析不同Bit1表达水平对胃癌细胞凋亡的影响;透射电镜观察不同Bit1表达水平对胃癌细胞线粒体形态、结构的影响。阐明Bit1在胃癌细胞中的生物学功能。3.生物信息学分析结果提示,胃癌组织中高表达的Bit1可能与EMT存在一定关联。我们通过Western blot及细胞免疫荧光法检测不同Bit1表达水平对胃癌细胞增殖、凋亡相关分子及EMT标志蛋白表达的影响,探究Bit1是否通过作用EMT影响胃癌进展。4.生物信息学分析结果提示,胃癌组织中高表达的Bit1可能与MMPs及integrinβ1具有一定相关性。通过Western blot验证不同Bit1表达水平对胃癌细胞中MMP-2、MMP-9及integrinβ1表达的影响,提示Bit1高表达胃癌中Bit1可能通过调节MMPs的表达,促进ECM降解进而影响胃癌进程。结果:1.胃癌组织中Bit1表达水平及临床意义通过WES、Western blot、RT-q PCR检测原发性胃癌患者癌组织与对应癌旁组织中Bit1蛋白及m RNA表达水平,结果表明胃癌组织中Bit1蛋白及m RNA表达水平均显着高于其对应癌旁组织;组织芯片免疫组化结果表明Bit1在胃癌组织中表达与胃癌患者肿瘤病理分级、淋巴侵袭密切相关;生物信息学分析结果显示:PTRH2在胃癌中高表达,且PTRH2的表达水平与GC患者肿瘤分期、淋巴结转移、患者性别、幽门螺杆菌感染及TP53突变等具有相关性;STRING数据库分析发现PTRH2可能与CDH1、CDH2、VIM、TJP1、MMP2、MMP9、ITGB1、VEGFC、FIGF、KDR、FLT1、FLT4等基因存在一定关联;通过RStudio软件进行KEGG富集分析发现PTRH2与细胞外基质受体等相关通路呈负相关,与胆固醇代谢等通路呈正相关。2.不同Bit1表达水平对胃癌细胞生物学功能的影响Western blot筛选出Bit1高表达胃癌细胞系BGC-803,通过Bit1 sh RNA慢病毒转染BGC-803,下调其内源性Bit1表达。通过Western blot及细胞免疫荧光实验对慢病毒转染成功的5个靶点进行验证,选择对BGC-803细胞内源性Bit1表达有较好干预效果的靶点Bit1 sh RNA1、Bit1 sh RNA5,用于进一步分析不同Bit1表达水平对胃癌细胞生物学功能的影响。细胞划痕实验结果显示,与WT、Vector组比较,24 h及48 h Bit1 sh RNA1、Bit1 sh RNA5组细胞划痕愈合率均显着降低,表明Bit1下调能抑制胃癌细胞迁移能力（P<0.01）;Transwell实验结果显示,与WT、Vector组比较,Bit1 sh RNA1、Bit1 sh RNA5组小室上表面侵袭至下表面的细胞数量明显减少,即Bit1下调能明显抑制胃癌细胞侵袭能力;CCK-8实验检测72 h内WT、Vector、Bit1 sh RNA1、Bit1 sh RNA5组细胞活力,结果表明,Bit1下调可显着抑制胃癌细胞增殖能力;流式细胞术及TUNEL法检测不同Bit1表达水平对细胞凋亡的影响,下调胃癌细胞中Bit1表达水平可显着增加胃癌细胞晚期凋亡数量及总凋亡率,促进胃癌细胞凋亡;电镜结果显示:Bit1下调可导致胃癌细胞线粒体重度肿胀,嵴扩张、断裂等损伤。3.Bit1下调可抑制EMT进程从而阻碍胃癌进展STRING数据库分析发现PTRH2可能与CDH1、CDH2、VIM、TJP1等编码EMT标志蛋白的基因存在一定关联。Western blot、细胞免疫荧光实验结果表明,沉默Bit1可上调促凋亡蛋白Bax表达,而下调增殖相关蛋白PCNA、Ki67及抗凋亡蛋白Bcl-2表达;下调Bit1表达水平可增强E-cadherin、ZO-1蛋白表达,而抑制Vimentin、N-cadherin蛋白表达,提示沉默Bit1可能通过抑制EMT进程阻碍胃癌进展。4.Bit1可能通过影响整合素及MMPs表达进而抑制胃癌进展Western blot结果表明,沉默Bit1可使MMP-2、MMP-9、integrinβ1表达下调,进而阻碍胃癌进展。结论:1.Bit1在胃癌组织中高表达,Bit1表达水平与胃癌患者病理分级、淋巴侵袭密切相关。2.沉默Bit1可明显促进胃癌细胞凋亡,抑制其迁移、侵袭、增殖能力,并破坏胃癌细胞线粒体形态结构。3.下调Bit1可通过调控增殖、凋亡相关分子及阻碍EMT进程而抑制胃癌进展。4.下调胃癌细胞中Bit1表达水平可抑制MMP-2、MMP-9及integrinβ1表达,提示Bit1高表达胃癌中Bit1可能通过调节MMPs表达,促进ECM降解进而影响胃癌进程。
韩健松[3]（2021）在《Pokemon靶向调控IGFBP3对膀胱癌转移的影响及其作用机制研究》文中提出研究背景在我国,尿路上皮癌（UC）仍是目前最常见的泌尿系统恶性肿瘤。然而,迄今为止,与细胞毒性疗法相比,尚无针对UC靶向药物的临床试验证明可以提高存活率。癌症基因组图谱（TCGA）已在膀胱癌中检测到许多潜在发挥重要作用的基因改变,为在这种疾病中使用小分子抑制剂提供了路线图。此外,在过去的五年中,随着飞速发展的新一代测序技术,深度测序实时定义着肿瘤的分子特征。寻找膀胱癌治疗诊断特异性的靶向基因,成为精准治疗时代亟需解决的问题。研究目的结合体内外实验,在验证Pokemon在膀胱癌中表达情况的基础上阐明其与膀胱癌体内外的肿瘤恶性行为有关。应用“挽救实验”明确Pokemon可以调控靶基因IGFBP3,同时进一步阐明IGFBP3抑制膀胱癌肿瘤恶性生物学功能。应用高通量芯片分析及利用亚硫酸氢盐修饰后基因组测序,揭示Pokemon通过影响IGFBP3表观遗传修饰发挥抑制膀胱癌转移的分子机制,并积极寻找IGFBP3调控的下游通路。进而对积极寻找靶向治疗膀胱癌的新方法提供理论依据和临床数据支撑。研究方法1.确定Pokemon在膀胱癌中高表达以及发挥促癌作用。（1）应用免疫组织化学染色检测临床组织样本中Pokemon的表达情况。（2）应用western blot,荧光定量PCR实验检测膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮永生化细胞中Pokemon mRNA和蛋白表达情况。（3）通过过表达质粒（pcDNA3.1）和小干扰RNA（siRNA）构建过表达/敲低Pokemon细胞。（4）分别做细胞-细胞粘附实验,细胞基质粘附实验,Transwell小室侵袭迁移实验,失巢凋亡实验。分析Pokemon在这些肿瘤转移表型中的作用。最后,通过实时荧光定量PCR,western blot检测相关功能基因,Integrin-β1,MMP-9,BCL-2的mRNA和蛋白表达水平。2.确定IGFBP3在膀胱癌中的表达情况以及发挥抑癌作用。（1）对从临床组织标本进行免疫组织化学染色检测组织中IGFBP3的表达情况。（2）对膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮永生化细胞进行western blot,实时荧光定量PCR实验检测IGFBP3在细胞中表达情况。（3）通过过表达质粒（pcDNA3.1）和小干扰RNA（siRNA）构建过表达/敲低IGFBP3细胞。（4）分析IGFBP3在上述肿瘤转移表型中的作用。通过实时荧光定量PCR,western blot检测相关功能基因的mRNA和蛋白表达水平。3.证明Pokemon是通过靶向调控IGFBP3影响膀胱癌的转移。设计挽救实验,同时敲低Pokemon和IGFBP3,判断相比于单独敲低Pokemon时肿瘤转移表型以及相关功能蛋白表达有无回复,判断Pokemon是否通过靶向作用IGFBP3影响肿瘤转移。4.验证Pokemon调控IGFBP3的表观遗传学机制,寻找IGFBP3下游信号通路。（1）在膀胱癌细胞中转染siPokemon和FAM无义序列,进行亚硫酸氢盐修饰后基因组测序。根据测序结果,分析IGFBP3的启动子区域发生甲基化的具体CpG位点,绘制甲基化图谱。分析阴性对照组和敲除Pokemon组的IGFBP3启动子甲基化程度高低。（2）在膀胱癌细胞中转染pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1IGFBP3,培养24h后,收集细胞,进行转录组测序。通过统计学分析列出所有在过表达IGFBP3后有统计学差异的上调/下调基因,绘制热图。并通过分析,筛选膀胱癌转移相关的信号通路。确定信号通路后,通过实时荧光定量PCR和western blot,对该信号通路进行验证。5.动物模型的建立进行体内实验。将稳定敲除/过表达Pokemon和IGFBP3的T24细胞进行裸鼠尾静脉注射,建立裸鼠膀胱癌尾静脉转移模型,8周后处死小鼠,开腹检查膀胱肿瘤转移情况,肉眼计数肺部转移灶的数目。并对组织切片做HE染色判断肿瘤转移情况。研究结果1.Pokemon在膀胱癌组织和旁组织中的高表达率有显着差异,癌组织高表达率67.3%,癌旁组织高表达率26.9%;膀胱癌细胞系中Pokemon的mRNA和蛋白表达量都高于正常膀胱上皮永生化细胞;临床标本信息分析表明,Pokemon表达高低与膀胱癌的肿瘤分期以及是否发生远处转移有明显相关性,而与年龄,性别,肿瘤大小的相关性没有统计学意义。2.Pokemon可以促进膀胱癌细胞体外侵袭,迁移,细胞基质粘附;Pokemon可以抑制细胞-细胞粘附和失巢凋亡;Pokemon可以促进MMP-9,Integrin-β1,BCL-2的转录表达。3.IGFBP3在膀胱癌组织和癌旁正常组织中的低表达率有显着差异,癌组织低表达率63.5%,癌旁组织低表达率38.5%;膀胱癌细胞系中IGFBP3的mRNA和蛋白表达量都低于正常膀胱上皮永生化细胞;临床标本信息分析表明,IGFBP3表达高低与膀胱癌是否发生远处转移有明显相关性,而与年龄,性别,肿瘤大小,肿瘤分期的相关性没有统计学意义。4.IGFBP3可以抑制膀胱癌细胞体外侵袭,迁移,细胞基质粘附;IGFBP3可以促进细胞-细胞粘附和失巢凋亡;IGFBP3可以抑制MMP-9,Integrin-β1,BCL-2的转录表达;IGFBP3可以抑制VASP和Paxillin的共定位表达,这代表了IGFBP3对黏着斑形成的抑制作用。5.Pokemon可以通过调控IGFBP3的转录表达,促进膀胱癌的侵袭迁移,细胞-基质黏附。抑制膀胱癌的细胞-细胞粘附,抑制膀胱癌细胞失巢凋亡。Pokemon可以通过调控IGFBP3的转录表达促进MMP-9,Integrin-β1,BCL-2的转录表达。6.T24细胞中敲低Pokemon的siPokemon组与阴性对照组相比,16个位点的甲基化比例下降,2个位点甲基化比例上升。J82细胞的siPokemon组与阴性对照组相比10个位点的甲基化比例下降,3个位点的甲基化比例上升。38个位点总的甲基化位点占比显示与对照组相比,siPokemon组的T24和J82细胞中IGFBP3启动子甲基化位点百分比降低,证明当Pokemon表达减少时,会使IGFBP3启动子去甲基化从而恢复IGFBP3的转录表达。7.真核有参转录组测序发现IGFBP3的过表达可以引起RIG-1的表达量增高,p<0.05。对信号通路的验证实验结果表明:敲低Pokemon或过表达IGFBP3后,RIG-1的mRNA和蛋白表达水平均升高,而过表达Pokemon或敲低IGFBP3后,RIG-1的mRNA和蛋白表达水平均降低。“挽救”实验结果表明,共转染siPokemon和si IGFBP3时,RIG-1的转录表达水平相比于单独敲低Pokemon时显着降低。8.在体内动物模型实验中,阴性对照组小鼠肺部发现大量转移性肿瘤结节。而敲低Pokemon的小鼠和过表达IGFBP3的小鼠和对照组相比,小鼠肺部转移性结节数量明显减少,尺寸明显变小,HE染色结果表现与大体组织表现一致。证明了敲低Pokemon和过表达IGFBP3组裸鼠表现出相似的转移抑制特性。结论Pokemon可以通过促进IGFBP3启动子甲基化抑制IGFBP3的转录表达,进而促进膀胱癌的转移。而且膀胱癌中Pokemon-IGFBP3可以调控下游RIG-1信号通路。
王冬海[4]（2021）在《S100A14、LOXL2在高侵袭性甲状腺乳头状癌转移中的作用研究》文中研究指明甲状腺乳头状癌是甲状腺最常见的恶性肿瘤,常发生局部淋巴结转移,但远处转移相对少见,通过手术治疗,多数患者预后良好;前期研究证实,高侵袭性甲状腺乳头状癌有更高的淋巴结转移率,甚至存在远处转移可能,预后较差。S100钙结合蛋白A14（S100A14）、赖氨酰氧化酶样2（LOXL2）在肠癌、胆管癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌等器官肿瘤均有研究报道,已证实妇产科肿瘤和消化道肿瘤的增殖、侵袭和转移中发挥一定的作用,但二者在甲状腺组织方面的研究鲜有报道,有待进一步探讨。收集空军特色医学中心病理科近6年753例甲状腺乳头状癌的临床资料与病理切片,根据2017版WHO（World Health Organization）内分泌器官肿瘤分类的标准,甲状腺乳头状癌共分为15个病理亚型,其中高侵袭性亚型包括高细胞亚型、柱状细胞亚型、实体/梁状亚型、鞋钉样亚型、弥漫硬化型;对753例组织切片重新阅片、判读,并分析各亚型临床病理特征,同时随机筛选出具有高侵袭性病理亚型30例,经典型30例,再随机纳入同期30例结节性甲状腺肿（Nodular Goiter,NG）,共90例甲状腺病变组织制成组织芯片,用免疫组化方法分别检测S100A14与LOXL2蛋白在30例结节性甲状腺肿（NG组）、30例经典型甲状腺乳头状癌（经典型组）及30例高侵袭性甲状腺乳头状癌（高侵袭组）的表达情况,同时对其中51例中进行q RT-PCR S100A14与LOXL2 m RNA相对含量表达检测,探讨S100A14与LOXL2表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系。结果显示,753例患者中男女比例为1:2.49,年龄范围为17～75岁（平均年龄为44.26岁）,性别在各年龄段分布有显着差异,包括562例经典型、89例滤泡亚型、23例高细胞亚型、22例实体/梁状亚型、20例柱状细胞亚型、10例包裹型、8例透明细胞亚型、7例鞋钉样亚型、5例嗜酸细胞亚型、4例Warthin瘤样亚型、3例弥漫硬化型。柱状细胞亚型、高细胞亚型、实体/梁状亚型、鞋钉样亚型甲状腺外侵犯发生率均高于经典型,差异具有统计学意义;而伴有鞋钉成分、高柱状细胞成分的乳头状癌淋巴结转移率均高于单纯经典型乳头状癌（P<0.05）。S100A14与LOXL2蛋白在甲状腺乳头状癌组织中普遍高表达,且在结节性甲状腺肿、经典型、高侵袭性甲状腺乳头状癌组织中的表达呈逐步递增趋势,在经典型组与高侵袭组阳性表达率有显着差异（P<0.05）;S100A14与LOXL2在60例甲状腺乳头状癌中的表达呈正相关（r=0.332）。LOXL2 m RNA在三组甲状腺病变组织中的表达量呈缓慢上升趋势,三组之间两两比较,高侵袭组的相对表达量大于结节性甲状腺肿组（P<0.05）,其他各组之间比较差异无统计学意义。S100A14 m RNA在各组之间的上升趋势不明显,三组之间两两比较,高侵袭组m RNA的相对表达量明显高于其他两组（P<0.05）,且在高侵袭组有淋巴结转移的m RNA相对表达量高于经典型组（P<0.05）。柱状细胞亚型、鞋钉样亚型、弥漫硬化型、高细胞亚型、实体/梁状亚型是具有高侵袭行为的5种病理亚型,与经典型相比,具有较高的甲状腺外侵犯和淋巴结转移率;S100A14与LOXL2高表达可能与甲状腺乳头状癌不良生物学行为、侵袭性有关,同时S100A14可能促进了淋巴结转移。通过该项研究提示S100A14、LOXL2可能成为甲状腺乳头状癌侵袭性、转移性的标记物,并有望为高侵袭性甲状腺乳头状癌靶向治疗研究提供理论依据。
