一、脊椎动物心肌基因表达的分子调控(论文文献综述)
兰聪[1](2021)在《孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中的作用研究》文中研究说明第一部分孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及心脏损伤修复研究背景:急性心肌梗死作为临床上常见的危重症之一,是冠心病最重要的死亡原因。心肌细胞的大量丢失是导致心肌梗死后发生心力衰竭甚至患者死亡的根本原因。实现对心肌梗死的彻底治疗,最根本的策略是应用有收缩能力的细胞来代替坏死的心肌,即通过心肌再生彻底治疗心肌梗死,恢复心功能。大量研究证据显示,心肌细胞增殖是心肌再生的主要来源,但哺乳动物在出生后短期,心肌细胞退出细胞周期,基本丧失增殖能力,其调控机制尚不清楚。要实现有效的心肌再生,需进一步阐明心肌细胞增殖调控机制并寻找促进心肌细胞增殖的有效方法。哺乳动物的心肌细胞在胚胎期具有较强的再生能力,但出生后心肌细胞快速退出细胞周期,基本丧失增殖能力,其原因尚不清楚。在众多研究的努力下,心肌细胞增殖的分子调控机制的神秘面纱已经初步被揭开。包括细胞周期基因,转录因子,细胞外因子等在心肌细胞增殖中的调控作用均已得到证实,但调控心肌细胞增殖的上游因素仍然不清楚。由于哺乳动物出生时脱离母体内环境,人们自然将研究重点放在孕期内环境和出生后环境差异上。出生前后心脏的氧环境和负荷差异均是导致出生后心肌细胞增殖停滞的重要原因。另外,出生前后心脏所处的激素环境发生大幅改变,已经有研究证实出生后甲状腺激素水平的升高是造成出生后心肌增殖能力下降的重要因素之一。众多的激素中孕激素在出生后下降幅度最大,并且孕激素的促增殖能力已在神经元等细胞中得到证实,因此我们推测其可能与出生前后心肌增殖调控存在一定关系。目的:(1)明确孕激素对心肌细胞增殖的调控作用。(2)阐明孕激素调控心肌细胞增殖的分子机制。(3)探索孕激素对成年心肌细胞增殖及心肌梗死后心脏修复的改善作用。方法:第一部分(1)我们首先通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测胚胎16天(E16)、出生后1天(P1)、P7、P14时小鼠血清孕激素浓度,同时通过免疫荧光染色检测E16、P1、P7、P14时小鼠心肌细胞Ki67及磷酸化组蛋白H3(PH3)阳性率以评估心肌细胞增殖能力,然后分析出生前后血清孕激素与心肌细胞增殖能力变化的相关性。(2)接下来我们给予新生小鼠每天腹腔注射孕激素(8mg/kg.d),于P7及P14时检测心脏体重比(HW/BW),通过免疫荧光染色染色检测心肌细胞Ki67及PH3阳性率,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测心脏细胞周期基因表达,通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞以检测心肌细胞大小。(3)为了进一步证明孕激素对心肌细胞增殖的促进作用,我们提取并培养7天新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌细胞,给予孕激素及孕激素受体拮抗剂RU486处理。通过免疫荧光染色染色检测心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,通过qRT-PCR检测心脏细胞周期基因表达。第二部分(1)为了明确孕激素对心肌细胞周期的调控及筛选介导孕激素促心肌细胞增殖效应的关键基因,我们应用孕激素处理培养的原代P7 SD大鼠心肌细胞后进行转录组测序。(2)根据基因表达变化初步筛选孕激素调控心肌细胞增殖的可能中间靶分子,并通过qRT-PCR和Western blot实验对其表达进行验证后,进一步筛选出可能的关键靶分子。(3)分离培养P7 SD大鼠心肌细胞,针对靶分子设计小干扰RNA(siRNA)并转染心肌细胞以沉默靶分子的表达,通过免疫荧光染色检测心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率以明确靶分子在孕激素促心肌细胞增殖中的作用。(4)我们构建了靶基因启动子-荧光素酶报告基因质粒并转染培养的心肌细胞,然后检测荧光素酶的活性以明确孕激素对靶基因启动子活性的影响;通过凝胶迁移阻滞(EMSA)实验检测孕激素受体与靶基因启动子的相互作用,同时通过染色质免疫共沉淀及荧光定量PCR(Ch IP-qPCR)实验检测孕激素受体在靶基因启动子区的富集度。第三部分(1)为了在体明确孕激素对成年心肌细胞增殖的影响,我们结扎小鼠冠状动脉前降支构建急性心肌梗死(AMI)模型,术后从P2开始经腹腔给予孕激素注射,于P7时通过制作心脏石蜡切片并通过免疫荧光染色检测梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,同时通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞后qRT-PCR检测细胞周期基因的表达。(2)心肌梗死后于P28利用小动物超声系统检测小鼠心功能,明确孕激素对心肌梗死后心功能的改善;同时P35时通过马松三色染色(Masson trichrome staining)检测心脏纤维化,明确孕激素对心肌梗死后心脏重构的保护作用。(3)为明确孕激素是否在成年心肌细胞依然促进靶基因的表达,心肌梗死后P7时通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞后进行qRT-PCR及Western blot检测孕激素对心肌梗死后靶基因表达的影响。结果:第一部分(1)心肌细胞Ki67及PH3阳性率从E16、P1、P7、P14依次降低,同时小鼠血清孕激素水平从E16、P1、P7、P14依次降低,二者的变化存在相关性。(2)于P7及P14时免疫荧光染色发现孕激素提高新生小鼠心肌细胞Ki67及PH3阳性率并促进细胞周期基因表达;孕激素对HW/BW无影响,但其处理后心肌细胞体积小于对照组。(3)孕激素提高原代P7 SD大鼠心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,同时这种作用被RU486阻断;孕激素促进原代P7 SD大鼠心肌细胞细胞周期基因表达,同时这种作用被RU486阻断。第二部分(1)转录组测序结果显示孕激素处理后,分别有2240个基因及2736个基因表达上下调超过1.4倍。基因本体分析(Gene Ontology,GO)及京都基因与基因组百科全书通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析显示与细胞增殖相关分子功能和信号通路出现大量上调基因富集。(2)我们根据基因表达变化初步筛选出4个介导孕激素调控心肌细胞增殖的可能中间靶分子,并通过qRT-PCR和Western blot实验对其表达进行验证后进一步筛选出上调幅度最大的yes相关蛋白(yes-associated protein,YAP)作为靶分子;同时通过YAP siRNA沉默YAP表达后,孕激素对原代P7 SD大鼠心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率的上调作用受到阻断。(3)荧光素酶报告基因实验表明孕激素处理后,心肌细胞荧光素酶活性升高,提示孕激素可以促进YAP基因启动子的转录活性;同时EMSA实验发现孕激素受体与YAP基因启动子存在相互作用,而Ch IP-PCR实验进一步显示孕激素受体在YAP基因启动子区存在富集,且孕激素存在时孕激素受体在YAP基因启动子区的富集增多。第三部分(1)通过结扎冠状动脉前降支,我们建立了小鼠急性心肌梗死模型。构建这一模型后于P7检测心肌心肌细胞增殖,我们发现孕激素可以显着提高梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,同时促进心肌细胞细胞周期基因表达。(2)心肌梗死后P28小动物超声结果显示孕激素处理后小鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)及左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)均明显高于对照组小鼠;同时P35时马松三色染色结果提示孕激素处理组小鼠心脏左心室纤维化面积比低于对照组。(3)心肌梗死后P7时通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞后qRT-PCR及Western blot检测结果显示孕激素促进心肌梗死后心肌细胞YAP基因表达。结论:通过以上研究,我们得出以下结论。(1)胚胎期和出生后不同时期血清孕激素和心肌细胞增殖能力的变化存在相关性。(2)出生后补充孕激素可促进新生小鼠心肌细胞增殖,同时孕激素可以促进离体培养的原代P7 SD大鼠心肌细胞增殖。(3)孕激素对心肌细胞增殖的促进作用主要是孕激素受体在孕激素存在时,结合于YAP基因启动子区进而促进YAP基因转录实现的。(4)孕激素可以刺激成年心肌梗死后心肌细胞增殖并改善心功能和心脏纤维化。这一研究揭示了孕激素在心肌细胞增殖中的作用及机制,为心肌再生治疗心肌梗死提供了新的理论依据和靶点。第二部分DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中作用研究研究背景:心肌细胞丢失是心肌梗死后心衰发生的重要病理学基础,成年心肌细胞微弱的增殖能力为心脏损伤修复提供了希望。探索成年心肌细胞增殖的关键调控因子,对促进成年心肌增殖,改善心肌梗死的治疗具有重要意义。双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)是一种在进化上高度保守的激酶,在调控细胞增殖、分化和存活等功能中发挥重要作用。既往研究证据表明,抑制DYRK1A可以抑制多种类型的肿瘤细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。