一、视网膜色素变性患者视觉电生理观察（论文文献综述）
欧阳旺斌[1]（2021）在《视网膜色素变性盲人视通路功能评价的研究》文中研究指明研究背景:视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa,RP）是一种慢性遗传性眼病,主要特征是感光细胞的变性。临床表现为夜盲、管状视野及中心视力下降,视网膜骨细胞样色素沉积。盲一般指远视力低于0.05或视野半径小于10度。目前RP的治疗大多处于临床试验阶段。在这些临床试验中,主要的挑战是如何客观安全的评估病人治疗前后的视功能变化。由于传统的一些检查方法可靠性低,一些新的评估手段因此得以建立,包括多亮度移动测试、全场光敏阈值测试等。然而,上述的视功能检测手段是主观的,客观评价盲人残余视通路功能的方法尚未完全建立。光学相干断层成像（Optical coherence tomography,OCT）能够无创的检测视网膜各层的结构及厚度。视觉电生理检查能够客观反映视网膜、视神经不同部位的功能。瞳孔对光反射（Pupillary light response,PLR）是一种重要的非成像视觉反应,随着外界光照刺激的增加导致瞳孔收缩的改变。功能磁共振成像（Functional magnetic resonance imaging,fMRI）是一种无创的成像技术,由于其优越的时空分辨率而在脑科学和心理学研究中应用广泛。在眼科学领域,fMRI已经被应用于研究青光眼、弱视和早中期RP病人的视皮层功能,可是评价RP盲人残存视皮层功能的一种合适手段。目的:对RP盲人视通路功能进行分析,为评估RP盲人视功能特点提供合适的客观检测手段,更好的对比病人接受治疗前后的视功能变化。方法:将研究分为以下三个部分:1.通过OCT、视觉电生理、PLR研究视网膜色素变性盲人视网膜、视神经及视觉皮层下中枢的功能特征。根据最佳矫正视力（Best corrected visual acuity,BCVA）将26名RP盲人分成了四组,分别为无光觉组（No light perception,NLP）、光觉组（Light perception,LP）、微弱形觉组（Faint form perception,FFP）、形觉组（Form perception,FP）,另外纳入了10名正常对照。使用OCT、视觉电生理、PLR检查对各组的视网膜、视神经及视觉皮层下中枢的功能特征进行了分析。2.通过fMRI定性研究视网膜色素变性盲人在视觉任务诱发下视皮层激活的变化。研究了5名RP盲人与5名正常人在视觉任务刺激下引起视皮层的激活的差异。3.采用fMRI定量研究视网膜色素变性盲人在视觉任务诱发下视皮层激活及视觉相关脑区之间的功能连接网络的变化。根据BCVA将18名RP盲人分成了2组,无形觉组（No form sense,NFS）和有形觉组（Form sense,FS）,另外还纳入了10名正常对照。使用fMRI对各组在视觉任务诱发下的视皮层激活及视觉相关脑区功能连接网络改变的特征进行了分析。结果:1.视网膜色素变性（RP）盲人视网膜结构与功能特征:OCT结果发现,相对于正常对照,RP盲人黄斑区视网膜全层、外核层（Outer nuclear layer,OPL）及外丛状层（Outer nuclear layer,ONL）厚度下降。NLP组的OPL、ONL厚度相比FFP组和FP组下降,LP组的ONL厚度相比FFP组和FP组下降,NLP组OPL、ONL消失。表明RP盲人外层视网膜厚度下降,OCT能够鉴别无形觉RP盲人（NLP组和LP组）和有形觉RP盲人（FFP组和FP组）的ONL层厚度差异,无形觉组厚度下降。RP盲人所有ERG检查均呈“熄灭型”,说明RP盲人视网膜功能极差,无法用ERG来评价RP盲人的视网膜功能。2.视网膜色素变性（RP）盲人视神经功能特征:视觉诱发电位（VEP）结果发现NLP组和LP组的FVEP P2波幅值比FFP组和FP组降低,而PVEP P100波仅能在残存有中心视力的RP盲人中记录到。表明FVEP可以检测出不同RP盲人的视神经功能差异,无形觉组视神经功能更差。3.视网膜色素变性（RP）盲人视觉皮层下中枢的功能特征:PLR结果发现在白光或蓝光刺激下,引起瞳孔收缩的PLR阈值在NLP组和LP组比FFP组和FP组高。表明PLR阈值能够检测出不同RP盲人视皮层下中枢功能的差异,无形觉组视皮层下中枢功能更差。4.视网膜色素变性（RP）盲人在视觉任务诱发下视皮层激活的定性特征。fMRI结果提示,在特定的视觉刺激下,fMRI能够检测到RP盲人和视功能正常者视皮层均存在显着激活,RP盲人仍有残留的视皮层功能。由于病例数目较少,无法比较两者之间的差异,但证实了fMRI是一种能够客观检测RP盲人视皮层功能的工具。5.视网膜色素变性（RP）盲人在视觉任务诱发下视皮层激活的定量特征。结果发现:1)在闪光刺激下,相比正常人RP盲人的视皮层激活减弱,且视力较差的病人激活较低。两两比较的结果显示,NC组在刺激眼同侧及对侧的BA17、BA18、BA19的激活均强于FS组及NFS组;而在刺激眼同侧及对侧BA17、刺激眼对侧的BA18、刺激眼对侧的BA19,FS组的激活强于NFS组。2)在棋盘格翻转刺激下,相比正常人RP盲人的视皮层激活减弱,且视力较差的病人激活更低。两两比较的结果显示,NC组在刺激眼同侧及对侧的BA17、BA18、BA19的激活均强于FS组及NFS组,而在刺激眼同侧及对侧BA17和BA18、刺激眼对侧的BA19,FS组的激活强于NFS组。以上表明视觉刺激下,相比正常对照,RP盲人的视皮层功能下降,且视力较差的病人视功能更差。与单纯的光觉刺激相比,棋盘格翻转刺激下两组RP盲人之间的激活差异脑区范围更大。6.视网膜色素变性（RP）盲人在视觉任务诱发下视觉相关脑区之间的功能连接网络变化特征。结果发现:1)在闪光视觉刺激下,相比正常人,RP盲人刺激眼同侧和对侧初级视皮层之间功能连接减弱,表明初级视皮层功能受损。刺激眼同侧和对侧额叶眼动区（FEF）之间功能连接减弱,表明FEF功能受损。刺激眼同侧的颞下回与其它脑区之间和刺激眼对侧的颞下回与其它脑区之间的功能连接都减弱,表明颞下回功能受损,视觉腹侧通路存在损伤。不同视力的RP盲人之间各个脑区间功能连接无明显差异。2)在棋盘格翻转视觉刺激下,相比正常人,RP盲人刺激眼同侧和对侧初级视皮层之间功能连接减弱,表明初级视皮层功能受损。未发现正常人与RP盲人其它视觉脑区间功能连接通路的改变。不同视力的RP盲人之间各个脑区之间功能连接也没有无明显差异。以上结果表明fMRI可以客观评价RP盲人视觉相关脑区功能连接通路的变化。结论:本研究全面的评估了RP盲人视网膜到视皮层的视通路功能,得到了以下结论:1.通过OCT、ERG、VEP以及PLR等手段研究了RP盲人视网膜、视神经及视觉皮层下中枢的结构和功能特点。证实了OCT、VEP及PLR能够评价RP盲人的视网膜结构和视功能,ERG无法评价RP盲人之间的视网膜功能。本研究报道了,以上检测能够客观鉴别不同RP盲人视功能的差异。2.采用闪光（光觉）和棋盘格翻转（光觉加形觉）两种不同视觉刺激来诱发视皮层的激活。证明了RP盲人的视皮层激活相比视功能正常者减弱,且无形觉的RP盲人较有形觉的RP盲人视功能更差。本研究率先观察到与单纯的光觉刺激相比,光觉和形觉共同刺激下RP盲人两组之间的激活差异脑区范围更大,表明棋盘格翻转刺激,可以更好的反映RP盲人的视皮层功能差异。这也为利用fMRI评估RP盲人的视皮层功能提供了客观指标。3.本研究首次揭示了RP盲人视觉相关脑区功能连接通路的损伤。RP盲人初级视皮层功能受损,额叶眼动区（FEF）功能受损,颞下回功能受损,腹侧通路存在损伤。这加深了对RP视觉相关脑区功能损伤的认识,对RP视功能损伤治疗指明了方向。
朱路瑶[2]（2021）在《中国西部区域人群Leber先天性黑曚的分子遗传学与临床表型研究》文中指出Leber先天性黑曚（Leber congenital amaurosis,LCA）是最早发病的一类具有致盲性的遗传性视网膜疾病（Inherited retinal dystrophies,IRD）,以1岁之前的严重视觉损伤和视网膜电流图波形熄灭为主要临床特征,主要遗传方式是常染色体隐性遗传。迄今为止,在中国以及其他国家已经报道了28个与LCA相关的已知致病基因,主要包括CRB1、RDH12、RIPGRIP1和CEP290等。LCA具有高度的遗传异质性和表型异质性,复杂的基因突变类型和临床表现使LCA的诊断难度加大。目的:探究中国西部区域汉族人群的Leber先天性黑曚（LCA）的主要分子遗传学和临床特征,筛查中国人群LCA中已知致病基因的突变频谱和新的突变位点。探索分子遗传学特征和临床表型之间的相关性,为临床诊断和治疗奠定更多的信息基础。方法:1、2009年至2019年,在遗传性视网膜疾病（IRD）队列中,筛选出严格定义的LCA患者37例74眼。进行标准化的相关信息收集和整理,其中包括知情同意书签署,患者及家系成员基本信息采集,家系图谱绘制。分析家系的患病情况和地域分布特点等。2、设计以195个已知的IRD致病基因作为靶序列的捕获芯片,通过靶向二代测序（Next-generation sequencing,NGS）筛选突变,进行Sanger测序验证和分离分析,在家系成员和200名正常对照组中进行新位点验证,运用生物信息学技术分析新突变的致病性。3、对37例LCA患者74眼进行全面的临床检查,包括最佳矫正视力（Best Corrected Visual Acuity,BCVA）,视野（Visual Field,VF）,闪光视觉诱发电位（Flash Visual Evoked Potential,FVEP）,闪光视网膜电图（Flash Electroretinogram,FERG）,多焦视网膜电图（Multi-focal Electroretinogram,mf ERG）,眼底彩照,眼底荧光血管造影（Fundus Fluorescein Angiography,FFA）和光学相干断层扫描（Optical Coherence Tomograpy,OCT）,总结临床特征,结合致病基因结果分析患者临床表型和基因型的相关性。结果:1、本研究采用NGS技术,以195个IRD相关致病基因作为特异性基因靶序列的捕获芯片在37例LCA患者中,有34例患者检测出具有已知的LCA基因,突变检出率为91.9%。2、本研究共检测出47个突变位点,其中检测出的8种基因都是与LCA相关的已知基因,即CRB1,RDH12,RPGRIP1,CEP290,GUCY2D,RPE65,LCA5和AIPL1。首次发现21个新突变位点,新突变位于CRB1,RDH12,RPGRIP1和CEP290基因,预测为具有致病性。在200名正常对照者中未发现新的突变。3个最高频突变的基因分别是CRB1（27.0%）,RDH12（24.3%）和RPGRIP1（18.9%）。3、CRB1和RPGRIP1基因在中国西部LCA患者突变频谱中占主要比例。这两个基因所占比例和在中国其他区域的比例也相似,而中国西部LCA患者中与RDH12相关的LCA的比例更大。4、本次研究中的LCA患者37名大部分视力较差,其中21名患者为低视力,15名患者为盲,眼底形态不同,呈现圆形、骨细胞样或者网格样色素,伴或不伴黄斑萎缩,电生理检查提示视觉功能受损严重。5、与CRB1相关的LCA临床特征是周边视网膜色素的眼底。RDH12相关的LCA临床表现为黄斑萎缩。与RPGRIP1相关的LCA的眼底变化与视觉功能损失的程度不一致。CEP290以及RPE65相关的LCA眼底外观基本正常或白点样色素。结论1、严格的临床诊断标准结合NGS技术有助于LCA检出率的提高。2、本研究完成了37名患者LCA致病基因筛查,共检测出47个突变等位基因,首次发现21个新突变,扩大了中国人群LCA的突变频谱。3、中国西部LCA患者中与RDH12相关的LCA的比例比其他区域大,揭示了LCA致病基因的地域分布和种族分布差异。4、本次研究首次分析了中国西部区域人群中LCA突变频谱的基因型及临床表型的关系。筛查出了新的突变位点,但是未发现新的临床表型。这丰富了LCA遗传学研究内容,为遗传咨询和基因疗法补充了必要的信息。
