一、NO与肝脏缺血再灌注损伤预处理保护效应（论文文献综述）
张世龙[1]（2021）在《杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中提出目的:明确杜仲桃叶珊瑚苷（AU）对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）的保护效应;并通过体内、体外实验对其保护机制进行深入探讨。方法:1.明确杜仲AU是否通过抗炎、抗氧化发挥对HIRI的保护效应。40只雄性SD大鼠（SPF级）随机分为5组,每组8只。分别设假手术组（Sham）,杜仲AU低剂量组（AU-L）、中剂量组（AU-M）、高剂量组（AU-H）及缺血再灌注损伤组（IRI）。其中AU-L、AU-M和AU-H组分别予AU 1、5、10mg/kg·d腹腔注射,Sham、IRI组予相同体积生理盐水腹腔注射。连续预处理10d后,除Sham组外,其余各组均建立HIRI模型（70%肝脏缺血1h,再灌注6h）。收集大鼠血清及再灌注肝组织进行相关指标检测。肝脏HE染色观察再灌注肝组织病理损伤情况;全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平,以了解肝功能损伤情况;ELISA法检测血清中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）及白细胞介素-1b（IL-1b）的含量,了解促炎细胞因子释放情况;硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法及荧光探针技术分别检测再灌注肝组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及活性氧（ROS）生成情况,了解氧化应激水平。2.探讨杜仲AU对HIRI的保护机制。（1）杜仲AU对HIRI无菌炎症反应的影响。（1）体内实验,在整体水平上明确杜仲AU是否通过下调HMGB1的表达和/或主动分泌,影响TLR-4/NF-k B信号通路,抑制HIRI无菌炎症反应。取HIRI保护效应最优的AU组及Sham、IRI组的再灌注肝组织进行以下指标检测:实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（WB）法分别检测HMGB1、Toll样受体4（TLR-4）及高度糖基化终产物受体（RAGE）的m RNA及蛋白水平,了解HMGB1、TLR-4及RAGE的表达情况;WB检测干扰素调节因子1（IRF-1）、免疫沉淀（IP）联合WB检测乙酰化HMGB1（Ac-HMGB1）,了解HMGB1主动分泌情况;WB检测髓样分化因子88（My D88）、核因子k B-p65（p65）、磷酸化p65（P-p65）、核因子k B抑制蛋白a（Ik B-a）、磷酸化Ik B-a（P-Ik B-a）、肝组织细胞核内p65蛋白、IL-1b及TNFa等的蛋白水平,了解杜仲AU对NF-k B炎症反应通路的影响。（2）体外实验,在细胞水平进一步明确杜仲AU对TLR-4/NF-k B通路的影响。选取人正常肝细胞株HL-7702（LO2）,构建TLR-4过表达LO2稳转细胞株。分为正常LO2组（NC）、空质粒转染组（EPT）、TLR-4过表达组（OE）、TLR-4过表达+杜仲AU组（AU）和TLR-4过表达+TLR-4受体抑制剂TAK-242组（TAK）。将各组细胞接种于6孔板,AU组和TAK组用含不同浓度AU或TAK-242的完全培养基培养48h,余下三组用普通完全培养基培养48h,收集细胞悬液。CCK-8检测杜仲AU和TAK-242对LO2细胞活力的影响;WB检测各组TLR-4、My D88、P-p65和P-Ik B-a蛋白水平,探讨杜仲AU对TLR-4/NF-k B信号通路相关蛋白的影响。（2）体内实验初步探讨杜仲AU对HIRI所致细胞凋亡的影响。取HIRI保护效应最优AU组及Sham、IRI组的再灌注肝组织进行以下指标检测:TUNEL法观察细胞凋亡现象;WB检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α）、解偶联蛋白2（UCP2）、caspase3和cleaved caspase3的蛋白水平,以初步了解杜仲AU对线粒体损伤介导细胞凋亡途径的影响。结果:1.不同剂量杜仲AU对大鼠HIRI的保护效应:AU-M组病理学评分较IRI组明显降低（P<0.05）,AU-L和AU-H组病理学评分较IRI组无明显差异（P>0.05）;与IRI组相比,三种剂量杜仲AU均能下调血清中ALT、AST、TNF-a、IL-1b和HMGB1水平,减少肝组织中ROS、MDA生成,增加肝组织SOD的表达,差异均具统计学意义（P<0.05）;其中AU-M组ALT、AST、HMGB1、TNF-a、IL-1b、MDA、ROS降低及SOD升高最为显着（P<0.05）。2.杜仲AU减轻HIRI分子机制:（1）杜仲AU对无菌炎症反应的影响:（1）体内实验,相较于IRI组,AU-M组肝组织中HMGB1、TLR-4和RAGE的m RNA及蛋白水平显着降低（P<0.05）;IRF-1和Ac-HMGB1,My D88、p65、P-p65、P-Ik B-a和入核p65,以及IL-1b、TNF-a的蛋白水平均明显降低（P<0.05）;Ik B-a蛋白水平明显升高（P<0.05）。（2）体外实验,与EPT组相比,NC组的TLR-4水平无明显变化（P>0.05）,而OE组的TLR-4水平明显升高（P<0.05）;杜仲AU（8μM）和TAK-242（4μM）预处理均能够明显减少肝细胞内TLR-4、My D88、P-p65和P-IκB-α的蛋白水平（P<0.05）,且两组之间除TLR-4水平存在差异（P<0.05）,其余指标均无显着差异（P>0.05）。（2）杜仲AU对HIRI所致细胞凋亡的影响:TUNEL染色结果显示:与Sham组相比,IRI组标记凋亡细胞的荧光明显增强,荧光区域明显增大;而AUM组的荧光较IRI组明显减弱,荧光区域也明显减小。AU-M组肝组织细胞中caspase3和cleaved caspase3蛋白水平较IRI组明显降低,而PGC-1α和UCP2蛋白水平明显升高（P<0.05）。结论:1.杜仲AU（1、5、10mg/kg·d）均可通过抗炎、抗氧化作用发挥对大鼠HIRI的保护效应,以5mg/kg·d AU保护效应最佳。2.杜仲AU可通过下调HMGB1表达及减少HMGB1主动分泌,进而抑制TLR-4/NF-k B信号通路,减轻HIRI无菌炎症反应,发挥对HIRI的保护效应。3.杜仲AU还可能通过抑制线粒体损伤介导的细胞凋亡途径,发挥对HIRI的保护效应。
刘环秋[2]（2021）在《CCN1敲低通过ERK通路对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:肝缺血/再灌注损伤（HIRI）,是肝移植和肝切除后对肝脏造成不可逆损伤的重要的危险因素,是临床上一个非常具有挑战性的问题。器官缺血-再灌注损伤（IRI）是临床治疗中一个非常常见也非常棘手并且一直没有得到解决的难题。到目前为止,肝移植仍然是治疗终末期肝病和肝恶性肿瘤唯一有效的治疗手段,但是由于供体的短缺导致大量的病人不能如愿等到供体就已经死亡。活体肝移植虽然在很大程度上缓解了供体短缺的问题,但是关于供体供肝之后出现严重并发症的病例也有报道,因此人们对活体肝移植也变的越来越谨慎。近年来,人们不断尝试使用老龄化供肝、脂肪肝以及心脏死亡供肝等边缘性供肝来缓解供体的不足,然而这些边缘性供肝对缺血再灌注损伤更加敏感,也导致了临床上HIRI病例的增加。肝移植和肝切除术后肝IRI是导致患者术后并发症和死亡率增加的主要原因,大约有10%的早期移植失败是由肝IRI引起的,此外IRI还增加了肝功能障碍和器官排斥的风险。无肝期缺血以及新肝期再灌注引起的肝脏IRI是导致肝部分切除和肝移植术后肝功能衰竭的主要原因。然而到目前为止尚没有可以治疗肝IRI的有效方法。因此,对肝脏IRI的病理机制的研究,以及建立临床上有效并且易于实施的技术手段,对于肝脏IRI预防和治疗至关重要。CCN1/Cyr61是CCN蛋白家族的一员,通过结合不同的配体,调节不同的细胞过程,如细胞粘附、迁移、分化、增殖和凋亡,参与血管生成、炎症和纤维组织修复的过程。CCN1甚至被确定为心肌及肾损伤的早期生物标志物,根据肝IRI中CCN1水平的增加,我们推测CCN1可能参与调节肝IRI的过程。参与炎症反应和细胞凋亡的CCN1在肝缺血再灌注损伤时表达上调,但其内在的机制尚未知晓。内质网广泛存在于真核细胞,是负责蛋白质合成、折叠、转运和成熟的细胞器,内质网通过激活未折叠蛋白反应来抵抗由于内质网应激引起的细胞损伤,恢复细胞功能。据报道内质网应激在肝IRI的发病机制中起着至关重要的作用;研究显示细胞内CCN1可以通过内质网应激触发未折叠蛋白反应激活诱导肝星形细胞凋亡。因此我们拟通过在体内建立肝缺血-再灌注（IR）模型,体外建立了低氧/复氧（HR）模型,以探讨CCN1在肝IRI中是否通过ERK通路调节细胞凋亡、炎症反应或内质网应激。研究目的:（1）CCN1在肝缺血再灌注损伤中的作用;（2）CCN1敲低是否可以对肝缺血再灌注损伤起到保护作用;（3）肝IRI时,CCN1在内质网应激中的作用,以及它是否通过内质网应激调节肝IRI过程;（4）为肝缺血再灌注损伤提供进一步的理论基础;（5）为临床肝缺血再灌注损伤的预防和治疗提供新的方向。实验方法:（1）通过阻断肝脏左叶和中叶的血管,然后再灌注建立小鼠的缺血/再灌注损伤模型;（2）使用选取成年雄性C57BL/6小鼠建立小鼠肝缺血再灌注损伤模型,使用两个针对CCN1的小干扰RNA（si RNA）来敲低CCN1,分别通过组织形态学、免疫荧光、Western blot、实时定量PCR、TUNEL等技术检测Sham组、IR组、IR+si-NC组、IR+si-CCN1-1组和IR+si-CCN1-2组肝细胞功能状况、炎症因子及凋亡相关蛋白表达情况;（3）使用两个针对CCN1的小干扰RNA（si RNA）来敲低CCN1,分别在体外建立小鼠AML-12肝细胞系,建立缺氧/复氧模型,通过组织形态学、免疫荧光、Western blot、实时定量PCR、TUNEL等技术检测观察Sham组、IR组、IR+si-NC组、IR+si-CCN1-1组和IR+si-CCN1-2组肝细胞功能状况、炎症因子及凋亡相关蛋白表达情况。（4）数据以平均±SD,使用T检验或单因素方差分析方法进行统计,利用软件graphpad prism进行统计学分析,p值小于0.05有显着性差异。结果:（1）肝缺血再灌注损伤时CCN1的表达会上调,并且CCN1敲低后能够降低肝细胞损伤和凋亡的严重程度;（2）在敲低CCN1后,促炎因子如TNF-α、IL-6,促凋亡蛋白caspase-9,caspase-3,Bax和CHOP水平下降而抗凋亡因子Bcl-2的表达增加;（3）敲低CCN1也可以抑制激活ER应激和ERK通路激活的蛋白质的水平;（4）体外实验表明,敲低CCN1可以抑制炎症反应,细胞凋亡和ER应激,而在未改变CCN1水平的情况下,添加TPA能够使这种保护效应减弱或消失。结论:（1）CCN1敲低对肝IRI的肝细胞具有保护作用;（2）CCN1敲低主要通过抑制ERK通路激活来实现对肝细胞的保护作用;（3）CCN1敲低能抑制肝IRI时的炎症反应;（4）CCN1敲低能抑制肝IRI时细胞凋亡的发生。总体而言,CCN1敲低可以通过抑制ERK通路激活,抑制炎症、凋亡和ER应激,从而抑制肝IRI的程度,这可能是未来肝移植和肝切除引起的肝IRI临床预防和治疗的突破口。
