一、利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异（论文文献综述）
陈乞[1]（2021）在《地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究》文中提出背景和目的:慢性乙型肝炎相关肝癌发病率及病死率逐年上升。目前肝癌发病机制虽有多种假说,但确切机制至今尚未明确是其妨碍提高防治水平的关键科学问题。多年来防治肝癌的策略主要集中于抗病毒和肝癌细胞本身,忽略了人体内在宿主因素的影响。随着肝癌微环境概念的提出,其作为影响肝癌发生发展的关键因素,逐渐引起研究者的重视。慢性肝病的肝脏炎症和纤维化形成的异常肝再生微环境促进肝癌的发生发展。因此研究通过改善肝再生微环境降低肝癌发生,抑制其进展及转移,具有极大的临床参考价值和深远的科学意义。本文结合临床试验和体外实验两部分,旨在探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制:第一部分,观察地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生率及发生风险的影响。第二部分,揭示共培养条件下TGF-β1活化肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的相关机制,分析其对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡和侵袭能力的影响,探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。方法:1.本试验通过对前期完成的针对HBeAg阴性慢乙肝的随机对照临床试验（中国临床试验注册中心注册号:Chi CTR-TRC-12002962）的单用地五养肝胶囊或单用恩替卡韦或二者联用治疗时间达到48周的患者,进行长达108月前瞻性随访观察（恩替卡韦随访期间不停药）,每6个月检测患者血常规、肝肾功能、凝血功能、乙肝两对半定量、血清HBV DNA水平和甲胎蛋白（AFP）。主要观察评价指标:观察随访期间终点事件肝癌的发生率。次要观察指标:观察随访期间慢乙肝患者生化学及病毒学应答。其中,肝癌累积发病率采用使用乘积限法（Kaplan-Meier）统计,并通过时序检验（log-rank）方法进行比较。2.体外实验通过建立TGF-β1诱导激活的人肝星状细胞LX-2与人肝癌细胞株HCCLM3的共培养模型,模拟肝癌的肝再生微环境。实验分为LX2对照组（LX2-NS）、共培养模型组（Co-culture model）、共培养DWYG组（Co-culture DWYG）,并给予地五养肝胶囊含药血清进行干预,通过CCK-8、流式细胞术、Transwell侵袭实验等细胞生物学方法观察共培养条件下活化人肝星状细胞LX2对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡、侵袭能力的影响,通过Western Blotting、q RT-PCR等分子生物学方法研究共培养条件下活化人肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的机制,分析这一过程中TGF-β/Smad信号通路的Smad2、Smad3、TβRI、Smad7等m RNA和蛋白表达规律,探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。结果:（1）入组基线资料及随访时间比较:对符合纳入标准的170例患者随机分为三组,其中A组为地五养肝胶囊治疗组（56例）,口服地五养肝胶囊;B组为地五养肝胶囊联合恩替卡韦治疗组（57例）,同时应用地五养肝胶囊和恩替卡韦;C组为恩替卡韦对照组（57例）,口服恩替卡韦,对治疗周期达到48周的患者进行108月随访。入组时各组患者在年龄、性别、血常规（包括中性粒细胞NEU、淋巴细胞LYM、中性粒细胞与淋巴细胞比值NLR以及血小板计数PLT）、PT国际标准化比值INR、肝功能包括（ALT、AST、GGT、ALB、TP、TBIL）及血清HBV-DNA水平无显着性差异（P>0.05）。随访从2012年1月1日至2021年1月11日,共随访108个月,平均随访时间84.03个月,中位随访时间94.00个月。地五养肝胶囊组的平均随访时间和中位随访时间分别为90.75个月、99.00个月,地五养肝胶囊联合恩替卡韦组的平均随访时间和中位随访时间分别为78.82个月、92.50个月,恩替卡韦组的的平均随访时间和中位随访时间分别为82.78个月、91.00个月。共计随访患者151例,总计失访率为11.18%（19/170）。其中,地五养肝胶囊组完成随访48例,地五养肝胶囊联合恩替卡韦组完成随访50例,恩替卡韦组完成随访53例,三组失访率依次为14.29%（8/56）、12.28%（7/57）、7.02%（4/57）,失访率组间比较无显着差异（P>0.05）。（2）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的比较:将不同干预方案的三组患者血生化结果进行分析,发现三组组间比较,ALT、AST水平无明显差异（P>0.05）。其他相关ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标,在三组间比较差异不显着（P>0.05）。三组随访患者血生化指标分别与入组时相比,发现三组随访患者肝功能ALT、AST均较前下降（ALT:23.50±15.40 vs 34.70±17.51,25.96±27.45 vs35.87±18.07,28.18±20.30 vs 40.25±21.20;AST:22.08±5.87 vs 28.72±11.24,23.11±11.17 vs 31.91±11.61,27.57±16.85 vs 33.72±14.35）,差异具有统计学意义（P<0.01）,而ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标,较前入组时相比无明显差异（P>0.05）。（3）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的比较:不同治疗方案的各组患者HBV DNA水平均较入组时明显下降（P<0.05）。HBV DNA水平在随访的三组间组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组HBs Ag水平分别与入组时相比,三组HBs Ag水平较前明显降低（P<0.05）。随访结果显示,三组患者中HBs Ag下降>1500 IU/ml依次为34.21%（13/38）、35.71%（10/28）、28.57%（8/28）,经统计学分析三者差异无意义（P>0.05）。（4）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌累积发病率影响:随访至108月,采用Kaplan-Meier（乘积限法）法绘制肝癌发病生存曲线,并计算地五养肝胶囊组、地五养肝胶囊联合恩替卡韦组、恩替卡韦组随访发生肝癌事件的累积发病率依次为0%（0/48）、2%（1/50）、11.32%（6/53）,然后采用时序检验Log Rank（Mantel-Cox）进行分析检验,结果显示:三组患者肝癌累积发病率具有差异（P<0.05）。其中,地五养肝胶囊组肝癌累积发病率（0%）明显低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P<0.05）。地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌累积发病率（2%）低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P<0.05）。地五养肝胶囊组肝癌发病率（0%）低于地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌发病率（2%）,但差异无统计学意义（P>0.05）。提示相对于单独应用恩替卡韦抗病毒治疗,单用地五养肝胶囊或联合应用恩替卡韦均可显着降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率。（5）TGF-β1诱导LX2活化以及LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的形态学观察:LX2活化前形体不规则呈多边星形,胞突生长不发达,细胞间连接紧密;经TGF-β1（10ng/ml）诱导激活后,细胞体积增大,胞突伸展,细胞间连接疏松,细胞增殖速度加快;与人肝癌细胞HCCLM3共培养后LX2胞伪足更加伸展,呈拉伸状两极生长,细胞增殖明显增快。（6）筛选DWYG含药血清最佳给药浓度:采用CCK-8法检测不同浓度DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖能力的影响。