李文会[5]（2021）在《基于GEO和TCGA数据库构建胃癌预后风险模型及CTNNAL1基因表达与胃癌临床病理因素及预后的关系》文中研究指明前言:胃癌是威胁人类健康的重要疾病之一,根据国际癌症机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）的研究结果,2020年全球新发病例约108万,占全球所有恶性肿瘤的5.6%,胃癌死亡病例在全世界大约76.9万（占7.7%）。随着对胃癌的认识不断加深、癌症筛查的实施、诊断和治疗方案的不断改进,胃癌的发病率和死亡率在世界范围内已有下降趋势。但是,随着人口的增长及老龄化,胃癌的疾病负担依然严重。尽管手术、化疗、靶向治疗、免疫治疗等方法的应用,进展期胃癌患者的预后仍较差。因此寻找影响胃癌预后的关键基因及治疗靶点尤为重要。随着基因组学技术的发展,大量的肿瘤相关生物数据的出现,肿瘤生物信息学可以通过对癌症基因表达谱进行分析,对癌症发病机制进行分析。通过鉴定肿瘤生物标志物与肿瘤预后的关系,使得寻找可以作为癌症诊断、预测、预后及治疗的分子标志物变为可能,而且意义尤为重要。然而癌症作为一个多基因参与的复杂疾病,单个基因纵然可以作为潜在的预后标志物,但具有一定的局限性。基于对癌症多组学大数据的分析,利用有效的生物信息学分析方法可以发现多个基因组合的预后模型,这些模型可以应用于癌症病人的诊断、预后评估和治疗效果评价等方面。目的:应用生物信息学方法分析TCGA和GSE62254数据集,基于预后相关基因构建胃癌预后风险模型,分析预后风险模型与临床病理因素的关系,并针对预后风险模型中的基因CTNNAL1的表达特征与临床病理因素的关系和预后进行深入分析。研究方法:1、采用生物信息学方法分析TCGA中胃癌数据集和GSE62254数据集,发现了其共同的预后相关基因,利用R语言cluster Profiler包对预后相关基因进行功能富集分析。基于Lasso（the least absolute shrinkage and selection operator）-Cox算法,构建包含六个基因的预后风险模型。利用时间依赖的受试者工作特征曲线（time-dependent receiver operating characteristic curve,t ROC）评估预后风险模型。分析预后风险模型与临床病理因素的关系,基于多因素风险回归分析,构建包含预后风险模型和多个临床病理因素的诺模图（nomogram）。2、在TCGA数据库中下载33个肿瘤类型基因表达谱数据,分析CTNNAL1m RNA的表达与肿瘤患者预后的关系;分析TCGA数据库中的胃癌表达数据集及临床病理因素,根据CTNNAL1m RNA表达量的中位值将患者分为两组,通过卡方检验,比较高表达组与正常对照组织之间CTNNAL1表达水平的差异,分析各临床病理因素分组之间CTNNAL1m RNA的表达差异。利用R语言survminer包确定GSE62254胃癌数据集中CTNNAL1m RNA表达与患者预后的最佳cutoff值。然后将GSE62254中的300例胃癌患者根据最佳cutoff值分成CTNNAL1m RNA高表达和低表达两组。利用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,log-rank检验比较两组之间的生存率;利用人类蛋白图谱HPA（the Human Protein Atlas）数据库分析CTNNAL1基因在人体各正常组织中的表达水平,利用单细胞测序数据分析CTNNAL1基因在细胞水平的表达特征;进一步在GSE134520（胃单细胞测序数据集）中分析CTNNAL1在胃组织中不同种类细胞中的表达;分析CTNNAL1基因的表达与间质细胞数量的相关性;通过基因集富集分析（GSEA,Gene set enrichment analysis）和蛋白蛋白相互作用（PPI,protein-protein interaction）网络预测CTNNAL1相关功能。3、免疫组化检测209例胃癌及其非癌胃粘膜组织中CTNNAL1蛋白的表达及178例胃癌组织中E-cadherin蛋白的表达,分析其与临床病理因素的关系和意义以及两者的相关性,蛋白表达与临床病理因素的关系采用卡方检验和kendall tau-b等级相关进行分析。结果:1、通过单因素Cox分析,TCGA胃癌数据集中与胃癌预后相关的基因共有1561个（P<0.05）,其中风险比（Hazard ratio,HR）>1的基因共1137个,HR<1的基因有424个。GSE62254数据集中与胃癌预后相关的基因共有5949个（P<0.05）,其中HR>1的基因有2913个,HR<1的有3036个。两个数据的预后相关基因共同的不良预后基因457个,良好的预后因素171个。不良预后因素KEGG信号通路明显富集在PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、黏着斑、Ras信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路、基底膜-受体相互作用等生物学通路。2、将TCGA和GSE62254中分析所得的共有预后相关基因代入Lasso-Cox回归模型,成功构建包含六个基因的预后风险模型,这六个基因分别是富脯氨酸蛋白15样（PRR15L,proline rich 15 like）、SP6转录因子（SP6,Sp6 transcription factor）、包含C2结构域蛋白8（CPNE8,copine 8）、神经菌毛素1（NRP1,neuropilin 1）、血小板源性生长因子样受体（PDGFRL,platelet derived growth factor receptor like）和α连环蛋白样1（CTNNAL1,catenin alpha like 1）。生存分析结果表明,风险评分高的胃癌患者生存率显着低于低风险组的患者。该模型预测的5年生存率AUC为0.754,结果表明该模型具有较好的预后评判价值。并在GEO数据库中验证了基于6个基因构建的预后风险模型具有一定的预后评判价值。3、根据胃癌预后风险模型评分分组,高风险组组织学分级更高,弥漫型胃癌中风险评分高于肠型胃癌Lauren分型,随着TNM分期的增加,高风险组的比例上升。4、将胃癌预后风险模型评分和临床病理因素（年龄、性别、组织学分级、lauren分型、T分期、N分期、M分期、MSI状态和是否进行放射治疗）纳入多因素Cox风险比例回归分析,建立了定量的诺模图用于预测胃癌患者的个体化生存时间。5、通过单因素Cox分析CTNNAL1m RNA表达与不同肿瘤类型的预后关系,发现CTNNAL1不仅在胃癌中与不良预后相关,在肾乳头状癌和低级别胶质瘤等也与肿瘤患者的不良预后有关。而在弥漫大B淋巴瘤和胸腺瘤等中,则与预后较好相关。6、HPA数据库显示CTNNAL1在人正常的肾上腺、卵巢、甲状腺、睾丸、肺脏、心肌中表达量较高。CTNNAL1基因在单细胞水平上,具有较低的细胞特异性,其中在滋养层细胞中表达量最高。内皮细胞和间质细胞中CTNNAL1的表达次之。胃单细胞测序数据集GSE134520的分析结果显示,CTNNAL1在多种细胞中存在表达,其中在内皮细胞和肿瘤细胞中表达较高。CTNNAL1基因表达与间质评分、肿瘤相关成纤维细胞数量和内皮细胞数量成正比。7、TCGA数据库中CTNNAL1 m RNA表达,在Lauren分型中,弥漫型胃癌的高表达率明显高于肠型胃癌（P=0.014）。组织学分级G3组中CTNNAL1 m RNA的高表达率高于G2组和G1组（P=0.023）,CTNNAL1m RNA表达在间质表型胃癌高于上皮表型（P<0.001）。GSE62254中CTNNAL1 m RNA高表达组胃癌患者生存率低于CTNNAL1m RNA低表达组（P<0.001）,CTNNAL1在弥漫型胃癌中的表达率明显高于肠型胃癌（P=0.010）。亚洲癌症研究组织（ACRG,Asian Cancer Research Group）胃癌分子分型中,MSS/EMT亚型CTNNAL1的m RNA表达高于其他亚型（P<0.001）。GSEA分析显示CTNNAL1基因与EPITHELIAL＿MESENCHYMAL＿TRANSITION（上皮间质转化）、MYOGENESIS（肌细胞生成）和TGF＿BETA＿SIGNALING（转化生长因子-β）信号通路相关。PPI网络分析显示CTNNAL1基因与细胞黏附、黏着连接等功能相关。8、免疫组织化学染色结果显示,胃癌组织中CTNNAL1蛋白高表达率显着高于非癌胃粘膜组织。CTNNAL1蛋白表达与胃癌组织学分级成弱等级相关（r=0.146,P=0.026）。Lauren分型中,弥漫型胃癌中CTNNAL1的表达显着高于肠型胃癌（P=0.008）。E-cadherin的缺失率在组织学分级G3组高于G1组和G2组,且与组织学分级呈弱等级相关（P<0.001,r=0.327）。Lauren分型中,弥漫型胃癌中E-cadherin的缺失率显着高于肠型胃癌（P<0.001）。但是,161例胃癌组织中CTNNAL1表达与E-cadherin表达未见明显相关性（P>0.05）。结论:1、本研究基于TCGA胃癌数据集和GSE62254数据集,得到了共同的预后不良相关基因457个,良好的预后基因171个。其中不良预后基因显着富集在PI3K-Akt信号传导通路、细胞外基质黏附等与癌症发生发展密切相关的通路。采用Lasoo-Cox回归模型,利用TCGA胃癌数据集,基于筛选得到的预后相关基因,构建了基于六个基因的胃癌预后风险模型。通过在多个GEO数据集的验证,证实该模型中的基因具有良好的预后预测价值。利用TCGA胃癌数据集中的临床病理资料和预后风险模型,构建了预测胃癌患者预后的诺模图。2、CTNNAL1基因与多种肿瘤的预后密切相关,有可能成为肿瘤预后评估的因子;CTNNAL1基因在多种组织中普遍表达,在单细胞层面,CTNNAL1基因在成间质细胞/成纤维细胞和内皮细胞表达较高。CTNNAL1在间质细胞/成纤维细胞和内皮细胞中的较高表达与胃癌不良预后相关,可能提示肿瘤微环境中成纤维细胞和/或内皮细胞的增多导致胃癌不良预后。3、胃癌组织中CTNNAL1的蛋白表达显着高于非癌胃粘膜组织;CTNNAL1在不同组织学类型的胃癌组织中表达具有异质性,CTNNAL1高表达与弥漫型胃癌和组织学分级相关。