陈睿[3]（2021）在《低氧预处理增强间充质干细胞对肝脏缺血再灌注损伤保护作用的机制研究》文中指出[目 的]1.分离、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（bonemarrow-derivedmesenchymalstem cell,BMMSC）,比较常氧培养BMMSC（n-BMMSC）、低氧预处理BMMSC（hypoxia-precondition BMMSC,hp-BMMSC）增殖活力、归巢到损伤肝脏能力的差异。2.比较 n-BMMSC、hp-BMMSC、雷帕霉素干预的 hp-BMMSC（rapa-hp-BMMSC）对肝脏缺血再灌注损伤（hepatic ischemiareperfusioninjury,HIRI）模型大鼠肝脏保护效应的差异及随时间的变化。3.研究不同处理的BMMSC减轻HIRI效应差异的分子机制,为增强BMMSC对HIRI的疗效和提高BMMSC治疗效率提供机制参考。[方法]1.分离培养SD大鼠BMMSC,诱导成骨、成脂肪、成软骨分化后染色,结合流式细胞术检测其表面的间充质干细胞标志分子以鉴定BMMSC。2.1%O2、5%CO2、94%N2培养 24h 建立 hp-BMMSC 模型,用 CCK-8 试剂盒检测 21%O2 培养的 n-BMMSC、hp-BMMSC、rapa-hp-BMMSC 的增殖活力,明确hp-BMMSC的增殖活力能否被rapa干预抑制。3.用荧光染料CM-Dil标记n-BMMSC、hp-BMMSC后经门静脉输注给HIRI模型大鼠,再灌注12 h后取材观察以比较两者归巢到损伤肝脏的差异。4.阻断大鼠70%肝脏血供45 min构建HIRI模型,再灌注开始后经门静脉分别输注n-BMMSC、hp-BMMSC、rapa-hp-BMMSC悬液或等量新鲜细胞培养基,12 h、24 h、48 h后检测血清转氨酶、SOD、MDA水平,评估肝脏病理损伤,Western Blotting法检测IL-6、IL-1β、TNF-α的表达以比较不同细胞治疗对HIRI保护效果的差异。5.用 RT-qPCR 和 Western Blotting 检测不同 BMMSC 中mTOR、HIF-1α的mRNA和蛋白表达以研究hp增强BMMSC对HIRI保护效应的分子机制。[结果]1.大鼠BMMSC经诱导成骨、成脂、成软骨分化并染色证实,具有诱导多向分化的潜能;流式细胞术检测BMMSC的MSC标志分子阳性率达到鉴定MSC的标准。因此,本实验成功地分离并鉴定了大鼠BMMSC。2.1%O2培养24 h是最佳的hp-BMMSC方案,其增殖活力较n-BMMSC显着提高。3.相同剂量下,hp-BMMSC归巢到HIRI肝脏的阳性率较n-BMMSC显着升高,这表明hp后BMMSC的迁移、归巢到损伤肝脏的能力增强。4.n-BMMSC降低了肝脏转氨酶,降低肝组织MDA并升高SOD活性,抑制了炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达,这一效应在再灌注前12h最明显。相比n-BMMSC,hp-BMMSC进一步增强了上述肝脏保护效应,但rapa-hp-BMMSC的肝脏保护作用较n-BMMSC无明显变化。5.hp-BMMSC中的mTOR、HIF1α的mRNA和蛋白表达均显着上调,而rapa干预后以上mTOR、HIF-1α的表达上调被明显抑制,提示hp-BMMSC增强对HIRI的保护效应可能受mTOR-HIF-1α轴调控。[结论]1.机械分离、选择性贴壁培养结合诱导分化染色和流式细胞术鉴定可以获得批量大鼠BMMSC,为后续实验提供了稳定的细胞来源。2.hp是提高BMMSC增殖活力,增强其归巢能力的有效方法。相较常氧培养,hp增强了 BMMSC在HIRI中抑制炎症因子介导的损伤、促进肝功能恢复肝脏保护的效应。3.再灌注前12 h是HIRI中肝脏免疫应答最活跃、炎症性损伤最重的阶段。无论n-BMMSC还是hp-BMMSC,对肝脏的保护效应在这一时段内最明显。4.hp-BMMSC可能通过mTOR-HIF-1α信号轴调控其对低氧微环境的适应,从而维持干细胞特性并增强对HIRI的保护作用。
仲富瑞[4]（2021）在《γ-谷维素预处理对小鼠肝缺血再灌注损伤的作用及机制研究》文中研究说明目的:以γ-谷维素（Oryzanol,ORY）作为干预手段,探讨其在小鼠肝缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion,I/R）损伤中的保护作用及相关分子机制。方法:以下将分为两部分来阐述本实验的研究方法,分为体内实验和体外实验两部分构成。第一部分为体内实验:（1）首先选取50只C57雄性8周龄小鼠随机分为5组:（1）假手术组（Sham组）、（2）缺血再灌注组（I/R组）、（3）低浓度γ-谷维素预处理组（I/R+ORY10组）、（4）中浓度γ-谷维素预处理组（I/R+ORY20组）、（5）高浓度γ-谷维素预处理组（I/R+ORY40组）,其中（2）-（5）组进行小鼠肝脏部分I/R手术,（3）-（5）组进行ORY预处理。（2）小鼠经肝部分缺血再灌注后取血清和肝脏以备后续实验,采取转氨酶检测试剂盒检测各分组血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）含量;（3）对各分组肝脏标本进行H&E（Hematoxylin and eosin,苏木精&伊红）染色;（4）通过试剂盒检测各分组小鼠肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）、还原性谷胱甘肽（GSH）和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量;（5）采用Tunel染色法检测各分组小鼠肝脏组织中细胞凋亡情况,评估小鼠肝脏组织损伤程度;（6）使用免疫组化法测定小鼠肝组织中GRP78的表达水平,并采用蛋白免疫印迹法检测肝组织中NLRP3炎症通路相关蛋白、损伤相关分子HMGB1、GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白和凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）的表达。本实验第二部分为体外实验:在体外以Co Cl2模拟缺氧环境来诱导小鼠肝细胞系AML12细胞缺氧损伤,探讨ORY对Co Cl2诱导的缺氧损伤的影响。（1）首先采用CCK-8法检测不同浓度的γ-谷维素在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的影响、不同浓度的二氯化钴（Co Cl2）在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的影响及在Co Cl2诱导缺氧条件下,各浓度γ-谷维素在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的作用;（2）设计分组:（1）空白对照组、（2）ORY组、（3）Co Cl2组和ORY+Co Cl2组（经ORY预处理后Co Cl2诱导损伤的AML12细胞组）;（3）通过DCFH-DA染色检测各组肝细胞模型中的活性氧含量;（4）通过Hoechst染色检测各组肝细胞模型中的细胞凋亡情况;（5）采用免疫印迹法检测各组细胞模型中GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白和凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）的表达。结果:第一部分体内实验结果显示:（1）成功建立小鼠肝I/R损伤模型;（2）各浓度γ-谷维素预处理组血清AST、ALT较I/R组明显降低;（3）各浓度γ-谷维素预处理组中肝组织结构的病理损伤变化明显轻于I/R组;（4）γ-谷维素预处理组中肝组织的SOD和GSH含量较I/R组明显增高,而MDA和MOP含量较I/R组明显降低;（5）Tunel染色结果显示各浓度γ-谷维素预处理组肝脏组织中细胞凋亡明显少于I/R组;（6）与I/R组相比,各浓度γ-谷维素预处理组的免疫组化检测小鼠肝组织中GRP78的表达明显下降;（7）与I/R组相比,Sham组和各γ-谷维素预处理组中肝组织的NLRP3炎症通路相关蛋白和损伤相关分子HMGB1表达明显下降;（8）与I/R组相比,Sham组和各γ-谷维素预处理组中肝组织的GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白的表达水平明显降低。（9）与I/R组相比,Sham组和γ-谷维素预处理组中肝组织的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显上调,促凋亡蛋白Bax表达显着下调。第二部分体外实验结果发现:（1）不同浓度的γ-谷维素溶液处理AML12小鼠肝细胞24小时后,400μg/ml浓度范围内的γ-谷维素溶液对小鼠肝细胞的增殖无明显影响;（2）不同浓度的二氯化钴溶液处理AML12小鼠肝细胞24小时后,随着二氯化钴溶液浓度升高,小鼠肝细胞的细胞活力值逐渐下降,当二氯化钴溶液浓度为300μmol/L时,细胞活力值下降为57.80%±3.45,后续建立缺氧模型选取此浓度;（3）不同浓度γ-谷维素溶液对小鼠肝AML12细胞预处理,在300μmol/L二氯化钴溶液条件下培养24小时后,与对照组相比,γ-谷维素溶液浓度在160μg/ml及240μg/ml时细胞活力值明显升高;（4）预处理组（ORY240+Co Cl2300组）中肝细胞的活性氧含量明显高于二氯化钴处理组（Co Cl2300组）;（5）与二氯化钴处理组（Co Cl2300组）相比,预处理组（ORY240+Co Cl2300组）中凋亡细胞明显减少;（6）ORY240+Co Cl2300组中GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白的表达水平明显降低。（7）与二氯化钴处理组相比,肝细胞的促凋亡蛋白Bcl-2表达水平较二氯化钴处理组明显增高,凋亡蛋白Bax表达水平较二氯化钴处理组明显降低;结论:γ-谷维素预处理能够改善肝I/R导致的肝脏损伤,其可能的机制与ORY减轻氧化应激、抑制NLRP3炎症通路和降低损伤相关分子HMGB1的表达来减轻炎症反应,并抑制GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路的激活减轻细胞凋亡来实现的。本研究探索了ORY在肝I/R损伤中的保护作用,为ORY将来用于治疗肝脏疾病提供依据。