同时DYRK1A对胰岛β细胞增殖也有强烈的调控作用,抑制DYRK1A可显着促进胰岛β细胞增殖,改善糖尿病的治疗。鉴于肿瘤细胞和胰岛β细胞均是难以调控增殖的细胞,提示DYRK1A可能是细胞增殖的强力调控因子。因此,我们推测DYRK1A可能对成年心肌细胞增殖具有调控作用。目的:(1)明确DYRK1A对成年心肌细胞增殖的调控作用。(2)探索DYRK1A调控心肌细胞增殖对心肌梗死后心脏修复的改善作用。方法:(1)通过Crispr-cas9系统,我们成功构建了能够条件性敲除DYRK1A的floxP小鼠(DYRK1Aflox/flox),通过将该小鼠与心肌细胞特性表达Cre重组酶的转基因小鼠(α-MHCMerCreMe)杂交,获得了α-MHCMerCreMer/DYRK1Aflox/flox小鼠,通过腹腔注射他莫昔芬诱导成年小鼠心肌DYRK1A敲除(DYRK1A CKO),通过Western blot实验检验DYRK1A的敲除效率。(2)为了研究DYRK1A敲除对成年心肌细胞增殖的影响,我们结扎小鼠冠状动脉前降支构建急性心肌梗死(AMI)模型,于心肌梗死后7天(P7)时通过制作心脏石蜡切片并通过免疫荧光染色检测梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率。(3)心肌梗死前一天及梗死后每周利用小动物超声系统检测小鼠心功能,明确DYRK1A敲除对心肌梗死后心功能的改善作用;同时P35时通过马松三色染色(Masson trichrome staining)检测心脏纤维化,明确DYRK1A敲除对心肌梗死后心脏重构的保护作用。结果:(1)接受他莫昔芬腹腔注射的α-MHCMer Cre Mer/DYRK1Aflox/flox小鼠心脏DYRK1A蛋白表达显着低于对照组。(2)免疫荧光染色发现DYRK1A敲除显着提高了梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率。(3)小动物超声结果显示DYRK1A敲除组小鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)及左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)均明显高于对照组小鼠;同时P35时马松三色染色结果提示DYRK1A敲除组小鼠心脏左心室纤维化面积低于对照组。结论:通过以上研究,我们得出以下结论。(1)DYRK1A是成年心肌细胞增殖的重要调控因子,通过敲除DYRK1A可显着促进成年心肌梗死后心肌细胞增殖。(2)DYRK1A敲除可通过促进成年心肌细胞增殖改善心肌梗死后心功能和心脏纤维化。这一研究揭示了DYRK1A在成年心肌细胞增殖中的作用,为心肌再生治疗心肌梗死提供了新的理论依据和靶点。
王芹[2](2020)在《BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究》文中研究指明提高家蚕的产丝量是蚕丝业几千年来一直追求的目标。家蚕的丝腺是合成和分泌蚕丝蛋白的器官,是整个蚕丝业的生物学基础。因此,探明家蚕丝腺形成和发育的分子调控机制具有重要的理论意义和实践意义。Slit是一类在进化上高度保守的分泌型糖蛋白,它与受体Roundabout(Robo)在神经轴突导向、神经元的迁移、血管生成、癌细胞转移、白细胞趋化等多种生理病理过程中具有调节作用。家蚕丝腺被认为是果蝇唾液腺的进化同源器官。现有研究发现,Slit及其受体Robo在果蝇唾液腺发育中发挥着重要作用,但是在家蚕丝腺中的功能研究还未有相关报道。Tbx20是一种进化上高度保守的转录因子,是T-box转录因子家族成员之一,在调控心脏发生、控制细胞迁移、促进细胞增殖等过程中扮演着重要角色。在果蝇胚胎发育过程中,Tbx20的同源基因midline能够调控唾液腺的导向迁移,也可以同时调控神经系统中slit和robo基因的表达,但对于Tbx20在家蚕中的功能目前还不清楚。本研究基于前期在家蚕中已鉴定并克隆的Bmslit和Bmrobo(Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3)以及Bmtbx20基因,通过qPCR和免疫荧光染色确定Bmslit、Bmrobo及Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式,探讨它们在丝腺发育中的功能,并在胚胎期采用RNAi技术,分析BmTbx20对Bmslit和Bmrobo基因的表达调控作用及对丝腺发育的影响,以期为揭示家蚕丝腺发生和发育的基因调控网络提供新的资料。主要研究结果如下:1.利用qPCR技术,系统检测了家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的表达变化。结果表明,Bmslit和3个Bmrobo基因在家蚕前、中、后部丝腺中均有表达,而且在不同发育时期存在很大差异,但Bmslit和Bmrobo的表达特征具有较高的相似性和关联性。2.通过免疫荧光染色对BmSlit和BmRobo蛋白进行双染,发现BmRobo1a、BmRobo1b、BmRobo2/3与BmSlit在家蚕胚胎以及幼虫不同发育时期、不同功能区的丝腺细胞质中均有合成,而且在幼虫丝腺细胞膜处都存在共定位。说明BmSlit可能通过与BmRobo结合而在家蚕丝腺中发挥作用。3.分别将Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的siRNA注射到丝腺发生前的蚕卵中进行RNA干涉。qPCR检测发现,注射48 h后的蚕卵中以上4种基因的表达均被不同程度抑制,相对表达量都比对照组极显着下调。4.取家蚕不同发育时期的丝腺组织,通过qPCR和免疫荧光染色分别从转录水平和蛋白水平上分析了Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式。结果表明,Bmtbx20在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期均有表达,转录因子BmTbx20与BmSlit在家蚕胚胎期和幼虫期丝腺中均有合成。5.对家蚕17-18期胚胎中的Bmtbx20基因进行RNAi,qPCR测定显示,蚕卵注射后48 h,不仅Bmtbx20的相对表达量与对照组NC相比极显着下降,而且Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的相对表达量也都存在不同程度的下调。这些结果表明,转录因子BmTbx20可能通过调控Bmslit和Bmrobo基因的表达从而调控丝腺的发育过程。6.在家蚕胚胎期对Bmslit、Bmrobo以及Bmtbx20基因进行RNAi,与对照组NC相比,Bmslit和Bmrobo基因RNAi后,丝腺的发生位置及丝腺发育情况均未见明显差异。但Bmtbx20基因RNAi后会导致胚胎发育加快,丝腺发育也相应提前,故在同一催青时间,丝腺较对照组延伸的较长。关于这些基因在丝腺发育中的详细作用机理还有待利用基因敲除等手段做进一步研究。
石斌刚[3](2020)在《天祝白牦牛肌肉生长和肌内脂肪沉积相关基因筛选与鉴定》文中研究指明牦牛(Bos grunniens)主要分布在青藏高原及其毗邻高海拔地区,以产肉和产奶为主。牦牛肉是当地牧民重要的动物性蛋白来源,但与普通牛肉相比,肌纤维较粗、肌内脂肪(IMF)沉积少而嫩度差。遗传对畜禽肉质性状有重要的影响,为了解析牦牛肉品质形成的转录调控机制,本研究以6月龄(M6,n=3)、30月龄(M30,n=3)和54月龄(M54,n=3)天祝白牦牛为研究对象,利用转录组(RNA-Seq)、同位素标记相对绝对定量蛋白质组学(Tandem Mass Tag,TMT)和荧光定量PCR(RT-qPCR)等方法,探究牦牛肌肉和IMF发育的转录调控机制,为发掘牦牛肌肉品质功能基因及分子育种应用提供理论依据。主要研究结果如下:1.天祝白牦牛6?30月龄生长速度较30?54月龄快;随年龄增长,肌肉剪切力值、IMF含量显着增加,且肌纤维直径显着增大(P<0.05或P<0.01)。2.不同年龄天祝白牦牛背最长肌RNA-Seq分析,M6 vs M30、M30 vs M54和M6vs M54组分别鉴定到1576个、124个和1407个差异表达基因(DEGs)(P-adjust<0.05&|log2FC|>=1);STEM(Short Time-series Expression Miner)时序性表达分析得到上调和下调DEGs分别为783个和747个,分别显着富集于393个和86个GO条目,包括多个与肌肉发育和脂质代谢相关GO条目;KEGG富集分析表明上调和下调DEGs分别富集在64个和16个信号通路中,包括PI3K-Akt、FoxO、PPAR等与肌肉发育和脂质代谢相关的信号通路;基因功能和通路分析,上调DEGs鉴定到7个肌肉发育(MSTN、IGF1、IGFBP5、IGFBP6、MYL1、MYL3、TNNT1)和4个脂肪沉积(ADIPOQ、FABP4、PLIN1、LPL)候选基因,下调DEGs鉴定到7个肌肉发育(IGF2、IGF1R、IGFBP1、IGFBP2、FOXO1、FOXO3、FBXO32)和6个脂肪沉积(ACSL4、STAT5A、ACACB、LPIN1、PPARδ、ADIPOR1)候选基因;随机选取的14个DEGs的RT-qPCR验证结果与测序结果一致。3.