贾媛媛[6]（2021）在《POSTN对肾细胞癌生物学行为的影响和机制研究》文中研究指明肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）简称肾癌,起源于肾实质泌尿小管上皮系统,具有高度异质性,是肾脏肿瘤中最常见的类型,已经成为威胁人类健康的重要卫生问题。肾细胞癌起病隐匿,患者确诊时常合并远处转移,且对化放疗不敏感,导致患者预后不良。因此积极探索肾细胞癌发生发展机制,寻找早期诊断标志物,对提高患者生存期显得尤为重要。骨膜蛋白（periostin,POSTN）首次于小鼠成骨细胞系中发现,在胚胎发育中促进成骨在骨膜的聚集分化,后续研究发现POSTN在多种恶性肿瘤中高度表达,参与肿瘤的发生发展,并与复发转移密切相关。POSTN能够诱导肿瘤血管生成,促进肿瘤细胞侵袭和转移;高水平的POSTN与肿瘤分化不良、微血管浸润和淋巴结转移密切相关,但其在肾细胞癌中的作用尚未见报道,同时其调控肾细胞癌发生发展的机制尚未证实。上皮间质转化（epithelial mesenchymaltransition,EMT）是上皮细胞表型转化的生理过程,是肾癌细胞发生转移侵袭的重要因素。据报道,POSTN调控恶性肿瘤侵袭转移与其促进EMT进程相关。POSTN作为分泌型基质蛋白,通过结合细胞表面整合素αVβ3激活整合素连接酶（integrin linked kinase,ILK）,而ILK下游的Akt/m TOR信号通路是激活EMT的关键信号介质。基于现有研究背景提出以下问题:POSTN在肾细胞癌及癌旁组织中是否存在差异性表达?POSTN在肾细胞癌中的生物学功能有哪些?POSTN在肾细胞癌发生发展的机制中所起的作用有哪些?是否与ILK/Akt/m TOR信号通路的激活相关?为了阐明上述问题的答案,本研究以肾细胞癌为基础模型,POSTN蛋白为核心,从临床标本、体内外细胞水平探究POSTN在肾细胞癌中的确切功能及其临床价值。研究方法:本研究采用qRT-PCR和免疫印迹检测肾细胞癌患者组织标本中POSTN m RNA及蛋白的表达水平;采用si RNA和慢病毒过表达质粒分别构建POSTN沉默、过表达的肾癌细胞模型;采用细胞免疫荧光观察POSTN在肾癌细胞中的表达和分布;采用qRT-PCR、western blot和细胞免疫荧光验证转染效率;采用CCK-8、集落形成、划痕实验、Transwell和流式细胞术检测POSTN对肾癌细胞生物学行为的影响;采用western blot检测EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表达趋势,以及ILK/Akt/m TOR信号通路相关蛋白的表达水平;采用裸鼠异种移植瘤模型检测肾癌细胞在体内的增殖能力,记录肿瘤组织的体积和重量,实验结束后分离肿瘤组织进行免疫组化和western blot检测POSTN和ILK/Akt/m TOR通路相关蛋白的表达趋势,在体验证POSTN对肾细胞癌增殖的调控作用及分子机制。研究结果:1.在37例肾细胞癌患者的肿瘤组织及癌旁组织中,qRT-PCR检测结果显示,与癌旁组织相比,肾癌组织中POSTN m RNA的表达水平显着上调（P<0.01）。western blot检测进一步证实,肾癌组织中POSTN蛋白表达水平显着升高;POSTN表达水平与肾细胞癌患者TNM分期、淋巴结及血管浸润相关（P<0.05）。免疫组化结果观察到POSTN在肾癌组织中高表达,大部分定位于肿瘤细胞的细胞质和肿瘤间质中。2.转染效率验证结果显示,si RNA-POSTN转染后,A498细胞和ACHN细胞中POSTN m RNA和蛋白表达量均显着下降,与阴性对照组存在显着差异（P<0.001）;转染LV-POSTN后,A498细胞和ACHN细胞中POSTN m RNA和蛋白表达量均显着上调,与阴性对照组存在显着差异（P<0.001）;3.在前述细胞模型的基础上,CCK-8和集落形成实验结果显示,沉默POSTN后,A498细胞和ACHN细胞增殖能力减弱;而POSTN过表达后,A498细胞和ACHN细胞增殖能力显着增强,与相应的阴性对照组相比,具有显着差异（P<0.01）;4.划痕实验结果表明,POSTN表达下调后,ACHN细胞和A498细胞迁移能力受到显着抑制;反之POSTN表达增强后,ACHN细胞和A498细胞迁移能力得到显着增强,与阴性对照组相比具有显着差异（P<0.001）;Transwell实验结果表明,POSTN表达下调后,ACHN细胞和A498细胞的侵袭能力受到显着抑制;反之POSTN表达增强后,ACHN细胞和A498细胞侵袭能力得到显着增强,与阴性对照组相比具有显着差异（P<0.001）;5.流式细胞术结果显示,沉默POSTN显着增加了ACHN细胞和A498细胞的凋亡比例,而在POSTN过表达后ACHN细胞和A498细胞的凋亡比例降低;6.POSTN沉默后,ACHN细胞和A498细胞中E-cadherin的表达量明显增加,N-cadherin和Vimentin的表达量显着降低;而在过表达POSTN后,肾细胞癌细胞中E-cadherin表达量减少;N-cadherin和vimentin表达水平上调;7.POSTN沉默后,抑制了ACHN细胞和A498细胞中ILK/Akt/m TOR通路激活,p-Akt和p-m TOR的表达水平下降;而POSTN过表达的ACHN细胞和A498细胞中ILK/Akt/m TOR通路显着激活,ILK、p-Akt和p-m TOR的表达水平上调;8.在裸鼠移植瘤模型中进一步证实,POSTN沉默后A498细胞和ACHN细胞成瘤能力受抑,肿瘤体积和重量显着低于对照组;相反,过表达POSTN可提高A498细胞和ACHN细胞的体内成瘤能力,肿瘤体积和重量显着高于对照组;9.体内研究证实,POSTN沉默后,抑制了A498细胞和ACHN细胞中ILK/Akt/m TOR通路的激活,ILK、p-Akt和p-m TOR表达水平下调;而POSTN过表达的ACHN细胞和A498细胞中ILK/Akt/m TOR通路显着激活,ILK、p-Akt、p-m TOR表达水平升高。结论:1.POSTN在肾癌组织中高表达,POSTN表达水平与肾细胞癌患者TNM分期、淋巴结及血管浸润相关;2.POSTN高表达能够促进肾癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,并抑制细胞凋亡;3.POSTN高表达激活ILK/Akt信号通路,促进肾癌细胞增殖。综上研究结果证实,POSTN高表达与肾细胞癌发生发展密切相关,并明确了POSTN作为生物标志物和干预靶点的潜在价值。
黄蕾[7]（2021）在《莱菔硫烷对膀胱癌细胞转移的影响及靶向能量代谢重排的机制研究》文中研究指明通过重新编排能量代谢模式来满足肿瘤细胞快速增殖和转移所需的能量（ATP）,已被认为是癌症的新特征之一。膀胱癌（Bladder Cancer,BC）是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,侵袭和转移是膀胱癌致死的首要原因,在此过程中膀胱癌细胞的能量代谢呈现何种特征,目前尚不清楚。莱菔硫烷（Sulforaphane,SFN）存在于多种十字花科蔬菜中,是迄今研究最广泛的一种有抗癌活性的异硫氰酸酯。课题组前期研究结果表明,SFN对膀胱癌细胞转移的抑制作用较强,该作用是否与能量代谢调控有关尚不清楚。本文在分析了膀胱癌患者能量代谢特征的基础上,通过离体细胞和整体动物实验,系统研究了SFN对膀胱癌细胞葡萄糖代谢的调控作用及能量代谢调控机制。主要结果如下:收集不同病理分期膀胱癌患者的肿瘤及癌旁组织,通过GC-MS检测了糖酵解、三羧酸循环及磷酸戊糖途径中关键代谢产物的含量变化。肿瘤组织中ATP及多种代谢产物均高表达,表明膀胱癌患者体内葡萄糖代谢异常活跃。随后,针对异常表达的代谢物进行代谢通路富集分析。得到81个富集的代谢信号通路,其中富集程度最高的是“瓦博格效应”。采用q PCR检测多种葡萄糖代谢酶的m RNA水平发现,膀胱肿瘤组织中PFK-1,LDHA及PDH的基因表达异常升高（P<0.05）。血清酶活检测发现患者体内关键限速酶HK2,LDHA,PDH和PKM2的活性均异常升高。随后,针对酶活与TNM分期的相关性分析发现,PKM2与肿瘤TNM分期呈正相关（r=0.4538,P=0.0103）;而PDH呈负相关（r=-0.3742,P=0.0381）。随后,以膀胱癌UMUC3（病理1级）和T24细胞（病理3级）为体外研究模型,从糖酵解和线粒体氧化磷酸化角度,研究SFN的调控机制。SFN可通过抑制膀胱癌细胞糖酵解和线粒体呼吸作用强烈下调胞内ATP水平。SFN显着抑制浸润性膀胱癌UMUC3和T24细胞内HK2,PDH和LDHA的蛋白表达;且对HK2的抑制效果在UMUC3细胞中最强,这表明SFN对低级别的膀胱癌细胞糖酵解抑制效果更明显。瞬时转染pEGFP n1-AKT1质粒可强烈逆转SFN对T24细胞中HK2蛋白表达的抑制,提示SFN对膀胱癌细胞中HK2的调控是通过AKT1起作用的。此外,SFN还可通过减少T24细胞线粒体数量,并抑制线粒体复合物I,II,III和V的活性来调控膀胱癌细胞线粒体有氧氧化。q PCR检测发现,SFN可通过抑制SREBP1的m RNA水平而强烈下调关键代谢酶ACC和FASN的基因表达,进而有效调控膀胱癌细胞脂肪酸合成代谢。在BBN诱导的小鼠膀胱癌模型中,证实SFN可通过调控膀胱癌小鼠肿瘤组织中AKT1的表达来进一步抑制HK2;且对关键代谢酶LDHA,PDH及PKM2的蛋白水平也有强烈的抑制作用。在明确SFN可主要通过调整膀胱癌细胞AKT1-HK2轴及线粒体复合物活性来抑制葡萄糖代谢供能的基础上,进一步关注SFN对细胞转移的关键部位-伪足的调控机制。采用划痕试验及Transwell分别检测细胞迁移及侵袭能力发现,SFN明显抑制膀胱癌细胞的体外转移及侵袭。通过透射电镜和扫描电镜观察发现,SFN可使细胞表面绒毛脱落,严重破坏膀胱癌细胞形态。采用鬼笔环肽标记细胞伪足主要组成成分F-actin,基于激光共聚焦显微镜观察细胞骨架形态变化。当AKT1过表达后,SFN对伪足形成调控因子Arp2的抑制大大削弱,且对细胞伪足的破坏作用消失,表明SFN可通过AKT1调控细胞代谢供能,抑制Arp2表达,阻断膀胱癌细胞伪足形成。AKT1过表达还可大幅度逆转SFN对T24细胞侵袭及转移的抑制作用。此外,SFN显着抑制cortactin和p-cortactin的蛋白表达,揭示调控cortactin的活化和表达是SFN破坏膀胱癌细胞伪足形成的另一主要方式。最后,在裸鼠体内通过尾静脉注射方式造膀胱癌细胞肺转移模型,证实SFN可下调膀胱癌小鼠体内cortactin及Arp2的基因表达;延缓并抑制膀胱肿瘤在肺部的形成及转移。
龚志勇[8]（2021）在《结直肠癌组织中COL1A1、miR-143的表达水平和临床意义以及两者的相关性》文中进行了进一步梳理目的:探讨COL1A1和miR-143在结直肠癌中的表达水平和临床意义以及两者的相关性。方法:1.收集80例结直肠癌组织蜡块,用IHC检测COL1A1蛋白的表达情况,并与相关参数进行分析。2.收集50例结直肠癌患者的新鲜标本,用qRT-PCR检测COL1A1mRNA和miR-143的相对表达量,分别与相关参数进行分析。3.统计学分析COL1A1mRNA和miR-143表达的相关性。结果:1.在结直肠癌组织中,COL1A1蛋白的表达高于癌旁（P<0.001）,并与肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关（P值<0.05）;与患者年龄、性别以及肿瘤位置无关（P>0.05）。2.在结直肠癌组织中,COL1A1mRNA的表达高于癌旁（P<0.001）,miR-143的表达低于癌旁（P<0.001）;COL1A1mRNA、miR-143的表达水平均与肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关（P值<0.05）,而与患者年龄、性别以及肿瘤位置无关（P>0.05）。3.COL1A1mRNA和miR-143的相对表达量呈显着负相关（r=-0.833,P<0.001）。结论:1.在结直肠癌组织中,COL1A1的表达升高,miR-143的表达降低,两者都与肿瘤的直径、分化程度、淋巴结转移和TNM分期相关。2.在结直肠癌组织中,miR-143与COL1A1mRNA的表达呈负相关。
赵巧云[9]（2021）在《PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究》文中认为研究背景与目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,预后较差。胃癌的发生发展经过了一系列漫长的演变过程,其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染是该演变过程中最重要的始动因子。H.pylori通过多种毒力因子如Cag A、Oip A、Vac A等调控胃上皮细胞生物学行为的改变,但其致病机制目前尚不明确。我们前期利用H.pylori 7.13和CCS9803两种野生菌株分别感染胃上皮细胞GES-1,构建体外细菌细胞共培养模型,并进行细胞转录组学测序分析和实验验证,发现H.pylori感染可上调胃上皮细胞GES-1的前列腺跨膜蛋白雄激素诱导基因1（prostate transmembrane protein androgen inducible gene 1,PMEPA1）的m RNA和蛋白的表达,提示了PMEPA1可能参与H.pylori感染相关的胃黏膜病变过程。PMEPA1是于2000年在前列腺组织中被发现的一种新型雄激素诱导基因,主要在细胞膜和亚细胞器如溶酶体、高尔基体等的亚细胞器膜上表达。已知PMEPA1基因是一种TGF-β诱导基因,负性调控TGF-β信号通路。研究发现,PMEPA1在多种肿瘤中高表达,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程。然而,PMEPA1在胃癌中的研究尚不明确,且PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜改变过程中的作用也未见报道。因此本文通过生物信息学、PMEPA1基因干预、细胞转录组学等多种方法研究了PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜病变过程中的作用及机制,为进一步挖掘H.pylori感染致病的新的分子机制及为H.pylori相关胃癌的靶向调控提供新的理论依据。材料方法:（一）PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中的表达分析:（1）利用Oncomine数据库、GEO数据库、TCGA数据库的胃癌测序数据,分析PMEPA1在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达及PMEPA1在不同劳伦分型胃癌中的表达;（2）从南昌大学第一附属医院手术室收集18对胃癌及癌旁组织标本,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）及蛋白质印迹（western blot,WB）的方法检测了PMEPA1在胃癌及癌旁组织的表达。2.PMEPA1表达与胃癌患者的预后分析:利用Kaplan-Meier Plotter在线分析数据库,评价PMEPA1与胃癌患者的总体生存期（over survival,OS）,无进展生存期（progression-free survival,FP）和进展后生存期（post-progression survival,PPS）的关系,明确PMEPA1的表达与胃癌患者预后的关系。