实验结果显示:与对照组相比,随着5%、10%、15%、20%等不同含药血清浓度的升高,各组细胞测得的A450值逐渐下降,HCCLM3细胞增殖活力明显下降（P<0.01）,细胞增殖抑制率逐渐增高（P<0.01）,选取10%为最佳实验用血清含药浓度。（7）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖的影响:（1）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖的影响:与M3对照组A450值（0.69±0.03）相比,共培养模型组（0.75±0.01）HCCLM3细胞增殖活力增强（P<0.01）。与M3对照组A450值（0.69±0.03）相比,共培养DWYG组（0.65±0.01）HCCLM3细胞增殖活力下降（P>0.05）。与共培养模型组A450值（0.75±0.01）相比,共培养DWYG组（0.65±0.01）HCCLM3细胞增殖活力显着降低（P<0.01）。由此可见,共培养模型组HCCLM3增殖率（111.45%）,显着高于M3对照组细胞增殖率（100%）,而共培养DWYG组HCCLM3细胞增殖率（90.77%）显着低于共培养模型组（111.45%）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可能促进肝癌细胞HCCLM3的增殖,DWYG含药血清可能抑制LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖。（2）LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的增殖:与LX2对照组（0.62±0.02）相比,共培养模型组（0.71±0.02）LX2细胞增殖活力显着增加（P<0.01）。与LX2对照组（0.62±0.02）相比,共培养DWYG组（0.63±0.01）LX2细胞活力无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组（0.71±0.02）相比,共培养DWYG组（0.63±0.01）LX2细胞增殖能力下降（P<0.01）。与LX2对照组（100%）相比,共培养模型组具有更高细胞增殖率（120.35%）。与共培养模型组（120.35%）相比,共培养DWYG组LX2细胞增殖率（90.77%）显着下降。提示LX2/HCCLM3共培养体系可能促进人肝星状细胞LX2的增殖,DWYG含药血清具有抑制LX2/HCCLM3共培养体系中LX2增殖的作用。（8）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3及LX2两种细胞凋亡的影响:（1）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系HCCLM3细胞凋亡的影响:根据流式细胞仪检测结果显示,与M3对照组（7.52±0.17）相比,共培养模型组（6.23±0.54）细胞凋亡率明显下降（P<0.01）。与M3对照组（7.52±0.17）相比,共培养DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。与共培养模型组（6.23±0.54）相比,共培养DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系抑制HCCLM3的凋亡,而DWYG含药血清可促进LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3的凋亡。与M3阴性对照组（6.23±0.54）相比,M3DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系抑制HCCLM3的凋亡,而DWYG含药血清可促进LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3的凋亡。（2）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞凋亡的影响:与LX2对照组（6.37±0.32）相比,共培养模型组（5.15±0.29）凋亡率明显下降（P<0.01）。与LX2对照组（6.37±0.32）相比,共培养DWYG组（7.36±0.37）细胞凋亡升高（P<0.01）。与共培养模型组（5.15±0.29）相比,共培养DWYG组（7.36±0.37）细胞凋亡显着升高（P<0.01）。表明LX2/HCCLM3共培养体系可一定程度上抑制LX2细胞的凋亡,DWYG含药血清可减弱该抑制作用从而促进LX2/HCCLM3共培养体系中人肝星状细胞LX2的凋亡。（9）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3侵袭能力的影响:与M3对照组（104.00±4.18）相比,共培养模型组（148.80±4.09）HCCLM3侵袭能力明显增强,差异具有统计学意义（P<0.01）。与M3对照组（104.00±4.18）相比,共培养DWYG组（78.00±6.60）侵袭能力下降（P<0.01）。与共培养模型组（148.80±4.09）相比,共培养DWYG组（78.00±6.60）细胞侵袭力显着下降（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可增强HCCLM3侵袭能力,而DWYG含药血清可降低由共培养体系诱导的高HCCLM3侵袭能力。（10）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞EMT相关m RNA的表达的影响:采用RT-PCR检测技术检测EMT相关E-cadherin、Vimentin m RNA的表达,统计结果显示:与LX2对照组相比,共培养模型组E-cadherin m RNA的表达下降（P<0.01）,Vimentin m RNA表达明显升高（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组E-cadherin m RNA的表达增加（P<0.01）,Vimentin m RNA的表达无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组E-cadherin m RNA的表达明显增加（P<0.01）,Vimentin m RNA的表达明显降低（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Vimentin m RNA的表达,抑制E-cadherin m RNA的表达,而DWYG含药血清则促进LX2/HCCLM3共培养体系中LX2细胞E-cadherin m RNA的表达,抑制Vimentin m RNA表达。（11）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞EMT和TGF-β/Smad信号通路相关m RNA的表达的影响:通过实验检测LX2细胞TGF-β/Smad信号通路相关Smad2、Smad3、TβRI、Smad7 m RNA的表达情况,结果分析显示:与LX2对照组相比,共培养模型组Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达升高,Smad7 m RNA表达下降（P<0.01）。与LX2对照组相比共培养DWYG组TβRI m RNA的表达下降（P<0.01）,Smad7 m RNA表达上升（P<0.01）,Smad2、Smad3m RNA表达下降（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达下降（P<0.05）,Smad7 m RNA表达上升（P<0.05）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达,降低Smad7 m RNA的表达,而DWYG含药血清则可促进LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞Smad7 m RNA的表达,抑制Smad2、Smad3、TβRIm RNA表达。（12）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系EMT相关蛋白的表达的影响:与LX2对照组相比,共培养模型组E-cadherin蛋白的表达下降（P<0.01）,Vimentin蛋白表达明显升高（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组E-cadherin蛋白的表达增强（P<0.01）,Vimentin蛋白的表达无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组E-cadherin蛋白的表达增加（P<0.01）,Vimentin蛋白的表达降低（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达,而DWYG含药血清则促进LX2/HCCLM3共培养体系E-cadherin蛋白的表达,抑制Vimentin蛋白表达。