不同年龄天祝白牦牛背最长肌TMT分析,共鉴定获得17708条多肽和4770个阳性表达蛋白,M6 vs M30、M30 vs M54和M6 vs M54组分别获得424个、139个和475个差异蛋白(DEPs)(Fold change≥1.2或≤0.8和P<0.05标准);其中上调和下调DEPs分别为216个和460个,且分别显着富集于153个和330个GO条目,包括发育、肌肉肥大负向调节、磷脂分解代谢、脂质储存、脂质代谢和脂肪酸代谢等多个与肌肉发育和脂质代谢相关GO条目;KEGG富集表明上调DEPs显着富集在补体途径、金黄色葡萄球菌感染和甲状腺激素合成等12个信号通路中,下调差异蛋白显着富集在氧化磷酸化和帕金森病等18个信号通路,包括心肌收缩、ECM受体相互作用及脂肪酸代谢、脂肪酸降解、脂肪酸延长等与生长发育和脂肪酸代谢相关通路;蛋白功能和通路分析鉴定了11个生长发育(MYL3、MYLK2、MyBP-C、MyBP-H、MYL9、MYH10、MYH13、TPM1、CFL1、CSRP1、CSRP3)和14个脂肪酸代谢和脂肪沉积(HADHA、HADHB、HADH、ACADM、ACADVL、ACADSB、ACAD8、FASN、CD36、FABP3、HSPB1、HSPB6、HSPB7、HSPB8)相关DEPs;蛋白互作网络分析发现,MYL3、MYL9、MYH10、MYLK2、TPM1及CD36、HADH、HADHA、HADHB、ACADM、ACADVL、FABP3等分别处于肌肉发育和脂肪沉积相关蛋白网络重要节点位置,可能是调控牦牛肌肉生长和IMF沉积的重要蛋白。本研究在阐明天祝白牦牛生长发育及肌肉品质变化规律的基础上,通过转录组和蛋白组分析,获得PI3K-Akt、心肌收缩、FoxO及PPAR等多个与肌肉发育和脂肪沉积相关的信号通路;鉴定了MSTN、IGF1、MYL1、IGFBP1、FOXO1、MYL3、MYL9、MYH10等25个与牦牛肌肉发育相关基因和蛋白,ADIPOQ、FABP4、PLIN1、LPL、HADHA、ACADM、FASN、CD36、FABP3、HSPB1等24个与IMF沉积相关的基因和蛋白。研究结果为阐明天祝白牦牛肌肉发育和IMF沉积的分子机制提供了基础数据。
霍达[4](2020)在《刺参应对高温低氧胁迫的生理响应与分子调控特征》文中研究说明仿刺参(Apostichopus japonicus),又名刺参,属于棘皮动物门(Echinodermata),主要分布在中国北部沿海及北太平洋西部浅海地区,是我国重要的海水养殖物种之一,并且在世界贸易中占据越来越重要的地位。温度和溶解氧是刺参水产养殖中最重要的两个非生物限制因素。近年来,在中国沿海水域和池塘中的刺参由于极端环境大量死亡,造成极为惨重的经济损失和资源破坏,限制了刺参水产养殖业的可持续发展。且在全球气候变化及人类活动加剧的大背景下,水域高温低氧现象正呈现常态化趋势。因此,迫切需要了解海洋生物对环境变化的响应机制。为探明极端天气下水体高温低氧环境对机体生理行为及分子调控等各方面的影响,本研究将刺参作为一种典型的棘皮动物模型,研究其对逆境的响应机制。利用控温棒及水体溶解氧实时控制系统模拟水体高温和低氧环境,通过测序技术辅以实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR或q PCR)验证,获得了刺参在应对高温低氧胁迫过程中m RNA、长非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)、micro RNA(mi RNA)、蛋白质、代谢物及关键免疫因子的变动与调控特征,并通过测定关键酶活性以及行为观察等方法获得了刺参生理行为方面的响应特征。主要研究结果如下:1.生理行为响应特征为探查高温低氧环境胁迫对刺参生理行为层面的响应特征,本项研究选取了与消化功能、免疫防御、氧化应激相关的16种酶进行活力测定。环境胁迫下刺参中α-淀粉酶(AMS)、胃蛋白酶(PEP)、胰蛋白酶(TRY)、脂肪酶(LPS)等消化相关酶活显着降低,消化功能可能受到潜在的负面影响。受到环境胁迫后刺参诱导了体内的免疫防御机制,酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LZM)活性显着增加,非特异性免疫增强。过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PPO)等氧化应激相关酶,在机体遭受环境胁迫时,活力发生改变,以清除O2-、H2O2、OH-等物质,共同组成了刺参活性氧防御系统,减弱刺参氧化应激压力。此外,环境胁迫下刺参的分布状态、运动速度、排泄摄食等发生改变;低氧胁迫下刺参多集中于水表面分布,机体形态、体壁及内脏状况发生改变,包括吸水胀大、体表溃烂等。且较单因素胁迫相比,双因素协同作用下,刺参的耐受性急剧下降。实验结果表明刺参机体为适应极端环境综合调节消化、免疫、氧化应激等相关酶类,形成一系列适应性机制,同时改变行为以响应逆境。2.m RNA(message RNA)和lnc RNA(long non-coding RNA)响应特征为探究lnc RNA和m RNA的响应特征,本项研究获取了在高温胁迫(HT)、低氧胁迫(LO)、高温低氧胁迫(HL)以及正常对照处理条件(NC)下刺参呼吸树的lnc RNA和m RNA表达谱。在高温、低氧和高温低氧胁迫下分别鉴定出159、355和495个显着上调的基因以及230、518和647个显着下调的基因,并基于此构建了差异lnc RNA-m RNA共表达网络。其中,三种处理组中共识别出的关系对共有8对,并且根据连接程度,MSTRG.27265、MSTRG.19729和MSTRG.95524被证明是关键的lnc RNA。基于测序数据和real-time PCR验证的显着变化的lnc RNA中,有4个lnc RNA(MSTRG.34610、MSTRG.10941、MSTRG.81281和MSTRG.93731)均与之前研究中鉴定出的刺参低氧响应的关键mi RNA(Aja-mi R-2013-3p)具有结合位点;低氧诱导因子(HIF-1α)也显示为Aja-mi R-2013-3p的潜在靶向目标。双萤光素酶报告系统验证结果显示,“HIF-1α/Aja-mi R-2013-3p/MSTRG.34610”网络和“HIF-1α/Aja-mi R-2013-3p/MSTRG.10941”网络在刺参应对环境胁迫时可能发挥重要作用。环境胁迫通过改变lnc RNA和m RNA的表达水平,进而影响刺参的免疫、能量代谢和细胞周期等各种生物学过程。与单因素胁迫相比,高温低氧协同胁迫能引起刺参分子水平上更加广泛的响应。3.micro RNA响应特征为探究三种类型的环境胁迫对刺参中mi RNA表达的影响,本项研究鉴定并表征了差异表达的mi RNA,并查明了其主要参与的生物学过程。与对照组相比,高温、低氧和高温低氧胁迫处理组分别鉴定出21、26和22个差异表达的mi RNA(DE-mi RNA),在三种处理组中共有54种非重复性差异表达mi RNA。利用比较组学分析及real-time PCR,鉴定并验证代表性响应mi RNA。表征了在刺参应对高温应激(热应激)中发挥潜在关键作用的五个mi RNA包括Aja-mi R-novel-299、Aja-let-7b-3p、Aja-mi R-71b-5p、Aja-mi R-novel-13218和Aja-mi R-2004;以及在刺参应对低氧应激中可能发挥关键作用的Aja-mi R-92b-3p、Aja-mi R-210-5p和Aja-mi R-novel-26331。鉴定出的差异表达mi RNA参与了与生物合成、代谢、免疫、细胞凋亡和信号转导有关的多个关键生物学过程,从而影响了刺参的机体状态。4.蛋白水平响应特征为阐明环境胁迫下刺参中蛋白质水平的响应,本项研究基于比较蛋白质组学分析,利用同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ),获取了高温和低氧单个及协同胁迫下的刺参呼吸树蛋白质表达谱,共鉴定出8437种蛋白质。其中高温、低氧及高温低氧胁迫下分别有262、155和433个差异响应蛋白。在高温低氧双因子共胁迫下,在刺参中鉴定出的差异调节蛋白多余单个胁迫,表明在蛋白质组水平上双因素协同胁迫具有累加效应。基于差异蛋白的基因本体论(Gene ontology,GO)分析表明,环境胁迫下,免疫响应相关蛋白上调,蛋白合成能力受到抑制;能量类物质如氨基酸、碳水化合物、脂类代谢过程发生改变;低氧胁迫诱导刺参中参与铁稳态的蛋白上调,糖原合成相关蛋白下调;高温胁迫及高温低氧胁迫下刺参中糖异生过程上调。刺参采取不同的策略应对不同的环境胁迫,主要包括“物质生物合成、运输和代谢”、“信号转导”、“蛋白质合成”、“免疫和防御反应”以及“能量产生和转化”等方面。5.代谢物响应特征为探究逆境下刺参中代谢物变动特征,本项研究利用超高效液相色谱-质谱(Ultra-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,UPLC-MS)获得刺参响应于不同形式的环境胁迫的代谢组学变化。在高温、低氧和高温低氧双胁迫下的刺参中分别观察到84、68和417种代谢物浓度发生显着改变,说明双环境因子协同胁迫对刺参呼吸树代谢产物的影响比单一胁迫更为广泛。研究确定了刺参中潜在的十种高温胁迫生物标志物和十种低氧胁迫生物标志物,包括德尔塔林、镰刀菌素C、环吡阿尼酸、顶羽菊内酯、蛇孢菌素A、软海绵素B、苦艾素、紫金牛醌和杀菌素等。结果表明,环境胁迫下刺参中氨基酸、碳水化合物、脂质、辅酶因子和维生素以及核苷酸有关的代谢过程产生了响应,使刺参得以维持基本的生存。具体而言,高温胁迫导致涉及氨基酸、脂类、辅酶和维生素代谢的代谢产物发生变化、碳水化合物代谢减少;当暴露于低氧环境时,刺参中涉及氨基酸、碳水化合物代谢和脂肪酸代谢的产物水平显着增加。此外,三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)中的关键代谢物及参与能量代谢调节的代谢物水平发生了显着变化。推定热应激是干扰刺参中谷氨酸-谷氨酰胺代谢过程的主要因素。这些结果将有助于了解水生动物对不利环境的响应机制。6.免疫基因时序响应特征前几部分的实验结果显示,环境胁迫下刺参的免疫发生了响应。为探究刺参免疫基因对环境胁迫的时序响应特征,本项研究分别分析了暴露于高温和低氧两种环境下8个时间点的刺参中与核因子κB(NF-κB)通路、蛋白酶家族、补体系统、热休克蛋白(HSPs)和转铁蛋白家族有关的17个基因的表达水平。这些基因具有相互关联的作用,共同构成环境胁迫下刺参的免疫防御网络。实验结果表明刺参中与NF-κB通路和热休克蛋白家族相关的基因表达水平受到高温胁迫的强烈影响;而黑素转铁蛋白(Mtf)、铁蛋白(Ft)和甘露聚糖结合C型凝集素(MBCL)的表达水平则受到低氧的显着影响。相比之下,在环境胁迫初期,补体因子B(Bf)、肌球蛋白V(Mys)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)基因在早期对胁迫并不敏感。在刺参受到高温和低氧胁迫时,一些基因具有相似的表达模式,包括Hsp90和溶菌酶(LZM)的表达增加以及主要蛋黄蛋白(MYP)和组织蛋白酶C(CTLC)的表达减少;与之相反,NF-κB和Hsp70在两种胁迫处理下的表达趋势不同。另外LZM诱导的免疫防御在刺参应对胁迫时可较为灵活地发挥作用。实验结果表明,刺参对不同类型的胁迫表现出复杂且多样的免疫反应。这些结果为研究环境胁迫下海洋生物响应提供免疫指标参考,有助于了解刺参在全球气候变化下的适应策略。