3.PMEPA1在胃癌的诊断价值:利用p ROC包对TCGA数据库中的375例胃癌和32例正常胃黏膜组织测序样本进行受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析,并计算曲线下面积（Areas under the curve,AUC）,评估PMEPA1在胃癌的诊断价值。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）根据PMEPA1的中位表达值,将TCGA数据库的375个胃癌样本分为PMEPA1高表达组和低表达组,利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析两个差异基因集富集的生物学过程;（2）用R语言对TCGA数据库中与PMEPA1基因相关的基因进行批量计算,并对相关基因进行KEGG信号通路富集。（二）H.pylori感染及其毒力因子对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.H.pylori及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）构建H.pylori 7.13和PMSS1的oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）,并制备抗Oip A抗原的抗体,在基因和蛋白水平对oip A基因的敲除效果进行验证;（2）将H.pylori PMSS1野生菌株以不同感染复数（MOI）与胃上皮细胞GES-1共培养不同时间（1h,3h,6h,12h,24h）,检测PMEPA1蛋白表达水平,并检测感染6h时PMEPA1的m RNA表达水平;（3）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）分别以不同MOI感染AGS细胞6h,检测PMEPA1蛋白的表达水平;（4）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）、cag A基因敲除菌株（Hp7.13Δcag A和Hp PMSS1Δcag A）及oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）分别与胃上皮细胞GES-1细胞和AGS细胞共培养6h,检测PMEPA1的蛋白和m RNA表达水平。2.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:从南昌大学第一附属医院病理科收集H.pylori感染的不同胃黏膜病理阶段的内镜标本石蜡切片,通过免疫组化法检测PMEPA1的表达。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1过表达及敲减稳转细胞株的构建:分别构建过表达PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1highGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1highGES-1)、敲减PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1lowGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1lowGES-1)、过表达PMEPA1的BGC-823细胞(PMEPA1highBGC-823)及对照细胞(NC-PMEPA1highBGC-823)。2.PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响及机制:（1）通过平板克隆形成实验、实时无标记细胞分析（Real Time Cellular Analysis,RTCA）技术、CCK8法检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞增殖的影响;（2）通过transwell侵袭和迁移实验、划痕修复实验检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞侵袭和迁移的影响;（3）通过生物信息学分析TCGA数据库胃癌数据集中PMEPA1与EMT转录因子的相关性;（4）Western Blot检测EMT相关分子的蛋白表达水平。3.PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响:（1）H.pylori PMSS1的野生菌株、cag A及oip A敲除菌株感染PMEPA1highBGC-823细胞及其对照细胞,RTCA技术、transwell侵袭和迁移实验检测PMEPA1过表达对H.pylori感染的胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;（2）H.pylori 7.13野生型菌株感染PMEPA1lowGES-1及其对照细胞NC-PMEPA1lowGES-1,transwell实验检测PMEPA1敲减对H.pylori感染的胃上皮细胞的侵袭和迁移能力的影响。（四）转录组学分析PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学功能的影响1.转录组学样品准备:将Hp7.13wt和Hp PMSS1wt分别感染PMEPA1lowGES-1及NC-PMEPA1lowGES-1细胞（MOI=100）,将Hp7.13wt、Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染PMEPA1highGES-1及NC-PMEPA1highGES-1细胞（MOI=100）,H.pylori感染6h后收集细胞总RNA;同时收集PMEPA1highBGC-823及NC-PMEPA1highBGC-823细胞总RNA;每个组设置三个生物学重复,共收集48个RNA样品。2.转录组测序及分析:（1）转录组测序委托上海美吉生物医药科技有限公司,基于Illumina Novaseq 6000测序平台,通过c DNA文库构建、上机测序、测序数据质控、基因注释等步骤获得基因表达量数据;（2）利用DESeq2软件对表达基因进行差异分析,筛选标准为差异基因表达倍数（Fold Change）>1.5,校正P<0.05;（3）采用Goatools软件对差异基因进行GO富集分析,校正P<0.05为显着富集;采用R语言对差异基因进行KEGG富集分析,P<0.05为显着富集。结果:（一）PMEPA1在胃癌组织的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中高表达:（1）Oncomine数据库分析结果显示,PMEPA1在多种癌症组织中显着高表达（P<0.05）,包括乳腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌及多个消化系统肿瘤如食管癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌。（2）利用GEPIA数据库,共纳入408例TCGA胃癌样本和211例包含TCGA及GETx数据库的正常胃黏膜组织样本,分析结果显示,PMEPA1在胃癌组织样本的表达显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（3）从GEO数据库中下载三个胃癌测序数据集（GSE54129,GSE79973,GSE118916）,分析结果显示,在三个GEO数据集中,PMEPA1在胃癌组织中的转录水平均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（4）利用Oncomine数据库分析PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织中的表达情况,结果显示PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织的表达均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（5）18例胃癌及癌旁手术标本的q RT-PCR及WB结果显示,PMEPA1在胃癌组织的表达显着高于癌旁组织（P<0.05）。2.PMEPA1高表达与胃癌患者不良预后有关:Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示,PMEPA1是胃癌患者预后不良的风险因素（HR>1）,PMEPA1高表达的胃癌患者总体生存期（HR=1.52）、无进展生存期（HR=1.38）及进展治疗后生存期（HR=1.67）显着缩短（P<0.05）。3.PMEPA1诊断胃癌的临床价值:对TCGA数据库的胃癌数据集绘制PMEPA1基因的受试者工作曲线（ROC）,曲线下面积AUC为0.893,说明PMEPA1是良好的胃癌诊断标志物。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）GSEA分析结果显示,PMEPA1高表达与TGF-β、上皮间充质转化（EMT）、血管生成、缺氧、Wnt信号通路和Hedgehog信号通路显着正相关（FDR q-value<0.05）;（2）批量相关性基因的KEGG富集分析结果显示,PMEPA1及其相关性基因主要富集在E2F靶基因、有丝分裂纺锤体、MYC靶基因、蛋白质分泌、DNA修复、G2M细胞周期检查点、血管生成、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、紧密连接、EMT等信号通路,其中PMEPA1与EMT信号通路呈显着正相关（校正P值=0.005）。（二）H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.成功构建了Hp7.13和Hp PMSS1菌株的oip A基因敲除菌株,及抗Oip A抗原的兔多克隆抗体。2.H.pylori感染上调胃上皮细胞PMEPA1蛋白和m RNA表达水平:（1）前期转录组学分析结果显示,Hp7.13和Hp CCS9803菌株感染感染GES-1细胞24h,与未感染H.pylori的细胞相比,PMEPA1表达分别上调1.59倍和1.13倍,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）Hp PMSS1以不同MOI感染胃上皮GES-1细胞1、3、6、12、24h,在感染6h和12h时随着MOI增大,PMEPA1蛋白表达水平逐渐上升,在MOI=50表达水平最高（P<0.05）,PMEPA1的m RNA表达水平在感染6h时MOI=100表达最高（P<0.05）。（3）将Hp 7.13和PMSS1以不同MOI感染胃癌细胞株AGS 6h,随着MOI的增加,PMEPA1蛋白表达水平上升,其中MOI=50在两个菌株中都有统计学差异（P<0.05）。3.Hp毒力因子Cag A和Oip A对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1 6h,Western Blot结果显示,Hp7.13wt或PMSS1wt感染后PMEPA1蛋白表达高于未感染的对照组,而cag A和oip A基因敲除菌感染的PMEPA1蛋白表达低于野生组;（2）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1和AGS细胞6h,荧光定量PCR结果显示,Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染GES-1和AGS细胞后,PMEPA1的m RNA表达水平显着高于未感染细胞（P<0.05）,而cag A和oip A基因敲除菌感染时PMEPA1的m RNA表达显着低于野生菌感染的细胞（P<0.05）。4.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:（1）PMEPA1在炎细胞和腺细胞中均有表达,主要定位于细胞质及核膜。（2）在腺细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的轻度慢性非萎缩性胃炎、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）;在炎细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的重度非萎缩性炎症、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）。（3）在H.pylori感染的标本中,PMEPA1在轻度和重度非萎缩性胃炎患者标本腺细胞中的表达显着低于肠化生、异型增生和胃癌组（P<0.05）;在轻度非萎缩性胃炎的炎细胞中的表达显着低于其它各组（P<0.05）;在H.pylori未感染患者,无论是腺细胞还是炎细胞,PMEPA1的表达在胃癌组均显着高于其它各组（P<0.05）。以上结果提示,PMEPA1可能参与了H.pylori感染的胃黏膜病变过程。