田万里[3]（2021）在《ASRGL1在视网膜色素变性中的功能研究》文中提出视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa,RP）是一种遗传性的视网膜疾病,其主要病变过程为视网膜色素上皮细胞以及视锥-视杆细胞凋亡,最终导致视网膜的萎缩。全球的RP患者约有150万人,在中国约有40万人。现已发现约100个RP致病基因,大多数的致病基因都有一定的研究,甚至为部分致病基因构建了动物模型来深入研究其在RP中的功能与机制,如ARL2、RHO、IMPG2等基因。ASRGL1是在RP患者中新发现的致病基因,探究ASRGL1在RP中的功能和潜在的分子机制具有重要的意义。ASRGL1蛋白是N端亲核水解酶超家族成员,能催化L-天冬酰胺和异天冬酰胺二肽的水解。含异天冬氨酸的多肽对几种蛋白酶的底物识别和转换有重要的影响,甚至在某些情况下充当蛋白酶抑制剂;且异天冬酰胺肽键的形成是非酶蛋白损伤的最常见来源之一,因为它会在蛋白质骨架中引入一个扭结,可以破坏正常的折叠,导致蛋白质水解的易感性改变或功能丧失,最终导致代谢功能紊乱。总之,ASRGL1蛋白对于清除含有异天冬氨酸的肽和将氨基酸返回代谢池中发挥重要的生理作用。在RP患者中发现了ASRGL1基因致病突变,但是对于ASRGL1在RP中的功能和机制尚未研究,同时缺乏相应的疾病动物模型。基于此我们利用CRISPR/Cas9技术构建了Asrgl1基因全身性敲除的小鼠动物模型来评估其在RP中的作用和潜在的分子机制。Asrgl1基因敲除小鼠再现了RP患者表型,包括视网膜电图（ERG）反应减弱和光感受器进行性退化。Asrgl1敲除小鼠的组织病理学检查显示,在12个月龄时,视网膜杆状细胞外节变短,视紫红质蛋白出现错误定位,以及视锥细胞外节发育受损和进行性锥体细胞死亡。同时在Asrgl1敲除小鼠的视网膜中也观察到胶质增生和视觉细胞凋亡增加。由此可见,Asrgl1在视网膜中具有的重要作用,本研究为Asrgl1突变引起的RP的机制研究和治疗开发提供了新的模型和思路。
易文洋[4]（2021）在《人类及猕猴视网膜衰老单细胞图谱》文中进行了进一步梳理视觉是人类与世界进行多感交互最重要的途径,人类每天获取的信息至少有80%来自于视觉信息处理。视网膜是位于眼球内壁的一层半透明神经薄膜组织,是视觉形成的第一站,其具有高度精密且特化的细胞组织结构,能够将光信号转换为电信号,并通过视神经将信号传递给脑中枢形成视觉感知。虽然哺乳类动物视网膜组织结构相似,但是人类等高级灵长类动物视网膜中存在一个特化的区域称为中央凹区（黄斑区）。中央凹区富集了大量负责感受明视觉和色觉的视锥细胞以及负责信号传递的神经节细胞,它是灵长类动物视觉分辨率最敏锐的区域,任何累及中央凹区的视觉疾病都会导致明显的视觉衰退。因此,研究人类和非人灵长类动物视网膜中央凹区的细胞组成以及基因表达特征,具有重要的生物学意义。视网膜组织结构精细且复杂,我们对于人类以及高级非人灵长类动物视网膜的认识仍然十分有限。尤其缺乏对灵长类动物视网膜中央凹区与外周区细胞组成和基因表达差异的认识。此外,人类与高级非人灵长类动物视网膜在细胞构成以及基因表达上的保守程度依然未知,这关系着灵长类动物是否能够作为可靠的人类视网膜疾病模型。特别的是,视网膜疾病患病率随着年龄增长逐年提升,给社会和家庭带来极大的负担。因此,我们急需了解人类以及非人灵长类动物视网膜在衰老过程中的细胞以及基因表达变化,为治疗和干预年龄相关性视网膜疾病提供重要的研究基础。为了详细探究上述问题,我们获取了人类出生后8天,35周岁,52周岁,63周岁,86周岁,87周岁以及非人灵长类动物猕猴-恒河猴2周岁,4周岁,5周岁,9周岁,23周岁中央凹区与外周区共119520个单细胞转录组数据。首先,通过数据分析和免疫荧光验证,我们发现了一群从未被描述过的视网膜细胞类型-OTX2/RLBP1双阳性细胞。其次,我们的研究结果表明:两个物种的视杆细胞虽然均可以分为MYO9A+视杆细胞以及MYO9A-视杆细胞两个特殊的亚群,但是两种视杆细胞亚型在物种间组成比例存在很大差异。结合ATAC-seq和免疫荧光验证,我们发现视杆细胞亚型的形成很可能受到转录因子OTX2调控。我们的分析结果还发现穆勒胶质细胞、视锥细胞在两个物种间均表现出区域性差异基因表达,水平细胞亚型在区域间呈现差异性分布,并且我们通过免疫荧光以及RNA-Scope原位杂交证明了差异真实存在。不仅如此,通过ATAC-seq,我们还发现视锥细胞的区域差异基因表达很可能是受到穆勒胶质细胞影响。我们的研究成果详细地解析了人类和恒河猴视网膜在细胞组成和分子特征上的差异性与保守性。为了研究人类和恒河猴视网膜衰老过程中细胞与分子演变进程,我们分析了两个物种视网膜在衰老进程中细胞组成和基因表达变化。发现在人类视网膜衰老过程中,视杆细胞对衰老不耐受,并且MYO9A-视杆细胞对衰老极其敏感。而由于猕猴视网膜中MYO9A-视杆细胞比例很低,故在衰老过程中并未展示出与人类一致的视杆细胞减少现象。此外,不同的细胞类型对衰老的响应并不一致,穆勒胶质细胞在衰老过程中上调的生物学过程与其他视网膜细胞类型明显不同。视网膜衰老不仅体现在各种细胞类型内在的基因表达变化,也体现在细胞与细胞间交互的改变。细胞间的受体-配体表达在年轻组与衰老组存在明显不同。通过整合衰老基因集,我们构建了人类视网膜衰老可视化模型,发现中央凹区衰老程度与衰老速率均大于外周区。不仅如此,我们还发现了新的视网膜衰老分子标记,探究了中央凹区与外周区差异在衰老过程中的变化。因此,我们的研究结果不仅系统解析了人视网膜中多种细胞类型在衰老进程中分子特征,而且揭示视网膜衰老呈区域性和细胞亚型特异性演变。在解析了视网膜衰老的基础之上,我们构建了 55种人类视网膜疾病共178个疾病易感基因在人类与猕猴视网膜中的表达图谱。发现疾病基因表现出物种间保守性以及物种间特异性并存的表达特征,暗示着猕猴作为人类视觉疾病模型需要因病制宜。以上结果为理解人类视网膜疾病细胞与分子机制提供了坚实基础。总结而言,我们解析灵长类动物视网膜的细胞组成以及相关分子特征,并比较了人类与猕猴视网膜在细胞组成以及基因表达上的保守程度。详细研究了灵长类动物视网膜衰老进程中的细胞以及分子事件。构建了多物种人类视觉疾病基因表达图谱,为未来视网膜疾病的临床治疗以及靶向药物递送提供了十分重要的参考资源。
Robson A. G.;[5]（2020）在《视觉电生理诊断流程指南》文中认为视觉系统的临床电生理检查包括一系列非侵入性无创检测,为临床提供视觉系统不同位置和细胞类型相关功能的客观指标。本指南由国际临床视觉电生理学会制定,介绍了视觉电生理诊断标准流程,包括全视野视网膜电图（ERG）、图形ERG、多焦ERG、眼电图和脑皮层产生的视觉诱发电位,概述了视觉电生理检查的基本原则,并且通过实例说明常见疾病的视觉电生理检查方法及其相应表现。（中华眼科杂志,2020,56:492-508）
张欢[6]（2020）在《hESC-RPE衍生的外泌体参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究》文中研究指明背景:视网膜色素上皮细胞（Retinal pigment epithelium cells,RPE）通过发挥营养、支持及屏障等关键作用来维持视网膜功能和代谢的稳态。视网膜变性疾病（Retinal Degenerative diseases,RD）的发生,伴随视网膜色素上皮细胞的凋亡和功能障碍[1]。视网膜下腔移植人胚胎干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（Human Embryonic Stem Cells derived RPE,hESC-RPE）是目前治疗此类疾病的最佳临床策略之一[2,3]。大量动物和临床实验证实,hESC-RPE的移植对于视网膜变性疾病有明确的短期疗效,是良好的种子细胞[4],既往研究报道,超过百分之95的治疗细胞移植后主要是通过细胞间物质交换,自分泌、旁分泌机制发挥免疫调节作用[5]。外泌体作为一种几乎所有活细胞都可产生的纳米级囊泡,分泌出胞后可在全身循环中传递,其内部搭载有蛋白质、核酸及脂质等物质[6],通过将上述生物活性分子传递给靶细胞从而改变靶细胞的行为和状态[7,8]。作为移植后细胞间物质交换和信息传递的重要载体,现阶段对hESC-RPE衍生的外泌体在变性视网膜中的作用尚不明晰。除此之外,由于患者血-视网膜屏障的损坏[9],移植后的细胞将长期浸润在炎症环境中,移植细胞在受到炎症因子刺激后,其分泌的外泌体所搭载的货物会发生显着改变[10],发挥的作用也将随之变化。因此,探索hESC-RPE在不同病理生理状态下所分泌外泌体的内含物和功能的差异,为明确临床上干细胞移植的有效性机制,加快干细胞移植的临床转化有重要意义。本研究假设:外泌体可能是hESC-RPE移植后发挥功能的重要途径之一,处于不同炎症微环境的hESC-RPE所分泌的外泌体可能发挥不同的功能,一方面正常培养的hESC-RPE所衍生的外泌体（Normal hESC-RPE derived exosomes,后称Nor-EXO）可能通过调节视网膜内免疫细胞的激活在一定程度上缓解变性视网膜的局部炎症;另一方面受到IFN-γ等炎症因子刺激的hESC-RPE所分泌的外泌体（IFN-γ stimulated hESC-RPE derived Exosomes,后称IFN-γ EXO）可能通过进一步刺激机体免疫细胞增殖激活,恶化视网膜变性炎症微环境。研究目的:本课题旨在探究受到或不受到视网膜变性炎症微环境刺激的hESC-RPE所分泌的外泌体在内含物及功能上的差异,及外泌体参与调控视网膜变性炎症微环境的机制。研究方法:第一部分:Nor-EXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究1.通过差速离心法分离提取hESC-RPE衍生的外泌体并利用透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）、蛋白质印迹（Western Blot,WB）和纳米粒度追踪（Nanosight analysis,NTA）对其进行鉴定。2.向变性早期（d21）RCS大鼠视网膜下腔移植外泌体,以PBS作为对照,通过闪光视网膜电图（Flash Electroretinogram,f-ERG）、光栅行为学等手段检测外泌体移植对RCS大鼠视功能的影响;通过免疫荧光技术及q-PCR（Quantitative Real-time PCR,q-PCR）技术,检测外泌体移植对RCS大鼠视网膜中小胶质细胞的影响。3.通过蛋白组高通量测序探索正常培养的hESC-RPE衍生的外泌体（Normal hESC-RPE derived exosomes,后称Nor-EXO）内部具体搭载的蛋白货物,并借助String、GO等多数据库联合分析挖掘其发挥功能的关键通路。