（13）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达的影响:通过实验检测LX2细胞TGF-β/Smad信号通路相关Smad2、Smad3、TβRI、Smad7蛋白的表达情况,结果分析显示:与LX2对照组相比,共培养模型组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达升高,Smad7蛋白表达下降（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达下降,Smad7蛋白表达上升（P<0.01）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达下降,Smad7蛋白表达上升（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达,降低Smad7蛋白的表达,而DWYG含药血清则可促进LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞Smad7蛋白的表达,抑制Smad2、Smad3、TβRI蛋白表达。结论:（1）根据170例地五养肝胶囊治疗HBeAg阴性慢性乙型肝炎RCT临床试验资料,随访至108月,单用地五养肝胶囊组与单用恩替卡韦组和联合用药组在生化学应答、病毒学应答方面疗效相当。单用地五养肝胶囊或者联用恩替卡韦能显着降低肝癌发病率。（2）构建的活化的LX2与HCCLM3共培养体系模拟的肝癌肝再生微环境可促进LX2和HCCLM3增殖活力,抑制LX2和HCCLM3凋亡,增强HCCLM3细胞侵袭能力,其机制可能通过激活TGF-β/Smad信号通路促进EMT。DWYG含药血清能显着抑制共培养体系中的LX2和HCCLM3增殖,促进LX2和HCCLM3凋亡,降低HCCLM3细胞侵袭能力,其机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路过度激活、调节EMT/MET失衡,改善肝癌肝再生微环境,发挥防治肝癌发生发展的作用。
卢婷[2]（2020）在《基于聚乳酸微球佐剂的乙肝疫苗研究》文中研究指明慢性乙肝的治愈之路充满挑战。与传统的抗病毒疗法相比,疫苗疗法是慢性乙肝预防和治疗的重要潜力途径。但是如何使疫苗获得有效的细胞免疫效果满足治疗性需求,具有更好的保护效果,是当前面临的重要挑战。本课题提出生物相容性好的聚乳酸（PLA）微球合理装载抗原和免疫刺激剂,实现按需递送的功能,作为治疗性乙肝疫苗,同时以PLA微球为佐剂探索免疫针次减少的疫苗制剂。课题具体研究内容如下:1)针对免疫刺激剂5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）在特定细胞位置发挥作用的需求,成功制备了按需释放抗原的DP微球及抗原/刺激剂的DP-D微球,并验证了其在细胞水平的效果。通过向PLA微球中引入阳离子脂双十八烷基二甲基溴化铵（DDAB）,微球可以温和高效携载乙肝表面抗原（HBsAg,吸附率85%以上）;并且借助质子海绵效应,促进溶酶体逃逸,使DMXAA释放到胞质中,与其受体结合,激活下游通路。在分子水平上,DP-D与抗原组相比,其STING通路的IRF-7和IFN-β表达分别提高了 12和8.2倍。同时微球携载HBsAg后易于被树突状细胞（DCs）摄取及引起溶酶体逃逸,提高DCs表面共刺激分子及MHC分子的表达,促进细胞因子分泌,在高效促进DCs活化的同时诱导后续免疫应答。2)评价了 PLA微球佐剂在健康鼠上的体液和细胞免疫效果,探索了其应用于疫苗时的作用机制。微球疫苗制剂诱导了注射部位IL-1β和CXCL-10等炎症因子和趋化因子的表达,同时招募DCs及巨噬等免疫细胞到注射部位,经APCs转运至淋巴结后,促进了淋巴结内DCs、B及滤泡辅助T细胞（Tfh细胞）的活化。在免疫健康鼠后,诱导产生了高水平的HBsAg特异性抗体IgG,提高IgG2a/IgG1比例、Th1细胞数量及IFN-γ等细胞因子的分泌,实现了体液和细胞免疫的双重提升。3)成功构建了慢性乙肝（CHB）模型鼠,并基于该评价模型开展了微球疫苗制剂的免疫及治疗评价。采用尾静脉注射重组乙肝腺病毒的方式构建CHB模型鼠。结果表明,DP、DP-D组诱导产生高水平的HBsAg特异性抗体IgG,可促进脾细胞增殖活化与Th1型细胞因子的分泌,提升了 HBsAg特异性CTL反应,产生免疫记忆起到保护效果。两组模型鼠血清中HBsAg转阴率均达到50%,显着降低了肝脏中HBcAg的表达,取得了良好的治疗效果。4)验证了以PLA微球为佐剂,用两针代替三针铝佐剂疫苗的长效免疫保护效果。微球疫苗制剂两针免疫后产生与铝佐剂相当的抗体水平,且抗体半年内维持较高水平,在HBsAg再次入侵时可快速产生抗体。优化了该疫苗制剂的冻干保护剂种类及相应浓度,考察了冻干制剂在室温下的稳定性。总体结果明确了微球疫苗佐剂具有减少免疫针次及可冻干的特性,具备临床转化的潜力。综上,本课题设计的PLA微球疫苗制剂应用于乙肝疫苗有较大潜力。
郑志远,吴和明,李仲坚[3]（2020）在《梅州地区客家人群HBV不同基因型分布及核苷（酸）类似物耐药位点、感染患者病情对比观察》文中研究表明目的探讨梅州地区客家人群乙型肝炎病毒（HBV）基因型分布,比较不同基因型感染患者拉米夫定、阿德福韦酯耐药突变位点及病情。方法梅州地区客家慢性HBV感染患者525例,采用磁珠法提取HBV核酸后在实时荧光定量PCR仪进行核酸扩增;采用HBV分型检测芯片进行HBV基因分型检测;采用HBV耐药突变位点检测芯片进行核苷（酸）类似物（拉米夫定、阿德福韦酯）耐药突变位点检测。采用生化法检测血清肝功能指标,化学发光免疫法检测血清甲胎蛋白（AFP）,并统计HBV不同基因型慢性感染者肝硬化、肝癌病例数。结果 525例梅州地区客家慢性HBV感染患者中,HBV B基因型463例（88. 19%）,HBV C基因型59例（11. 24%）,HBV B+C基因型、HBV B+D基因型和HBV D基因型各1例,各占0. 19%。525例HBV慢性感染者中,位点突变475例（90. 48%）,其中HBV B基因型421例、HBV C基因型54例; 437例对拉米夫定耐药,18例对阿德福韦酯耐药,20例为多重耐药。对拉米夫定耐药的437例HBV慢性感染者中,以B基因型HBV耐药位点rt180M+rt204V最常见,耐药患者所占比例为72. 89%。对阿德福韦酯耐药的18例患者中,以B基因型HBV耐药位点rt236T最常见,耐药患者所占比例为45. 45%。HBV B、C基因型慢性感染患者血清谷丙转氨酶（ALT）水平比较,P <0. 05。HBV C基因型慢性感染者肝硬化、肝癌比例（分别为57. 63%和28. 81%）高于B基因型（分别为25. 92%和14. 47%）（P均<0. 05）。结论梅州地区客家人群HBV基因型有B、C、B+C、B+D、D型,以B基因型为主。HBV B基因型慢性感染者拉米夫定耐药位点以rt180M+rt204V最为多见,阿德福韦酯耐药位点以rt236T最为多见。HBV B基因型慢性感染患者病情轻于C基因型。
韦武均[4]（2020）在《反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究》文中提出第一章HBV C编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定目的:针对乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）编码链C基因设计合成反基因锁核酸（locked nucleic acid,LNA）片段,以HBV转基因小鼠为研究对象,筛选出最佳给药剂量、给药途径和给药方式。方法:针对乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点,利用RNAstructure 5.0软件设计合成反基因LNA片段5ˊ-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3ˊ,设置不同给药剂量组、给药途径组和给药方式组,以阳离子聚合物介导转染HBV转基因小鼠,分别于给药前、给药后1、3、5和7 d,采集眼眶静脉血,采用PCR荧光探针法和磁微粒化学发光法检测血清HBV DNA和HBs Ag、HBe Ag含量。采用单链特异性核酸内切酶酶切实验鉴定LNA片段稳定性。结果:给药后第7d,0.5μg/g剂量组、尾静脉注射组和1次/48h给药组对病毒HBV DNA复制和HBs Ag、HBe Ag表达抑制效果较明显,HBV DNA复制抑制率分别为57.09%、56.61%和57.22%,HBs Ag表达抑制率分别为49.29%、48.65%和48.41%,HBe Ag分别为71.72%、69.95%和69.44%。LNA抗核酸酶降解能力较强。结论:LNA片段5ˊ-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3ˊ的最佳给药剂量为0.5μg/g,给药途径为尾静脉注射,给药方式为1次/48h。