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖:（1）平板克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highGES-1的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;PMEPA1lowGES-1的增殖能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）体外克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highBGC-823的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;2.PMEPA1促进胃上皮和胃癌细胞的侵袭和迁移:（1）Transwell侵袭和迁移实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的侵袭和迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1lowGES-1细胞的侵袭和迁移能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）划痕修复实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）。3.PMEPA1与上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）有关:（1）利用Cbioportal数据库分析了PMEPA1与EMT有关基因的相关性,分析结果显示,PMEPA1与间充质细胞标志物N-cadherin的编码基因CDH2、Vimentin的编码基因VIM、EMT间充质细胞转录因子ZEB1、TWIST1、TWIST2显着正相关（P<0.05）,与Snail转录因子编码基因SNAI1和Slug转录因子编码基因SNAI2显着正相关（P<0.05）;与基质金属蛋白酶分子编码基因MMP11、MMP14、MMP7、MMP2、MMP1、MMP17、MMP13和MMP24显着正相关（P<0.05）;（2）Western Blot结果显示,PMEPA1lowGES-1的E-cadherin蛋白表达显着高于NC细胞（P<0.05）,N-cadherin蛋白表达显着低于NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1high GES-1则反之（P<0.05）。4.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞BGC-823增殖的影响:Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823细胞和对照细胞,RTCA结果显示,H.pylori感染18小时后开始促进NC组细胞的增殖,在感染后的40-78h内,Hp PMSS1wt菌株显着促进NC-PMEPA1highBGC-823细胞的增殖（P<0.05）,而Hp PMSS1Δcag A及Hp PMSS1Δoip A感染组与Hp PMSS1wt感染组相比,细胞增殖无统计学差异（P>0.05）;Hp PMSS1wt菌株及cag A和oip A敲除菌株对PMEPA1highBGC-823细胞的增殖无统计学差异（P>0.05）。5.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞和胃上皮细胞迁移和侵袭的影响:（1）PMEPA1过表达对H.pylori感染的BGC-823胃癌细胞迁移和侵袭的影响:H.pylori未感染组中,过表达PMEPA1显着促进BGC-823细胞的迁移和侵袭（P<0.05）;Hp7.13wt感染PMEPA1highBGC-823及对照细胞后细胞迁移和侵袭能力显着高于未感染细胞（P<0.05）,同时Hp7.13wt感染组细胞的迁移和侵袭能力显着高于Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染组（P<0.05）;Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823和NC细胞后,细胞侵袭能力同Hp7.13菌株,而迁移能力在PMEPA1highBGC-823细胞各组无统计学差异（P>0.05）。（2）PMEPA1敲减对Hp7.13wt感染的胃上皮GES-1细胞的迁移和侵袭的影响:Hp7.13wt感染PMEPA1lowGES-1及对照细胞后,细胞迁移和侵袭能力显着增加（P<0.05）。（四）转录组学分析PMEPA1在H.pylori感染的胃上皮细胞作用的生物学功能1.PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响:（1）PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞GES-1转录水平的影响:（1）GES-1过表达PMEPA1后共有1025个差异基因,敲减PMEPA1后共有1376个差异基因;（2）差异基因主要富集的GO通路有细胞运动相关如质膜黏附分子的细胞间黏附作用、趋化运动、黏附过程、细胞迁移、细胞运动、细胞外基质成分、细胞运动的调节等生物过程;（3）差异基因富集到的KEGG信号通路主要有细胞粘附分子、TGF-β、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）PMEPA1过表达对胃癌细胞株BGC-823转录水平的影响:（1）共有132个差异基因;（2）主要富集的GO通路有细胞外基质组成、组织形态发生、急性炎症反应、TGF-β的分泌调控等生物过程;（3）主要富集到的KEGG通路包括耶尔森菌感染、小细胞肺癌、内吞、抗坏血酸和醛酸代谢、肌动蛋白细胞骨架的调控、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、ECM-受体相互作用。综上,PMEPA1过表达或敲减主要影响细胞运动、迁移、细胞黏附、受体配体相关作用、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用等生物学过程。2.H.pylori感染对敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响（1）H.pylori感染对敲减PMEPA1的GES-1细胞转录水平的影响:（1）Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染PMEPA1lowGES-1细胞后,分别有2315和959个差异基因;（2）差异基因富集的GO通路相似,主要包括细胞对缺氧的反应、细胞分裂、血管发育的调控、细胞周期的正向调控、细胞运动的正向调控等生物过程;（3）共同富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）H.pylori感染对过表达PMEPA1的GES-1转录水平的影响:（1）Hp7.13wt感染NC-PMEPA1highGES-1后,共有1646个差异基因,富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路的研究、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路等;（2）Hp7.13wt与Hp7.13Δcag A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因富集到了17条信号通路,主要有肿瘤中的micro RNAs、细胞周期、P53信号通路、细胞衰老、FOXO信号通路、癌症中的转录调控异常、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路等,说明cag A可能通过以上这些通路起作用。（3）Hp7.13wt与Hp7.13Δoip A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因未富集到KEGG通路。综上,H.pylori感染可能通过转录因子的调控作用、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路介导敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的变化,其中毒力因子Cag A可能发挥重要作用。3.PMEPA1对不同H.pylori菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响（1）PMEPA1敲减对Hp7.13（或PMSS1）感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp PMSS1wt）感染PMEPA1lowGES-1及其对照组细胞,差异基因富集的KEGG通路相似,主要包括AGE-RAGE信号通路的研究、癌症中胆碱代谢、细胞衰老、Hippo信号通路、EGFR酪氨酸酶抑制耐受、癌症中的micro RNA、Fox O信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、细胞骨架调控等;（2）PMEPA1过表达对不同H.pylori菌株感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）感染PMEPA1highGES-1及其对照细胞,差异基因富集的信号通路相似,主要的GO富集有TGF-β的反应、趋化性的调节、质膜粘附分子的粘附、细胞对生长因子刺激反应等过程等生物过程;主要的KEGG富集有细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路等。综上,在H.pylori感染胃上皮细胞的过程中,PMEPA1可能通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。结论:1.PMEPA1在胃癌组织高表达,与胃癌不良预后有关,是良好的胃癌诊断标志物。2.PMEPA1高表达促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,与EMT表型相关。3.H.pylori感染调控PMEPA1的表达,促进胃上皮细胞的增殖、侵袭和迁移,部分依赖于毒力因子Cag A和Oip A的作用。4.H.pylori感染胃上皮细胞调控多种生物学过程;PMEPA1通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。
钟永泷[10]（2020）在《KIF18A在肺腺癌中的生物学功能及作用机制研究》文中进行了进一步梳理背景:KIF18A是N型驱动蛋白-8亚家族成员,在大多数人类正常组织中低表达,而在多种恶性肿瘤组织中异常高表达。KIF18A与肿瘤患者恶性病理特征和不良预后相关,促进肿瘤细胞增殖、侵袭与转移,很可能是肿瘤基因治疗的新型分子靶点。然而,KIF18A在肺腺癌的研究较少,其生物学功能及作用机制尚不清楚,对其深入研究将有助于为肺腺癌诊治提供新的思路和理论依据。方法:收集肺腺癌组织标本,采用q PCR、western blot和免疫组化检测肺腺癌组织及癌旁正常肺组织中的KIF18A表达。分析KIF18A表达与肺腺癌患者临床病理特征的相关性。分析KIF18A表达对肺腺癌患者生存预后的影响。挖掘TCGA和GEO数据库的肺腺癌RNA-seq数据,分析KIF18A m RNA在肺腺癌组织中的表达水平,及其与患者临床病理特征及预后的相关性。利用慢病毒转染构建KIF18A过表达或干扰表达的肺腺癌细胞株。采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、流式细胞术及β-半乳糖苷酶染色检测KIF18A表达对肺腺癌细胞增殖、凋亡、周期分布和细胞衰老的影响。构建裸鼠皮下移植瘤模型,评估KIF18A表达对肺腺癌细胞体内增殖能力的影响。采用细胞划痕、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测KIF18A表达对肺腺癌细胞体外迁移与侵袭能力的影响。采用western blot实验检测KIF18A表达对MMP2/9表达的影响。构建裸鼠体内转移瘤模型,评估KIF18A表达对肺腺癌细胞体内转移能力的影响。采用细胞免疫荧光实验检测KIF18A表达与肺腺癌EMT的关系。采用western blot实验和TCGA数据库挖掘,分析KIF18A表达与EMT相关指标、MMPs表达的相关性。采用Cancer SEA数据库分析肺腺癌单细胞水平的KIF18A基因功能。采用western blot实验检测KIF18A表达对Smad2/3蛋白表达的影响。采用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测干扰KIF18A表达对TGF-β1诱导的细胞迁移和侵袭能力的影响。给予TGF-β1或SB431542处理,采用western blot实验验证KIF18A在TGF-β/Smad信号通路中的作用。采用生物信息学方法预测KIF18A基因的上游调节性mi RNA。采用双荧光素酶报告基因实验验证mi R-26b-5p与KIF18A基因的靶向关系。采用q PCR实验和TCGA数据挖掘,分析肺腺癌中的mi R-26b-5p表达水平,及其与KIF18A基因表达相关性和预后价值。采用western blot实验检测mi R-26b-5p对KIF18A蛋白表达的影响。采用平板克隆形成、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测mi R-26b-5p/KIF18A对肺腺癌细胞增殖和转移能力的影响。结果:肺腺癌组织中KIF18A m RNA和蛋白表达均高于正常肺组织,与患者淋巴结转移、TNM分期和生存状况密切相关。KIF18A表达与患者OS负相关,是影响患者不良预后的独立危险因素。KIF18A在肺腺癌A549细胞中相对低表达,在PC9细胞中相对高表达,选择这两株细胞构建KIF18A干扰表达或过表达的肺腺癌细胞株。KIF18A过表达促进肺腺癌细胞体内外增殖,而干扰KIF18A表达则抑制癌细胞增殖、诱导细胞凋亡、衰老和细胞周期G2/M期阻滞。KIF18A过表达增强肺腺癌细胞的体内外迁移和侵袭能力,而干扰KIF18A表达则抑制细胞迁移和侵袭。KIF18A过表达促进MMP2/9蛋白表达,而干扰KIF18A表达则抑制MMP2/9蛋白表达。KIF18A过表达促进裸鼠肺脏表面转移结节形成,而干扰KIF18A表达则抑制裸鼠体内肺转移。KIF18A过表达促进肺腺癌细胞发生EMT,而干扰KIF18A表达则抑制EMT过程。肺腺癌单细胞水平下的KIF18A基因功能与增殖、侵袭、转移和EMT相关。KIF18A调节肺腺癌细胞Smad2/3蛋白磷酸化水平。干扰KIF18A表达抑制TGF-β1诱导的A549细胞迁移和侵袭能力。干扰KIF18A表达显着抑制TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化水平。SB431542能够抑制KIF18A过表达引起的Smad2/3蛋白磷酸化。KIF18A通过TGF-β/Smad信号通路调控EMT相关蛋白和MMP2/9表达。miR-26b-5p是KIF18A基因的上游调节性mi RNA,在肺腺癌组织中低表达,且与KIF18A表达和患者预后负相关。转染mi R-26b-5p模拟物抑制A549细胞的增殖和转移能力,而KIF18A可逆转mi R-26b-5p对A549细胞增殖和转移的抑制作用。结论:KIF18A在肺腺癌中高表达,是影响患者不良预后的独立危险因素。KIF18A增强肺腺癌细胞体内外增殖能力,抑制KIF18A导致细胞凋亡和衰老、细胞周期G2/M期阻滞。KIF18A通过激活TGF-β/Smad信号通路调控EMT和细胞外基质重塑,促进肺腺癌侵袭和转移。mi R-26b-5p直接靶向KIF18A基因调控肺腺癌细胞增殖和转移。KIF18A很可能成为肺腺癌治疗的新型分子靶点。