高伟东[5]（2020）在《不同提取方式的杜仲提取物对肝缺血再灌注损伤的保护作用研究及机制初探》文中认为目的:探讨杜仲水提取物及醇提取物是否对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）具有保护作用,如有保护作用何种提取方式的提取物保护效果较好,并分析其可能的原因以及作用机制。方法:（1）64只雄性SPF级大鼠（180g±20g）随机分为8组,每组8只。分别设为假手术组,HIRI组,杜仲水提取物低、中、高剂量组和杜仲醇提取物低、中、高剂量组。其中各杜仲提取物组予相应剂量杜仲提取物对大鼠进行灌胃预处理10天,水提取物及醇提取物三种不同剂量依次为20g生药/kg、40g生药/kg和80g生药/kg,假手术组及HIRI组给予相同剂量生理盐水预处理10天。除假手术组外,其余各组于灌胃第11天建立肝脏缺血再灌注损伤模型。缺血时间为1h,再灌注时间为4h。检测大鼠肝组织中肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白细胞介素-1b（IL-1b）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）表达水平,并制作肝脏HE染色观察肝脏病理改变情况,同时测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平。（2）40只雄性SPF级大鼠（180g±20g）随机分为5组,每组8只。分别为假手术组,HIRI组,杜仲多糖低、中、高剂量组。杜仲多糖剂量分别为80mg/kg、160mg/kg和320mg/kg。预处理及建立肝脏缺血再灌注损伤模型方式同前。HE染色观察肝组织病理改变情况以及测定血清高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、ALT、AST、TNF-a、IL-1b水平;检测肝组织中活性氧（ROS）、MDA、SOD生成情况以及HMGB1、Toll样受体4（TLR-4）的m RNA及蛋白表达水平,以及肝组织中干扰素调节因子1（IRF-1）、核因子kB-p65（NF-kB p65/p65）、磷酸化p65（P-p65）、My D88、核因子kb抑制蛋白a（IkB-a）、磷酸化IkB-a（P-IkB-a）的蛋白表达水平。结果:1、杜仲不同提取方式提取物对大鼠HIRI保护作用:（1）肝脏结构及功能:与假手术组相比,HIRI组大鼠肝脏肝索明显紊乱、大量炎性细胞浸润、血清ALT和AST水平较假手术组明显升高;各杜仲提取物预处理组较HIRI组大鼠肝索结构整齐、炎性细胞浸润明显减少、ALT、AST表达水平降低,尤以杜仲水提取物高剂量作用最为明显。（2）氧化应激及炎症反应水平测定:相较于假手术组,HIRI组的肝组织匀浆MDA、IL-1b、TNF-a水平明显升高,SOD活性则显着降低（P<0.05）,杜仲提取物预处理组则可抑制由HIRI导致的MDA、IL-1b、TNF-a升高及SOD降低,以杜仲水提取物高剂量（80g生药/kg）作用最明显（P<0.05）。2、杜仲多糖对大鼠HIRI保护作用:（1）肝脏结构和功能:HIRI组可见明显的肝索紊乱、炎性细胞浸润及肝细胞坏死,血清ALT、AST水平较假手术组明显升高。杜仲多糖预处理组大鼠肝组织坏死面积、肝索紊乱及炎细胞浸润程度较HIRI组明显减轻、ALT、AST水平明显降低,尤以杜仲多糖高剂量组改善肝脏结构和功能损伤最为显着。（2）氧化应激及炎症反应水平测定:HIRI组较假手术组肝组织匀浆MDA含量,血清IL-1b、TNF-a水平明显升高,而SOD水平明显降低（P<0.05）;三种杜仲多糖预处理组均可降低MDA、IL-1b、TNF-a水平,并提高SOD水平,以杜仲多糖高剂量组（320mg/kg）作用最为显着（P<0.05）。（3）无菌炎症反应机制相关指标检测:高剂量杜仲多糖可明显减少由HIRI引起的外周血中HMGB1的释放、肝组织ROS生成及IRF-1水平增加。此外,高剂量杜仲多糖预处理可明显减少由HIRI引起的肝组织HMGB1、TLR-4的m RNA及蛋白表达增加,降低My D88、p65蛋白表达水平,抑制P-p65蛋白生成,同时抑制IkB-a蛋白降解及P-IkB-a生成（P<0.05）,抑制HMGB1/TLR-4/NF-kB信号通路。结论:1、杜仲水提取物及醇提取物可通过抗炎、抗氧化发挥对HIRI的保护作用;高剂量杜仲水提物的保护效果最佳。2、杜仲提取物中有效成分杜仲多糖对HIRI具有保护作用,且其含量越高,保护作用越强。其保护机制:①通过增加SOD活性,促进ROS清除发挥抗氧化作用。②通过减少肝细胞内HMGB1合成及释放,抑制TLR-4/NF-kB途径的激活,发挥抗无菌炎症反应的作用。
周春泽[6]（2020）在《CD103+DCs在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及机制研究》文中认为机体器官或组织遭受缺血、缺氧打击,在恢复血供氧供后不仅不能恢复该器官或组织的结构和功能,反而出现其结构和功能损伤加重的现象被称为缺血灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,IRI）。全身各个脏器均可发生IRI,其中肝脏IRI最为常见和严重,肝脏IRI的发生会造成肝功能损伤甚至肝衰竭,严重者出现全身多脏器功能障碍/衰竭,IRI亦会增加移植器官排斥几率,增加肿瘤复发转移机会,直接影响到疾病的预后,故进一步探寻肝脏IRI的发生机制及并据此制定更有针对性的防治措施将对未来肝脏手术及介入治疗的发展起到重要的作用。肝动脉栓塞（transcatheter arterial embolization,TAE）是中晚期肝癌、肝转移癌及部分肝良性肿瘤的常用治疗方法,TAE术后肝功能损伤甚至肝功能衰竭是术后最常见的并发症,但TAE是否会导致IRI的研究极少,TAE导致的肝损伤是否与IRI有关尚不明确。从理论上来说,在TAE术后其同样经历着组织器官缺血-血流恢复的过程,故同样可能出现IRI损伤,但TAE术后没有栓塞血管的立即再通过程,其病理生理过程不同于既往研究的IRI过程。故TAE术后是否存在IRI?其导致的IRI是否与肝功能损伤有关?这些问题都值得被重视及进一步研究。在肝脏IRI的病理过程中,固有免疫细胞如:树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞都扮演了重要的角色。树突状细胞（dendritic cells,DCs）是目前已知的最重要的抗原递呈细胞,它是连接固有免疫和适应性免疫应答的重要桥梁。DCs存在于大多数的组织器官中,其中包括实质性脏器如肝脏、肾脏、肺脏等,国内外许多研究表明DCs在多种肝脏疾病中发挥了重要的作用。近期研究发现肝脏DCs同样在肝脏IRI的过程中扮演重要角色,但所得出的结论却存在差异性,究其原因可能与DCs群体的高度的异质性相关,对不同来源的DCs如局部定居或循环来源以及局部组织中分化为不同亚群的DCs如pDCs（plasmacytoid dendritic cells）、cDCs（classical dendritic cells）在疾病和各阶段的病程中所发挥的功能不尽相同。DCs可分为几类亚群,其中包括经典DCs、单核细胞来源的DCs和浆细胞样DCs。而经典DCs依据表面标志和功能的不同在非淋巴器官中可进一步分出CD103+DCs这一亚群。CD103+DCs定居于实质性脏器如肝脏、肾脏、肺脏等,数量比例均在局部定居的DCs总群体中占多数,并且既往很多研究指出其参与了多种疾病的病程,在机体的免疫应答中发挥了重要的作用,然而在肝脏IRI中有关CD103+DCs的研究却鲜有报道。因此明确CD103+DCs在肝脏IRI疾病中的变化及所发挥的功能是一个值得深入探讨的课题。在CD103+DCs亚群中具有一些独特的分子标记与组织中其他亚群的DCs细胞有所区分,如转录因子（Batf3、IRF8）和生长因子受体（FMS-like tyrosine kinase 3,Flt3）等。其中Flt3可通过磷酸化活化与其配体（Flt3 ligand,Flt3L）结合发挥作用,对DCs的分化、成熟起到重要的作用,并且相较其他亚群DCs,CD103+DCs的发育和成熟更加依赖Flt3,因此我们推测Flt3/Flt3L是一个可用来调控CD103+DCs功能的靶点。调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）是T淋巴细胞一个重要的亚群,在机体维持免疫稳态中发挥着关键的作用,很多研究中表明增加Treg的表达可以减轻炎症和损伤的程度。相继有研究报道CD103+DCs可诱导初始T细胞向Treg转化,进而发挥其保护性的免疫调节作用有利于疾病的缓解。然而目前通过CD103+DCs活化Treg细胞进而缓解疾病进展的研究多集中在自身免疫性疾病领域,而对于炎症性疾病的作用了解甚少。因此在以炎症为主要发病机制的肝脏IRI疾病中,CD103+DCs所扮演的角色,以及其作用机制都值得进一步去探究,以便明确是否有希望针对CD103+DCs进行靶向调节治疗肝脏IRI。目的1.动态监测肝癌栓塞手术前后SOD、MDA、IL-6、ALT、AST、LDH等与肝IRI相关的指标,分析缺血再灌注指标与肝功能之间的相关性,初步评估肝动脉栓塞术后是否存在IRI并探讨肝功能损伤与IRI相关性;2.通过检测肝脏IRI动物模型中再灌注不同时间点的肝脏组织损伤、肝脏功能、炎症细胞因子及肝脏组织中DCs及DCs亚群CD103+DCs的数量和比例,观察肝脏IRI病程与CD 103+DCs的相关性;3.通过给予流式分选小鼠的CD103+DCs,提前回输至模型小鼠体内,检测经过干预后肝脏功能、组织损伤、炎症细胞因子及CD103+DCs数量、比例的变化,探讨CD103+DCs在肝脏IRI疾病中发挥的作用;4.采用Flt3抑制剂、Flt3L及si-Flt3转染的不同方式在肝脏IRI小鼠模型中干预CD103+DCs上Flt3/Flt3L靶点的表达以调控CD103+DCs的功能。通过动物实验检测肝脏功能、组织损伤、炎症细胞因子、凋亡蛋白表达等指标,进而探讨通过Flt3/Flt3L调控CD103+DCs影响肝脏IRI病程的作用机制;5.