4.将外泌体与RCS大鼠视网膜外植体共培养,通过细胞因子芯片、q-PCR等手段探索Nor-EXO对变性视网膜中促炎细胞因子及小胶质细胞相关细胞因子的影响。5.借助小胶质细胞系BV-2探索Nor-EXO参与调节变性视网膜的具体机制。第二部分:IFN-γ EXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究1.使用IFN-γ预处理hESC-RPE模拟体内视网膜变性炎症微环境;差速离心法分离纯化正常培养的hESC-RPE外泌体（Nor-EXO）及IFN-γ刺激后hESC-RPE分泌的外泌体（IFN-γ stimulated hESC-RPE derived EXO,后称 IFN-γ EXO）,通过WB、NTA、TEM等手段对两种外泌体进行鉴定。2.在RCS大鼠的视网膜变性的早、中、晚期分别向其视网膜下腔移植两种不同种类外泌体,通过f-ERG等手段检测移植后RCS大鼠视功能变化,并通过流式细胞术和q-PCR,检测不同外泌体在体内对免疫细胞比例及相关促炎细胞因子表达水平的影响。3.利用高通量蛋白组测序检测Nor-EXO及IFN-γ EXO内部搭载蛋白货物差异,并借助GO、KEGG、Uniprot等多数据库联合分析,挖掘富集免疫相关通路,预测功能差异。4.在体外将hESC-RPE与两种外泌体共培养,通过流式细胞术和实时q-PCR表征不同外泌体对hESC-RPE免疫原性、活性、功能及对免疫细胞趋化能力的影响。5.通过羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（Carboxyfluorescein succinimidyl amino ester,CFSE）、固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）、流式细胞术等手段表征两种不同外泌体对视网膜变性患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中自然杀伤细胞（Natural killer cells,NK cells）、CD8+细胞毒性T细胞的比例（CD8+Cytotoxicity Tcells,CD8+T cells）、增殖及效应物颗粒酶B（Granzyme B）的分泌差异。研究结果:第一部分:Nor-EXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究1.捕获hESC-RPE分泌的外泌体（后称Nor-EXO）,电镜下呈经典双凹茶托样结构,NTA检测平均直径为119.7nm,表达CD63、CD81、TSG101等外泌体标志蛋白,表明差速离心法能够获得较为纯净的外泌体。2.相较于PBS移植组,将Nor-EXO移植入RCS大鼠的视网膜下腔后,RCS大鼠视功能得到保留,闪光视网膜电图b波幅值（p<0.05）和视敏度（p<0.05）显着增高,提示Nor-EXO移植延缓RCS大鼠视功能丢失;3.免疫荧光显示RCS大鼠Nor-EXO移植组视网膜中小胶质细胞形态多为静息态“分支状”,而PBS移植组多为激活态“阿米巴样”;且Nor-EXO移植组视网膜中IFN-γ、CCL-2等小胶质细胞相关促炎细胞因子表达水平显着更低（p<0.05）,表明Nor-EXO移植减缓RCS大鼠视网膜中小胶质细胞介导的炎症反应。4.通过高通量蛋白组测序发现Nor-EXO内部搭载蛋白质主要富集到的免疫学相关生物学通路是:Negative regulation of acute inflammatory response（q<0.05）。5.细胞因子芯片显示,与Nor-EXO共培养显着降低RCS大鼠视网膜外植体中IL-1α、IL-1β、sICAM-1等促炎细胞因子的表达水平（p<0.05）;q-PCR结果提示Nor-EXO显着下调激活的小胶质细胞标志物CD68等在转录水平的表达（p<0.05）;表明Nor-EXO通过下调激活的小胶质细胞数目降低RCS大鼠视网膜外植体中促炎细胞因子水平。6.Nor-EXO与经由LPS刺激后的BV-2小胶质细胞系共培养后,流式细胞术显示M1型小胶质细胞标志物CD86表达水平显着降低（p<0.01）;q-PCR结果同样显示IL-6、iNOS等激活的M1型小胶质细胞相关炎症因子表达水平显着降低（p<0.05）,而Arg-1、IL-10等调节性细胞因子表达水平上调（p<0.01）,提示Nor-EXO通过减少M1型小胶质细胞数目来抑制促炎细胞因子的分泌,进而改善变性视网膜炎症微环境。第二部分:IFN-γ EXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究1.IFN-γ刺激hESC-RPE 24h后,流式细胞术显示hESC-RPE表面HLA抗原表达水平升高,提示成功构建视网膜变性炎症微环境中高免疫原性hESC-RPE模型。2.捕获IFN-γ刺激后hESC-RPE衍生的外泌体（后称IFN-γ EXO）,电镜下观察呈双层膜样结构,NTA检测外泌体平均直径为123.4nm,表达CD63、CD81、TSG101等外泌体标志蛋白,提示Nor-EXO和IFN-γ EXO在形态结构及粒径方面没有显着差异。3.在RCS大鼠的视网膜变性的早、中、晚期分别向其视网膜下腔移植Nor-EXO或IFN-γ EXO,f-ERG结果显示三个时间点IFN-γ EXO的移植均导致RCS大鼠fERG b波幅值快速丢失（p<0.05）,而Nor-EXO则在RCS变性的早、中期较为显着的保留b波幅值（p<0.05）,提示Nor-EXO移植能够在一定程度上保护RCS大鼠的残存视力,但其保护作用随着变性程度的加深而减弱,而IFN-γ EXO无论是在变性的早期、中期或是晚期移植均将导致RCS大鼠视觉功能进一步丢失。4.流式细胞术结果显示,IFN-y EXO移植后显着增加RCS大鼠变性视网膜中NK细胞及CD8+T细胞的比例（p<0.01）,而Nor-EXO在一定程度上减少了 NK细胞比例（p<0.05）,对CD8+T细胞影响不显着;q-PCR结果提示IFN-γ EXO显着上调RCS大鼠视网膜中CCL-2、CCL-5、CXCL9等趋化因子表达水平（p<0.05）,而Nor-EXO除能显着降低CCL-2表达水平外（p<0.05）,对其趋化因子几乎没有影响,提示IFN-γEXO通过趋化募集NK细胞和CD8+T细胞,导致RCS大鼠视网膜炎症反应增强,改变其视网膜炎症微环境。5.通过对Nor-EXO及IFN-γ EXO的蛋白组测序数据进行分析,共检测到428个差异表达蛋白,进一步利用多数据库联合分析,发现IFN-γ EXO中MHC Ⅰ类抗原呈递、白细胞迁移、细胞因子介导的免疫反应等通路显着上调（q<0.05）,结果提示IFN-γ EXO可能通过增强MHC抗原的呈递引起NK细胞及CD8+T细胞的募集激活,导致促炎细胞因子释放增加,增强视网膜内炎症反应。6.将前述两种外泌体与hESC-RPE共培养48h后,通过流式细胞术发现IFN-γEXO显着上调hESC-RPE表面HLA抗原表达水平（p<0.01）,流式细胞术及q-PCR结果提示 IFN-γ EXO 促进 hESC-RPE 凋亡（p<0.01）,降低 RPE65,PEDF、bestrophin等功能基因的表达（p<0.05）,并增加CCL-2,CCL5,CXCL-9等趋化因子在转录水平的表达（p<0.05）,而Nor-EXO组则对hESC-RPE无显着影响,以上结果提示IFN-γ EXO上调hESC-RPE表面HLA抗原的表达,诱导hESC-RPE凋亡、下调功能基因表达水平并上调hESC-RPE对免疫效应细胞的趋化能力。7.将前述两种外泌体与视网膜变性（RD）患者的PBMC共培养48h后,流式细胞术结果提示IFN-γ EXO显着提高RD患者PBMC中NK和CD8+T细胞的比例（p<0.01）,同时增强NK细胞的增殖（p<0.05）;ELISPOT结果显示IFN-γ EXO显着促进NK细胞与CD8+T细胞的激活及其细胞毒性效应物GranzymeB的分泌（p<0.01）,而Nor-EXO则对GranzymeB的分泌有一定的抑制作用（p<0.05）,以上结果证明了,与Nor-EXO起到的缓解炎症作用相反,IFN-γ EXO通过激活两种免疫效应细胞,诱导免疫效应物的分泌从而恶化移植细胞所处炎症微环境,上述发现为细胞水平及整体水平的实验结果提供了有力支撑。结论:本研究选用经典的视网膜变性疾病模型鼠RCS大鼠,在不同阶段向其视网膜下腔移植两种不同的外泌体,并结合高通量蛋白组测序、外植体培养及Elispot等手段,探索了外泌体对视网膜变性炎症微环境的作用及调控机制。1.本研究借助RCS大鼠模型首次观察到Nor-EXO移植后通过缓解在体小胶质细胞的激活,抑制相关炎症因子分泌从而挽救视功能;而IFN-γ EXO则在移植后显着上调了变性视网膜中NK细胞及CD8+T的比例,从而导致RCS大鼠视功能迅速丢失。2.本研究率先通过高通量蛋白组学对Nor-EXO及IFN-γ EXO内部搭载蛋白进行了测序对比,发现Nor-EXO上调蛋白主要富集在抑制急性炎症等通路上,而IFN-γ EXO上调蛋白则主要富集在增强抗原呈递、促进炎症因子释放等通路上。3.本研究利用了视网膜外植体培养技术,在离体组织水平上证实了 Nor-EXO显着降低RCS大鼠变性视网膜中CCL-2为代表的一系列炎症因子表达水平;同时借助BV-2小胶质细胞系,发现Nor-EXO通过抑制激活的M1型小胶质细胞数量,从而减少相关细胞因子的表达水平,明确了 Nor-EXO对激活小胶质细胞介导炎症的抑制,是限制变性视网膜炎症微环境进一步恶化的重要机制,以上结果尚未见文献报道。4.本研究观察到,IFN-γ EXO与hESC-RPE共培养后将显着上调细胞表面HLA抗原的表达水平,恶化hESC-RPE的存活及功能相关基因的表达,并上调对免疫细胞的趋化能力。5.本研究创新性的将视网膜变性患者PBMC与外泌体的共培养体系和Elispot这一可视半定量实验结合,率先发现与Nor-EXO起到的抑制作用相反,与IFN-γEXO共培养将显着增加PBMC中NK细胞和CD8+T细胞的比例、增殖及激活后效应物GranzymeB的释放,进一步恶化变性视网膜微环境,以上结果为干细胞治疗视网膜变性疾病的有效性机制研究提供了新的思路。
林永琼[7]（2020）在《Reep6.1基因功能研究》文中研究表明目的:视网膜色素变性（RP）是一种较常见的遗传眼病,目前尚无有效的临床治疗手段,因此视网膜疾病相关基因及病理机制的研究对疾病预防、诊断及治疗具有重要意义。REEP6是受体表达增强蛋白（receptor expression enhancing protein,REEPs）家族成员,Reep6基因有两种主要形式的异构体,其差异为是否含有5号外显子。目前已有研究证实Reep6基因突变会导致视网膜变性,而包含5号外显子的异构体Reep6.1在视网膜中特异性表达。因此,本论文通过敲除小鼠Reep6.1基因5号外显子,研究Reep6.1基因在视网膜中的功能和基因突变导致视网膜变性的病理变化过程。最终目的是通过综合分析Reep6.1以及其它已报道的视网膜变性相关基因的功能和作用机制等,阐述视网膜变性的疾病发生过程和发病机制并进一步探索潜在的RP治疗方法。方法:利用CRISPR/Cas9技术构建Reep6.1基因5号外显子敲除小鼠模拟人类视网膜色素变性早期症状;采用视网膜电图（ERG）方法检测视网膜功能;用视网膜冰冻切片免疫荧光染色（IHC）和视网膜蛋白免疫印迹（WB）方法分析敲除小鼠的病理组织改变和光传导蛋白表达情况。最后基于研究结果进行总结分析,阐述Reep6.1基因突变导致视网膜变性病理机制,为相关疾病的深入研究和疾病治疗铺垫基础。结果:Reep6.1基因5号外显子敲除小鼠（KO）视网膜中不表达REEP6.1;REEP6.1的缺失会导致小鼠出现视网膜变性早期症状,视网膜功能受损,光感受器退化,与人类视网膜色素变性症状相似。视网膜切片免疫荧光染色发现KO小鼠光感受器细胞渐进性退化;视网膜蛋白免疫印迹实验发现KO小鼠视网膜中光传导相关蛋白表达异常,视紫红质（RHO）、鸟苷酸环化酶1（GC1）、鸟苷酸环化酶2（GC2）和鸟苷酸环化酶激活蛋白（GCAP2）表达降低;G蛋白偶联受体激酶1（GRK1）和磷酸二酯酶（PDE6b）表达未见显着异常。结论:Reep6.1基因5号外显子的缺失导致视网膜功能异常,光感受器功能障碍,光传导蛋白表达异常。Reep6.1基因5号外显子对维持视网膜稳态,光信号转导有重要意义。