二、细胞外基质蛋白1在肿瘤中的表达及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞外基质蛋白1在肿瘤中的表达及意义（论文提纲范文）
（1）miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCC中抑癌miR-876从TCGA数据库的筛选鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-876在HCC细胞及组织中低表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-876 的异常表达和HCC进展及纤维化相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-876 抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 miR-876 靶向调控POSTN |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 miR-876 通过POSTN抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 POSTN高表达和HCC组织EMT及肝硬化相关 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 miR-876及POSTN的异常表达和HCC预后相关 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨膜蛋白(POSTN)的结构功能及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）Bit1在胃癌中的生物学功能及其影响胃癌进展机制初步探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 样本 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 主要抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 Western blot实验 |
| 2.2 全自动毛细管Western blot(WES) |
| 2.3 RT-qPCR |
| 2.4 组织芯片免疫组化法 |
| 2.5 生物信息学分析 |
| 2.6 细胞培养 |
| 2.7 慢病毒转染实验 |
| 2.8 细胞免疫荧光 |
| 2.9 细胞划痕实验 |
| 2.10 细胞侵袭实验 |
| 2.11 细胞增殖抑制实验(CCK-8法) |
| 2.12 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 2.13 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.14 细胞透射电镜实验 |
| 2.15 统计分析 |
| 三、结果 |
| 1.胃癌患者癌组织与其对应癌旁组织Bit1蛋白表达水平 |
| 2.胃癌患者癌组织及其对应癌旁组织Bit1mRNA表达水平 |
| 3.IHC法检分析组织芯片中90例胃癌组织及其对应癌旁组织中Bit1蛋白表达水平及临床意义 |
| 4.生物信息学分析 |
| 4.1 与PTRH2 相互关联的蛋白质互作网络图 |
| 4.2 PTRH2 在胃癌中高表达,且与肿瘤分期、淋巴结转移等相关 |
| 4.3 与PTRH2表达相关的信号通路富集情况 |
| 5.不同Bit1表达水平对胃癌细胞生物学功能的影响 |
| 5.1 不同胃癌细胞系中内源性Bit1表达情况 |
| 5.2 Bit1shRNA慢病毒转染胃癌细胞,沉默其内源性Bit1表达 |
| 5.3 下调Bit1表达水平可抑制胃癌细胞迁移及侵袭能力 |
| 5.4 下调Bit1表达水平可显着抑制胃癌细胞增殖能力 |
| 5.5 下调Bit1表达水平可显着促进胃癌细胞凋亡 |
| 5.6 沉默Bit1可损伤胃癌细胞线粒体形态结构 |
| 6.下调Bit1表达可能通过抑制EMT进程进而阻碍胃癌细胞转移 |
| 6.1 下调 Bit1表达可通过上调胃癌细胞Bax,下调 PCNA、Ki67、Bcl-2表达促进细胞凋亡、抑制细胞增殖 |
| 6.2 下调Bit1表达可抑制BGC-803细胞EMT进程 |
| 6.3 Bit1高表达胃癌中Bit1可能通过促进ECM降解进而影响胃癌进程 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 七、综述 胰腺癌细胞失巢凋亡相关抑制性分子研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）Pokemon靶向调控IGFBP3对膀胱癌转移的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤转移 |
| 1.2 膀胱癌概述 |
| 1.3 Pokemon在肿瘤中的研究进展 |
| 1.4 IGFBP3在肿瘤中的研究进展 |
| 1.5 拟采取的技术路线 |
| 第2章 Pokemon在膀胱癌组织中的表达及生物学功能 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验步骤和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Pokemon在膀胱癌组织和细胞中明显上调 |
| 2.3.2 Pokemon表达水平与临床病理特点的联系 |
| 2.3.3 siRNA和过表达质粒的转染成功敲低/过表达Pokemon |
| 2.3.4 Pokemon促进膀胱癌细胞的侵袭迁移 |
| 2.3.5 Pokemon影响膀胱癌细胞的粘附作用 |
| 2.3.6 Pokemon促进膀胱癌细胞抵抗失巢凋亡 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 Pokemon通过调控IGFBP3表达影响膀胱癌转移 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验步骤与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IGFBP3在膀胱癌中低表达 |
| 3.3.2 IGFBP3与临床病理特征的关系 |
| 3.3.3 siRNA和过表达质粒的转染成功敲低/过表达IGFBP3 |
| 3.3.4 IGFBP3抑制膀胱癌细胞的侵袭迁移 |
| 3.3.5 IGFBP3影响膀胱癌细胞的粘附能力 |
| 3.3.6 IGFBP3抑制膀胱癌细胞的失巢凋亡抵抗能力 |
| 3.3.7 IGFBP3影响黏着斑的形成 |
| 3.3.8 Pokemon可以通过调控IGFBP3的转录表达促进膀胱癌转移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 Pokemon调控IGFBP3的表观遗传学机制及对RIG-1 通路的调控作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验步骤与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Pokemon影响IGFBP3启动子甲基化程度 |
| 4.3.2 Pokemon通过IGFBP3调节RIG-1信号通路 |
| 4.3.3 Pokemon-IGFBP3通路可以调节膀胱癌体内转移 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（4）S100A14、LOXL2在高侵袭性甲状腺乳头状癌转移中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果一 |
| 结果二 |
| 结果三 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 S100A14在肿瘤发生发展中的研究现状 |
| 参考文献 |
| LOXL2 在肿瘤发生发展中的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）基于GEO和TCGA数据库构建胃癌预后风险模型及CTNNAL1基因表达与胃癌临床病理因素及预后的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:基于TCGA和 GEO数据库寻找胃癌预后基因并构建预后风险模型的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 TCGA数据库中胃癌数据 |
| 2.1.2 GEO数据库胃癌基因表达谱 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分析流程 |
| 2.2.2 TCGA胃癌数据集的生存分析 |
| 2.2.3 GSE62254 生存分析 |
| 2.2.4 基因功能富集分析 |
| 2.2.5 构建胃癌预后风险模型及模型评估 |
| 2.2.6 胃癌预后风险模型与临床病理相关因素的关系 |
| 2.2.7 胃癌预后风险模型与临床病理相关因素构建诺模图 |
| 3 结果 |
| 3.1 TCGA胃癌数据集和GSE62254 数据集的单因素Cox分析胃癌预后相关基因及功能富集分析 |
| 3.2 构建胃癌预后风险模型及模型评估 |
| 3.3 胃癌预后风险模型与TCGA胃癌临床病理因素的关系 |
| 3.4 胃癌预后风险模型与临床病理因素构建诺模图 |
| 3.5 胃癌预后风险模型相关基因 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:TCGA、HPA和 GEO等数据库中CTNNAL1 与肿瘤预后的关系及其表达特征 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 CTNNAL1 表达与TCGA33 种肿瘤生存预后分析 |
| 2.2 TCGA胃癌数据中CTNNAL1 的表达与临床病理因素的关系 |
| 2.3 GSE62254中CTNNAL1 的表达与胃癌临床病理因素及预后的关系 |
| 2.4 HPA数据库中CTNNAL1 的表达特征 |
| 2.5 GSE134520 单细胞测序数据分析CTNNAL1 基因在不同细胞的表达 |
| 2.6 CTNNAL1 基因与肿瘤微环境中细胞数量的相关性 |
| 2.7 CTNNAL1 基因集富集分析GSEA(Gene set enrichment analysis) |
| 2.8 CTNNAL1 基因蛋白质-蛋白质相互作用(protein-proteininteraction,PPI)网络及功能富集分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 CTNNAL1 TCGA-pan Cancer预后分析 |
| 3.2 TCGA数据库中CTNNAL1 m RNA在胃癌中的表达 |
| 3.3 TCGA数据库中CTNNAL1 m RNA表达与临床病理因素的关系及意义 |
| 3.4 GSE62254中CTNNAL1m RNA表达与胃癌预后及临床病理因素的关系 |
| 3.5 HPA数据库中CTNNAL1 的表达特征 |
| 3.5.1 CTNNAL1 在人体各组织中的表达水平 |
| 3.5.2 CTNNAL1在sc RNA-seq单细胞基因测序数据中的表达 |
| 3.6 GSE134520 单细胞测序数据分析CTNNAL1 基因在不同细胞的表达 |
| 3.7 CTNNAL1 基因表达在间质细胞数量的相关性 |
| 3.8 GSEA分析CTNNAL1 相关信号通路 |