张婷[5](2019)在《铜诱导斑马鱼髓鞘和轴突发育缺陷的分子调控机制》文中进行了进一步梳理铜(copper,Cu)是生物体必需的微量元素,直接参与生物体造血发生、神经发育、骨骼形成以及机体免疫等过程。在体内过量会导致鱼类幼鱼运动能力下调,还与多种神经退行性疾病的发生相关,但其调控神经发育的潜在分子机制至今仍鲜有报道。本研究以模式动物斑马鱼(Danio rerio)作为研究对象,通过基因芯片(microarray)技术发现铜胁迫导致幼鱼髓鞘和轴突导向基因表达下调。而髓鞘和轴突是神经元与肌肉等靶器官通讯的基础,且髓鞘和轴突损伤是多种神经退行性疾病的共同病理特征。因此本研究通过转录组分析、整体原位杂交(whole mount in situ hybridization,WISH)以及荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)技术对铜诱导斑马鱼幼鱼髓鞘和轴突发育缺陷的分子表型进行了详细的鉴定。随后,结合转录组测序和胚胎全基因组甲基化测序结果分析,鉴定了铜诱导髓鞘和轴突发育缺陷的关键调控因子,并利用CRISPR/Cas9敲除技术,Morpholinos(MO)敲降技术以及过表达实验,对上述关键调控因子的功能进行了深入的研究,最后借助铜转运突变体,阐明了它们在铜诱导髓鞘和轴突发育中的功能,揭示了铜胁迫导致斑马鱼中枢神经系统(central nervous system,CNS)髓鞘和轴突发育缺陷的分子调控机理。本文主要研究结果如下:1、铜胁迫导致斑马鱼CNS髓鞘和轴突发育缺陷通过表型观察及整体原位杂交检测发现,铜胁迫会导致胚胎孵化率降低、运动能力降低,神经标记基因表达量下调。基因芯片进一步分析发现,铜胁迫造成斑马鱼髓鞘与胶质细胞、轴突导向等神经系统相关的基因表达量下调。接着对髓鞘和轴突的超微结构进行电镜观察发现铜胁迫会导致脊髓处髓鞘变薄甚至是脱失,轴突直径变小。整体原位杂交以及髓鞘和轴突转基因鱼的实时观察结果显示铜胁迫导致脊索处髓鞘和轴突发育缺陷。上述结果表明,铜胁迫导致CNS髓鞘和轴突发育缺陷。2、铜通过抑制Wnt/Notch-hoxb5b信号通路抑制CNS髓鞘和轴突的发育通过基因芯片和整体原位杂交对其调控机理进一步分析时发现转录因子hoxb5b在铜胁迫胚胎中显着性下调。利用Morpholinos(MO)敲降hoxb5b后胚胎呈现与铜胁迫胚胎类似的表型。此外,通过CRISPR/Cas9技术构建hoxb5b突变体,hoxb5b基因敲降和敲除的幼鱼都呈现铜胁迫幼鱼类似的CNS髓鞘和轴突发育缺陷。并且hoxb5b过表达后可以拯救铜胁迫导致的孵化率降低以及CNS髓鞘和轴突发育缺陷,表明铜通过抑制hoxb5b诱导CNS髓鞘和轴突发育缺陷。此外,铜胁迫导致Wnt和Notch信号通路相关基因表达下调,而Wnt和Notch信号通路激活后可以拯救铜胁迫导致的hoxb5b及CNS髓鞘和轴突发育缺陷。综上所述,铜通过Wnt和Notch信号通路抑制hoxb5b的表达进而导致斑马鱼幼鱼CNS髓鞘和轴突发育缺陷。3、铜诱导的fam168等基因的高甲基化及其转录水平降低促进CNS髓鞘和轴突发育缺陷的产生全基因组甲基化分析结果显示,在铜胁迫胚胎中,26个基因甲基化水平显着性上调,其中pou3f1、pou3f2和fam168b与髓鞘和轴突的发育相关,而这些基因以及fam168b的同源基因fam168a的转录水平在铜胁迫组中显着性下调。整体原位杂交结果显示fam168a和fam168b的基因表达模式相似,且与pou3f1的表达也类似。通过转录组测序分析发现,fam168a和fam168b基因敲降胚胎都呈现pou3f1基因敲除胚胎类似的神经和突触发育缺陷。通过整体原位杂交和q RT-PCR进一步的探究发现,fam168a和fam168b功能缺失幼鱼都呈现出CNS髓鞘发育缺陷,与pou3f1基因敲除以及铜胁迫的幼鱼有类似的表型。此外,fam168a,fam168b和pou3f1过表达后可以部分拯救铜胁迫导致的CNS髓鞘和轴突发育缺陷,表明铜胁迫导致的fam168b、pou3f1和pou3f2的高甲基化调控及其转录水平的下调促进CNS髓鞘发育缺陷的产生。4、铜诱导的fam168b基因的高甲基化与其转录水平下降之间的调控关系fam168b启动子高甲基化区域5’缺失片段活性分析结果显示fam168b高甲基化区域的缺失导致fam168的表达降低,表明铜胁迫胚胎中上述基因的高甲基化调控其转录表达。但铜胁迫后fam168b转录水平的下调先于甲基化水平的上调,表明区域甲基化可能是转录复合物和染色体DNA结构变化的次要结果。5、Hoxb5b信号因子与fam168a/fam168b/pou3f1等高甲基化基因之间的调控关系整体原位杂交和q RT-PCR结果显示,hoxb5b功能缺失胚胎中fam168a、fam168b和pou3f1的表达显着性上调,而fam168a、fam168b和pou3f1功能缺失的胚胎hoxb5b转录水平显着上调。而fam168a、fam168b、pou3f1和hoxb5b的转录同时被抑制时会导致铜胁迫幼鱼类似的CNS髓鞘和轴突发育缺陷,表明fam168a/fam168b/pou3f1与Wnt&Notch-hoxb5b信号在铜胁迫胚胎中发挥互为跷跷板的功能,且两条途径共同作用导致CNS髓鞘和轴突发育缺陷。6、铜通过cox17/atp7b调控Wnt/Notch-hoxb5b及fam168a/fam168b/pou3f表观因子共同诱导髓鞘和轴突发育缺陷通过整体原位杂交和q RT-PCR检测不同铜转运突变体幼鱼铜胁迫后髓鞘基因的表达,结果显示,在cox17-/-突变体中,fam168a、fam168b和pou3f1表达量下调,而在atp7b-/-突变体中,pou3f1表达量下调,而fam168a和fam168b的表达量没有显着性差异,此外,hoxb5b在atp7b-/-突变体中表达下调,在cox17-/-突变体中表达不变,表明胚胎铜胁迫后可能导致ROS进而影响Wnt&Notch-hoxb5b信号对髓鞘和轴突发育造成影响,但不影响pou3f1/fam168a/fam168b的甲基化和转录调控。因此,cox17缺失后,铜可能通过影响染色质结构调控表观因子pou3f1/fam168a/fam168b导致髓鞘和轴突发育缺陷。同样的,在atp7b-/-突变体中,铜可以通过抑制Wnt&Notch-hoxb5b导致髓鞘和轴突发育缺陷。
储蔓[6](2019)在《受体酪氨酸激酶TIE在脉管系统发育和稳态维持中的作用及机制》文中研究表明哺乳动物的动静脉分化是心血管系统发生的关键环节。血管内皮生长因子受体-2(Vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)介导的信号途径在血管新生与动脉分化中起重要作用,但目前对于静脉发生的调控机制还了解较少。TIE(Tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains)受体家族包括 Tie1和Tie2两个成员,是血管成熟重塑的重要调节因子,其作用机制有待深入研究。另外,淋巴管发育起源于胚胎静脉内皮细胞,本课题组前期研究表明,TIE1是淋巴管网络形成与重塑所必须,但对于TIE2是否直接参与调控淋巴管发育尚不清楚。研究目的:探究Tie1与Tie2在出生后血管生成和稳态维持中的作用、以及Tie2在淋巴管发育中的作用。研究方法:本研究利用靶向Tie1与Tie2的条件性基因敲除小鼠,结合全身性及内皮细胞特异性表达CreERT2重组酶的转基因小鼠,分析新生鼠诱导敲除Tie1与Tie2基因对血管生成的影响以及胚胎期诱导Tie2敲除对淋巴管生长的影响。研究发现:1.在出生后第1至4天诱导Tie1敲除,导致出生后(P7)视网膜表层血管面积减少、以及视网膜深层血管内皮细胞迁移受到抑制(P9-P11)。同时,Tie1敲除导致静脉端出现异常血管增生(P9-P11),但是该表型在出生后3周龄时得以部分恢复。2.本研究组前期工作利用靶向Tie2的全身性敲除小鼠模型分析出生后血管表型,表明Tie2敲除抑制出生后(P7)时视网膜的血管化面积。本研究利用此敲除模型,在出生后第1至4天诱导Tie2敲除,发现:(1)Tie2敲除小鼠导致视网膜表层血管网络的静脉形态出现异常(P9-P11),在2周龄时静脉形态异常加剧,直到3周龄时Tie2敲除导致静脉退化,并生成瘤样血管簇,且该表型比Tie1敲除小鼠更严重。用静脉标志物EphB4和周皮细胞标志物NG2进一步探究发现,此瘤样血管簇有腔,是由周皮细胞覆盖的大量新生内皮细胞聚集而成。在出生后不同阶段(包括第5至8天、以及第11至16天)诱导敲除Tie2也会导致不同程度的静脉发育异常。(2)利用成年鼠进行的分析发现,Tie2长时间敲除导致耳部皮肤静脉曲张。说明Tie2不仅影响静脉发育,对已形成的静脉维持也至关重要。(3)Tie2敲除导致肺和视网膜组织的静脉特异性标志物APJ和EphB4的mRNA表达水平下降,静脉分化关键转录因子mRNA水平虽没有变化,但其COUP-TFⅡ蛋白水平显着降低。