采用Flt3抑制剂、Flt3L及si-Flt3体外干预CD103+DCs后与T细胞进行混合淋巴细胞培养,证实CD103+DCs对于Treg增殖、功能的影响;通过体外实验CD103+DCs对肝细胞缺氧复氧模型进行干预,检测肝细胞凋亡变化。探讨CD 103+DCs改善肝脏IRI疾病程度的作用机制。方法按照纳入及排除标准选取因肝癌接受肝动脉化疗栓塞术（TACE）的患者。分别于TACE术前、TACE术后1d、2d、3d早晨抽取患者外周静脉血标本,分别送检检测病人LDH及肝功能指标ALT、AST;氧化应激指标:MDA和SOD;炎性细胞因子水平:IL-6。比较各指标在不同时间点各项指标的变化并比较不同栓塞剂量下肝功能损伤指标、氧化应激指标、炎症指标的差异。SPF级雄性C57BL/6小鼠168只,体重20-25g,设立一期实验（动物模型构建）:对照组、假手术组、模型组（Oh、6h、12h、24h亚组）,二期实验:对照组、假手术组、阴性对照组（肝脏IRI模型）、PBS处理阴性对照组（PBS处理肝脏IRI模型）、干预组（过继转移CD103+DCs预处理组、Flt3抑制剂预处理组、Flt3抑制剂与过继转移CD103+DCs共处理组和Flt3L预处理组）,每组8只。常规清洁饲养,室温24℃左右,12小时明暗交替。采用无创血管夹阻断肝脏左叶和中叶的出入血管,使70%的肝脏缺血;假手术组仅分离小鼠肝动脉和门静脉,未予夹闭血管;对照组中小鼠无任何干预。干预组各组小鼠按实验方案予以预处理,除模型构建小鼠外,其余各组小鼠均予肝脏缺血6小时后处死取材,留取外周血标本采用ELISA检测肝脏功能,肝脏标本用作组织病理检测,-80℃冻存用作分子生物检测,其余肝脏标本用作流式细胞检测及分选。采用ELISA检测各组小鼠血清中肝脏功能（ALT、AST、LDH）的水平、炎症细胞因子TNF-α IL-1β、IL-6,Treg相关的细胞因子IL-10、TGF-β的含量,RT-qPCR检测ICAM-1、TNF-α、IL-1β的基因表达水平,WB检测IL-1β、ICAM-1炎症细胞因子的蛋白表达水平;HE染色观察小鼠肝脏病理损伤改变,TUNEL染色检测肝脏细胞凋亡程度;流式细胞仪检测肝脏组织中CD103+DCs和Treg细胞的数量和比例的数量、比例以及体外实验检测肝细胞凋亡比例。采用SPSS17.0统计软件包进行分析。计量资料先检验是否符合正态分布,符合者以均数±标准差（x±s）表示,两组数据之间比较采用t检验,三组及以上数据采用单向方差分析,方差齐用Bonferroni检验,方差不齐则用Tamhane检验,重复测量资料采用重复测量资料方差分析,不符合正态分布者采用非参数检验。校验水准α=0.05。采用Image J软件对免疫组化及免疫荧光结果进行统计。采用Graph pad 5.0对结果进行处理并作图。结果1.按照纳入标准及排除标准,纳入肝癌患者43例,其中男31例,女12例。TAE术后1d、2d、3d患者ALT、AST较术前明显升高,两者均在术后第2d升高最明显,LDH在术后亦明显升高,术后1d升高最为明显。TAE术后1d、2d、3d患者MDA及IL-6指标均较术前明显升高,且都在术后1d达到高峰,其后缓慢下降,但均高于术前水平（P<0.05）,SOD在术后第一天明显下降（P<0.05）,术后2-3d仍低于术前水平。以术后1d为例,在碘油>12ml组（n=17）,肝功能ALT、AST指标、IRI指标LDH、MDA及IL-6指标明显高于<12ml组（n=26）,而SOD明显低于<12ml组;2.肝脏IRI模型构建:观察给予肝脏缺血60min,再灌注Oh、6h、12h、24h各组小鼠模型的肝脏损伤显示:小鼠肝脏组织学损伤随着再灌注时间的延长逐渐升高,小鼠血清ALT、AST、LDH水平随着再灌注时间的延长逐渐升高,于再灌注12 h达到高峰,而后有所恢复。炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平在再灌注6h达到高峰,CD103+DCs在肝脏IRI模型中的变化与之呈负相关,再灌注6h后CD103+DCs 比例最低。3.给予肝脏IRI模型小鼠预先外源性回输CD103+DCs后,流式细胞仪检测肝脏组织中CD103+DCs的变化,发现肝脏组织中CD103+DCs的比例较IRI模型组明显升高,IRI组的CD103+DCs比例占总DCs的8.85%,而外源性回输组中比例为14.2%,肝脏损伤程度与IRI模型小鼠相比有明显改善,表现为过继转移CD103+DCs后:1)肝脏功能指标如:ALT、AST和LDH较模型小鼠明显降低;2)肝脏组织病理HE染色可见细胞水肿及炎性细胞浸润程度明显改善,肝脏损伤评分明显减低,TUNEL染色可见肝脏组织中细胞未见明显凋亡;3)肝脏组织凋亡相关的基因（Fas、Bax）和蛋白（Bcl-2）的表达降低。4.分别在建立肝脏缺血再灌注模型前给与Flt3抑制剂（MLN518）、CD103+DCs过继转移（DCs infusion）、MLN518 联合过继转移 CD103+DCs（MLN518+DCs infusion）和补充Flt3L处理,再灌注6小时后收集各组小鼠的肝脏组织标本。1)流式结果显示,与IRI组相比,MLN518组的肝脏组织中CD103+DCs比例显着降低,且具有统计学差异（P<0.05）;Flt3L组肝脏组织中CD103+DCs比例显着升高（P<0.05）;与 DCs infusion 组相比,MLN518+DCs infusion 组肝脏组织中CD103+DCs比例显着降低,且具有统计学差异（P<0.05）;2)肝脏功能及组织病理结果显示:与IRI组相比,Flt3L组ALT、AST和LDH水平及肝脏损伤评分都显着降低（P<0.05）,与CD103+DCs infusion组相比,MLN518+CD103+DCs infusion组ALT、AST和LDH水平及肝脏损伤评分都显着升高,且具有统计学差异（P<0.05）;3)肝脏组织凋亡相关检测显示:与IRI组相比,MLN518组肝脏组织中促凋亡基因Fas和Bax的表达显着升高,抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达显着降低（p<0.05）;Flt3组肝脏组织中促凋亡基因Fas和Bax的表达显着降低,抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达显着升高（p<0.05）;与DCs infusion组相比,MLN518+DCs infusion组肝脏组织中促凋亡基因Fas和Bax的表达显着升高,抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达显着降低（p<0.05）;4)RT-qPCR检测肝脏组织炎症因子表达显示与IRI组相比,MLN518组的肝脏组织中TNF-αIFN-γ、ICAM-1、IL-2mRNA 以及 IL-1β 蛋白表达显着增加（p<0.05）;Flt3 组肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、ICAM-1、IL-2 mRNA以及IL-lβ蛋白表达显着降低（p<0.05）;与 DCs infusion 组相比,MLN518+DCs infusion 组肝脏组织中 TNF-α、IFN-γ、ICAM-1、IL-2mRNA 以及 IL-1β 蛋白表达显着增加（p<0.05）。5.在建立肝脏缺血再灌注模型前给与Flt3抑制剂（MLN518）、CD103+DCs过继转移（DC infusion）、MLN518 联合过继转移 CD103+DCs（MLN518+DCs infusion）和补充Flt3L不同处理,流式结果显示,与IRI组相比,MLN518组的外周血中Treg细胞比例显着降低,且具有统计学差异（P<0.05）。Flt3L组外周血中Treg细胞比例显着升高（P<0.05）,与DCs infusion组相比,MLN518+DCs infusion组外周血和肝脏组织中Treg细胞比例显着降低,且具有统计学差异（P<0.05）。在混合淋巴细胞反应实验中将CD4+T细胞与不同条件的 CD103+DCs（阴性对照组、si-Flt3+Flt3L 组、si-RNA+Flt3L 及 Flt3L 组）共培养后,检测Treg细胞在CD4+T细胞中的比例。结果显示:与PBS对照组相比,Flt3L组Treg细胞比例显着升高（P<0.01）,TGF-β和IL-10的基因表达水平显着升高;与Flt3L组相比Flt3L+si-Flt3组Treg细胞比例显着降低（P<0.01）,TGF-β和IL-10的基因表达水平显着降低（P<0.01）;而Flt3L组与Flt3L+si-RNA组之间无显着差异（P>0.05）。6.在缺氧复氧模型中,缺氧再给氧处理后肝细胞的凋亡率显着提高。将L02肝细胞系与不同处理后的CD103+DCs共培养（阴性对照组、si-Flt3+Flt3L组、si-RNA+Flt3L及Flt3L组）,与PBS对照组相比,Flt3L组肝细胞凋亡比例显着降低（P<0.01）。与Flt3L组相比Flt3L+si-Flt3组肝细胞凋亡比例显着升高（P<0.01）。而 Flt3L 组与 Flt3L+siRNA 组之间无显着差异（P>0.05）。结论1.肝癌TAE术后,被栓塞的肿瘤组织及正常肝组织可发生IRI,IRI的程度与肝损伤的程度存在相关性;肝损伤及IRI程度与被栓塞面积呈正相关;2.过继转移CD 103+DCs可减轻肝脏IRI模型小鼠肝脏损伤和炎症状态,改善肝脏功能。3.CD103+DCs在肝脏IRI模型中的肝脏保护作用是通过调控其表面Flt3/Flt3L靶点的表达来实现的。4.CD103+DCs可促进肝脏IRI模型中Treg的分化和增殖进而减轻肝脏IRI。