第二章反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达目的:探讨针对乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点的反基因LNA在HBV转基因小鼠体内的抗病毒效果。方法:将30只HBV转基因小鼠完全随机分为5组,每组6只,分别为5%GLU空白对照组、无关序列对照组、拉米夫定对照组、反义LNA对照组和反基因LNA实验组,采用尾静脉注射法对5%GLU空白对照组、无关序列对照组、反义LNA对照组和反基因LNA实验组给药,采用连续灌胃法对拉米夫定对照组给药,分别于给药前、给药后1、3、5和7 d,采集眼眶静脉血,采用PCR荧光探针法和磁微粒化学发光法检测血清HBV DNA和HBs Ag、HBe Ag含量,利用RT-PCR法和免疫组化技术检测肝脏HBV Cm RNA和HBs Ag、HBe Ag表达水平。通过HE染色和血常规、生化指标判断反基因LNA对肝肾细胞结构和功能的改变。结果:给药后第1、3、5和7d,反基因LNA组对HBV DNA复制和HBs Ag、HBe Ag表达均有较明显的抑制效果,HBV DNA复制抑制率分别为20.68%、45.66%、52.33%和55.68%,HBs Ag表达抑制率分别为20.44%、36.17%、44.90%和47.87%,HBe Ag分别为35.65%、54.29%、65.08%和72.67%,与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05;肝脏HBV C m RNA相对表达量和HBs Ag、HBcAg阳性细胞率为0.36和38.20%、32.50%,与对照组比较,差异有统计学意义,P<0.05。HE染色和血常规、生化指标未发现肝肾细胞结构和功能有明显改变。结论:乙肝病毒编码链C基因24042418 nt位点是反基因LNA治疗的有效靶点。
陈望,刘爱玲,吴敏[5]（2019）在《深圳地区慢性乙型肝炎病毒感染者天然耐药现状及其与基因型的关系》文中研究指明目的 了解深圳地区慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者的天然耐药现状,并对其基因分型和天然耐药基因进行分析。方法 收集2017年3月～2018年2月来深圳市龙华区人民医院就诊并确诊为HBV感染且未使用核苷（酸） 类似物抗病毒治疗的患者503例。采用PCR-反向点杂交基因芯片法对患者标本的HBV基因型及其与HBV耐药相关基因突变进行分析。结果 503例HBV感染者中检出64例对拉米夫定（LMV）和/或阿德福韦酯（ADV）天然耐药,耐药率为12.72%,其中对LMV天然耐药率为73.44%,明显高于对ADV天然耐药率的23.44%和对LMV和ADV同时耐药的3.13%,差异有统计学意义（P<0.01～0.05）。503例HBV感染者B基因型检出率68.59%,明显高于C基因型的23.06%、D基因型的2.59%及B+C混合基因型的5.77%,差异有统计学意义（P<0.05～0.01）。对LMV和ADV天然耐药基因突变中,耐药基因型均以B型为主,其中对LMV天然耐药基因突变类型以rtM204V为主,突变率为36.17%,明显高于其他突变类型,差异有统计学意义（P<0.01～0.05）,对ADV天然耐药基因突变类型以rt236T为主,突变率为46.67%,明显高于其他突变类型,差异有统计学意义（P<0.01～0.05）,而2例对LMV和ADV同时耐药基因型以B型为主,基因突变类型均为rtM204V+rtN236T。结论 深圳地区慢性HBV感染者对LMV和/或ADV有一定的天然耐药率,基因突变主要见于B基因型,基因突变类型以rtM204V和rtN236T为主。因此,HBV感染者治疗前进行天然耐药、基因分型及突变类型检测,对提高HBV治疗效果和降低耐药率具有重要的临床意义。
李雯,赖启南,张志成,李炜,陈勇平,肖影群[6]（2019）在《慢性乙型肝炎患者HBV基因分型和耐药突变的分析》文中提出目的利用PCR-反向点杂交（PCR-RDB）技术检测乙型肝炎病毒（HBV）基因分型及耐药位点突变情况,为临床制定抗病毒治疗方案提供参考依据,帮助降低疾病进展风险。方法收集2017年7月至2019年6月南昌市第九医院的542例慢性乙肝患者,采用PCR-RDB法检测HBV基因型和耐药突变位点情况。结果本研究中542例CHB患者,共检出B基因型450例（83.0%,450/542）,C基因型68例（12.6%,68/542）,检出BC基因型、BD基因型和其他基因型分别为13（2.4%,13/542）、8（1.5%,8/542）、3（0.6%,3/542）。同时,检出184例患者发生耐药突变,耐药检出率为33.9%（184/542）,其中B基因型151例,耐药检出率为33.6%（151/450）,C基因型22例,耐药检出率为32.4%（22/68）,B、C基因型在耐药检出率方面无统计学差异（P>0.05）。分析结果显示,HBV对拉米夫定、替比夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦4种药均具有耐药性,发生耐药突变例数分别为152（82.6%）、151（82.1%）、50（27.2%）和27（14.7%）,同时检出20种耐药突变模式,单个位点突变以rt204 I/V突变检出率最高（33.7%,62/184）,多个位点突变以rt204 I/V+rt180 M突变检出率最高（22.3%,41/184）。结论江西地区慢性乙肝患者HBV基因型主要以B、C基因型为主,核苷（酸）类似物相关HBV耐药突变模式复杂多样,且耐药检出率较高。
余学高,邓间开,陈耀铭,陈培松,何小洪,钟良英,黄彬[7]（2019）在《下一代测序法检测乙型肝炎病毒YMDD突变的方法学建立及性能评价》文中研究表明目的建立乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法,并对此方法进行性能评价。方法采用离心柱法提取血清标本中的DNA,设计引物对乙型肝炎病毒P基因区扩增并靶向捕获,通过下一代测序技术对捕获的DNA进行检测,利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行分析,得到基因突变结果,建立下一代测序用于乙型肝炎病毒YMDD突变的检测方法。收集慢性乙型肝炎患者血清样本共229例,采用下一代测序法和Sanger测序法同时检测YMDD基因突变,评价下一代测序法的检测性能。选取5例基因突变阳性的样本（包含不同基因突变型别）、2例基因突变阴性样本,采用下一代测序法对所选样本进行重复检测,评价该方法的重复性。结果建立了乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序检测方法。对229份临床样本的检测中,2种测序方法均检测到74例（74/229,32.31%）YMDD突变,其中下一代测序法检测到44例（44/229,19.21%）rtM204V突变,25例（25/229,10.92%）rtM204I突变,5例（5/229,2.18%）rtM204V/I混合突变。Sanger测序法检测到47例（47/229,20.52%）rtM204V突变、25例（25/229,10.92%）rtM204I突变和2例（2/229,0.87%）rtM204V/I混合突变。下一代测序法检测到3例Sanger测序法漏检的rtM204V/I混合突变。与Sanger测序法相比,下一代测序法的灵敏度、特异度和准确度均为100%,突变类别完全符合率为95.95%（71/74）,部分符合率为4.05%（3/74）。2种方法的一致性（κ）为0.97（P<0.01）。经重复性试验检测,下一代测序法的检测结果均一致,重复性符合率为100%。结论本研究建立的乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法灵敏度高,特异性好,重复性好,准确性高,比Sanger测序法更灵敏,能检测到更多的混合突变,为乙型肝炎病毒耐药基因检测提供了新的手段。