结合本课题组合作者利用体外培养的细胞开展的研究表明,TIE2通过AKT信号途径调节COUP-TFⅡ的蛋白稳定性,从而在静脉发生与稳态维持中起重要作用。3.利用双基因敲除小鼠模型开展的研究表明,在出生后第1至4天诱导Tie1敲除、并结合Tie2杂合突变,导致视网膜表层血管面积减少、以及内皮细胞迁移受阻的程度加剧。在出生后3周龄时,被抑制的表层和深层血管化进程不能恢复,而且引入Tie2杂合突变致使Tie1敲除小鼠在2和3周龄时出现静脉退化并伴有瘤样血管簇生成。表明Tie2杂合突变加剧Tie1敲除导致的血管表型,从而证实Tie1与Tie2在血管发生过程中存在相互协同的作用,相关作用机制尚待深入研究。4.本课题利用靶向Tie2的内皮细胞特异性基因敲除小鼠模型,在胚胎期(E)10.5利用他莫西芬在淋巴管内皮细胞诱导Tie2敲除(Tie2-/iLECKO),导致胚胎背部出血和水肿;然而,在胚胎期E12.5起诱导Tie2敲除不影响或轻微影响淋巴管发育。进一步的机制研究表明,Tie2-/iLECKO小鼠模型中Prox1-CreERT2可介导Tie2在静脉敲除;利用红细胞标志物Ter119进行的免疫染色信号表明,Tie2-/iLECKO小鼠血管发生渗漏,故小鼠水肿以及淋巴管发育异常可能是由于血管异常所导致。结论:1.Tie1缺失导致出生后视网膜血管新生滞后,但其在出生后3周龄时视网膜血管异常的表型与对照小鼠相比已部分恢复。2.Tie2在促进出生后血管新生、静脉发生及维持过程中都起重要作用。3.Tie1与Tie2在血管发生过程中存在相互协同的作用。4.胚胎期Tie2缺失导致血管发育异常,从而影响淋巴管网络生成。
高莹莹[7](2019)在《性别相关基因(Sex-Related Gene)在暗纹东方鲀生殖发育过程中的调控机理研究》文中认为暗纹东方鲀是我国南方重要的淡水养殖种类之一。暗纹东方鲀精巢营养价值很高,规模化养殖全雄暗纹东方鲀,能够显着提高我国养殖暗纹东方鲀的经济效益。本研究采用转录组学、生物信息学和分子生物学的方法,初步探究了暗纹东方鲀性别相关基因在早期发育过程中的分子调控机制。主要研究结果如下:1.暗纹东方鲀幼鱼遗传性别的鉴定采用ARMS-PCR技术快速检测暗纹东方鲀的遗传性别。根据暗纹东方鲀amhr2激酶结构域内存在一个与性别连锁的错义突变SNP位点,设计特异等位基因引物,即在下游PCR引物3’末端不同碱基位点设计不同种类的错配碱基,进行特异性引物的筛选,并通过优化PCR反应体系与反应条件,建立暗纹东方鲀幼鱼遗传性别差异鉴定的ARMS-PCR方法。此外,为了判断ARMS-PCR方法鉴定暗纹东方鲀幼鱼遗传性别的可行性,我们同时利用直接测序法和组织切片法分别鉴定样品的遗传性别和表型性别。结果表明,利用ARMS-PCR方法可以快速区分暗纹东方鲀的遗传性别,并且ARMS-PCR方法的鉴定结果与直接测序结果相同,同时也与组织切片鉴定的表型性别一致。2.暗纹东方鲀早期发育阶段性腺组织的转录组分析对孵化后60150日龄的暗纹东方鲀进行性腺差异的转录组测序和分析。结果显示,卵巢和精巢分别获得clean reads 54229278条和52089726条,其中分别有43588138和43837845条定位到参考基因组中,经过拼接组装后获得33247条unigenes,包含9890个新基因。差异表达基因分析结果显示,相邻发育时期卵巢中的差异表达基因数目普遍高于精巢,且性别间差异表达基因的数量远远高于性别内差异表达基因的个数。进一步对其显着性富集的Pathway进行筛选,共获得24条参与性别分化与性腺发育的代谢通路,其中神经活性配体-受体相互作用、MAPK信号通路和细胞周期等代谢通路中差异表达基因富集较多。从代谢通路差异表达的基因中筛选出cyp19a、cyp19b和hsd17b1等8个卵巢高表达基因以及dmrt1、cyp11a1和hsd3b等15个精巢高表达基因。上述候选基因为暗纹东方鲀性别决定和性别分化的分子调控机制的研究以及性别标记基因的开发提供重要的信息。3.暗纹东方鲀性别相关基因的克隆及结构分析根据转录组数据和已知河豚属鱼类的保守序列,分别设计了amhr2、cyp19a、dmrt1、sox9a和sox9b基因的简并引物,克隆了这5个基因的cDNA全长序列,分析了暗纹东方鲀性别相关基因的序列结构及相关生物信息学特征。暗纹东方鲀amhr2全长cDNA为1868bp(NCBI登录号:MH218814),编码513个氨基酸。cyp19a全长cDNA为1786bp(NCBI登录号:MH218815),编码514个氨基酸。dmrt1全长cDNA为1620bp(NCBI登录号:MH218816),编码294个氨基酸。Sox9a全长cDNA为1274bp(NCBI登录号:MH218818),编码227个氨基酸,Sox9b全长cDNA为1943bp(NCBI登录号:MH218819),编码489个氨基酸。基本理化性质结果显示,Amhr2、Dmrt1、Sox9a和Sox9b均属于不稳定的亲水性蛋白,仅Cyp19a属于稳定的亲水性蛋白。同源性和系统发育结果显示,Cyp19a和Dmrt1均与红鳍东方鲀和星点东方鲀同源性最高,亲缘关系最近;而Amhr2和两个Sox9均与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。4.暗纹东方鲀性别相关基因的表达研究对在暗纹东方鲀Ⅰ龄鱼不同组织和孵化后60150日龄幼鱼性腺组织中amhr2、cyp19a、dmrt1、sox9a和sox9b的表达情况进行相对定量分析。组织表达结果显示,amhr2仅在性腺中表达,且卵巢中的表达量明显高于精巢;cyp19a主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达;dmrt1主要在雄鱼中表达,且其表达模式具有精巢特异性;sox9a和sox9b均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在脑、垂体、肝和眼等其他组织中也有较高水平的表达。早期发育阶段性腺组织的表达结果显示,在90日龄雄鱼精巢中sox9a和sox9b表达量均显着升高;在120日龄雌鱼卵巢中cyp19a表达量显着升高,而在120日龄雄鱼精巢中dmrt1表达量显着升高;在150日龄雌鱼卵巢和雄鱼精巢中amhr2表达量均显着升高。以上定量结果说明,这5个基因均参与暗纹东方鲀的性腺发育过程,其中cyp19a与卵巢发育相关,dmrt1与精巢发育相关,sox9a和sox9b与神经调控有关。
田凯[8](2018)在《鸡胸肌组织发育过程中差异基因的筛选及功能验证》文中指出鸡肉在我国肉类消费结构中占有重要地位,产肉性状一直是鸡遗传育种研究领域的热点。我国地方鸡种具有独特的基因资源,如何从功能性转录组和调控性转录组层面来解析肌肉生长发育的分子调控机制,将成为鸡遗传改良工作的重要突破口。对不同生长发育时期肌肉组织转录水平上的分析,有助于了解该组织生长发育相关基因和调控因子之间所参与的分子调控机制。本试验利用RNA-seq技术对不同发育时间点胸肌组织的mRNAs和lncRNAs进行了系统地筛选和分析,筛选与肌肉生长发育相关的lncRNAs和mRNAs并构建两者的分子调控网络,初步探讨lncRNAs与mRNAs在调控肌肉发育方面的关系;另外,在筛选到的差异基因中,本试验选择GPR133和SH3BP5基因在细胞水平上进行功能验证,首先通过克隆技术得到与肌肉生长发育相关基因GPR133的两个转录亚型,并在细胞水平上验证了GPR133的两个转录亚型以及差异基因SH3BP5的功能。主要研究结果如下:(1)在49个测序文库中总共获得了817.74 Gb原始数据(Raw data),其中约有706.32 Gb的高质量读段(Clean data)达到质控标准被保留下来,最终产生的高质量读段有74%~88.8%的Reads能比对到鸡基因组上。通过对Clean Reads的比对和组装,共鉴定出17905个编码蛋白mRNAs和28032个定位到基因组位置的lncRNAs,其中包括9594个基因区的lncRNAs和15946个基因间区的lncRNAs。与lncRNAs相比,mRNAs转录本具有长度更长、所含外显子数目更多、表达水平更高的特征,而在染色体分布方面,大部分的mRNAs和lncRNAs都分布在鸡大型染色体上,具有明显的倾向性。根据mRNAs表达量层次聚类、主成份分析以及mRNAs和lncRNAs表达量的相关性分析发现各样本生物学重复间的相关性较高。(2)在胚胎发育中期、胚胎发育后期、生长发育旺盛期及成年期中分别有1020、294、165和299个高表达的基因;随着生长发育的进行,大部分差异表达的mRNAs和lncRNAs总体呈现下调趋势;在300天肌肉组织中筛选到263和131个特异表达的mRNAs和lncRNAs;通过进一步的筛选,得到82和34个与肌肉生长发育强相关的mRNAs和lncRNAs。通过对这些肌肉特异性表达或与生长发育强相关mRNAs的功能预测发现,许多编码蛋白的基因显着富集到转录调控以及与肌肉生长发育和代谢相关的生物学过程和信号通路中,表明这些基因可能参与肌肉生长发育和代谢过程。(3)通过构建肌肉特异性mRNAs和lncRNAs的共表达调控网络,总共得到了5个共表达网络图和网络图中一些核心的mRNAs和lncRNAs,其中一些lncRNAs与一个或多个mRNAs有直接的交互作用。例如lncRNAs TU124209与MYOG,TU60015与SRBD1和MYOC(肌纤蛋白)都有直接的交互作用。(4)利用RACE-PCR结合RT-PCR的方法克隆得到了鸡GPR133基因两个大小分别为3385和3289 bp的转录亚型GPR133-va和GPR133-vb,其中GPR133-va保留了所有的26个外显子,而GPR133-vb则通过外显子4跳跃的可变剪切方式产生。两个亚型的预测蛋白结构都含有3段保守结构域,分别是N端的Lam G和GPS,以及C端的G蛋白偶联受体家族典型的七次跨膜结构域7TM。对GPR133基因两个转录亚型在鸡31个器官组织中的表达谱分析发现,两个亚型在多个器官组织中都有较高表达。(5)分别将GPR133基因不同转录亚型的特异性干扰si RNA片段转染至鸡卫星细胞中发现,干扰GPR133基因两个转录亚型后,卫星细胞增殖数都变少,相关增殖和分化标记基因的表达量也显着下调,表明GPR133基因的两个转录亚型可以促进鸡卫星细胞的增殖和分化。(6)在鸡卫星细胞中过表达SH3BP5基因后,细胞增殖数目减少,细胞增殖标记基因CCNB2表达量下调,P21基因表达量上调;另外,过表达SH3BP5基因后抑制了相关成肌分化标记基因的表达,结果说明SH3BP5基因可以抑制鸡卫星细胞的增殖和分化。本研究从转录组层面初步解析家鸡肌肉各个生长发育阶段的分子差异,构建了lncRNAs与mRNAs的分子调控网络,并对差异基因GPR133的不同转录亚型以及SH3BP5的功能进行了初步验证,丰富了家禽胚胎期以及胚后期转录遗传信息,为我国地方鸡种的先天选育提供遗传资源和分子理论基础。