卢紫阳[8]（2019）在《特异性促消退介质延缓视网膜退行性疾病进展及其机制的研究》文中研究说明研究背景视网膜退行性疾病（Retinal degeneration,RD）指包括视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa,RP）、年龄相关性黄斑变性（Age-related macular degeneration,AMD）、糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy,DR）和青光眼等在内的一系列致盲性眼病。目前,RD是世界范围内不可逆盲的首位病因,也是WHO现阶段防盲重点[1],其共同病理生理机制是感光细胞和（或）神经节细胞（Retinal ganglion cells,RGC）等神经细胞渐进性凋亡以及由此导致的视网膜感光功能丧失和视觉信号传导障碍。由于致病因素的复杂性,此类疾病目前尚缺乏有效治疗手段。不同的致病因素,如遗传突变或视网膜缺血、缺氧等损伤应激,是否能够触发相同的细胞凋亡途径?我们是否能够调控该凋亡途径?这对于治愈此类病因异质但表型相似的疾病是至关重要的。研究发现,视网膜退行性疾病的发生发展过程中感光细胞和RGC的进行性凋亡主要归因于两方面:其一是感光细胞或RGC因其自身基因突变缺陷发生凋亡反应[2,3,4]。既往研究表明,钙调蛋白酶（calpains）在视网膜细胞因基因缺陷合成并积累异常蛋白质时被激活[5],且在退行性病变视网膜中依赖于calpains的细胞凋亡途径具有重要地位[6];其二是视网膜退行性疾病中失衡的视网膜微环境加剧了感光细胞和RGC的非细胞自主性的凋亡[7]。如在青光眼、DR和RP的视网膜中过量谷氨酸致calpains激活并参与细胞凋亡[8]。此外,小胶质细胞作为视网膜最主要的常驻免疫应答细胞,其在退行性病变过程中被激活并扮演双刃剑的角色。一方面,激活的小胶质细胞可以吞噬凋亡的细胞,清除炎症物质,限制炎症反应。另一方面,过度激活的小胶质细胞则会释放大量促炎因子恶化视网膜微环境[9,10],加剧感光细胞和RGC的凋亡。因此,抑制视网膜中依赖calpains的凋亡反应或调控小胶质细胞介导的视网膜炎症可望成为治疗视网膜退行性疾病的新策略。特异性促消退介质（Specialized pro-resolving mediators,SPM）是机体内ω-6/3多不饱和脂肪酸（ω-6/3 PUFA）代谢生成的一类具有抗炎、促炎症消退及促细胞再生的脂类介质[11]。机体内含量最为丰富的ω-6和ω-3 PUFA分别是花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）。在15-脂氧合酶（15-LOX）的作用下,DHA和AA分别代谢生成脂氧素A4（Lipoxin A4,LXA4）和神经保护素D1（Neuroprotectin D1,NPD1）。前者主要表现出较强的抗炎作用,而后者则具有较为显着的神经保护特性。既往文献表明机体内SPM的代谢失调在阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）、AMD以及青光眼等神经退行性疾病中均可发生[12,13,14],且15-LOX参与介导DR中视网膜炎症和青光眼中RGC的保护作用[15,16]。这提示SPM可能是治疗视网膜退行性疾病的重要调控介质。因此,我们提出假设:在视网膜退行性疾病的进展中,SPM可能具有重要调控作用。SPM一方面通过直接抑制神经细胞中calpains参与的凋亡反应保护感光细胞、RGC等神经细胞;另一方面,SPM通过调控小胶质细胞的激活,改善视网膜炎症微环境来发挥间接神经保护作用。研究目的本研究主要探索了LXA4和NPD1两种重要的SPM对于视网膜退行性疾病过程中神经细胞的凋亡及小胶质细胞的激活是否具有调控作用。研究方法第一部分:LXA4延缓视网膜变性疾病的进展1.按照RD1小鼠发育与其视网膜变性不同阶段的关系,将RD1小鼠的病程分为变性前期（PN7）、变性高峰期（PN14）和变性晚期（PN21）。利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术对三阶段的RD1小鼠视网膜中LXA4受体及其代谢关键酶的mRNA表达水平进行评估;2.分别于PN6、PN9和PN12行RD1小鼠玻璃体腔注射LXA4或PBS处理,而后进行:1)运用ERG、视觉行为学实验评估RD1小鼠视功能;2)利用视网膜冰冻切片免疫荧光染色技术评估RD1小鼠感光细胞的凋亡,RT-PCR及Western blotting从分子水平上检测感光细胞特异标记物Rhodopsin的表达水平;3)利用视网膜冰冻切片免疫荧光、RT-PCR及Western blotting技术检测RD1小鼠视网膜中小胶质细胞的形态及其相关炎症因子的表达水平;3.取PN13的RD1小鼠视网膜离体培养并进行LXA4处理,于PN21应用炎症因子蛋白芯片检测变性期间小胶质细胞相关炎症因子及其激活标记物CCL-2的表达水平变化。第二部分:NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC为了研究视网膜内calpains参与的细胞凋亡反应,我们采用NMDA损伤视网膜大鼠模型。首先,为了明确NPD1对NMDA损伤RGC是否具有保护作用,我们进行了:1.取出生后21天（PN21）的Long Evans（LE）大鼠随机分组后行玻璃体腔注射NMDA、NMDA+NPD1、PBS,并在其后进行视觉电生理检查、视觉行为学检查评估大鼠视功能,以及视网膜冰冻切片免疫荧光染色评估RGC凋亡;2.取PN21的LE大鼠随机分组后,分别以富含DHA饲料、缺乏DHA饲料和普通饲料喂养一个月,后行ELISA检测内源性NPD1水平是否增高。随后大鼠接受玻璃体腔NMDA单独注射或NMDA+NPD1共注射处理,并利用视觉电生理检查、视觉行为学检查评估大鼠视功能,以及免疫荧光染色评估RGC凋亡;接下来,为了探究NPD1对NMDA损伤视网膜大鼠模型RGC保护作用的机制,我们进行了:3.应用转录组测序和蛋白组检测技术分析玻璃体腔NMDA单独注射或NMDA+NPD1共注射处理的LE大鼠视网膜中总RNA表达谱和蛋白质的变化,并用RT-PCR和Western blotting实验验证;4.取PN21的LE大鼠随机分组后行玻璃体腔注射calpain 1、calpain 1+NPD1、PBS,并在其后进行视网膜冰冻切片免疫荧光染色评估RGC凋亡;RT-PCR检测三组视网膜中Brn3a、Thy-1和RBPMs等RGC特异表达基因以及Bax、Bid、AIF等参与calpain 1依赖性凋亡途径的基因的表达水平;5.采用视网膜冰冻切片免疫荧光标记iba1评估玻璃体腔NMDA单独注射或NMDA+NPD1共注射处理的LE大鼠视网膜中小胶质细胞的形态,并利用Western blotting检测小胶质细胞激活及吞噬功能相关的生物标记物CCL-2和ED-1蛋白的表达变化;RT-PCR技术检测两组视网膜组织中炎症因子表达变化。研究结果第一部分:LXA4延缓视网膜变性疾病的进展1.LXA4维持RD1小鼠视功能作用的研究（1）LXA4合成限速酶和受体在视网膜变性过程中表达水平的变化在PN14的RD1小鼠视网膜中,Alox15和Fpr2 mRNA水平较PN7显着升高（p<0.0001）,但与PN14相比,在RD1小鼠变性晚期（PN21）时两者的表达显着降低（p<0.0001）。（2）LXA4延缓RD1小鼠视功能的丧失LXA4处理组RD1小鼠在PN15、PN18（p<0.01）和PN21（p<0.05）三个时间点的ERG反应中持续表现出比PBS处理组小鼠更高的b波幅值。在开放明场视觉行为学检测实验中,PN18（p<0.05）和PN21（p<0.01）的LXA4处理组RD1小鼠在暗室中停留的时间明显长于PBS处理组,提示LXA4维持变性晚期RD1小鼠的视功能。2.LXA4对RD1小鼠视功能维持作用的机制研究（1）LXA4减少RD1小鼠视网膜中感光细胞的凋亡免疫染色结果可见LXA4处理组RD1小鼠视网膜ONL的Rhodopsin阳性细胞数量明显高于PBS处理组。RT-PCR（p<0.01）及Western blotting结果（p<0.001）证实了LXA4处理的RD1小鼠视网膜中Rhodopsin表达水平更高。TUNEL染色显示LXA4显着减少感光细胞凋亡（p<0.05）并维持RD1小鼠视网膜外核层厚度（p<0.01）。（2）LXA4缓解RD1小鼠视网膜中的小胶质细胞激活1)LXA4缓解RD1小鼠视网膜炎症反应LXA4处理使PN21的RD1小鼠视网膜中Alox5 mRNA表达水平显着降低（p<0.05）。2)LXA4调节RD1小鼠视网膜中激活小胶质细胞相关的炎症因子的表达免疫染色结果可见LXA4处理组与PBS处理组的变性晚期RD1小鼠视网膜中iba1阳性的小胶质细胞皆呈现“阿米巴”样激活状态,但Western blotting检测结果发现,LXA4处理的RD1小鼠视网膜中iba1蛋白的表达水平较PBS处理组明显降低（p<0.01）。LXA4显着抑制RD1小鼠视网膜中细胞因子,如CCL-2,iNOS,TNF-α,IFN-γ,IL-1β和GM-CSF在mRNA水平的表达（p<0.05）,但提高了IL10 mRNA水平表达（p<0.0001）。以上数据提示LXA4减少RD1小鼠视网膜中激活小胶质细胞的数量,同时降低激活小胶质细胞相关的促炎因子的表达。3)LXA4减少离体培养的RD1小鼠视网膜中小胶质细胞的激活细胞因子蛋白芯片结果显示,LXA4处理组RD1小鼠视网膜及其培养上清中的所有可检测到的炎症因子与PBS处理组相比均显着降低。PN21的RD1小鼠视网膜及其培养上清中都检测到更高的CCL-2含量,且LXA4处理明显降低了PN21的RD1小鼠视网膜CCL-2的产生和分泌（p<0.05）,提示LXA4降低变性晚期的RD1小鼠视网膜中小胶质细胞的激活。第二部分:NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC1.NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型RGC的作用研究（1）大鼠玻璃体腔注射NPD1保护NMDA损伤的RGC1)大鼠玻璃体腔注射NPD1减少NMDA诱导的RGC凋亡大鼠玻璃体腔单独注射NMDA后RGC发生剧烈快速的凋亡反应,且这种现象在72h内较为明显。