王珊[8]（2019）在《基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究》文中研究指明慢性乙型肝炎（以下简称乙肝）是目前最突出的全球性公共卫生问题之一,严重威胁人类健康。尽管近些年乙肝疫苗的使用有效降低了乙肝的发病率,每年仍有1-3千万人感染乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）,约有1百万人死于HBV感染及其并发症。为了有效地控制HBV的传播,确保HBV感染者得到及时的治疗,对HBV的高效检测尤为重要。而针对HBV DNA的核酸检测技术由于其具有灵敏度高、特异性强等优势,已广泛应用于乙肝的诊断、监测、预后评价和输血筛查等方面。然而,目前临床上仍有部分HBV感染者体内存在现有方法难以检出的低浓度HBV DNA,这不仅增加了由此引发的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的发病风险,还可能造成输血以及肝移植过程中的HBV感染。此外,对乙肝病毒耐药突变的检测和监测可预防由此引发的抗病毒治疗失败。但由于“准种”的存在,部分患者体内存在难以检出的极低含量的HBV耐药突变株,在某种情况下,如肝移植、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）合并感染等,这些未检出的低含量HBV耐药突变株,可能带来严重的临床后果（如HBV感染、肝衰竭等）。因此,研发一种高灵敏度的HBV DNA和耐药突变检测技术对乙肝的防治具有重大现实意义。近年来,新的RNA靶向系统CRISPR-Cas13a已被开发为一种可检测痕量核酸的高灵敏、高特异检测技术,通过结合RPA等温扩增技术可实现对单拷贝核酸和单碱基突变的准确检测和鉴定。相比检测成本高、稳定性差的等温扩增技术,基于PCR技术的核酸检测方法具有更高的临床实用性。因此,在本研究中,我们首次基于PCR扩增技术和CRISPR-Cas13a系统建立了针对HBV DNA及耐药突变的高灵敏、高特异核酸检测技术（PCR-CRISPR）,可实现对低至单拷贝HBV DNA的高灵敏检测。通过临床样本的验证,该方法对HBV DNA的检测灵敏度高于qPCR,达到甚至超过了数字PCR（ddPCR）的检测灵敏度。同时,我们还基于上述方法建立了针对乙肝YMDD耐药突变的高灵敏检测技术,可以特异性地检测出低至单拷贝耐药突变株,并在极低病毒载量临床样本中,鉴定出了qPCR无法检出的YMDD耐药突变株。1.建立基于PCR-CRISPR技术的高灵敏度HBV DNA检测方法通过LwCas13a蛋白的诱导表达、纯化及活性鉴定,获得了具有良好RNA酶活性的LwCas13a蛋白,纯度可达96%;通过比对不同基因型HBV聚合酶区（P区）的基因序列,我们在保守区设计并筛选出可以高效检测HBV DNA的crRNA。建立了基于PCR扩增、转录、crRNA识别及LwCas13a激活、报告RNA剪切及荧光检测的新型核酸检测技术:PCR-CRISPR。并实现了对低至单拷贝HBV DNA的高灵敏检测。2.利用PCR-CRISPR技术检测血清样本中HBV DNA我们利用PCR-CRISPR方法对32份已知血清样本进行HBV DNA的检测,检测结果（16份阴性,16份阳性）与qPCR一致。通过对280份未知血清样本的检测,进一步探索了该方法对临床样本HBV DNA检测的敏感度和特异性。检测结果显示,90份qPCR检测为HBV DNA阳性的血清样本和180份qPCR检测阴性的血清样本均被PCR-CRISPR成功检出。同时,对于10例qPCR判定为阴性的血清样本,PCR-CRISPR方法和ddPCR均检测出了痕量的HBV DNA（浓度约1.2-5.4拷贝/反应）。随后,我们利用PCR-CRISPR方法和ddPCR对该10例痕量样本分别进行了10次重复检测,结果显示PCR-CRISPR平均检出次数为7次,而ddPCR平均检出次数为3次。通过查阅患者的临床信息我们发现,其中6例患者存在慢性乙肝病史,2例显示为HBV感染者。以上结果表明,新建立的PCR-CRISPR方法对HBV DNA检测的灵敏度明显高于qPCR,达到甚至高于ddPCR的检测灵敏度。3.建立基于PCR-CRISPR技术的乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法通过对HBV YMDD区序列的保守性分析,我们设计并筛选了分别针对YVDD和YIDD耐药突变的crRNAs并建立了针对上述两种耐药突变的PCR-CRISPR检测方法。该技术可在PCR扩增后10 min内检测出低至单个拷贝的YVDD突变株,和100个拷贝的YIDD耐药突变株。该方法还可以通过荧光强度有效区分1 copy的YVDD突变株与106 copy的野生株。在本部分研究表明,新建立的PCR-CRISPR乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法,可以实现对乙肝YMDD耐药突变株的快速、高灵敏检测。4.利用PCR-CRISPR技术检测血清样本中乙肝病毒YMDD耐药突变利用qPCR、直接测序法和PCR-CRISPR方法,我们对424份血清样本进行了YMDD耐药突变的检测,结果显示,3种方法均检测出了27例血清样本（HBV DNA>100 IU/mL）中的YMDD耐药突变（5例YVDD和22例YIDD）;此外,qPCR和PCR-CRISPR 2种方法均检出了18例直接测序法未检出的YMDD耐药突变（5份YVDD和13份YIDD）;值得一提的是,PCR-CRISPR方法还在12例HBV DNA浓度低于100 IU/mL的血清样本中,检测出了qPCR和直接测序法均未检出的YMDD耐药突变（4例YVDD和8例YIDD）。以上结果表明,该技术可用于血清样本中YMDD耐药突变株的高灵敏检测,尤其适用于对低浓度HBV DNA血清样本中耐药突变的检测。综上,本研究首次将PCR扩增技术和CRISPR-Cas13a检测技术结合,建立了基于PCR-CRISPR技术的乙肝病毒DNA和YMDD耐药突变的高灵敏度、高特异性的检测方法。该方法可以用于对血清中低浓度HBV DNA的高灵敏检测,对降低输血和肝移植中HBV感染的风险、减少抗病毒治疗停药后的乙肝复发率,制定合适的抗病毒治疗方案具有重大临床意义。此外,本研究也为将该方法用于对其它病原的高灵敏高特异核酸检测奠定了理论和技术基础。
李征[9]（2019）在《肝内胆管癌的抗病毒治疗及长链非编码RNA在肿瘤进展中的作用和机制》文中研究说明第一部分肝内胆管癌的抗病毒治疗研究目的:乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）的重要危险因素,本研究拟评估抗病毒治疗（antiviral therapy,AVT）对合并HBV感染的ICC病人手术预后的影响。研究方法:回顾性的研究2006年至2011年,在上海东方肝胆外科医院和福建孟超肝胆外科医院接受肝切除治疗的928例合并HBV感染ICC病人的临床病理资料。详细记录病人的病毒再激活,肿瘤复发,肿瘤特异性生存和总体生存数据。生存率的分析使用时间依赖的Cox回归模型,以校正潜在协变量。结果:接受术前AVT,未接受术前AVT-低病毒载量（<2000 IU/mL）,以及未接受术前AVT-高病毒载量（≥2000 IU/mL）病人的术后病毒再激活率分别为3.3%,8.3%和15.7%（P<0.001）。高病毒载量和病毒再激活是肿瘤复发（hazard ratio[HR]:1.22和1.34）,肿瘤特异性生存（HR:1.36和1.46）和总体生存（HR:1.23和1.36）的独立危险因素。接受AVT治疗病人的术后5年肿瘤复发率,肿瘤特异性生存率和总体生存率（70.5%,46.9%和43.0%）优于未接受AVT-高病毒载量的病人（86.5%,20.9%和20.5%,所有P<0.001）;与未接受AVT-低病毒载量的病人无显着差异（71.7%,35.5%和33.5%,P=0.057,0.051和0.060）。同未接受AVT-高病毒载量的病人相比,无论是术前还是术后开始AVT治疗,均能改善病人的长期预后（肿瘤复发HR:0.44和0.54;肿瘤特异性生存HR:0.38和0.57;总体生存HR:0.46和0.54）。结论:病毒再激活影响合并HBV感染ICC病人的肝切除手术预后。AVT治疗可以降低病毒再激活率,改善高病毒载量病人的手术长期预后。第二部分长链非编码RNA在肝内胆管癌进展中的作用和机制研究目的:肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）的发病率和死亡率逐年升高,已成为研究热点。手术切除是唯一可能治愈ICC的治疗方式,但术后复发率高,远期疗效并不理想。由于ICC起病隐匿,早期无明显临床症状,病人发现时多处于晚期阶段,失去手术机会。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）长度大于200 bp,没有或仅有弱的蛋白编码能力。越来越多的证据表明,lnc RNA广泛参与细胞过程,包括表观遗传特征和基因表达的调控,但在ICC中却鲜有研究。本研究将探索lnc RNA在ICC肿瘤进展中的作用和机制,以期找到新的诊断标志物和治疗靶点。研究方法:通过基因芯片检测找出ICC癌和癌旁组织中差异表达的lnc RNA分子,结合高内涵增殖实验筛选,鉴定出增殖相关功能阳性目的基因。q PCR验证目的基因芯片检测结果,并进行大样本验证,分析目的基因的表达与病人临床病理特征及手术预后的关系。选择RBE细胞系作为工具细胞,短发卡RNA（short hairpin RNA,sh RNA）慢病毒敲减目的基因,观察目的基因改变对细胞凋亡,细胞周期和克隆形成能力的影响。裸鼠成瘤实验观察目的基因改变对QBC939细胞成瘤能力的影响。使用RNA荧光原位杂交技术及核质分离PCR对目的基因进行亚细胞定位。生物信息学预测目的基因可以靶定的微小RNA（micro RNA,mi RNA）及下游靶基因,双荧光素酶报告基因验证目的基因和靶基因之间的相互作用。结果:共7对ICC癌和癌旁组织用于基因芯片检测,发现113条lnc RNA分子在癌组织中高表达。