彭夕洋[9](2017)在《斑马鱼tmp3,hprg1b和cxxc5基因在心脏发育中的功能研究》文中进行了进一步梳理先天性心脏病是新生儿出生缺陷中发病率和死亡率最高的疾病,研究表明心脏发育调控基因的表达异常是导致先心病的内在原因。阐明心脏在早期发育过程中的基因调控机制就成为治疗先心病的关键。随着斑马鱼成为研究发育生物学和功能基因组学的脊椎动物模型,利用该模型可为探究心脏的早期发育和先心病发生的分子调控机制提供行之有效的研究策略。本文主要利用斑马鱼模型研究了tmp3,hprg1b和cxxc5基因在心脏早期发育过程中的调控功能。一、tmp3基因在心脏发育中的功能研究tmp3基因为实验室早期克隆的一个心脏发育候选基因,本文利用Tol2转座系统构建的tmp3启动子驱动的EGFP表达转基因斑马鱼品系Tg(tmp3:EGFP),简称tmp3EGFP。追踪该转基因斑马鱼中EGFP的表达发现,在受精后36,48和56小时(hpf)Tmp3蛋白主要强表达于心脏和骨骼肌中。原位杂交技术检测EGFP早期表达信号发现在40%外包时,表达信号定位于卵裂球边缘生心区;22体节时,信号定位于心锥和骨骼肌;24 hpf,信号定位于心管和骨骼肌;48 hpf,信号定位在骨骼肌和跳动的心脏中。将Tg(tmp3:EGFP)鱼与标记心内膜层细胞的Tg(fli1a:DSRED)鱼及标记心肌层细胞的Tg(myl7:DSRED)鱼分别杂交,对发育到72 hpf的双转基因斑马鱼进行激光共聚焦显微镜单层切面扫描,结果显示心脏中的tmp3基因表达只定位于心肌层。利用TALEN打靶技术构建的tmp3基因敲除斑马鱼品系进行Western blot检测证明,tmp3敲除阳性个体中没有相应的功能型蛋白合成。观察tmp3敲除纯合子的表型发现,tmp3敲除斑马鱼表现为心包肿大,心脏腔室减小,环化异常和躯干发育异常。观察Tg(myl7:DSRED;flk1:EGFP)双转基因tmp3敲除斑马鱼的表型发现,tmp3基因敲除导致斑马鱼心脏腔室减小和房室通道缩窄。为了探究心脏腔室的减小是由于心肌细胞大小的减小还是由于数目的减少导致的,利用细胞膜紧密连接蛋白ZO-1的抗体标记细胞膜,检测tmp3敲除斑马鱼心脏细胞的大小,结果表明tmp3敲除鱼心脏中的细胞大小并未发生显着变化。另外,通过肌球蛋白重链MHC抗体和核内DNA染料DAPI对心肌细胞染色并计数发现,48hpf tmp3敲除鱼心脏中心肌细胞的数量显着减少。证明tmp3基因敲除斑马鱼心脏腔室的变小是由于心肌细胞数量减少导致。Edu细胞增殖分析结果显示tmp3基因敲除后增殖的幼鱼心肌细胞数量显着减少。而TUNEL凋亡细胞分析结果显示tmp3敲除幼鱼心脏细胞的凋亡并未发生显着变化。由此证明tmp3基因通过影响心肌细胞的增殖从而调控斑马鱼早期心脏发育。本实验室早期通过酵母双杂交和COIP相互作用分析筛选出与Tmp3蛋白相互作用的蛋白分子Creb2,那么Tmp3蛋白是否通过与Creb2相互作用从而调控心脏发育呢?本文利用免疫荧光和激光共聚焦扫描检测斑马鱼胚胎心脏内源Tmp3与Creb2蛋白的表达发现,这两个蛋白在72 hpf的幼鱼心脏中存在共定位。进一步的免疫荧光实验证明在H9c2大鼠心肌细胞中TMP3蛋白与CREB2蛋白共定位于心肌细胞的细胞核中。接下来,用免疫荧光检测了诱导向心肌细胞分化的P19小鼠畸胎瘤干细胞在诱导第6天和第10天内源Tmp3和Creb2蛋白的定位。发现在诱导第6天两种蛋白大部分共定位在细胞质中,而在诱导第10天这两种蛋白共定位在细胞核中。提示随着胚胎细胞向心肌细胞分化,Tmp3与Creb2两种蛋白逐渐从细胞质迁移到细胞核中,提示这两个蛋白的入核进程可能与心肌细胞的发育过程相关。由于Tmp3是一个不具备入核信号的跨膜蛋白,为探究Tmp3是否依赖与Creb2的相互作用入核,构建tmp3全长荧光质粒发现该质粒在细胞核与细胞质中均有表达,而除去与Creb2相互作用结构域(134-240AA)后的截短体蛋白Tmp3荧光质粒仅定位在细胞质中。由此证明,Tmp3蛋白是通过与Creb2蛋白相互作用介导入核的。早期心肌细胞增殖和分化的关键调控因子gata4敲减的斑马鱼胚胎与tmp3基因敲除斑马鱼表现出类似的心脏缺陷表型,提示gata4可能是Tmp3-Creb2复合物的下游调控靶标。本文利用RT-qPCR检测了tmp3敲除斑马鱼胚胎中gata4及其调控心肌细胞增殖的下游因子ccnd2a和cdk4的表达。结果表明,gata4,ccnd2a和cdk4在tmp3敲除斑马鱼中均显着下调。由此提示gata4可能是Tmp3-Creb2复合物的下游靶标。另外在tmp3基因敲除斑马鱼一细胞期显微注射gata4mRNA可以一定程度上拯救心脏的发育畸形,从而进一步证明gata4为Tmp3-Creb2复合物调控早期心脏发育的下游靶标。利用RT-qPCR技术检测法洛式四联症(TOF)病人心肌组织中TMP3 mRNA的表达量发现TOF病人心肌组织中TMP3 mR NA的水平显着下调。随后通过测序分析在TOF病人中检测到一个TMP3基因的错义突变(c.820C>T,p.R274C)。将突变的TMP3质粒(R274C,TMP3m)转染到H9c2细胞中,利用荧光报告系统分析发现GATA4基因的上游应答原件CRE-luc荧光报告基因的转录活性较野生型对照组显着降低。而且western blot检测发现TMP3m转染的H9c2细胞中GATA4蛋白的表达量也显着降低。由此可见,TMP3m突变可能通过影响GATA4蛋白的表达从而参与TOF的发病机制。二、hprg1b基因在心脏发育中的功能研究hprg1b基因是实验室前期通过果蝇P因子突变筛选出的另一个早期心脏发育候选基因。本文为了追踪hprg1b基因在心脏早期发育过程中的时空定位,利用Tol2转座系统构建了hprg1b启动子驱动EGFP蛋白表达的转基因斑马鱼品系Tg(hprg1b:EGFP),简称1bEGFP。追踪胚胎发育过程中绿色荧光信号的表达发现在16hpf hprg1b基因的表达信号定位于侧板中胚层两侧的心脏原基中,随后在20hpf融合信号出现在心锥区域,在24hpf定位于心管的位置,48hpf后信号在心脏中检测到。由此可见,hprg1b基因的时空表达谱与早期心脏的形态建成区域一致。本文将1bE GFP转基因斑马鱼分别与Tg(myl7:DSRED)和Tg(kdrl:MCHERRY)转基因斑马鱼杂交后得到Tg(1bEGFP;myl7DSRED)和Tg(1bEGFP;kdrlMCHERRY)双转基因斑马鱼,观察72 hpf的转基因斑马鱼心脏发现Hprg1b蛋白表达只定位于心肌层。进一步检测75hpf的Tg(1bEGFP;myl7DSRED)双转基因斑马鱼心脏发现hprg1b强表达于流出道,房室通道和流入道处。此时心脏的3D立体图像显示hprg1b只在一部分心肌细胞细胞中表达。流氏细胞仪分析2个月大的Tg(1bEGFP;myl7DSRED)转基因斑马鱼原代心脏细胞发现,hprg1b阳性细胞只占心脏细胞的10.7%,从而提示hprg1b阳性细胞可能是一种特殊的心肌细胞。本文构建了hprg1b过表达质粒pC V/hf,将该质粒转染进入斑马鱼干细胞系Z428中。RT-PCR初步检测发现hprg1b过表达质粒转染1天后Z428细胞中早期心肌细胞标记基因gata4和nkx2.5,心内膜早期标记基因etv2和心肌细胞分化标记基因myh6的表达均出现明显的上调。进一步用ddPCR技术精确定量这四个基因在hprg1b过表达的Z428细胞中的表达变化,发现在hprg1b过表达1天后四个基因的表达与对照组相比均显着上调;2天后,nkx2.5,gata4和myh6的表达均持续增加,但etv2的表达开始下调;第三天,3个心肌细胞标记基因的表达持续上调,但心内膜标记基因etv2却持续下调。由此推断,hprg1b是通过持续诱导心肌细胞早期标记基因的表达,从而调控胚胎干细胞向心肌细胞分化进而调控心脏发育的。三、cxxc5基因在心脏发育中的功能研究CXXC5(CXXC-type zinc-finger protein 5)被报道在其表达的组织中发挥广泛的生理和病理学功能。以往的研究表明CXXC5在心脏中高表达,并且CXXC5与病理性和生理性心肌重构相关,提示CXXC5很可能在心脏发育、心肌分化和心脏疾病的发病机理中发挥重要作用。尽管如此,至今仍缺乏一个直接的证据阐明CXXC5在心脏中的功能。生物信息学分析表明CXXC5的功能结构域在进化上高度保守,因此利用斑马鱼模型探究CXXC5在早期胚胎心脏发育中的功能可为人类早期心脏发育关键调控因子的筛选提供线索。本文利用RT-PCR检测cxxc5基因在斑马鱼早期胚胎中的表达,发现cxxc5在40%外包时起始表达,并持续表达于胚胎与成体斑马鱼中。原位杂交检测cxxc5 mR NA的时空表达模式表明cxxc5在40%外包时表达于卵裂球两侧边缘生心区,在22体节时cxxc5表达于心锥,在24hpf表达于心管,在48hpf表达于心脏。cxxc5的时空表达模式提示cxxc5可能参与调控早期心脏发育。Morpholino敲减cxxc5的表达对心脏发育产生了显着的影响。注射了cxxc5 MO的胚胎约70%表现出环化异常,发育不良和心包水肿的表型。胚胎注射Morpholino后的致死率统计发现,大部分的cxxc5敲减胚胎在第七天死亡。