焦智慧[7]（2020）在《ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究》文中研究指明肝脏是哺乳动物最大的实质器官,具有加工储存营养物质、代谢药物毒物、分泌胆汁、合成蛋白质等重要功能。肝脏缺血再灌注损伤是外科手术中常见的一种临床综合征,20世纪90年代出现了腹腔镜的肝切除术,腹腔镜手术可以最大程度的减少腹壁神经和肌肉的损伤,减少出血、术后疼痛和粘连,加快手术恢复。尽管采用微创外科手术,在肝切除、肝移植、出血性休克等临床手术中仍不可避免的出现肝脏缺血再灌注损伤,严重会导致肝炎以及术后肝功能的衰竭。对于晚期肝功能不全的有效治疗办法是原位肝移植,但也面临着器官短缺,费用昂贵、免疫排斥和移植并发症等问题,因此,寻找能够减轻肝脏缺血再灌注损伤以及提高肝脏再生能力的安全有效的治疗办法是目前肝脏外科亟待解决的问题之一。脂肪间充质干细胞（ADSCs）能够自我更新、具有多向分化能力、来源丰富、取材损伤小,是目前细胞疗法理想的种子细胞。ADSCs主要依靠分化和旁分泌发挥作用,旁分泌指干细胞释放的多种生物因子在微环境里通过细胞基质在局部以及临近组织对靶细胞发挥的生物学作用。随着对旁分泌机制的深入研究,发现ADSCs分泌的多种细胞因子具有促进血管生成,抑制炎症反应,调节免疫应答,修复组织再生等多种生物学功能。ADSCs在体外培养的过程中,会将细胞因子等生物活性物质分泌到培养液中,这种含有细胞分泌物的培养液为脂肪间充质干细胞的条件培养液（ADSC-CM）。尽管ADSCs在临床上对许多疾病有治疗效果,但ADSCs具有免疫原性,对植入ADSCs的不可控分化仍是重要的安全隐患。因此,使用ADSC-CM的无细胞疗法成为绕过细胞疗法局限性的一种再生医学治疗方法。目前有关肝脏缺血再灌注损伤的动物模型以啮齿类动物为主,而从比较医学角度,小型猪与人的同源性好,体积大小以及器官大小与人更为接近,因此也作为研究缺血再灌注损伤理想的实验动物,所获得的研究数据更有价值,易于临床转化。而ADSC-CM在大型实验动物的研究较少,特别是肝脏领域尚未见报道,所以本研究旨在通过建立小型猪肝脏缺血再灌注合并部分切除模型,探究ADSC-CM治疗肝脏缺血再灌注合并部分切除损伤的疗效,为比较医学开展肝病治疗,拓宽ADSC-CM移植领域提供研究依据。本研究使用30头小型猪,其中6头用于脂肪组织的获取。采用胶原酶消化法分离培养ADSCs,使用诱导培养基和特定染色鉴定ADSCs成脂、成骨、成肝分化能力,应用细胞流式鉴定ADSCs表面特异性抗原。ADSCs饥饿培养48 h获得ADSC-CM,经3 kda超滤管离心浓缩ADSC-CM用于后续实验。另外24头小型猪随机分为四组:模型组（IRI）,DMEM对照组（DMEM）,脂肪间充质干细胞组（ADSCs）,脂肪间充质干细胞条件培养基组（CM）,每组6头。四组实验动物均通过腹腔镜手术建立肝脏缺血再灌注合并部分肝切除模型,IRI组通过肝实质注射生理盐水,DMEM组注射基础培养基,ADSCs组注射脂肪间充质干细胞,数量为1×106/kg,CM组按照1×106/kg细胞数提取等量干细胞分泌的条件培养液,注射浓缩的ADSC-CM进行干预。分别在术前、术后1 d、3 d、7 d采集血液样本及肝组织样本用于相关指标的检测。通过HE染色观察病理组织学变化,透射电镜观察超微结构的变化,血常规检测外周血的炎性细胞变化,试剂盒检测抗氧化酶以及细胞凋亡酶活性,TUNEL染色检测凋亡细胞的阳性率,ELISA法检测血清中炎症相关因子、再生相关因子以及ADSC-CM成分,q RT-PCR法检测炎症、凋亡以及再生相关基因水平变化,Western Blot法检测肝组织中凋亡以及再生相关蛋白水平的变化,免疫组化染色检测凋亡相关蛋白以及再生相关蛋白水平的变化。本研究结果如下:（1）病理组织学与超微结构变化:术后各组肝小叶结构被破坏,肝索排列紊乱,肝细胞空泡变性明显,炎性细胞浸润,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显减少空泡变性和炎性细胞浸润;术后IRI组和DMEM组肝细胞内质网严重扩张,细胞核膜皱缩,染色质边集化,ADSCs或ADSC-CM干预改善了内质网扩张及肝细胞核膜皱缩的程度。（2）肝脏功能变化:术后各组ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL均升高,TP呈降低趋势,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显降低了ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL的升高程度,缓解了TP的降低程度,促进肝脏功能的恢复。（3）氧化应激指标变化:术后各组肝组织抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD活性显着降低,MPO酶活性和MDA含量显着升高,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着增强了抗氧化酶的活性,降低MPO酶活性,并能减少氧化产物MDA的水平,从而减少术后的氧化应激反应,且两个干预组的上述氧化应激指标均无显着性差异。（4）炎症指标变化:术后外周血中炎性细胞WBC、NE、LY含量迅速升高,ADSCs或ADSC-CM干预减少了外周血中的炎性细胞的数量;IRI组和DMEM组血清中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量呈升高趋势,ADSCs或ADSC-CM干预降低促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平,同时增强抑炎因子IL-10的表达;肝组织中炎症因子基因水平的表达与血清结果一致,ADSCs和ADSC-CM通过抑制促炎因子的过度释放以及增强抑炎因子的表达显着改善了术后的炎症反应,且两个干预组之间没有显着性差异。（5）凋亡指标变化:术后各组P53、Bax、Fas、Fasl基因和蛋白水平均显着升高,Bcl-2表达水平降低,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预抑制了凋亡相关指标P53、Bax,、Fas、Fasl的表达,提高抗凋亡Bcl-2的表达水平;ADSCs组和CM组显着降低TUNEL阳性细胞率及Caspase酶活性,减少术后肝细胞凋亡,且两组之间没有显着性差异。（6）再生指标变化:相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着提高血清中血管生成相关因子VEGF、ANG-1、ANG-2的表达,增强组织中肝脏再生相关基因HGF、Cyclin D1的表达,抑制肝再生终止基因TGF-β的表达,提高Ki67的阳性细胞数及细胞增殖PCNA蛋白的表达,且ADSCs组和CM组之间没有显着性差异。（7）ADSC-CM成分检测:通过ELISA法检测到小型猪ADSC-CM中含有促进血管生成的VEGF、ANG-1、ANG-2、b-FGF,调节炎症反应与肝脏再生的TNF-α、IL-1β、IL-6。综上所述,经肝实质移植ADSCs和ADSC-CM均能够改善肝脏缺血再灌注合并部分肝切除的病理组织学损伤及超微结构变化,减轻过度炎症反应及氧化应激反应,减少细胞凋亡,促进肝脏再生。本试验成功应用ADSCs和ADSC-CM干预肝脏缺血再灌注合并部分切除后的肝损伤,证明ADSCs和ADSC-CM抗氧化、抗炎、抗凋亡和促进肝再生的作用,且二者干预效果无显着差异,推测ADSCs发挥作用的机制很可能是通过分泌细胞因子的旁分泌途径。
赵良中[8]（2020）在《靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究》文中指出由病毒感染、肝毒素、酒精摄入或药物引起的肝损伤已成为世界范围内严重的人类健康问题,其发病率不断上升。目前,除了肝移植治疗急性肝衰竭和终末期慢性肝损伤外,没有有效的治疗方法。然而,由于供体组织的来源有限且成本高昂,严重限制了通过肝移植进行的治疗。因此,迫切需要探索新的有效的预防和治疗策略。过量服用对乙酰氨基酚（4’羟基乙酰苯胺,扑热息痛,APAP）已成为药物引起的急性肝衰竭的最常见原因。APAP诱导急性肝损伤（APAP-induced liver injury,AILI）的研究显示,血管生成和氧化还原稳态在肝保护和修复中起着重要作用。低氧诱导因子-1（HIF-1）是一种转录因子,在调节血管生成、氧化还原稳态和能量平衡相关基因的表达中发挥关键的调节作用。在包括急性肝损伤在内的急性组织损伤过程中,HIF-1作为急性低氧应激最敏感的因子,它的上调是促进血管生成和组织损伤修复的关键。HIF-α上的脯氨酸残基可以被细胞内的脯氨酰羟化酶（PHDs）羟化,羟化后的HIF-α通过泛素-蛋白酶体途径降解,因此,PHD是调节细胞中HIF-α稳定性的限速酶。其中PHD2是催化HIF-1α脯氨酸羟化的关键限速酶。研究表明,抑制PHD2的活性导致HIF-1α的稳定,从而增强了HIF-1下游大量靶基因的诱导,这些基因调节广泛的低氧反应,如血管生成,能量补偿,氧化还原,pH稳态以及许多其他过程,最终改善急慢性低氧时组织损伤。因此,PHD2已成为促进血管生成和组织损伤修复的一个潜在靶点。鉴于目前PHDs抑制剂缺乏特异性和靶向性,会产生大量的毒副作用,因此如何获得高效特异抑制PHD2活性的抑制剂备受关注。由于抗体具有高特异性和高亲和性作用特点,近年来备受关注。随着抗体工程技术的发展,派生出来的胞内抗体技术,通过对抗体分子的适当修饰,实现细胞内重要靶分子的表型敲除。为此,本研究利用胞内抗体技术制备了一种在细胞内靶向失活PHD2的胞内单链抗体,并对其生物学活性和在APAP肝损伤中的作用进行研究。课题组前期研究中纯化了人源PHD2蛋白,以此蛋白为抗原,通过噬菌体库筛选的方法获得了抗PHD2单链抗体（scFv）,并且通过可溶性表达、纯化及ELISA分析,发现此scFv能够特异性结合重组PHD2。本研究为了靶向失活细胞内的PHD2,以抗PHD2的scFv基因为模板,用内质网（ER）滞留信号序列修饰,从而制备了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体（ER-INP）,检测此胞内抗体是否会在细胞中成功表达,并对其活性进行表征,然后探讨了ER-INP在小鼠APAP诱导的急性肝损伤中的作用和可能的机制。取得如下结果:一、成功构建了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体（ER-INP）。以抗PHD2人源单链抗体scFv基因为模板,通过PCR引入滞留于内质网的细胞内定位信号和E-tag序列,成功制备内质网滞留型抗PHD2胞内抗体基因ER-INP,并将其克隆入真核表达载体中构建重组人ER-INP真核表达载体pER-INP。将pER-INP转染进细胞中,RT-PCR、免疫荧光和Western blot实验分析结果表明,引入内质网定位信号和E-tag序列的抗PHD2胞内抗体基因能够在细胞中有效表达和实现目标蛋白的内质网定位。二、抗PHD2胞内抗体特异性结合细胞内PHD2并抑制其脯氨酰羟化酶活性。将pER-INP转染进细胞中,免疫共沉淀实验、Western blot和免疫荧光实验分析抗PHD2胞内抗体的作用效能。结果表明,细胞内表达的抗PHD2胞内抗体ER-INP能够识别并结合细胞内的PHD2蛋白,抑制PHD2脯氨酰羟化酶活性,即抑制其羟化HIF-1α的Pro564和Pro402的活性,明显上调HIF-1α的蛋白水平。三、抗PHD2胞内抗体在体外和体内均显示出明显的促血管生成活性。