| 3.9 CTNNAL1 基因PPI网络及功能富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:胃癌组织中CTNNAL1 表达与临床病理因素的关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 免疫组织化学染色与结果判定 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床病理资料 |
| 3.2 CTNNAL1 在细胞、非癌胃粘膜组织和胃癌中的表达 |
| 3.3 胃癌组织CTNNAL1 蛋白表达与临床病理因素的关系 |
| 3.4 E-cadherin表达与胃癌临床病理因素的关系及意义 |
| 3.5 CTNNAL1 表达与E-cadherin表达的相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附录 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 CTNNAL1 与肿瘤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）POSTN对肾细胞癌生物学行为的影响和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 POSTN结构与功能 |
| 2.2 POSTN在正常组织中的表达和功能 |
| 2.3 POSTN的表达调控 |
| 2.4 POSTN在癌症进展标志性事件中的作用 |
| 2.5 POSTN在肿瘤中的表达与作用 |
| 2.5.1 结直肠癌 |
| 2.5.2 非小细胞肺癌 |
| 2.5.3 原发性肝细胞癌 |
| 2.5.4 乳腺癌 |
| 2.5.5 膀胱癌 |
| 2.6 POSTN可作为潜在治疗靶点 |
| 2.7 AKT/MTOR通路、上皮间质转化在肿瘤细胞中的作用 |
| 2.8 肾细胞癌的国内外研究现状 |
| 第3章 POSTN在肾细胞癌组织中的表达与意义 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 组织标本 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析 |
| 3.3.2 Western Blot |
| 3.3.3 免疫组化染色 |
| 3.3.4 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 POSTN在肾癌组织中的表达 |
| 3.4.2 POSTN蛋白表达水平与临床病理参数的关系 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 POSTN对肾癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 肾癌细胞株 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析 |
| 4.3.3 Western Blot |
| 4.3.4 细胞转染 |
| 4.3.5 细胞活力检测 |
| 4.3.6 平板克隆实验 |
| 4.3.7 划痕试验 |
| 4.3.8 侵袭试验 |
| 4.3.9 细胞免疫荧光 |
| 4.3.10 细胞凋亡检测 |
| 4.3.11 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 POSTN沉默和过表达效率的验证 |
| 4.4.2 POSTN在肾癌细胞增殖中的作用 |
| 4.4.3 POSTN对肾癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 4.4.4 POSTN对肾癌细胞凋亡的影响 |
| 4.4.5 POSTN表达水平对肾癌细胞EMT的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 POSTN调控肾癌进展的机制研究和动物实验验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 5.3.2 免疫组化染色 |
| 5.3.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析 |
| 5.3.4 Western Blot |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 POSTN 过表达对肾细胞癌 ILK/Akt/mTOR 信号通路的激活 |
| 5.4.2 体内实验验证POSTN调控肾癌进展的生物学功能 |
| 5.4.3 体内实验验证POSTN调控肾癌细胞增殖的分子机制 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）莱菔硫烷对膀胱癌细胞转移的影响及靶向能量代谢重排的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究目的和意义 |
| 1.2 肿瘤转移与细胞伪足 |
| 1.2.1 细胞伪足 |
| 1.2.2 伪足的功能 |
| 1.2.3 伪足的调控 |
| 1.3 能量代谢与肿瘤转移 |
| 1.3.1 肿瘤细胞运动与能量代谢重排 |
| 1.3.2 糖酵解与肿瘤转移 |
| 1.3.3 脂肪酸代谢与肿瘤转移 |
| 1.3.4 线粒体呼吸作用与肿瘤转移 |
| 1.4 莱菔硫烷 |
| 1.4.1 莱菔硫烷概述 |
| 1.4.2 莱菔硫烷与肿瘤进展 |
| 1.4.3 莱菔硫烷与能量代谢 |
| 1.5 主要研究内容和课题来源 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器与设备 |
| 2.1.2 试剂与药品 |
| 2.1.3 人群生物样本 |
| 2.1.4 实验动物样品 |
| 2.2 测定方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 过表达质粒构建及瞬时转染 |
| 2.2.3 CCK细胞毒性测定 |
| 2.2.4 GC-MS法测定代谢物含量 |
| 2.2.5 能量代谢表型的测定 |
| 2.2.6 胞内ATP含量测定 |
| 2.2.7 代谢相关酶类活性的测定 |
| 2.2.8 Real-time PCR法 |
| 2.2.9 蛋白质印记法 |
| 2.2.10 细胞随机运动能力的测定 |
| 2.2.11 细胞侵袭能力的测定 |
| 2.2.12 透射电镜观察细胞形态 |
| 2.2.13 扫描电镜观察细胞形态 |
| 2.2.14 激光共聚焦显微镜法 |
| 2.2.15 BBN诱导膀胱癌小鼠模型的建立 |
| 2.2.16 裸鼠体内膀胱癌细胞肺转移模型的建立 |
| 2.2.17 肿瘤组织病理学观察 |
| 2.2.18 免疫组化检测 |
| 2.3 统计分析 |
| 第3章 膀胱癌患者能量代谢模式分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 研究对象的人口学资料 |
| 3.3 GC-MS测定组织样本中代谢物含量 |
| 3.3.1 葡萄糖差异代谢产物概况 |
| 3.3.2 不同糖代谢途径中差异代谢产物分析 |
| 3.3.3 差异表达代谢物的主成分分析 |
| 3.3.4 Pathway代谢途径富集分析 |
| 3.4 膀胱肿瘤中异常代谢的调节 |
| 3.4.1 糖酵解代谢的调控 |
| 3.4.2 脂代谢的调控 |
| 3.5 代谢酶活性及其与TNM分期的相关性分析 |
| 3.5.1 糖酵解代谢酶活性检测 |
| 3.5.2 代谢酶活性与TNM分期的相关性分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 莱菔硫烷对膀胱癌细胞代谢重排的调控及机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 莱菔硫烷对膀胱癌细胞增殖的抑制作用 |
| 4.3 SFN对膀胱癌细胞内ATP含量的影响 |
| 4.4 SFN对膀胱癌细胞能量代谢的影响 |
| 4.4.1 SFN对膀胱癌细胞能量代谢调节的时间效应 |
| 4.4.2 SFN对膀胱癌细胞能量代谢调节的剂量效应 |
| 4.4.3 SFN对膀胱癌细胞能量代谢表型的调节 |
| 4.5 SFN对膀胱癌细胞内葡萄糖代谢产物的影响 |
| 4.5.1 SFN对磷酸戊糖途径代谢产物的影响 |
| 4.5.2 SFN对糖酵解代谢产物的影响 |
| 4.5.3 SFN对三羧酸循环代谢产物的影响 |
| 4.6 SFN对膀胱癌细胞代谢酶的调节 |
| 4.6.1 SFN对糖酵解代谢酶的抑制作用 |
| 4.6.2 SFN对线粒体复合物的抑制作用 |
| 4.6.3 SFN对脂代谢关键酶的抑制作用 |
| 4.7 SFN对膀胱癌细胞能量代谢调节因子的影响 |
| 4.7.1 对糖酵解调节因子的抑制作用 |
| 4.7.2 对线粒体数量的影响 |
| 4.7.3 对脂代谢调节因子的抑制作用 |
| 4.8 SFN抑制膀胱癌细胞糖代谢的作用机制 |
| 4.8.1 SFN通过AKT1抑制HK2的蛋白表达 |
| 4.8.2 SFN通过AKT1/HK2轴调控膀胱癌细胞内ATP含量 |
| 4.9 SFN对膀胱癌小鼠体内能量代谢的影响 |
| 4.9.1 小鼠的基本生理指标 |
| 4.9.2 SFN对膀胱癌小鼠体内糖酵解的调节 |
| 4.9.3 SFN对膀胱癌小鼠体内脂代谢的影响 |
| 4.10 本章小结 |
| 第5章 莱菔硫烷抑制膀胱癌细胞伪足形成的能量代谢调控机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 SFN对膀胱癌细胞转移及侵袭的影响 |
| 5.2.1 SFN对膀胱癌细胞随机运动能力的影响 |
| 5.2.2 SFN对膀胱癌细胞侵袭能力的影响 |
| 5.3 膀胱癌患者体内伪足形成调控因子的基因表达 |
| 5.4 SFN对膀胱癌细胞形态的影响 |
| 5.4.1 细胞伪足的扫描电镜观察 |
| 5.4.2 细胞伪足的透射电镜观察 |
| 5.5 SFN对膀胱癌细胞伪足形成的调节及作用机制 |
| 5.5.1 SFN对膀胱癌细胞伪足形成的影响 |
| 5.5.2 SFN抑制膀胱癌细胞伪足形成的作用机制 |
| 5.6 SFN通过靶向能量代谢调控膀胱癌细胞伪足形成 |
| 5.6.1 ATP对膀胱癌细胞伪足形成的影响 |
| 5.6.2 AKT1在SFN抑制伪足形成中的作用 |
| 5.6.3 SFN对膀胱癌细胞Arp2表达的影响 |
| 5.7 SFN通过靶向能量代谢抑制膀胱癌细胞迁移 |
| 5.7.1 AKT1过表达对SFN抑制膀胱癌细胞迁移的影响 |
| 5.7.2 c-Myc过表达对SFN抑制膀胱癌细胞迁移的影响 |
| 5.8 SFN对膀胱癌细胞体内肺转移的影响 |
| 5.8.1 小鼠的基本生理指标 |
| 5.8.2 SFN对膀胱癌细胞在小鼠体内肺转移的影响 |
| 5.8.3 SFN对小鼠体内糖代谢的影响 |
| 5.8.4 SFN对小鼠肿瘤组织中细胞伪足形成的影响 |
| 5.9 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）结直肠癌组织中COL1A1、miR-143的表达水平和临床意义以及两者的相关性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 前言 |
| 一、结直肠癌概述 |
| 二、miR-143在结直肠癌中的研究 |
| 三、COL1A1在肿瘤中的研究 |
| 第2章 结直肠癌组织中COL1A1蛋白的表达水平及其意义 |
| 1. 标本收集 |
| 2. 实验仪器及试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3. 实验步骤 |
| 3.1 设置对照组 |
| 3.2 确定COL1A1抗体浓度 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.4 实验结果判读 |
| 3.5 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 COL1A1蛋白表达水平 |
| 4.2 COL1A1蛋白表达水平与临床病理参数的关系 |
| 5. 讨论 |
| 第3章 COL1A1mRNA、miR-143在结直肠癌组织中的表达水平和临床意义以及两者的相关性 |
| 1. 标本收集 |
| 2. 主要仪器及试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 RNA 引物(由赞纳生物公司设计) |
| 3. 实验步骤 |
| 3.1 提取RNA |
| 3.2 反转录 |
| 3.3 miRNA/mRNA实时荧光定量分析 |
| 3.4 结果判读 |
| 3.5 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 COL1A1研究结果 |
| 4.2 miR-143研究结果 |
| 4.3 COL1A1mRNA与miR-143表达水平间关系 |
| 5. 讨论 |
| (一) COL1A1mRNA在结直肠癌中的表达水平及意义 |
| (二) miR-143在结直肠癌中的表达水平及意义 |
| (三) COL1A1mRNA、miR-143在结直肠癌中表达水平的相关性 |
| 第4章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 miRNA在结直肠癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 H.pylori主要的致癌因子 |