利用LE大鼠行玻璃体腔NMDA单独注射,或玻璃体腔NMDA+NPD1共注射,并在其后的24h、48h及72h时进行免疫荧光染色。结果发现,与NMDA单独注射组相比,NMDA+NPD1共注射组的大鼠视网膜中TUNEL和Brn3a双阳性细胞分别由60±4.8%降至41±6.3%（p<0.05）,55±7.5%降至31±4.3%（p<0.01）,以及50±3.7%降至27±3.1%（p<0.001）,提示NPD1降低NMDA诱导的RGC凋亡反应。2)大鼠玻璃体腔注射NPD1维持NMDA损伤的RGC电生理功能利用LE大鼠行玻璃体腔注射NMDA单独注射,或NMDA+NPD1共注射,并在其后的72h内行大鼠视觉电生理检查。ERG结果发现,NMDA+NPD1共注射组的大鼠的PhNR幅值从102±11μV以较平缓趋势下降至63±13μV,而NMDA单独注射组大鼠的PhNR幅值从103±14μV急剧下降至24±8μV。fVEP结果显示,NMDA+NPD1共注射较NMDA单独注射组的大鼠在24h、48h和72h皆维持较高的P2波幅值（p<0.05）。以上数据提示,NPD1维持NMDA损伤的RGC电生理功能。3)玻璃体腔注射NPD1挽救NMDA损伤视网膜大鼠模型的视敏度与PBS处理组相比,大鼠玻璃体腔单独注射NMDA 72h后,其视敏度由0.76±0.05c/d下降至0.27±0.19 c/d,但NMDA+NPD1共注射组大鼠的视敏度仅下降至0.56±0.05c/d,显着地挽救了大鼠的视功能（p<0.001）。（2）内源性提高NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC1)膳食补充DHA提高大鼠内源性NPD1含量ELISA结果显示,与膳食缺乏DHA组大鼠相比,大鼠膳食补充DHA可将其视网膜组织中内源性NPD1含量由36.2±2.8提升至48.8±0.9 pg/mg（p<0.001）,血浆中NPD1含量则由6.0±0.03增至8.5±0.3 pg/ml（p<0.001）。2)内源性提高NPD1减少NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC凋亡免疫染色显示,膳食缺乏DHA组大鼠行玻璃体腔注射NMDA损伤视网膜后,TUNEL和Brn3a双阳性的细胞数占GCL的89.93±2.73%,而膳食富含DHA组大鼠行玻璃体腔注射NMDA损伤视网膜后,TUNEL和Brn3a双阳性的细胞数仅为21.33±2.36%（p<0.001）。但膳食缺乏DHA组大鼠行玻璃体腔NMDA+NPD1共注射后,其双阳性细胞比例又可显着降低至11.58±3.13%（p<0.001）,提示膳食缺乏DHA使RGC更容易受到NMDA诱导的损伤,但内源性和外源性NPD1的升高都能减少RGC的凋亡。膳食富含DHA组大鼠行玻璃体腔注射NMDA损伤视网膜后,其PhNR幅值为44.23±4.66μV,而膳食缺乏DHA组大鼠在玻璃体腔注射NMDA损伤视网膜后,其PhNR幅值为22.78±1.93μV,较富含DHA组明显降低（p<0.05）。但膳食缺乏DHA组大鼠行玻璃体腔NMDA+NPD1共注射后,其PhNR幅值则被显着维持在43.40±2.82μV（p<0.05）,提示膳食缺乏DHA使RGC更容易受到NMDA的损伤,但内源性和外源性NPD1的升高都能维持RGC的功能。2.NPD1对NMDA损伤视网膜大鼠模型RGC保护作用的机制研究（1）NPD1通过降低大鼠NMDA损伤视网膜中calpain 1的表达减少RGC凋亡1)NPD1调控大鼠NMDA损伤视网膜中神经死亡相关通路利用转录组测序和蛋白组检测技术筛选出玻璃体腔NMDA+NPD1共注射组与NMDA单独注射组的大鼠视网膜组织中差异表达的基因和蛋白质,经功能聚类发现NPD1调控神经元死亡和发育以及炎症反应等过程。2)NPD1负调节大鼠NMDA损伤视网膜中细胞凋亡反应由转录组测序筛选出NMDA+NPD1共注射组与NMDA单独注射组的大鼠NMDA损伤视网膜组织中差异表达基因进行聚类热图分析,发现NPD1下调与细胞凋亡反应相关的基因,火山图中calpain 1在281个下调差异基因中排名位居前列。3)NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中calpain 1的表达以缓解视网膜细胞凋亡反应Western blotting及RT-PCR结果显示大鼠玻璃体内NMDA单独注射诱导其视网膜组织中calpain 1的蛋白（p<0.05）和mRNA水平（p<0.001）升高,且Bax,Bid,AIF和Caspase 3四个参与calpain 1依赖性凋亡途径的基因的mRNA水平皆显着升高（p<0.001）。但NMDA+NPD1共注射则能够显着抑制大鼠视网膜中calpain 1蛋白（p<0.05）和mRNA表达（p<0.01）,以及Bax,Bid,AIF和Caspase 3的mRNA表达,提示NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中calpain 1的表达以缓解视网膜中细胞凋亡反应。4)NPD1减少大鼠NMDA损伤视网膜中calpain 1诱导的RGC凋亡在NMDA损伤的大鼠视网膜中,免疫染色显示calpain 1与NeuN/Brn3a共定位,提示calpain 1表达在RGC上。利用LE大鼠上行玻璃体腔注射时,免疫染色发现,与PBS处理组相比,calpain 1单独注射组大鼠视网膜中凋亡的RGC由1.96±0.51%提高至19.08±1.58%（p<0.001）,但calpain 1+NPD1共注射组大鼠视网膜中RGC的凋亡仅为8.90±1.10%,明显低于calpain 1单独注射组（p<0.001）。RT-PCR结果发现,与calpain1单独注射组相比,calpain 1+NPD1共注射组大鼠视网膜中Brn3a、Thy-1和RBPMs等RGC特异表达基因的mRNA水平较高,而Bax、Bid、AIF以及Caspase 3的mRNA水平较低。以上结果提示,NPD1减少calpain 1诱导的RGC凋亡。（2）NPD1通过调控大鼠NMDA损伤视网膜中小胶质细胞介导的炎症反应保护RGC1)NPD1调控大鼠NMDA损伤视网膜组织中炎症相关通路由转录组测序和蛋白组检测技术筛选出玻璃体腔NMDA+NPD1共注射组与NMDA单独注射组大鼠视网膜组织中差异表达的基因和蛋白质,经功能聚类发现NPD1参与调控大鼠NMDA损伤视网膜的炎症反应,差异基因热图提示NPD1下调炎症反应中的基因。2)NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中炎症因子表达水平LE大鼠行玻璃体腔NMDA+NPD1共注射相较于NMDA单独注射,可以显着降低其视网膜中诸如CCL-2、IL1β、IFN-γ、TNFα等细胞因子的表达,但又上调了抗炎因子TGF-β和IL10,皆具有差异显着性（p<0.001）,提示NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中炎症因子的表达。3)NPD1缓解大鼠NMDA损伤视网膜中激活小胶质细胞介导的炎症LE大鼠行玻璃体腔NMDA+NPD1共注射与NMDA单独注射,由免疫染色结果发现前者视网膜中iba1阳性的小胶质细胞在形态上呈现出更多分枝和更长突起（p<0.05）,由Western blotting结果发现前者视网膜中CCL-2蛋白表达水平明显降低（p<0.05）,而ED-1蛋白的表达水平升高至后者视网膜组织的8.5倍（p<0.05）,提示NPD1降低大鼠NMDA损伤视网膜中小胶质细胞的激活,并促进其吞噬清除作用,从而限制炎症反应。研究结论1.本研究揭示,在视网膜退行性疾病动物模型RD1小鼠中,SPM的代谢关键酶15-LOX的表达水平在病变早期先代偿性升高,在病变晚期则显着降低,表明内源性SPM失调可发生在视网膜退行性疾病中。这为采用SPM调控视网膜退行性疾病进展提供了新的思路。2.本研究发现,LXA4和NPD1两种SPM皆能调控RD1小鼠视网膜和大鼠NMDA损伤视网膜中小胶质细胞的激活与功能来缓解其介导的炎症反应,从而改善退行性病变视网膜的微环境,间接保护视网膜神经细胞。3.本研究观察到,LXA4和NPD1两种SPM皆具有减少退行性病变视网膜中神经细胞凋亡的作用。LXA4降低RD1小鼠变性晚期视网膜中感光细胞的凋亡并维持外核层的厚度,挽救视网膜电生理功能。NPD1减少NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC的凋亡并维持其电生理反应。4.本课题创新性地利用视网膜外植体培养技术,在组织水平上离体研究了SPM对于退行性病变视网膜中炎症反应的调控作用,并证实LXA4显着降低RD1小鼠变性晚期视网膜中CCL-2的产生与分泌。这明确了LXA4对小胶质细胞激活的抑制作用是其限制退行性病变视网膜炎症的重要机制。5.本课题率先报道在NMDA损伤视网膜大鼠模型的视网膜中calpains参与的RGC凋亡途径,并发现外源性NPD1通过降低NMDA损伤大鼠视网膜calpain 1的表达来发挥其对RGC的抗凋亡作用。这为延缓视网膜退行性疾病中进行性的神经细胞变性和凋亡提供了新的干预靶点。
崔璇[9]（2019）在《视网膜小胶质细胞在小鼠视网膜色素变性模型中的作用的研究》文中认为研究背景小胶质细胞（Microglial cells,MGCs）具有维持组织稳定的功能;在中枢神经系统疾病和视网膜退行性变（如青光眼、糖尿病眼病和老年黄斑变性）,最新的研究结果证明了活化的小胶质细胞参与了疾病的进展。作为中枢神经系统和视网膜的免疫细胞,视网膜小胶质细胞对视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa,RP）的作用目前仍不清楚。在本次研究中,我们将探讨视网膜小胶质细胞在视网膜色素变性发生发展中的作用,为视网膜色素变性的预防和诊治提供新的策略。研究目的1.探究视网膜小胶质细胞在由不同基因突变造成的视网膜色素变性模型中的密度、分布和激活状态。2.在利用Cre-LoxP-STOP系统建立的新的视网膜色素变性小鼠模型种,探究视网膜小胶质细胞在病程进展中的密度、分布和激活状态随时间变化的情况。3.使用Cre-LoxP-STOP系统在视网膜色素变性的早、中、晚期进行基因治疗,以探究基因治疗对疾病病程的影响,以及对视网膜小胶质细胞的密度、分布和激活状况的改变。研究方法和结果在第一部分实验中,我们使用了Pde6αD670G/D670G和Pde6βH620Q/H620Q两种小鼠模型。这两种小鼠模型的基因突变位点与两位视网膜色素变性患者的基因突变的位点造成的的氨基酸改变一致,都分别位于PDE6（3’,5’-cyclic-nucleotide phosphodiesterase,环核苷酸磷酸二酯酶）的α和β亚基的催化基团上。依据PDE6在人和小鼠种属间的同源性,我们预测,两种小鼠模型的致病原理与两位患者的致病原理相似,故该小鼠模型最大程度的模拟了视网膜色素变性患者的疾病状态。之后,我们将该两种小鼠模型与可以特异性的在小胶质细胞中高表达绿色荧光蛋白（GFP）的Cx3cr1GFP/+小鼠模型杂交,以便更好的观察在小鼠视网膜色素变性时,视网膜小胶质细胞的形态改变及其在视网膜各层中分布的改变。