为了检测ER-INP在体外和体内是否具有促血管生成活性,分别采用划痕实验检测人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的迁移能力,3D培养模型来检测HUVEC的成管能力,利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAMs）模型来检测其体内血管生成情况。通过实时定量PCR、Western blot和ELISA等实验方法分析HIF-1下游促血管生成相关靶基因的表达。实验结果表明ER-INP的表达显着促进了HUVEC的迁移和管状形成能力,并增强了鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成能力。此外,实时定量PCR检测结果表明ER-INP促进了HIF-1下游促血管生成相关靶基因VEGF、ANGPTL-2、MMP-2和MMP-13等的表达,而且Western blot和ELISA结果表明ER-INP显着提高VEGF、MMP-2和MMP-13等促血管生成因子的蛋白水平。四、抗PHD2胞内抗体保护APAP诱导的急性肝损伤。将带有GFP的对照质粒尾静脉注射入小鼠体内,发现从注射后的第1天到第3天可以检测到该蛋白的表达,第3天在肝脏中的表达达到最高水平,由此推测该表达载体携带的ER-INP基因尾静脉注射入小鼠体内后可能主要在肝脏中表达,并在第3天达到最高水平;和对照组相比,正常小鼠尾静脉注射表达ER-INP的质粒不影响肝脏的组织形态学以及小鼠血清谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）水平,总之ER-INP不损害小鼠肝脏,并且ER-INP可以在小鼠肝脏中成功表达;小鼠腹腔注射250 mg/kg剂量的APAP溶液,于注射后24 h,48 h和72 h处死小鼠,发现24 h达到肝损伤的高峰期,表现为ALT和AST水平显着升高以及肝脏小叶中央区出现明显的坏死,而尾静脉注射表达靶向PHD2胞内抗体ER-INP质粒预处理48 h后再给予APAP,可显着抑制APAP引起的血清ALT和AST的升高以及肝小叶中央区的坏死也明显改善。五、ER-INP对APAP诱导急性肝损伤的保护作用机制。一方面,ER-INP预处理的APAP肝损伤小鼠肝组织出现了明显促血管生成效应,表现为免疫组化结果显示肝脏中血管新生标志分子CD31表达明显上调,同时具有促血管生成作用的HIF-1α水平显着上调,Western blot和ELISA结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF和MMP-2的蛋白表达水平明显上调,实时定量PCR结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF、ANGPTL-2和MMP-2的基因转录水平明显上调;另一方面,ER-INP预处理有利于维持APAP肝损伤小鼠肝组织的氧化还原稳态,表现为ER-INP预处理显着抑制肝脏氧化应激标志分子丙二醛（malondialdehyde,MDA）的水平,Western blot结果显示ER-INP预处理显着抑制了内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein 78,GRP78）水平的升高,然而显着增强抗氧化酶即过氧化物氧化还原酶4（peroxiredoxin 4,PRDX4）的活性和显着抑制抗氧化分子即谷胱甘肽（L-glutathione,GSH）的消耗。总之,ER-INP可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的急性肝损伤。综上所述,成功制备在细胞内特异性结合PHD2的胞内抗体ER-INP,靶向PHD2的胞内抗体能够在体内外抑制PHD2活性,提高HIF-1α的稳定性,促进HIF-1下游靶基因的转录激活,可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的肝损伤,这为组织损伤和局部缺血性疾病的临床治疗开辟了新途径,为新药研发提供了新思路和实验依据。
林杰[9]（2020）在《人参皂甙Rg1通过抑制线粒体凋亡和自噬途径减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的机制研究》文中研究表明[目的]肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic ischemiareperfusion injury HIRI）常发生在肝移植、肝切除等需要对入肝血流进行全部或部分阻断的肝胆外科手术操作中,表现为肝脏血液供应恢复后,肝功能不仅未得到改善,反而使损伤进一步加重的现象。因此,寻找一种最小化HIRI的方法变得迫切需要。在预防或治疗HIRI的研究中,机械性缺血预处理（ischemic preconditioning,IPC）和药物预处理是临床及基础实验研究中常采用的两种预处理方式。缺血预处理已被诸多研究证明是一种有效的处理方法。选用何种药物来进行药物预处理的研究,我们认为至少要与缺血预处理效果相当甚至更优。目前,在有关缺血预处理的研究中,何种缺血预处理方案能够为减轻HIRI提供最佳的效果并不明确。已知人参皂甙Rg1具有改善微循环、抗氧化、抗凋亡等多重药理功效,能够有效减轻心、脑、肝等组织器官的I/R损伤。然而,在HIRI的研究中,对于Rg1减轻I/R损伤的具体作用机制并不清楚。目前研究认为线粒体凋亡途径和线粒体自噬途径是HIRI病理生理过程中可调控的两个重要通路,而亲环蛋白D（CyclophilinD,CypD）蛋白又被认为与线粒体结构和功能密切相关。因此本研究的目的是首先明确提供最佳保护的缺血预处理方案,从而为选择Rg1作为药物预处理的目标药物提供参照;其次,从CyPD这一作用靶点探讨Rg1通过线粒体途径减轻HIRI的作用机制,为临床医疗中使用中药制剂来防治HIRI提供一定的理论依据。[方法]①建立大鼠肝脏部分（70%）热缺血再灌注损伤模型,分别予以5-10min-IPC、10-10min-IPC、循环3次的5-5min-IPC这三种缺血预处理措施。通过检测肝功能、SOD活性、GSH含量、MDA含量、组织病理学改变、肝细胞凋亡,优选出最佳的缺血预处理方案。②我们通过Rg1预处理与最佳缺血预处理方案的处理进行比较,通过检测肝功能、SOD活性、GSH含量、MDA含量、组织病理学改变、肝细胞凋亡,评价两者对HIRI的保护效果,明确选定Rg1进行后续药物预处理研究的可行性及意义。③分别在体内大鼠肝脏热缺血再灌注损伤模型和体外OGD/R处理的大鼠BRL-3A细胞模型中,经过Rg1预处理后,通过TUNEL法、Annexin V-AF647-PI双染法检测细胞凋亡水平,western blot检测细胞凋亡相关信号分子（Cyt-c,Caspase9,Caspase3）的蛋白质表达,观察Rg1预处理对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过检测CypD的蛋白质表达水平、线粒体跨膜电位、线粒体钙保留能力,透射电镜观察线粒体结构,进一步观察Rg1预处理对肝细胞线粒体凋亡途径的影响。同时评估大鼠肝功能和组织学损伤以及体外BRL-3A细胞损伤以明确Rg1的有效性。④使用IRI体内外模型,通过检测不同再灌注时间点的线粒体自噬关键蛋白（LC3I,LC3II,p62,PINK1和Parkin）明确过度线粒体自噬的时间点;然后,予以Rg1预处理后,通过TUNEL法、Annexin V-AF647-PI双染法检测细胞凋亡水平,western blot检测线粒体自噬相关信号分子（LC3I,LC3II,p62,PINK1和Parkin）的蛋白质表达水平,检测线粒体跨膜电位,透射电镜观察线粒体自噬体的数量,检测体内肝功能和组织病理学改变以及体外BRL-3A细胞增殖活力,观察Rg1预处理对线粒体自噬途径的调控作用,从而进一步完善Rg1通过线粒体途径保护HIRI的作用机制。[结果]①在大鼠动物模型研究中发现,与I/R组相比较,三种IPC方案均显示出肝转氨酶的活性水平明显降低,组织病理学损伤改变减轻,SOD活性和GSH含量升高,MDA含量降低;其中实施循环3次5-5min-IPC方案的改变最为明显,表明其减轻I/R损伤的效果最佳。②将Rg1预处理与IPC 比较研究后发现,两者的肝转氨酶的活性水平、组织病理学损伤、SOD活性、GSH含量、MDA含量表现出相似的变化结果,两者联合处理后上述指标改变更加明显;这表明,Rg1预处理能够达到与IPC相同的效果,两者还具有累加效应。③研究发现,在体内大鼠HIRI模型研究中,与I/R组相比,Rg1预处理可降低ALT和AST活性水平,减轻肝脏组织病理学损伤变化和细胞凋亡;在体外BRL-3A细胞OGD/R模型研究中,40μM Rg1预处理24h能够提供最佳的保护作用,Rg1显着增强细胞活力,抑制细胞凋亡;在体内和体外模型中,Rg1可抑制CypD的表达,稳定线粒体跨膜电位,提高CRC,保护线粒体结构和功能,限制线粒体凋亡途径,减少肝细胞凋亡;并且在体外研究中,这种有益作用被H2O2所抑制;这表明,Rg1预处理可能通过抑制CypD的表达,限制线粒体凋亡途径减轻HIRI。④在体内动物实验和体外BRL-3A细胞实验中发现,在体内再灌注6h后线粒体自噬相关蛋白表达水平最高并肝转氨酶活性水平最高,在体外复氧复糖6h后线粒体自噬相关蛋白表达水平最高;在体内,与I/R组相比,Rg1预处理明显降低了 ALT和AST的活性水平,肝脏组织学损伤变化明显减轻;在体外,Rg1预处理明显增强了细胞增殖活力;在体内外研究中均发现Rg1预处理后线粒体自噬关键蛋白（LC3I,LC3II,p62,PINK1和Parkin）的蛋白质表达下降,细胞凋亡水平明显降低、线粒体跨膜电位明显升高,线粒体自噬体的数目减少;提示在再灌注期过度的线粒体自噬加重损伤,Rg1预处理可能通过抑制线粒体自噬,减轻了 HIRI。[结论]1.循环3次的5-5min-IPC方案提供了 IPC对肝脏缺血再灌注损伤的最佳的保护;2.Rg1预处理减轻大鼠HIRI,并且能够达到与IPC相同的效果,可能是通过抗氧化应激损伤减少肝细胞凋亡来实现的;3.Rg1能够有效降低CypD蛋白的表达;4.Rg1可通过抑制CypD蛋白的表达,调控MPTP的开放,限制线粒体凋亡途径,从而减轻大鼠HIRI;5.在HIRI的再灌注阶段,过度的线粒体自噬导致损伤加重;6.Rg1通过抑制PINK1/Parkin信号通路的激活,从而减轻再灌注期发生的过度的线粒体自噬,减轻HIRI;其部分作用机制是通过抑制CypD蛋白表达,抑制MPTP的开放而实现的。