在RBE细胞系中使用sh RNA慢病毒干扰目的基因,结合高内涵增殖实验筛选,找出一条与ICC增殖相关的lnc RNA,并将其命名为URICC（up regulated in intrahepatic cholangiocarcinoma）。对116例ICC病人的分析显示,URICC高表达的病人具有更高的血清糖链抗原19-9水平（58.8 vs.27.2 U/m L,P=0.030）,更大的肿瘤直径（7.0 vs.6.1 cm,P=0.019）,肿瘤数目多发者以及合并大血管侵犯者更多（50.0%vs.25.9%,P=0.007;25.9%vs.8.6%,P=0.014）。多因素Cox回归分析显示,URICC高表达是病人术后复发（hazard ratio[HR]:1.974,P=0.020）和总体生存（HR:1.796,P=0.047）的独立危险因素。干扰URICC的表达能够将细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞凋亡,抑制克隆形成。体内实验表明,干扰URICC的表达可减弱QBC939细胞的裸鼠皮下成瘤能力。双荧光素酶报告基因显示,URICC可以通过竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ce RNA）机制,解除mi R-320a对MCL-1的抑制,从而逃避线粒体途径的细胞凋亡。结论:URICC在ICC癌组织中高表达,干扰URICC可以抑制ICC细胞增殖。高表达URICC与病人差的预后显着相关。在机制上,URICC可以通过靶向结合mi R-320a,解除其对MCL-1的抑制,从而促进ICC的进展,是ICC的潜在治疗靶点和肿瘤标志物。
罗佳佳[10]（2019）在《高通量测序在HBV PreS区耐药突变及基因分型中的临床应用》文中研究说明[目的]乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染已成为世界性健康问题,特别是中国乙型肝炎患病率高。现随着核苷类药物长期、广泛使用,HBV耐药发生率越来越高,这已成为临床抗病毒治疗过程中一大难题。本研究利用高通量测序也称为二代测序（Next generation sequencing,NGS）,对慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者进行深度测序,研究NGS在HBV多耐药位点及基因分型的应用价值。[方法]选取2018年5月至2019年3月期间,于昆明医科大学第一附属医院、昆明医科大学第二附属医院及昆明市传染病医院收集89例确诊感染HBV患者血清标本,使用NGS法检测HBV基因型分布及耐药位点分析;完善患者的临床资料,分析野生型和突变株之间临床实验室指标的差异,并评估其临床应用价值。[结果]HBV基因分型检测中,B型患者33例、C型 52例、B+C型患者4例,本研究人群主要以C型为主,占比58.4%;检出突变株阳性患者9例,共检出耐药突变位点 7 个:M/V207i、M204I、M250L、M250I、V173L、L180M、A180T,以M/V207I单碱基突变检出频率最高（83.33%）;9例突变株阳性患者的耐药位点以2071检出次数最多,其次为2041;均为多重耐药,最常见的耐药形式为LAM+LdT耐药;野生型患者与突变型患者在肝功能检测指标、HBV-DNA拷贝数和乙肝血清标志物三者之间不存在有差异。[结论]高通量测序能对HBV耐药基因型及突变位点提供定量结果,直观分析耐药情况;高通量测序在突变率<5%时即能检出突变位点,对突变频率要求低,可测出更多突变位点,对潜在耐药位点的发现有重要意义,具有实用的临床应用价值,并能监测患者治疗过程中潜在耐药位点的动态变化,有利于发现并监测新的耐药形式,对于实现临床个体化用药,制定个体化诊疗方案就显得尤为重要。
二、利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异（论文提纲范文）
（1）地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的临床研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 分组 |
| 1.5 随访及监测指标 |
| 1.6 观察和评价指标 |
| 1.7 安全性评价 |
| 1.8 检验方法 |
| 1.9 试验流程图 |
| 2 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 三组HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者主要基线特征 |
| 3.2 三组HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者失访率比较 |
| 3.3 地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的影响 |
| 3.4 地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的影响 |
| 3.5 地五养肝胶囊降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HBeAg阴性慢性乙型肝炎抗病毒治疗的研究进展 |
| 4.2 HBeAg阴性慢乙肝患者存在肝纤维化的异常肝再生微环境是其肝癌发生风险居高不下的重要机制 |
| 4.3 地五养肝胶囊改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用 |
| 4.4 地五养肝胶囊改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发病率的作用 |
| 5 小结 |
| 第二部分 体外实验研究地五养肝胶囊对肝星状细胞与肝癌细胞共培养体系中两种细胞的影响及其改善EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱的相关机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TGF-β1 诱导LX2 活化以及LX2/HCCLM3 共培养体系中LX2的形态学观察 |
| 3.2 筛选DWYG含药血清最佳给药浓度 |
| 3.3 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中两种细胞增殖的影响 |
| 3.4 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中两种细胞凋亡的影响 |
| 3.5 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中HCCLM3侵袭能力的影响 |
| 3.6 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系LX2细胞EMT和 TGF-β/Smad信号通路相关m RNA的表达的影响 |
| 3.7 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系EMT和TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肝纤维化的异常肝再生微环境影响肝癌发生发展的作用及其机制 |
| 4.2 地五养肝胶囊改善肝再生微环境防治肝癌发生发展的作用及其机制 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 肝再生信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间论文发表及参与科研情况 |
| 致谢 |
（2）基于聚乳酸微球佐剂的乙肝疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 慢性乙肝概述 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 慢性乙肝的疾病进程 |
| 1.1.3 慢性乙肝的免疫耐受 |
| 1.1.4 慢性乙肝的药物治疗 |
| 1.2 乙肝疫苗的免疫学基础及当前研究进展 |
| 1.2.1 免疫概述 |
| 1.2.2 预防性乙肝疫苗 |
| 1.2.3 治疗性乙肝疫苗 |
| 1.2.4 慢性乙肝模型鼠 |
| 1.3 疫苗佐剂概述 |
| 1.3.1 免疫刺激剂类佐剂 |
| 1.3.2 递送系统类佐剂 |
| 1.3.3 疫苗及其佐剂研发的挑战 |
| 1.4 立题依据和研究目标 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究目标 |
| 第2章 DDAB-PLA微球制剂制备及细胞水平评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 微球的制备 |