在我们获得的Cx3cr1GFP/+Pde6αD670G/D670G和Cx3cr1GFP/+Pde6βH620Q/H620Q两种视网膜色素变性模型中,视网膜感光细胞层厚度在4周时有不同程度的降低,而视网膜小胶质细胞均呈现密度增加的现象。且在疾病模型中,视网膜小胶质细胞活化,细胞体增大呈气球样。另外,在对照小鼠中,视网膜小胶质细胞分布于外丛状层和内层神经层;而在疾病模型中,视网膜小胶质细胞分布于视网膜全层,尤其是细胞凋亡严重的区域:视网膜外核层和内、外节盘膜层。在第二部分实验中,我们引入了Pde6βSTOP/STOP小鼠模型,并利用Cre-LoxP-STOP体系,建立一个可以进行基因治疗的疾病模型,其基因型为Cx3cr1GFP/+Pde6γCre/+Pde6βH620Q/STOP。在该小鼠模型中,感光细胞层厚度随时间变化逐渐减低,且感光细胞对光刺激的反应逐渐减小。而在整个疾病进程的中期,视网膜小胶质细胞的密度呈现稳定的平台期,持续并稳定的维持在高于对照小鼠模型的水平;直至疾病晚期,感光细胞的大量死亡之后,活化的视网膜小胶质细胞的密度逐渐降低。且类似的,在该模型中,视网膜小胶质细胞的细胞体增大呈气球样,并分布于全层视网膜,尤其是外核层和内、外节盘膜层,即细胞凋亡发生的区域。此部分实验为后续的基因治疗之后,观察小胶质细胞的形态变化及在视网膜中的分布的变化提供了背景基础。在第三部分实验中,通过在早、中、晚期三个时间点对Cx3cr1GFP/+Pde6γCre/+Pde6βH620Q/STOP小鼠模型进行基因治疗。我们发现在三个治疗时间点治疗后2周,视网膜色素变性的病程均停滞,并可以在很长时间内维持稳定;并且越早治疗,对视网膜感光细胞的保护作用越好。此外,视网膜小胶质细胞不会因为治疗时间的不同而出现差异:不同的时间点进行治疗时,视网膜小胶质细胞的密度在治疗后2周依然维持在较高水平,治疗后6周内恢复至对照小鼠的密度。且视网膜小胶质细胞的分布均于治疗后4-6周逐渐局限于内外从状层和内层神经视网膜层内,并逐渐恢复至高度分枝状,呈现去激活状态。研究结论1.视网膜小胶质细胞在不同的Pde6突变小鼠模型中,均呈现活化状态,并分布于细胞凋亡的区域,比如外核层和内外节盘膜层。2.在视网膜色素变性病程中期,视网膜小胶质细胞密度高于对照并维持稳定,直至病程晚期;病程晚期时,感光细胞大量死亡之后,视网膜小胶质细胞的密度呈现下降趋势。3.利用Cre-LoxP-STOP系统对小鼠进行基因治疗,治疗后2周,视网膜色素变性的病程均停滞,并可以在很长时间内维持稳定;但视网膜小胶质细胞的密度在治疗后2周依然维持在较高水平,于治疗后6周之内恢复至对照小鼠的视网膜小胶质细胞密度,同时其分布和形态恢复至正常状态。4.利用Cre-LoxP-STOP系统在病程进展的不同时期进行基因治疗时,早期治疗的视网膜感光细胞层的厚度和感光细胞对光刺激的反应幅度的效果明显好于晚期治疗;而视网膜小胶质细胞对治疗的反应的变化情况却不会因为治疗时间的不同而出现差异。
孙鹏程[10]（2019）在《基于光学成像的经角膜电刺激视网膜诱发视觉通路响应特性研究》文中研究说明人类从外界环境获取的信息绝大部分来自于视觉感知,作为最重要的感觉系统,视觉传导通路中任意位置发生结构性或功能性损伤都会造成视力受损甚至失明。神经电刺激作为一种近些年迅速发展的治疗策略,针对一些常规药物手术治疗无法起效的疾病,有着十分显着的治疗效果。在人工视觉修复的研究领域中,特别是对于不可治愈性的视网膜退化疾病,侵入式（有创）视网膜电刺激（即视网膜假体）效果显着,已经取得了长足的进步和发展。同时无创的视网膜电刺激也被证实具有神经保护作用,在治疗视觉系统疾病以及评估患者视觉通路功能等方面也得到广泛关注。虽然电刺激视网膜能够引起人工视觉感知,但是与正常视觉刺激诱发响应相比,仍然存在许多不同之处。系统客观的比较这两种刺激在视觉系统中诱发响应的异同能够进一步帮助理解其中的神经机制,然而目前类似的研究尚不够充分。因此本研究围绕这一系列问题,基于光学成像技术,采用无创的经角膜电刺激（Transcorneal Electrical Stimulation,TES）,开展动物（猫）在体实验研究,研究TES诱发视觉通路（视觉皮层及视网膜）响应的时空特性,比较其与视觉刺激诱发响应的异同,探讨潜在的神经机制。电刺激视网膜是否能够在视觉皮层诱发与正常光刺激相似的皮层响应,视觉系统在处理正常视觉信息和外源性电刺激的过程中存在哪些差异,直接比较这两种刺激引起皮层响应的时空模式可以直观地帮助探究这些问题。本研究采用无创的TES方式,可以在不损伤视觉通路的前提下与视觉刺激直接比较,基于内源信号光学成像技术,记录了不同参数的两种刺激在视觉皮层诱发的响应,通过比较两种刺激诱发皮层响应的时空模式,分析推断视觉系统在处理视网膜电刺激的过程中可能存在的神经机制。结果表明:TES与视觉刺激诱发的皮层响应峰值时间无明显差异,但TES诱发响应的延迟期更短;与全视野视觉刺激相比,当电流强度大于1.2 mA时,TES在18区诱发的响应更强;视觉刺激诱发的皮层响应存在视网膜拓扑映射关系,而TES优先激活视觉皮层18区,当刺激强度大于3.6 mA时17区神经元才被激活;TES激活17区的电流强度明显高于18区的激活阈值电流。考虑到TES诱发响应在17/18区边界的变化规律,我们推测TES在视觉皮层引起的响应不仅与刺激电流在视网膜处形成的电场分布有关,还会受到不同视网膜神经元之间电刺激激活阈值差异的影响。本研究通过比较两种刺激诱发皮层响应的异同,分析探讨了视觉系统在处理外源性电刺激时可能存在的神经机制,同时也为TES临床应用提供了一些实验理论支持。视网膜是一种具有多层结构的复杂神经组织,不同层视网膜细胞的电刺激响应特性存在差异,目前电刺激诱发视网膜响应的具体规律仍不清楚,因此探索电刺激引起不同层视网膜细胞的响应对于研究电刺激激活视网膜细胞的神经机制十分重要。但是由于电刺激伪迹的干扰,之前的研究多是采用电生理方法记录离体视网膜细胞响应,或在体记录后端视觉通路响应间接反映视网膜细胞的响应。本研究首次将光学相干层析成像（Optical Coherence Tomography,OCT）应用在电刺激视网膜响应的研究,利用其优良的轴向分辨率,并使用不阻挡成像光路的TES作为刺激方式,研究电刺激诱发视网膜不同层细胞响应的时空模式,同时比较视觉刺激与电刺激诱发视网膜响应的异同。结果表明:在分割的三层视网膜（内层视网膜、外层视网膜和视网膜下腔）中,TES均能够引起显着的正负两相内源性光学散射信号（Intrinsic Optical Signals,IOSs）,外层视网膜响应最弱;刺激强度与IOSs具有正相关性,但并不显着;TES在三层视网膜引起响应的潜伏期均短于85 ms,响应上升时间随着刺激强度的增大而变长;通过比较神经阻断剂抑制视网膜细胞神经活动前后TES诱发IOSs,我们认为OCT记录到的IOSs主要来源于视网膜神经活动;比较视觉刺激与电刺激诱发视网膜响应的时间特性,发现视觉刺激诱发的IOSs在刺激开始后立刻产生并持续增加,直至刺激结束后几百毫秒才开始减弱,而TES诱发的IOSs在刺激开始时立刻出现并很快达到峰值,然后一直保持在相对稳定的水平,直到刺激结束后才开始缓慢减弱,所以我们认为电刺激诱发的IOSs是一种与刺激电场高度同步的响应。该部分研究结果进一步帮助理解电刺激诱发视网膜响应的时空模式及潜在的神经机制。本文利用光学成像技术研究了经角膜电刺激诱发视觉皮层和视网膜的具体响应模式和时空特性,并与视觉刺激诱发的响应进行比较。研究结果探索了电刺激诱发视觉通路响应潜在的神经机制,为电刺激视网膜在视觉功能修复及视觉系统疾病治疗方面提供实验基础,有助于非侵入式经角膜电刺激在临床视觉系统疾病治疗及视觉通路功能评估等领域的应用。
二、视网膜色素变性患者视觉电生理观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、视网膜色素变性患者视觉电生理观察（论文提纲范文）
（1）视网膜色素变性盲人视通路功能评价的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 视网膜色素变性盲人视网膜、视神经及视觉皮层下中枢功能检测的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 视网膜色素变性盲人的基本临床信息 |
| 2.3.2 视网膜色素变性盲人的视网膜结构及功能研究 |
| 2.3.3 视网膜色素变性盲人视神经功能研究 |
| 2.3.4 视网膜色素变性盲人视觉皮层下中枢功能研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 视网膜色素变性盲人fMRI视皮层功能检测的定性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 视网膜色素变性盲人及正常人的基本临床信息 |
| 3.3.2 视网膜色素变性盲人的视觉皮层激活情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 视网膜色素变性盲人fMRI视皮层功能检测的定量研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 视网膜色素变性盲人及正常人的基本临床信息 |
| 4.3.2 闪光视觉刺激下视网膜色素变性盲人视皮层激活的变化 |
| 4.3.3 棋盘格翻转视觉刺激下视网膜色素变性盲人视皮层激活的变化 |
| 4.3.4 闪光视觉刺激下视网膜色素变性盲人视皮层相关脑区之间功能连接网络变化 |
| 4.3.5 棋盘格翻转视觉刺激下视网膜色素变性盲人视皮层相关脑区之间功能连接网络变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 fMRI在视网膜色素变性中的应用与进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）中国西部区域人群Leber先天性黑曚的分子遗传学与临床表型研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 Leber先天性黑曚分子遗传学研究的重要性 |
| 1.2 Leber先天性黑曚的临床和遗传异质性 |
| 1.3 Sanger测序和第二代测序技术为Leber先天性黑曚的致病基因筛查提供重要手段 |
| 1.4 中国人群Leber先天性黑曚的临床表型分析和分子遗传学研究 |
| 第二章 中国西部区域人群Leber先天性黑曚的主要基因表达谱 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 中国西部区域人群Leber先天性黑曚的主要基因表达谱与临床表型的相关性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Leber先天性黑曚的分子遗传学研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表文章及成果 |
| 致谢 |
（3）ASRGL1在视网膜色素变性中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 视网膜色素变性的发病机制及研究现状 |
| 1.1.1 视网膜色素变性的概述 |
| 1.1.2 视网膜色素变性的发病机制 |