cxxc5MO与cxxc5加帽mR NA共注射可以在一定程度上拯救cxxc5 MO敲减的胚胎表型,说明cxxc5敲减胚胎的表型是由于cxxc5 mRNA表达降低造成的。原位杂交检测心肌标记基因cmlc2的表达,发现24hpf的cxxc5敲减胚胎中cmlc2的表达停留在中线,而并未像野生型一样前端迁移到左眼处。48hpf的cxxc5敲减斑马鱼的心室和心房纵轴间的平均夹角为12°,与野生型的胚胎的平均夹角27°相比显着减小。本文进一步利用Semi-Automated Optical Heartbeat Analysis探究了cxxc5敲减对胚胎心脏的生理学功能的影响。分析表明,cxxc5敲减后,胚胎的心动周期显着延长,心率显着减缓,心脏收缩面积改变率显着减小。由此证明,cxxc5敲减后斑马鱼的心脏功能受损。前期研究表明人类CXXC5与SMADs蛋白(SMAD2,SMAD3)存在相互作用,本文通过生物信息学分析发现人类的CXXC5,SMAD2和SMAD3与斑马鱼中的同源蛋白高度同源。本实验室曾利用COIP和GST-pulldown证明了斑马鱼Cxxc5和Smad2,Smad3的相互作用。于是本文分别检测了TGF-β信号荧光报告质粒CAGA-LUC,BMP信号荧光报告质粒BRE-LUC,和Activin信号荧光报告质粒3TP-LUC在过表达Cxxc5的H9c2细胞中转录活性,结果表明CAGA-LUC和BRE-LUC的荧光活性显着增强,而3TP-LUC的活性没有变化,由此提示cxxc5基因在心肌细胞中影响了TGF-β信号和相关的BMP信号。为了找寻到TGF-β信号中Cxxc5-Smads复合物的靶点,本文分析了几个经典TGF-β信号下游靶基因nkx2.5,gata4,hand2,和has2启动子区域中是否包含MH1结合结构域SBE(Smad-binding element,CAGAC)和CpG岛。结果表明gata4,hand2和has2的启动子中均包含Smad-binding element(CAGAC)位点和CpG岛。RT-PCR分析表明cxxc5敲低的斑马鱼中hand2和has2的表达显着下调。而且胚胎注射hand2加帽mRNA可有效的拯救cxxc5 MO导致的心脏环化缺陷。从而证明cxxc5可能通过TGF-β信号的hand2调控心脏的环化过程。文献报道人类CXXC5基因在先心病患儿术前和术后的表达具有显着差异,本文利用RT-qPCR检测了TOF病人中CXXC5的表达,发现TOF病人中CXXC5 mRNA水平显着下调,提示CXXC5可能是TOF的临床诊断候选靶标分子。上述结果表明,斑马鱼cxxc5是在早期心脏发育中表达的内源性因子,可能在心脏左右不对称的形态建成中发挥重要作用,并且首次在体内证明cxxc5可以通过TGF-β信号调控心脏发育与心脏环化。
张博,陈晓芳,黄勋,杨晓[10](2016)在《2015年中国动物遗传学研究领域若干重要进展》文中进行了进一步梳理2015年中国科学家在动物遗传学领域的研究成果斐然。据不完全统计,2015年围绕线虫(Caenorhabditis elegans)、果蝇(Drosophila melanogaster)、斑马鱼(Danio rerio)、爪蛙(Xenopus)和小鼠(Mus musculus)等5个模式动物发表的论文中涉及中国的论文数约占总论文数的1/5,众多具有原创性的研究成果在国际高影响力的期刊上发表。例如:首次鉴定出潜在的磁受体Mag R,为磁感应遗传与分子机制的研究带来了重大突破;揭示了褐飞虱(Nilaparvata lugens)翅多型性的遗传基础;首次证明在果蝇基因组中存在腺嘌呤的N6-甲基化;揭示了哺乳动物树突棘修剪与成熟的新的分子机制;发现CRTC2介导的信号通路调控肝脏脂代谢;发现神经递质多巴胺能够调节炎症反应;发现Gasdermin蛋白家族具有诱导细胞焦亡的功能;发现小清蛋白阳性的兴奋性视觉通路能够触发小鼠的恐惧反应等。2015年中国科学家在TALEN和CRISPR/Cas基因组靶向编辑技术领域同样做出了重要贡献。据不完全统计,其中涉及中国的论文占比多于1/5,覆盖了从线虫到灵长类的多种动物、多种基因组修饰方法,并且在世界上首次成功编辑了人类早期胚胎。中国在基因组序列测定与分析研究领域一如既往地保持世界领先,2015年中国科学家在动物基因组方面绘制了家鹅(Anser cygnoides)、壁虎(Gekko japonicus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和大黄鱼(Larimichthys crocea)的基因组序列图谱,完成了69头中国地方猪(Sus scrofa)的基因组重测序,分别分析了这些动物所独有的生理病理特征以及环境适应能力的遗传基础。本文首次尝试对以中国本土科研团队为主的动物遗传学领域若干重要科研进展进行年度回顾,并选取若干重点论文进行简要介绍,以彰显中国科学家在动物遗传学领域的科研实力和重要贡献。
二、脊椎动物心肌基因表达的分子调控(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脊椎动物心肌基因表达的分子调控(论文提纲范文)
(1)孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中的作用研究(论文提纲范文)
中英文缩略词表 |
abstract |
摘要 |
第一部分 孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及心脏损伤修复 |
第一章 前言 |
第二章 孕激素可促进新生哺乳动物心肌细胞增殖 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验方法 |
2.3 统计学分析 |
2.4 实验结果 |
2.5 讨论 |
2.6 小结 |
第三章 孕激素调控YAP表达实现促心肌细胞增殖作用 |
3.1 实验材料 |
3.2 实验方法 |
3.3 统计学分析 |
3.4 实验结果 |
3.5 讨论 |
3.6 小结 |
第四章 孕激素促进成年心肌梗死后心肌细胞增殖及心脏损伤修复 |
4.1 实验材料 |
4.2 实验方法 |
4.3 统计学分析 |
4.4 实验结果 |
4.5 讨论 |
4.6 小结 |
全文总结 |
参考文献 |
第二部分 DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中作用研究 |
5.1 实验材料 |
5.2 实验方法 |
5.3 统计学分析 |
5.4 实验结果 |
5.5 讨论 |
5.6 小结 |
参考文献 |
文献综述 心肌细胞增殖的研究进展 |
参考文献 |
攻读博士学位期间发表论文 |
致谢 |
(2)BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究(论文提纲范文)
符号说明 |
中文摘要 |
Abstract |
1 前言 |
1.1 家蚕丝腺研究进展 |
1.1.1 家蚕丝腺的结构及功能 |
1.1.2 家蚕丝腺的发生和发育 |
1.1.3 家蚕丝腺发育的调控机理 |
1.2 Slit-Robo信号通路的研究进展 |
1.2.1 Slit-Robo家族简介 |
1.2.2 Slit-Robo信号通路基本结构 |
1.2.2.1 Slit基本结构 |
1.2.2.2 Robo基本结构 |
1.2.3 Slit-Robo信号通路的主要功能 |
1.2.3.1 对神经轴突的导向作用 |
1.2.3.2 调节细胞迁移 |
1.2.3.3 参与器官形成 |
1.3 Tbx20的研究进展 |
1.3.1 T-box家族简介 |
1.3.2 tbx20基因的鉴定 |
1.3.3 转录因子Tbx20的功能研究 |
1.3.3.1 调控心脏的发育 |
1.3.3.2 控制细胞的迁移 |
1.3.3.3 促进心肌细胞的增殖 |
1.3.4 tbx20的表达调控机制 |
1.4 本研究的目的与意义 |
2 材料与方法 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 试验动物 |
2.1.2 试剂及配制 |
2.1.2.1 试剂及试剂盒 |
2.1.2.2 相关试剂的配制 |
2.1.3 主要仪器设备 |
2.1.4 生物信息学分析工具及数据处理软件 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 Bmslit、Bmrobo和 Bmtbx20 基因在家蚕丝腺中的表达测定 |
2.2.1.1 取材 |
2.2.1.2 家蚕丝腺总RNA的提取 |
2.2.1.3 RNA反转录合成c DNA |
2.2.1.4 qPCR引物设计 |
2.2.1.5 qPCR反应体系及程序 |
2.2.1.6 数据处理与分析 |
2.2.2 BmSlit、BmRobo和 BmTbx20 蛋白在家蚕丝腺中的表达定位 |
2.2.2.1 抗体稀释 |
2.2.2.2 家蚕丝腺解剖与染色前处理 |
2.2.2.3 免疫荧光染色 |
2.2.3 Bmslit、Bmrobo和 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕胚胎期丝腺发育的影响分析 |
2.2.3.1 siRNA的设计与注射液的配制 |
2.2.3.2 显微注射前准备工作 |
2.2.3.3 注射卵的制备 |
2.2.3.4 蚕卵的显微注射 |
2.2.3.5 RNAi对家蚕胚胎期Bmslit、Bmrobo和 Bmtbx20 基因表达水平影响测定 |
2.2.3.6 RNAi对家蚕胚胎发育和丝腺发生的影响观察 |
3 结果与分析 |
3.1 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期的表达模式 |
3.1.1 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫前部丝腺中的表达变化 |