| 2.2.4 微球的表征 |
| 2.2.5 微球的体外释放 |
| 2.2.6 抗原活性与稳定性的检测 |
| 2.2.7 髓源树突状细胞(BMDCs)的提取 |
| 2.2.8 微球细胞毒性检测 |
| 2.2.9 STING信号通路表达水平检测 |
| 2.2.10 微球在BMDCs中的内化及转运 |
| 2.2.11 BMDC的活化水平检测 |
| 2.2.12 BMDCs细胞因子检测 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 微球的表征 |
| 2.3.2 微球的体外释放 |
| 2.3.3 抗原的稳定性与免疫原性 |
| 2.3.4 微球的细胞毒性检测 |
| 2.3.5 STING信号通路表达水平检测 |
| 2.3.6 微球在BMDCs中的内化及转运 |
| 2.3.7 BMDCs的活化水平 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 DDAB-PLA微球的作用机制探索及体内免疫效果研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 注射部位的炎症反应 |
| 3.2.4 注射部位免疫细胞的招募 |
| 3.2.5 小动物成像检测 |
| 3.2.6 淋巴结中滤泡辅助T细胞检测 |
| 3.2.7 淋巴结中DC、B细胞的激活 |
| 3.2.8 免疫方案 |
| 3.2.9 抗体水平检测 |
| 3.2.10 脾细胞的提取 |
| 3.2.11 脾细胞增殖 |
| 3.2.12 淋巴细胞的激活与杀伤 |
| 3.2.13 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 3.2.14 Th1型细胞免疫检测 |
| 3.2.15 微球疫苗制剂的安全性评价 |
| 3.2.16 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 微球制剂在注射部位的驻留 |
| 3.3.2 注射部位的炎症反应 |
| 3.3.3 注射部位免疫细胞的招募 |
| 3.3.4 淋巴结中DCs和B细胞的活化 |
| 3.3.5 淋巴结中滤泡辅助T细胞检测 |
| 3.3.6 体液免疫评价 |
| 3.3.7 脾细胞增殖 |
| 3.3.8 脾细胞的激活与杀伤 |
| 3.3.9 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 3.3.10 Th1细胞免疫水平 |
| 3.3.11 微球疫苗制剂的安全性评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 DDAB-PLA微球制剂在慢性乙肝模型鼠中的治疗效果考察 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 慢性乙肝模型鼠的构建 |
| 4.2.4 免疫方案 |
| 4.2.5 血清转阴率检测 |
| 4.2.6 体液免疫水平检测 |
| 4.2.7 脾细胞的提取 |
| 4.2.8 脾细胞增殖 |
| 4.2.9 淋巴细胞活化和杀伤检测 |
| 4.2.10 记忆性淋巴细胞水平检测 |
| 4.2.11 肝脏HBcAg和浸润程度检测 |
| 4.2.12 肝功能检测 |
| 4.2.13 统计分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 模型鼠的构建 |
| 4.3.2 脾细胞增殖 |
| 4.3.3 淋巴细胞的活化和杀伤 |
| 4.3.4 细胞因子分泌 |
| 4.3.5 治疗效果评价 |
| 4.3.6 免疫记忆水平 |
| 4.3.7 安全性评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 DDAB-PLA微球制剂的长效免疫及冻干研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 免疫方案 |
| 5.2.4 抗体水平检测 |
| 5.2.5 脾细胞的活化和杀伤 |
| 5.2.6 安全性评价 |
| 5.2.7 冻干制剂研究 |
| 5.2.8 统计学分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 抗体水平检测 |
| 5.3.2 脾细胞活化杀伤 |
| 5.3.3 安全性评价 |
| 5.3.4 冻干制剂探究 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点总结 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 主要符号表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）梅州地区客家人群HBV不同基因型分布及核苷（酸）类似物耐药位点、感染患者病情对比观察（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 血清HBV-DNA载量、HBV-DNA基因分型和耐药突变位点检测 |
| 1.3 血清肝功能指标及甲胎蛋白(AFP)的检测 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 525例客家慢性HBV感染者HBV基因型分布 |
| 2.2 不同基因型HBV拉米夫定、阿德福韦脂的耐药位点及耐药率 |
| 2.3 不同基因型HBV慢性感染者血清AST、ALT、AFP、HBV-DNA及肝硬化、肝癌比例比较 |
| 3 讨论 |
（4）反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一章 HBVC编码链反基因锁核酸设计、筛选及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV转基因小鼠体内病毒活性与亚型检测结果 |
| 2.2 LNA稳定性鉴定结果 |
| 2.3 给药剂量对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 2.4 给药途径对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 2.5 给药方式对HBV转基因小鼠血清病毒标志物的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二章 反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 反基因LNA对 HBV病毒DNA复制的影响 |
| 2.2 反基因LNA对 HBV病毒C-m RNA表达的影响 |
| 2.3 反基因LNA对 HBV病毒HBs Ag、HBe Ag表达的影响 |
| 2.4 反基因LNA对 HBV病毒HBcAg表达的影响 |
| 2.5 反基因LNA对肝肾脏细胞结构和功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒免疫治疗研究新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（5）深圳地区慢性乙型肝炎病毒感染者天然耐药现状及其与基因型的关系（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 一般资料 |
| 2 仪器与试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 标本采集与保存: |
| 3.2 HBV病毒基因分型和耐药突变基因检测: |
| 4 统计学处理 |
| 结 果 |
| 1 HBV天然耐药率 |
| 2 HBV基因型分布情况 |
| 3 HBV基因型与天然耐药基因突变位点分布情况 |
| 讨 论 |
（6）慢性乙型肝炎患者HBV基因分型和耐药突变的分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 HBV DNA的提取 |
| 1.3.2 PCR扩增 |
| 1.3.3 杂交 |
| 1.3.4洗膜和显色 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 结果判读 |
| 2.2 HBV基因分型 |
| 2.3 NAs药物的耐药情况 |
| 2.4 HBV耐药突变位点分析 |
| 3 讨论 |
（7）下一代测序法检测乙型肝炎病毒YMDD突变的方法学建立及性能评价（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样本 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 下一代测序法检测YMDD突变 |
| 1.3.1. 1 样本核酸提取 |
| 1.3.1. 2 病毒DNA扩增及纯化 |