| 1.1.2.1 基因突变导致视细胞功能紊乱 |
| 1.1.2.2 免疫机制 |
| 1.1.3 视网膜色素变性的治疗进展 |
| 1.1.3.1 细胞治疗 |
| 1.1.3.2 基因治疗 |
| 1.1.3.3 神经保护治疗 |
| 1.1.3.4 营养疗法 |
| 1.2 ASRGL1的功能及其相关机制 |
| 1.2.1 ASRGL1的概述 |
| 1.2.2 ASRGL1的相关功能 |
| 1.3 本文的研究内容及结构安排 |
| 1.3.1 研究的主要内容 |
| 1.3.2 技术路线及结构安排 |
| 第二章 实验材料与研究方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验质粒和细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 常用试剂配制 |
| 2.1.4 实验器材设备 |
| 2.1.5 实验小鼠的构建与观察 |
| 2.1.6 基因敲除小鼠引物列表 |
| 2.1.7 抗体列表 |
| 2.2 实验方法及步骤 |
| 2.2.1 质粒载体转化与提取 |
| 2.2.2 细胞培养及相关实验 |
| 2.2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2.2 细胞复苏 |
| 2.2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.2.5 细胞爬片 |
| 2.2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.2.7 细胞免疫荧光 |
| 2.2.3 小鼠基因分型 |
| 2.2.3.1 待鉴定小鼠DNA样本获取 |
| 2.2.3.2 基因鉴定 |
| 2.2.4 小鼠视网膜实验 |
| 2.2.4.1 小鼠视网膜RNA提取 |
| 2.2.4.2 小鼠视网膜蛋白提取 |
| 2.2.4.3 Western blotting |
| 2.2.4.4 小鼠视网膜电生理 |
| 2.2.4.5 小鼠视网膜冰冻切片 |
| 2.2.4.6 小鼠视网膜免疫荧光染色 |
| 2.2.4.7 小鼠视网膜石蜡切片 |
| 2.2.4.8 小鼠眼球视网膜HE染色 |
| 2.2.5 视网膜转录组测序 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 Asrgl1在小鼠器官的表达与细胞亚定位 |
| 3.2 Asrgl1基因敲除小鼠敲除效率验证 |
| 3.2.1 DNA水平上验证Asrgl1敲除效率 |
| 3.2.2 RNA水平上验证Asrgl1敲除效率 |
| 3.3 Asrgl1基因敲除小鼠视网膜电生理异常 |
| 3.4 Asrgl1基因敲除导致小鼠视网膜外核层变薄 |
| 3.5 Asrgl1基因敲除导致小鼠胶质增生和细胞凋亡 |
| 3.6 Asrgl1导致RP致病机制的初步结果 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 讨论和分析 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 未来展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（4）人类及猕猴视网膜衰老单细胞图谱（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 哺乳类动物的视网膜结构 |
| 1.1.1 哺乳类动物视网膜的结构特征 |
| 1.1.2 小鼠等啮齿类动物视网膜与灵长类动物视网膜的差异 |
| 1.2 灵长类动物中央凹(黄斑)区的特殊性 |
| 1.2.1 中央凹区特化的生理结构及功能 |
| 1.2.2 中央凹区形成的分子机制及细胞过程 |
| 1.3 啮齿类及灵长类视觉系统的衰老 |
| 1.3.1 视觉衰老以及啮齿类动物的视觉系统衰老特征 |
| 1.3.2 灵长类的视觉系统衰老特征 |
| 1.3.3 中央凹区的疾病易感性 |
| 1.4 单细胞测序技术及其在视网膜研究领域的应用 |
| 1.4.1 单细胞转录组测序技术 |
| 1.4.2 单细胞测序技术在视网膜研究领域的应用 |
| 1.5 本课题的选题目的及主要研究内容 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料获取与知情同意 |
| 2.2 人类及猕猴视网膜组织样品获取以及预处理 |
| 2.3 实验试剂,耗材,仪器设备 |
| 2.3.1 试剂与试剂盒 |
| 2.3.2 抗体 |
| 2.3.3 仪器设备 |
| 2.3.4 溶液 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 视网膜单细胞悬液制备 |
| 2.4.2 视网膜单细胞测序文库构建与测序 |
| 2.4.3 视网膜ATAC测序文库构建 |
| 2.4.4 数据分析 |
| 2.4.5 人类,猕猴视网膜组织固定,包埋及切片 |
| 2.4.6 免疫荧光 |
| 2.4.7 RNA-SCOPE原位杂交 |
| 第3章 实验结果与结论 |
| 3.1 人类及非人灵长类恒河猴视网膜衰老单细胞转录图谱 |
| 3.1.1 人类视网膜衰老单细胞转录图谱 |
| 3.1.2 鉴定出新的人类视网膜细胞类型 |
| 3.1.3 猕猴视网膜衰老单细胞图谱 |
| 3.1.4 人类和猕猴视网膜的跨物种转录组比较 |
| 3.2 人类与猕猴的视杆细胞亚型 |
| 3.3 双极细胞物种间保守性 |
| 3.4 人类及猕猴视网膜中央凹区与外周区差异 |
| 3.4.1 穆勒胶质细胞与视锥细胞具有区域特异性基因表达模式 |
| 3.4.2 穆勒胶质细与视锥细胞区域特异基因表达模式相关性 |
| 3.4.3 水平细胞亚型具有区域分布差异 |
| 3.5 人类视网膜衰老表征 |
| 3.5.1 视网膜衰老上调基因与下调基因生物学功能 |
| 3.5.2 视网膜衰过程中细胞类型比例变化 |
| 3.5.3 视杆细胞亚型具有不同的衰老耐受性 |
| 3.5.4 衰老过程中细胞与细胞间通讯的改变 |
| 3.6 中央凹区与外周区的衰老差异 |
| 3.6.1 中央凹区与外周区衰老程度存在差异 |
| 3.6.2 中央凹区与外周区差异在衰老过程中的变化 |
| 3.7 人类视网膜疾病基因表达图谱 |
| 第4章 讨论与展望 |
| 4.1 人类与猕猴视网膜单细胞图谱 |
| 4.2 人类与猕猴视网膜细胞类型的保守程度 |
| 4.3 新的视杆细胞亚型以及其在人类与猕猴视网膜中的分布差异 |
| 4.4 中央凹区与外周区差异 |
| 4.5 人类视网膜衰老过程中细胞与转录组变化以及区域衰老差异 |
| 4.6 人类视网膜疾病图谱 |
| 4.7 总结 |
| 4.8 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表一 人类视觉疾病中英文对照表 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 |
（6）hESC-RPE衍生的外泌体参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 外泌体概述 |
| 1.2 外泌体与免疫 |
| 1.3 外泌体与眼科疾病的免疫学关系 |
| 1.4 展望 |
| 2. 绪论 |
| 3. Nor-EXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料及方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4. IFN-γEXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5. 全文结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表文章及参与课题 |
| 致谢 |
（7）Reep6.1基因功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 视网膜的结构与功能 |
| 1.1.1 视网膜简介 |
| 1.1.2 视觉信号的形成 |
| 1.2 视网膜色素变性的研究 |
| 1.2.1 疾病简介 |
| 1.2.2 疾病的发生和致病因素研究 |
| 1.2.3 疾病治疗 |
| 1.3 Reep6基因研究概况 |
| 1.3.1 Reep6基因 |
| 1.3.2 Reep6基因在视网膜中的研究 |
| 1.4 研究意义 |
| 1.5 主要工作安排 |
| 1.6 论文结构安排 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂和耗材 |
| 2.1.2 配制溶液 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.1.4 抗体列表 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠模型的构建和小鼠饲养 |
| 2.2.2 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 视网膜电图检测 |
| 2.2.4 视网膜冰冻切片 |
| 2.2.5 视网膜免疫荧光染色 |
| 2.2.6 视网膜全蛋白提取 |
| 2.2.7 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Reep6.1基因5号外显子敲除小鼠模型鉴定 |
| 3.1.1 敲除小鼠基因分型 |
| 3.1.2 敲除小鼠视网膜中不表达REEP6.1 |
| 3.2 Reep6.1基因5号外显子敲除影响小鼠视网膜功能 |
| 3.3 Reep6.1基因5号外显子缺失对小鼠光感受器结构的影响 |
| 3.3.1 视网膜外核层厚度变化 |
| 3.3.2 光感受器外节变化 |
| 3.4 Reep6.1基因5号外显子缺失对光信号转导相关蛋白的影响 |
| 3.5 本章总结 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 4.1 Reep6.1基因5号外显子缺失导致小鼠视网膜功能异常 |
| 4.2 Reep6.1基因5号外显子缺失导致小鼠光感受器结构和功能异常 |
| 4.2.1 敲除小鼠光感受器结构异常 |
| 4.2.2 敲除小鼠光信号转导途径异常 |
| 4.3 视网膜变性疾病的治疗 |
| 4.4 Reep6基因小鼠模型的构建 |
| 4.5 本章总结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 未来工作与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（8）特异性促消退介质延缓视网膜退行性疾病进展及其机制的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 LXA4延缓视网膜变性疾病的进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型的RGC |