| 1.3 H.pylori感染胃黏膜改变的关键分子PMEPA1 |
| 第2章 PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及其生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床组织标本及资料收集 |
| 2.1.2 生物信息学数据库 |
| 2.1.3 主要试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学数据挖掘 |
| 2.2.2 组织蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 2.2.3 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PMEPA1在胃癌组织中显着高表达 |
| 2.3.2 PMEPA1与胃癌患者预后的关系 |
| 2.3.3 PMEPA1诊断胃癌的临床价值 |
| 2.3.4 生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 H.pylori感染及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 临床组织标本收集 |
| 3.1.2 细胞系及实验菌株 |
| 3.1.3 质粒及感受态细胞 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 幽门螺杆菌的复苏、鉴定、传代 |
| 3.2.2 H.pylori7.13和PMSS1 oipA基因敲除菌株的构建 |
| 3.2.3 制备抗oipA重组抗原的免疫兔多克隆抗体 |
| 3.2.4 细胞培养及细菌细胞共培养模型的构建 |
| 3.2.5 蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 3.2.6 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 3.2.7 石蜡切片及免疫组织化学 |
| 3.2.8 细胞转录组学 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Hp7.13和PMSS1 菌株的oipA基因敲除菌株的构建及鉴定 |
| 3.3.2 H.pylori感染上调胃上皮细胞中PMEPA1的表达水平 |
| 3.3.3 H.pylori cag A和 oipA影响胃上皮细胞PMEPA1的表达 |
| 3.3.4 PMEPA1在不同胃黏膜病变阶段的表达及与H.pylori感染的关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒稳转细胞株的构建 |
| 4.2.2 CCK8 细胞增殖实验 |
| 4.2.3 实时无标记细胞增殖实验 |
| 4.2.4 Transwell细胞迁移和侵袭实验 |
| 4.2.5 划痕修复实验 |
| 4.2.6 克隆形成实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 成功构建PMEPA1过表达和敲减稳转细胞株 |
| 4.3.2 PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.3 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞的生物学行为的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 PMEPA1在H.pylori感染胃上皮细胞改变的转录组学研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞转录组测序流程 |
| 5.2.2 转录组测序数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 测序样品的RNA验证 |
| 5.3.2 PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响 |
| 5.3.3 Hp感染对过表达或敲减PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.3.4 PMEPA1对不同Hp菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 小结和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 PMEPA1在肿瘤中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 幽门螺杆菌外膜蛋白致病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（10）KIF18A在肺腺癌中的生物学功能及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 驱动蛋白超家族简介 |
| 1.1.1 驱动蛋白分类 |
| 1.1.2 驱动蛋白的结构 |
| 1.1.3 调节蛋白的作用 |
| 1.1.4 微管轨道选择 |
| 1.1.5 驱动蛋白的运动 |
| 1.2 驱动蛋白的作用 |
| 1.2.1 .驱动蛋白在细胞有丝分裂中的作用 |
| 1.2.2 驱动蛋白在疼痛中的作用 |
| 1.2.3 驱动蛋白与其他疾病 |
| 1.3 驱动蛋白与肿瘤 |
| 1.3.1 驱动蛋白与肿瘤发生 |
| 1.3.2 驱动蛋白与肿瘤转移 |
| 1.3.3 驱动蛋白与肿瘤预后 |
| 1.3.4 驱动蛋白与肿瘤耐药 |
| 1.4 KIF18A的研究进展 |
| 1.4.1 KIF18A的结构与功能 |
| 1.4.2 KIF18A与肿瘤 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 临床标本来源 |
| 2.1.2 病例与标本选择 |
| 2.1.3 病例随访信息 |
| 2.1.4 细胞系来源与培养条件 |
| 2.1.5 实验动物来源与饲养 |
| 2.1.6 伦理审核 |
| 2.1.7 主要仪器、耗材与试剂 |
| 2.1.8 主要试剂配制方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床标本处理 |
| 2.2.2 实时定量荧光PCR |
| 2.2.3 Western blotting实验 |
| 2.2.4 免疫组织化学 |
| 2.2.5 苏木素-伊红(HE)染色 |
| 2.2.6 细胞传代 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.2.9 shRNA慢病毒包装和转染 |
| 2.2.10 慢病毒过表达载体构建 |
| 2.2.11 慢病毒包装 |
| 2.2.12 慢病毒转染 |
| 2.2.13 CCK-8实验 |
| 2.2.14 细胞平板克隆形成实验 |
| 2.2.15 细胞凋亡检测 |
| 2.2.16 细胞周期检测 |
| 2.2.17 细胞衰老检测 |
| 2.2.18 细胞划痕实验 |
| 2.2.19 Transwell迁移实验 |
| 2.2.20 侵袭实验 |
| 2.2.21 裸鼠皮下成瘤模型 |
| 2.2.22 裸鼠体内转移瘤模型 |
| 2.2.23 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.24 microRNA预测与筛选 |
| 2.2.25 KIF18A靶基因载体构建 |
| 2.2.26 双荧光素酶报告基因检测实验 |
| 2.2.27 小干扰RNA转染 |
| 2.2.28 TCGA数据库转录组测序数据分析 |
| 2.2.29 GEO数据库基因表达谱芯片数据分析 |
| 2.2.30 单细胞水平的基因功能分析 |
| 2.2.31 数据统计学分析 |
| 第三章 KIF18A在肺腺癌中的表达及临床意义 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 KIF18A在肺腺癌组织中高表达 |
| 3.2.2 KIF18A蛋白表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系 |
| 3.2.3 KIF18A高表达与肺腺癌患者的不良预后相关 |
| 3.2.4 基于TCGA数据库分析KIF18A在肺腺癌中的表达与临床意义 |
| 3.2.5 基于GEO数据库分析KIF18A在肺腺癌中的表达与临床意义 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 KIF18A对肺腺癌细胞增殖、凋亡及衰老的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 KIF18A在肺腺癌细胞系中的表达情况 |
| 4.2.2 构建KIF18A干扰表达和过表达的肺腺癌细胞株 |
| 4.2.3 KIF18A对肺腺癌细胞增殖能力的影响 |
| 4.2.4 干扰KIF18A表达对肺腺癌细胞凋亡的影响 |
| 4.2.5 干扰KIF18A表达对肺腺癌细胞周期的影响 |
| 4.2.6 干扰KIF18A表达对肺腺癌细胞衰老的影响 |
| 4.2.7 KIF18A表达对肺腺癌细胞体内增殖能力的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 KIF18A对肺腺癌细胞侵袭与转移能力的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 KIF18A对肺腺癌细胞迁移能力的影响 |
| 5.2.2 KIF18A对肺腺癌细胞侵袭能力的影响 |
| 5.2.3 KIF18A对肺腺癌细胞基质金属蛋白酶的表达影响 |
| 5.2.4 KIF18A对肺腺癌细胞体内转移能力的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 KIF18A通过TGF-β/Smad通路调控肺腺癌EMT、细胞外基质重塑 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 KIF18A促进肺腺癌细胞上皮间质转化过程 |
| 6.2.2 肺腺癌单细胞水平的KIF18A基因功能分析 |
| 6.2.3 KIF18A对 Smad2/3 蛋白的表达影响 |
| 6.2.4 干扰KIF18A表达抑制TGF-β1 诱导的肺腺癌细胞迁移与侵袭 |
| 6.2.5 KIF18A参与TGF-β1/Smad信号通路调控 |
| 6.2.6 KIF18A通过TGF-β/Smad信号通路调控EMT和 MMPs表达 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 miR-26b-5p通过靶向调控KIF18A抑制肺腺癌细胞增殖与转移 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 miR-26b-5p是 KIF18A基因候选上游调节性miRNA |
| 7.2.2 miR-26b-5p靶向调控KIF18A基因表达 |
| 7.2.3 miR-26b-5p和 KIF18A在肺腺癌中的表达与相关性 |
| 7.2.4 miR-26b-5p调控肺腺癌中KIF18A表达 |
| 7.2.5 KIF18A可逆转miR-26b-5p对肺腺癌细胞增殖的抑制 |
| 7.2.6 KIF18A可逆转miR-26b-5p对肺腺癌细胞迁移和侵袭的抑制 |
| 7.3 讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
四、细胞外基质蛋白1在肿瘤中的表达及意义（论文参考文献）
- [1]miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究[D]. 陈凯. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]Bit1在胃癌中的生物学功能及其影响胃癌进展机制初步探讨[D]. 赵馨旭. 湖北医药学院, 2021(02)
- [3]Pokemon靶向调控IGFBP3对膀胱癌转移的影响及其作用机制研究[D]. 韩健松. 吉林大学, 2021(01)
- [4]S100A14、LOXL2在高侵袭性甲状腺乳头状癌转移中的作用研究[D]. 王冬海. 河北北方学院, 2021(01)
- [5]基于GEO和TCGA数据库构建胃癌预后风险模型及CTNNAL1基因表达与胃癌临床病理因素及预后的关系[D]. 李文会. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]POSTN对肾细胞癌生物学行为的影响和机制研究[D]. 贾媛媛. 吉林大学, 2021(01)
- [7]莱菔硫烷对膀胱癌细胞转移的影响及靶向能量代谢重排的机制研究[D]. 黄蕾. 哈尔滨工业大学, 2021(02)
- [8]结直肠癌组织中COL1A1、miR-143的表达水平和临床意义以及两者的相关性[D]. 龚志勇. 大理大学, 2021(09)
- [9]PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究[D]. 赵巧云. 南昌大学, 2021(01)
- [10]KIF18A在肺腺癌中的生物学功能及作用机制研究[D]. 钟永泷. 广西大学, 2020(02)