| 1.3.1. 3 文库构建 |
| 1.3.1. 4 模板制备和模板富集 |
| 1.3.1. 5 DA8600测序仪测序 |
| 1.3.1. 6 结果分析 |
| 1.3.2 Sanger测序 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 成功建立下一代测序法检测YMDD突变的方法 |
| 2.2 下一代测序法检测YMDD突变的方法学评价 |
| 2.3 下一代测序法的重复性 |
| 2.4 下一代测序法与Sanger测序法的方法学比较 |
| 2.5 3例检测结果不一致的分析 |
| 3 讨论 |
（8）基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、研发针对乙肝病毒DNA的高灵敏检测技术对乙肝的防治至关重要 |
| 1.1 乙肝的流行概况 |
| 1.2 高灵敏HBV DNA检测的临床意义 |
| 1.3 现有HBV DNA检测技术仍存在诸多不足 |
| 二、研发针对乙肝病毒耐药突变的早期检测技术是实现精准治疗的关键 |
| 2.1 乙肝病毒耐药概述 |
| 2.2 高灵敏检测乙肝耐药突变的重要性 |
| 2.3 现有的乙肝病毒耐药突变检测技术仍存在诸多不足 |
| 三、CRISPR-Cas13a系统可用于核酸的高灵敏、高特异性检测 |
| 3.1 CRISPR-Cas13a系统简介 |
| 3.2 CRISPR-Cas13a系统在核酸检测技术中的应用 |
| 3.3 本文研究 |
| 第一章 基于CRISPR-Cas13a系统的高灵敏度HBV DNA检测方法的建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒载体与细胞系 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Lw Cas13a蛋白的诱导表达 |
| 1.2.2 Lw Cas13a蛋白的纯化 |
| 1.2.3 Lw Cas13a蛋白的Western Blot鉴定 |
| 1.2.4 Lw Cas13a蛋白的活性检测 |
| 1.2.5 基于PCR和 CRISPR的HBV DNA检测方法的建立 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 Lw Cas13a蛋白电泳鉴定 |
| 1.3.2 Lw Cas13a蛋白的Western Blot检测 |
| 1.3.3 Lw Cas13a蛋白活性检测 |
| 1.3.4 CRSPR-LwCas13a结合PCR的PCR-CRISPR检测方法的建立 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 基于PCR-CRISPR方法的血清样本HBV DNA的高灵敏检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 血清样本 |
| 2.1.2 质粒及引物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血清样本核酸提取 |
| 2.2.2 血清样本HBV DNA的PCR-CRISPR检测 |
| 2.2.3 血清样本HBV DNA的qPCR检测 |
| 2.2.4 血清样本HBV DNA的ddPCR检测 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床信息已知的血清样本HBV DNA的检测 |
| 2.3.2 临床信息未知的血清样本HBV DNA的检测及与qPCR的比较 |
| 2.3.3 血清样本HBV DNA的ddPCR验证 |
| 2.3.4 PCR-CRISPR与ddPCR检测HBV DNA的结果比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于CRISPR-Cas13a系统的乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法的设计 |
| 3.2.2 YMDD区基因序列分析及耐药突变质粒的构建 |
| 3.2.3 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的设计 |
| 3.2.4 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的特异性检测 |
| 3.2.5 YMDD耐药突变的灵敏度检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 .YMDD突变区序列的保守性分析 |
| 3.3.2 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的设计效果 |
| 3.3.3 YMDD突变检测的灵敏度 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于PCR-CRISPR方法的血清样本乙肝病毒YMDD耐药突变的检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 血清样本 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 血清样本核酸提取 |
| 4.2.2 直接测序法检测血清样本中的YMDD突变 |
| 4.2.3 qPCR法检测血清样本中的YMDD突变 |
| 4.2.4 PCR-CRISPR检测血清样本中的YMDD突变 |
| 4.2.5 PCR-CRISPR检测血清样本YMDD突变的效果评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 血清样本YVDD突变检测 |
| 4.3.2 血清样本YIDD突变检测 |
| 4.3.4 血清样本YMDD突变的测序验证 |
| 4.3.5 PCR-CRISPR检测血清样本YMDD突变的效果评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A HBV DNA靶点序列保守性分析结果 |
| 附录B 280份血清样本基本信息 |
| 附录C 用于突变检测的144份血清样本基本信息 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（9）肝内胆管癌的抗病毒治疗及长链非编码RNA在肿瘤进展中的作用和机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 肝内胆管癌的抗病毒治疗 |
| 前言 |
| 病人和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 长链非编码RNA在肝内胆管癌进展中的作用和机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（10）高通量测序在HBV PreS区耐药突变及基因分型中的临床应用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异（论文参考文献）
- [1]地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究[D]. 陈乞. 湖北中医药大学, 2021
- [2]基于聚乳酸微球佐剂的乙肝疫苗研究[D]. 卢婷. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2020(01)
- [3]梅州地区客家人群HBV不同基因型分布及核苷（酸）类似物耐药位点、感染患者病情对比观察[J]. 郑志远,吴和明,李仲坚. 山东医药, 2020(15)
- [4]反基因锁核酸抑制转基因小鼠体内乙肝病毒编码链C基因表达研究[D]. 韦武均. 右江民族医学院, 2020
- [5]深圳地区慢性乙型肝炎病毒感染者天然耐药现状及其与基因型的关系[J]. 陈望,刘爱玲,吴敏. 临床输血与检验, 2019(06)
- [6]慢性乙型肝炎患者HBV基因分型和耐药突变的分析[J]. 李雯,赖启南,张志成,李炜,陈勇平,肖影群. 实验与检验医学, 2019(06)
- [7]下一代测序法检测乙型肝炎病毒YMDD突变的方法学建立及性能评价[J]. 余学高,邓间开,陈耀铭,陈培松,何小洪,钟良英,黄彬. 分子诊断与治疗杂志, 2019(06)
- [8]基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究[D]. 王珊. 军事科学院, 2019(09)
- [9]肝内胆管癌的抗病毒治疗及长链非编码RNA在肿瘤进展中的作用和机制[D]. 李征. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(10)
- [10]高通量测序在HBV PreS区耐药突变及基因分型中的临床应用[D]. 罗佳佳. 昆明医科大学, 2019(05)