| 3.1 引言 |
| 3.2 NPD1保护NMDA损伤视网膜大鼠模型RGC的作用研究 |
| 3.3 NPD1对NMDA损伤视网膜大鼠模型RGC保护作用的机制研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 视网膜退行性疾病中细胞凋亡的机制 |
| 参考文献 |
| 学习期间在投和已发表的论文 |
| 致谢 |
（9）视网膜小胶质细胞在小鼠视网膜色素变性模型中的作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、视网膜小胶质细胞在多种视网膜色素变性模型中的生物学特征研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物和实验仪器药品 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 数据统计 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 Pde6 基因突变导致患者视网膜色素变性 |
| 1.2.2 患者PDE6的3D蛋白质结构分析,显示Pde6α ~(Q569K/Q569K)和Pde6β~(V778M/V778M)患者的突变造成的蛋白质结构变化均出现在PDE6蛋白α和β亚基的催化基团 |
| 1.2.3 小鼠模型与患者的PDE6蛋白质的同源性和突变位点的比较 |
| 1.2.4 验证两种动物模型是否经历视网膜色素变性的病程 |
| 1.2.5 在两种视网膜色素变性小鼠模型中,视网膜小胶质细胞的密度均增加,但是在视网膜中呈现不同的分布模式 |
| 1.2.6 在两种视网膜色素变性模型中,外核层厚度随时间变化逐渐减小,视网膜小胶质细胞被激活,且分布于视网膜外核层和内外节盘膜层 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、视网膜小胶质细胞随视网膜色素变性病程进展的生物学特性的变化情况 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物和实验仪器药品 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 数据统计 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 引入 Pde6β STOP/STOP，建立 Cx3cr1GFP/+Pde6βSTOP/STOP小鼠模型并分析。 |
| 2.2.2 建立新的小鼠模型Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/STOP) |
| 2.2.3 Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~ (H620Q/STOP)小鼠模型的感光细胞层厚度和视网膜功能随时间进展不断下降,持续到约16周 |
| 2.2.4 Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/STOP)小鼠模型中,视网膜小胶质细胞的密度在病程中期维持稳定,并在晚期呈现下降趋势,但整个过程中视网膜小胶质细胞的密度均高于对照小鼠模型 |
| 2.2.5 Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/STOP)小鼠模型中,视网膜小胶质细胞在疾病模型中呈现激活状态并分布于全层视网膜 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、基因治疗视网膜色素变性对视网膜小胶质细胞的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物和实验仪器药品 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 数据统计 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/STOP)小鼠模型接受他莫昔芬治疗后,基因型变为Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/+) |
| 3.2.2 Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/STOP)小鼠模型2周(早期)行基因治疗,疾病病程在治疗后2周停止,而视网膜小胶质细胞的密度逐渐下降至治疗后6周时恢复至正常水平,并维持稳定 |
| 3.2.3 Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/STOP)小鼠模型4周(中期)行基因治疗,疾病病程在治疗后2周停止,且视网膜小胶质细胞密度逐渐下降至治疗后6周时恢复至正常水平,并维持稳定 |
| 3.2.4 Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/STOP)小鼠模型8周(晚期)行基因治疗,疾病病程在治疗后2周停止,且视网膜小胶质细胞密度逐渐下降至治疗后6周时恢复至正常水平,并维持稳定 |
| 3.2.5 Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/STOP)小鼠模型在疾病的早、中、晚期行基因治疗,视网膜功能检测疾病病程在治疗后2周内停滞,且越早治疗效果越好 |
| 3.2.6 在不同的时间点对Cx3cr1~(GFP/+)Pde6γ~(Cre/+)Pde6β~(H620Q/STOP)小鼠模型进行治疗时,治疗后2周,视网膜色素变性的疾病病程停滞;而视网膜小胶质细胞的分布在治疗后逐渐向对照小鼠模型过渡,其密度逐渐下降 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 小胶质细胞与视网膜退行性疾病研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于光学成像的经角膜电刺激视网膜诱发视觉通路响应特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 视觉系统简介 |
| 1.1.1 视觉传导通路 |
| 1.1.2 眼和视网膜 |
| 1.1.3 视神经和外侧膝状体 |
| 1.1.4 视觉皮层 |
| 1.2 视网膜电刺激及其应用 |
| 1.2.1 视觉损伤 |
| 1.2.2 假体视网膜电刺激 |
| 1.2.3 非侵入式视网膜电刺激 |
| 1.3 视网膜电刺激诱发视觉通路响应特性及神经机制的研究 |
| 1.3.1 电刺激视网膜诱发视觉皮层响应及其与视觉诱发响应的差异 |
| 1.3.2 电刺激视网膜响应特性的研究 |
| 1.4 论文主要内容和创新 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 视觉刺激与经角膜电刺激诱发皮层响应的比较 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料方法与实验设计 |
| 2.2.1 实验动物(猫)视觉系统简介 |
| 2.2.2 动物实验手术过程 |
| 2.2.3 内源信号光学成像(OIS)记录 |
| 2.2.4 视觉刺激和经角膜电刺激 |
| 2.2.5 数据处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 初级视觉皮层17/18区边界的划分 |
| 2.3.2 视觉刺激与经角膜电刺激诱发响应的时空模式 |
| 2.3.3 视觉刺激与TES诱发皮层响应的幅值特性 |
| 2.3.4 视觉刺激与TES诱发响应的空间变化模式 |
| 2.3.5 皮层响应在17/18区边界附近的变化规律 |
| 2.4 实验结果讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 经角膜电刺激诱发视网膜不同层细胞的响应研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料方法与实验设计 |
| 3.2.1 实验动物视觉系统简介 |
| 3.2.2 动物实验过程 |
| 3.2.3 光学相干层析成像(OCT)记录 |
| 3.2.4 经角膜电刺激及视觉刺激 |
| 3.2.5 视网膜神经活动的阻断 |
| 3.2.6 实验方案 |
| 3.2.7 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 TES诱发视网膜内源性散射相对变化的特性 |
| 3.3.2 TES诱发IOSs来源的研究 |
| 3.3.3 闪烁光与TES诱发IOSs的比较 |
| 3.4 实验结果讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 研究总结 |
| 4.1.1 视觉刺激与经角膜电刺激诱发皮层响应的比较 |
| 4.1.2 经角膜电刺激诱发视网膜不同层细胞的生理响应研究 |
| 4.2 研究创新点 |
| 4.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩写对照 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
四、视网膜色素变性患者视觉电生理观察（论文参考文献）
- [1]视网膜色素变性盲人视通路功能评价的研究[D]. 欧阳旺斌. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021
- [2]中国西部区域人群Leber先天性黑曚的分子遗传学与临床表型研究[D]. 朱路瑶. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021
- [3]ASRGL1在视网膜色素变性中的功能研究[D]. 田万里. 电子科技大学, 2021(01)
- [4]人类及猕猴视网膜衰老单细胞图谱[D]. 易文洋. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [5]视觉电生理诊断流程指南[J]. Robson A. G.;. 中华眼科杂志, 2020(07)
- [6]hESC-RPE衍生的外泌体参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究[D]. 张欢. 西南大学, 2020(01)
- [7]Reep6.1基因功能研究[D]. 林永琼. 电子科技大学, 2020(07)
- [8]特异性促消退介质延缓视网膜退行性疾病进展及其机制的研究[D]. 卢紫阳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [9]视网膜小胶质细胞在小鼠视网膜色素变性模型中的作用的研究[D]. 崔璇. 天津医科大学, 2019(02)
- [10]基于光学成像的经角膜电刺激视网膜诱发视觉通路响应特性研究[D]. 孙鹏程. 上海交通大学, 2019(06)