涂勇浪[10]（2020）在《术后远端缺血处理对肝切除术后早期肝功能的恢复的临床研究》文中提出[目的]探讨术后远端缺血处理在促进肝脏切除患者的术后早期肝功能恢复中的作用,以及其是否能够减少肝脏的缺血再灌注损伤,同时探讨可能的发生机制,为临床工作提供相应参考。[方法]将2017年9月至2019年9月在昆明医科大学第一附属医院收治的41例肝脏肿瘤行肝切除的患者随机分为2组:实验组:肝切除术后第1、2、3天采用患者单侧上肢绑止血带,充气压力至26.6kPa（约200mmHg）以阻断患者上肢血流,维持5min后放气至0kPa（0mmHg）,再开放5min,循环3次;对照组:肝切除术后第1、2、3天采用患者单侧上肢绑止血带,不行充气放气。术前两组一般临床资料（年龄、性别、肿瘤大小、有无肝硬化、有无门静脉血栓、手术时间、术中出血量、术前肝功能分级等）比较无显着性差异。对比两组患者术后血清中第1、3、7天肝功能检验的指标（ALT、AST、TBIL）恢复情况。[结果]（1）由两组患者术后血清ALT、AST、TBIL的变化可以发现,实验组术后第1、3、7天血清ALT、AST、TBIL均明显低于对照组（P<0.05）。术后两组的住院天数、并发症发生率等差异无统计学意义。（2）对于伴有肝硬化的患者,两组术后血清ALT、AST、TBIL的变化可见:实验组术后第1、3、7天血清ALT、AST明显低于对照组（P<0.05）;术后第3天血清TBIL低于对照组（P<0.05）,术后第1天和第7天血清TBIL两组间差异无统计学意义（P>0.05）,考虑可能与患有肝硬化的患者,其胆红素恢复相对缓慢或肝硬化患者胆红素的长期淤积、代谢有关。[结论]术后远端缺血处理能促进肝脏切除患者术后早期肝功能的恢复,这与远端缺血处理减少肝脏缺血再灌注损伤的发生有关。
二、NO与肝脏缺血再灌注损伤预处理保护效应（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NO与肝脏缺血再灌注损伤预处理保护效应（论文提纲范文）
（1）杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中药杜仲对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）CCN1敲低通过ERK通路对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 综述 肝缺血再灌注损伤的机制及预防和治疗策略 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肝缺血再灌注损伤的机制 |
| 1.2.1 无氧代谢、酸中毒与细胞程序性死亡 |
| 1.2.2 细胞内Ca~(2+)超载与细胞程序性死亡 |
| 1.2.3 线粒体通路在HIRI细胞程序性死亡中的作用机制 |
| 1.2.4 氧化应激在HIRI细胞程序性死亡中的作用机制 |
| 1.2.5 炎症反应与细胞程序性死亡 |
| 1.2.6 其他炎症介质 |
| 1.3 肝缺血再灌注损伤与细胞程序性死亡 |
| 1.4 HIRI中细胞程序性细胞死亡的类型 |
| 1.4.1 细胞凋亡(apoptosis) |
| 1.4.2 坏死性凋亡(necroptosis) |
| 1.4.3 细胞焦亡(pyroptosis) |
| 1.4.4 自噬(autophagy) |
| 1.5 HIRI的预防和治疗 |
| 1.5.1 药物预防与治疗 |
| 1.5.2 抗凋亡治疗 |
| 1.6 器官移植过程中的肝保护 |
| 1.6.1 缺血预处理(IPC)和缺血后处理(IPost C) |
| 1.6.2 离体肝脏机械灌注 |
| 1.6.3 低温机械灌注(Hypothermic machine perfusion,HMP) |
| 1.6.4 亚低温机械灌注(subnormothermic machine perfusion,SNMP) |
| 1.6.5 常温机械灌注(normothermic machine perfusion,NMP) |
| 1.7 总结与展望 |
| 第2章 CCN1敲低通过抑制ERK通路对肝缺血/再灌注损伤产生保护作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设备及材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要实验设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物模型的建立 |
| 2.3.2 病理检测 |
| 2.3.3 TUNEL检测 |
| 2.3.4 Western blot |
| 2.3.5 总RNA提取 |
| 2.3.6 试剂盒检测TNF-α、IL-6、MPO、AST与ALT |
| 2.3.7 细胞培养 |
| 2.3.8 病理TUNEL检测见在体实验部分 |
| 2.3.9 Weston blot见在体实验部分 |
| 2.3.10 总RNA提取见在体实验部分 |
| 2.3.11 Elisa检测TNF-α与 IL-6见在体实验部分 |
| 2.3.12 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足之处 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）低氧预处理增强间充质干细胞对肝脏缺血再灌注损伤保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 低氧预处理增强BMMSC对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞治疗肝脏缺血再灌注损伤的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（4）γ-谷维素预处理对小鼠肝缺血再灌注损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 γ-谷维素预处理对小鼠肝 I/R 损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二部分 γ-谷维素对二氯化钴诱导细胞缺氧损伤的作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 内质网应激与肝脏冷缺血再灌注损伤的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）不同提取方式的杜仲提取物对肝缺血再灌注损伤的保护作用研究及机制初探（论文提纲范文）
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分:两种不同提取工艺的杜仲粗提物对肝脏缺血再灌注损伤保护作用的比较 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:杜仲多糖在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用及机制探讨 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）CD103+DCs在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言及综述 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肝动脉栓塞术后缺血再灌注损伤的初步观察性研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小鼠肝脏缺血再灌注模型的建立 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CD103+DGS减轻肝缺血再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 CD103+DCS降低肝缺血再灌注损伤的机制研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 研究局限性 |
| 参考文献 |
| 附表及附图 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（7）ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 腹腔镜微创技术简介 |
| 1.1.1 腹腔镜微创技术的发展简介 |
| 1.1.2 腹腔镜肝切除术的发展应用 |
| 1.1.3 腹腔镜微创技术的客观评价 |
| 1.1.4 腹腔镜微创技术的发展方向 |
| 1.2 肝脏缺血再灌注损伤 |
| 1.2.1 肝脏缺血再灌注损伤的发生机制 |
| 1.2.2 肝脏缺血再灌注损伤的预防治疗 |
| 1.2.3 探究肝脏缺血再灌注损伤的实验动物模型 |
| 1.3 间充质干细胞概述 |
| 1.3.1 干细胞的生物学特性与分类 |
| 1.3.2 间充质干细胞的由来与定义 |
| 1.3.3 间充质干细胞生物学功能 |
| 1.3.4 间充质干细胞作用机制 |
| 1.3.5 干细胞临床应用的安全性 |
| 1.4 间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.1 间充质干细胞的旁分泌作用 |
| 1.4.2 间充质干细胞条件培养基的治疗作用 |
| 1.4.3 脂肪间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.4 脂肪间充质干细胞条件培养基的临床应用 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验器材 |
| 2.1.3 试验药品及试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养 |
| 2.2.2 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 2.2.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 2.2.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 2.2.5 小型猪腹腔镜下肝缺血再灌注合并部分切除模型的建立 |
| 2.2.6 腹腔镜建立肝缺血再灌注合并部分切除模型的安全性监测 |
| 2.2.7 小型猪ADSC-CM对血液常规指标的影响 |
| 2.2.8 小型猪ADSC-CM对肝组织形态学观察 |
| 2.2.9 小型猪ADSC-CM对肝脏酶谱的影响 |
| 2.2.10 小型猪ADSC-CM对肝脏氧化应激的影响 |
| 2.2.11 小型猪ADSC-CM对炎症反应的影响 |
| 2.2.12 小型猪ADSC-CM对肝细胞凋亡的影响 |
| 2.2.13 小型猪ADSC-CM对肝再生的影响 |
| 2.2.14 小型猪ADSC-CM成分检测 |
| 2.2.15 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养和形态比较 |
| 3.2 小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 3.2.1 表面抗原的鉴定 |
| 3.2.2 成骨分化能力的鉴定 |
| 3.2.3 成脂分化能力的鉴定 |
| 3.2.4 成肝分化能力的鉴定 |
| 3.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 3.3.1 增殖能力的比较 |
| 3.3.2 迁移能力的比较 |
| 3.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 3.4.1 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取 |
| 3.4.2 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的浓缩 |
| 3.5 腹腔镜建立肝损伤模型安全性监测结果 |
| 3.6 血液常规指标检测结果 |
| 3.6.1 白细胞(WBC) |
| 3.6.2 中性粒细胞(NE) |
| 3.6.3 淋巴细胞(LY) |
| 3.7 肝组织形态学观察结果 |
| 3.7.1 肝脏病理结构观察结果 |
| 3.7.2 肝脏超微结构观察结果 |
| 3.8 术后肝脏酶谱检测结果 |
| 3.8.1 谷丙转氨酶(ALT) |
| 3.8.2 谷草转氨酶(AST) |
| 3.8.3 碱性磷酸酶(ALP) |
| 3.8.4 乳酸脱氢酶(LDH) |
| 3.8.5 总胆红素(TBIL) |
| 3.8.6 总蛋白(TP) |
| 3.9 肝组织氧化应激检测结果 |
| 3.9.1 丙二醛(MDA) |
| 3.9.2 超氧化物歧化酶(SOD) |
| 3.9.3 过氧化氢酶(CAT) |
| 3.9.4 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) |
| 3.9.5 髓内过氧化物酶(MPO) |
| 3.10 炎症反应水平检测结果 |
| 3.10.1 血清炎症相关指标检测结果 |
| 3.10.2 肝脏组织炎症相关基因水平检测结果 |
| 3.11 肝细胞凋亡水平检测结果 |
| 3.11.1 肝脏组织凋亡相关酶活性检测结果 |
| 3.11.2 肝脏组织凋亡相关基因水平检测结果 |
| 3.11.3 肝脏组织凋亡相关蛋白水平检测结果 |
| 3.11.4 肝脏组织Fas和Fasl免疫组织化学染色结果 |
| 3.11.5 肝脏组织TUNEL染色结果 |
| 3.12 肝脏再生水平检测结果 |
| 3.12.1 血清再生相关指标检测结果 |
| 3.12.2 组织再生相关基因检测结果 |
| 3.12.3 组织再生相关蛋白检测结果 |
| 3.12.4 肝脏组织Ki67免疫组织化学染色结果 |
| 3.13 小型猪ADSC-CM成分分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ADSCs培养方法的改良 |
| 4.2 ADSC-CM对肝脏缺血再灌注损伤的研究基础 |
| 4.3 ADSC-CM对小型猪肝脏功能的影响 |
| 4.4 ADSC-CM对小型猪氧化应激的影响 |
| 4.5 ADSC-CM对小型猪炎症反应的影响 |
| 4.6 ADSC-CM对小型猪细胞凋亡的影响 |
| 4.7 ADSC-CM对小型猪肝脏再生的影响 |
| 4.8 小型猪ADSC-CM成分分析的探讨 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤 |
| 1.1.1 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤现状 |
| 1.1.2 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤机制 |
| 1.2 低氧诱导因子/脯氨酰羟化酶通路 |
| 1.2.1 低氧诱导因子/脯氨酰羟化酶通路的发现 |
| 1.2.2 氧平衡与低氧 |
| 1.2.3 低氧诱导因子 |
| 1.2.4 低氧诱导因子脯氨酰羟化酶 |
| 1.2.5 靶向PHD抑制剂的应用 |
| 1.3 胞内抗体 |
| 1.3.1 胞内抗体的概述 |
| 1.3.2 胞内抗体的分类 |
| 1.3.3 胞内抗体的优势和应用 |
| 1.4 本研究的立题目的和研究内容 |
| 第2章 靶向PHD2 胞内抗体的构建和活性表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 成功制备靶向PHD2 胞内抗体ER-INP |
| 2.3.2 靶向PHD2 胞内抗体ER-INP在细胞中的表达及定位 |
| 2.3.3 靶向PHD2 胞内抗体ER-INP的生物学活性 |
| 2.3.4 靶向PHD2 胞内抗体ER-INP不影响细胞形态和生存率 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 靶向PHD2 胞内抗体体内和体外的促血管生成效应 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 靶向PHD2 胞内抗体在体内外有效促进血管生成 |
| 3.3.2 靶向PHD2 胞内抗体显着上调HIF-1 下游靶基因 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 靶向PHD2 胞内抗体保护APAP诱导的肝损伤 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 建立了APAP诱导的肝损伤动物模型 |
| 4.3.2 小鼠尾静脉注射GFP质粒靶向富集肝脏 |
| 4.3.3 ER-INP能在小鼠肝脏表达,但不影响正常肝脏组织形态和酶学特征 |
| 4.3.4 靶向PHD2 胞内抗体对APAP诱导肝损伤的保护作用 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 靶向PHD2 胞内抗体对APAP诱导肝损伤的保护作用机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 靶向PHD2胞内抗体有效促进APAP诱导肝损伤小鼠肝脏血管生成 |
| 5.3.2 靶向PHD2 胞内抗体对肝损伤小鼠体内细胞应激的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 靶向PHD2 胞内抗体的制备及其促血管生成效应 |
| 6.2 靶向PHD2 胞内抗体对APAP诱导肝损伤的保护作用及机制 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（9）人参皂甙Rg1通过抑制线粒体凋亡和自噬途径减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 不同缺血预处理方案对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 人参皂甙Rg1的药物预处理和/或缺血预处理对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 人参皂甙Rg1通过抑制CyPD介导的线粒体凋亡途径减轻大鼠肝脏热缺血再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 人参皂甙Rg1通过线粒体自噬途径减轻大鼠肝脏热缺血再灌注损伤 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 线粒体途径在肝缺血再灌注损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）术后远端缺血处理对肝切除术后早期肝功能的恢复的临床研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 知情同意书 |
| 远端肢体缺血处理对术后的脏器功能保护及恢复机制综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、NO与肝脏缺血再灌注损伤预处理保护效应（论文参考文献）
- [1]杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 张世龙. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]CCN1敲低通过ERK通路对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究[D]. 刘环秋. 吉林大学, 2021(01)
- [3]低氧预处理增强间充质干细胞对肝脏缺血再灌注损伤保护作用的机制研究[D]. 陈睿. 昆明医科大学, 2021(01)
- [4]γ-谷维素预处理对小鼠肝缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D]. 仲富瑞. 西南医科大学, 2021(01)
- [5]不同提取方式的杜仲提取物对肝缺血再灌注损伤的保护作用研究及机制初探[D]. 高伟东. 遵义医科大学, 2020(12)
- [6]CD103+DCs在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及机制研究[D]. 周春泽. 山东大学, 2020(11)
- [7]ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究[D]. 焦智慧. 东北农业大学, 2020(04)
- [8]靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究[D]. 赵良中. 吉林大学, 2020(08)
- [9]人参皂甙Rg1通过抑制线粒体凋亡和自噬途径减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的机制研究[D]. 林杰. 昆明医科大学, 2020(02)
- [10]术后远端缺血处理对肝切除术后早期肝功能的恢复的临床研究[D]. 涂勇浪. 昆明医科大学, 2020(02)