3.1.2 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫中部丝腺中的表达变化 |
3.1.3 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫后部丝腺中的表达变化 |
3.2 BmSlit和 BmRobo在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期的组织定位 |
3.2.1 BmSlit和 BmRobo在家蚕胚胎期丝腺中定位 |
3.2.2 BmSlit和 BmRobo在家蚕幼虫期前部丝腺中共定位 |
3.2.3 BmSlit和 BmRobo在家蚕幼虫期中部丝腺中共定位 |
3.2.4 BmSlit和 BmRobo在家蚕幼虫期后部丝腺中共定位 |
3.3 Bmslit和 Bmrobo基因RNAi对家蚕胚胎期相关基因表达的影响 |
3.3.1 RNAi对家蚕胚胎期Bmslit基因表达水平的影响 |
3.3.2 RNAi对家蚕胚胎期Bmrobo1a基因表达水平的影响 |
3.3.3 RNAi对家蚕胚胎期Bmrobo1b基因表达水平的影响 |
3.3.4 RNAi对家蚕胚胎期Bmrobo2/3 基因表达水平的影响 |
3.4 转录因子BmTbx20 在家蚕丝腺中的表达定位及其对Bmslit和 Bmrobo的表达调控 |
3.4.1 Bmtbx20在家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期的表达模式 |
3.4.2 BmTbx20和BmSlit在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期的组织定位 |
3.4.3 BmTbx20 调控Bmslit和 Bmrobo的表达 |
3.5 Bmslit、Bmrobo及 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕胚胎发育和丝腺发生的影响 |
3.5.1 Bmslit、Bmrobo及 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕胚胎发育的影响 |
3.5.2 Bmslit、Bmrobo及 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕丝腺发生的影响 |
4 讨论 |
5 结论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士学位期间发表论文情况 |
(3)天祝白牦牛肌肉生长和肌内脂肪沉积相关基因筛选与鉴定(论文提纲范文)
摘要 |
Summary |
第一章 文献综述 |
1.1 骨骼肌生长发育研究进展 |
1.1.1 骨骼肌的结构和类型 |
1.1.2 肌纤维形成与发育的生物学过程 |
1.1.3 骨骼肌生长发育的功能基因及其调控机理 |
1.2 肌内脂肪研究进展 |
1.2.1 脂肪细胞分化与脂肪生成 |
1.2.2 影响脂肪生成的功能基因及其调控机理 |
1.3 转录组测序(RNA-Seq)技术及其应用 |
1.3.1 转录组学概述 |
1.3.2 普通牛肌肉发育和IMF沉积转录组研究进展 |
1.4 蛋白质组测序技术及其应用 |
1.4.1 蛋白质组学概述 |
1.4.2 普通牛肌肉发育和IMF沉积蛋白质组研究进展 |
1.5 牦牛肌肉和IMF发育遗传研究 |
1.5.1 牦牛肌肉发育分子遗传研究 |
1.5.2 牦牛IMF沉积分子遗传研究 |
1.5.3 牦牛肌肉发育和IMF沉积的转录组和蛋白组学研究 |
1.6 本研究的目的与意义 |
第二章 不同年龄牦牛肉品质及肌纤维发育研究 |
2.1 试验材料与方法 |
2.1.1 试验动物 |
2.1.2 主要仪器设备 |
2.1.3 主要试剂及来源 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 牦牛屠宰性能测定 |
2.2.2 牦牛肉品质测定 |
2.2.3 背最长肌石蜡切片及H.E.(Hematoxylin-eosin staining)染色 |
2.2.4 数据分析 |
2.3 结果分析 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 不同年龄牦牛背最长肌转录组分析 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 试验动物 |
3.2.2 主要仪器设备 |
3.2.3 主要试剂 |
3.2.4 背最长肌组织总RNA提取 |
3.2.5 RNA质检和定量 |
3.2.6 cDNA文库构建与测序 |
3.2.7 测序数据统计与分析 |
3.2.7.1 原始数据预处理和序列比对 |
3.2.7.2 转录本组装 |
3.2.7.3 表达量分析 |
3.2.7.4 差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs)筛选 |
3.2.7.5 DEGs功能富集 |
3.2.7.6 DEGs时间序列表达模式聚类 |
3.2.8 差异表达基因RT-q RCR验证 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 牦牛背最长肌9个样品总RNA的质量检测 |
3.3.2 测序数据统计 |
3.3.3 基因表达水平分析 |
3.3.4 不同年龄牦牛背最长肌DEGs筛选 |
3.3.5 DEGs的表达模式聚类分析 |
3.3.6 不同表达模式基因GO富集分析 |
3.3.7 不同表达模式基因的KEGG通路富集分析 |
3.3.8 差异表达基因RT-q PCR验证 |
3.3.9 肌肉发育和脂肪沉积相关转录因子预测 |
3.4 讨论 |
3.4.1 不同年龄牦牛背最长肌DEGs表达趋势不同 |
3.4.2 肌肉发育和脂肪沉积相关基因的鉴定及功能分析 |
3.4.2.1 上调DEGs对牦牛肌肉发育和IMF沉积的影响 |
3.4.2.2 下调DEGs对牦牛肌肉发育和IMF沉积的影响 |
3.4.3 关键信号通路对牦牛肌肉发育和IMF沉积的调控作用 |
3.5 小结 |
第四章 不同年龄牦牛背最长肌蛋白组分析 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 试验动物 |
4.2.2 主要仪器设备 |
4.2.3 主要试剂及来源 |
4.2.4 肌肉组织蛋白质提取 |
4.2.5 蛋白质量检测 |
4.2.5.1 BCA试剂盒定量 |
4.2.5.2 SDS-PAGE电泳 |
4.2.6 还原烷基化和酶解 |
4.2.7 TMT标记 |
4.2.8 高p H RPLC一维分离 |
4.2.9 液相串联质谱 |
4.2.10 数据库选择与搜索 |
4.2.11 数据统计和生物信息学分析 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 牦牛背最长肌提取蛋白质的定量及SDS-PAGE电泳检测 |
4.3.2 蛋白质鉴定基本信息 |
4.3.3 蛋白质分子量分布 |
4.3.4 肽段序列长度分布 |
4.3.5 肽段数量分布 |
4.3.6 不同年龄牦牛背最长肌差异蛋白(DEPs)分析 |
4.3.6.1 DEPs筛选 |
4.3.6.2 DEPs聚类分析 |
4.3.7 DEPs功能分析 |
4.3.7.1 DEPs GO功能注释 |
4.3.7.2 DEPs GO功能富集分析 |
4.3.7.3 DEPs KEGG Pathway富集分析 |
4.3.7.4 肌肉生长和脂肪沉积相关蛋白互作网络 |
4.4 讨论 |
4.4.1 不同年龄牦牛蛋白表达模式存在差异 |
4.4.2 生长发育相关蛋白鉴定与功能分析 |
4.4.3 脂肪沉积相关蛋白鉴定与功能分析 |
4.5 小结 |
第五章 结论 |
5.1 主要结论 |
5.2 创新点 |
5.3 需要继续研究的内容 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简介 |
在读期间发表论文情况 |
导师简介(一) |
导师简介(二) |
导师简介(三) |
导师简介(四) |
(4)刺参应对高温低氧胁迫的生理响应与分子调控特征(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1 章 研究背景 |
1.1 高温胁迫下水生生物的响应特征 |
1.1.1 典型水生生物的温度耐受区间 |
1.1.2 高温胁迫对水生动物生理行为的影响 |
1.1.3 高温胁迫对水生动物分子调控的影响 |
1.2 低氧胁迫下水生生物的响应特征 |
1.2.1 低氧胁迫下水生生物的耐受性差异 |
1.2.2 低氧胁迫对水生生物生理行为的影响 |
1.2.3 低氧胁迫对水生动物分子调控的影响 |
1.3 刺参应对高温胁迫的响应机制研究进展 |
1.3.1 生理行为层面 |
1.3.2 分子响应层面 |
1.4 刺参应对低氧胁迫的响应机制研究进展 |
1.4.1 生理行为层面 |
1.4.2 分子响应层面 |
1.5 研究目的、意义及研究思路 |
1.5.1 目的与意义 |
1.5.2 科学问题 |
1.5.3 研究内容与技术路线 |
1.5.4 预期成果 |
1.6 本章小结 |
第2 章 高温低氧胁迫下刺参生理行为变化 |
2.1 研究背景 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 样品收集 |
2.2.2 酶活力测定及统计分析 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 高温低氧下刺参的消化功能相关酶活变化 |
2.3.2 高温低氧下刺参的免疫防御相关酶活变化 |
2.3.3 高温低氧下刺参的氧化应激相关酶活变化 |
2.3.4 高温低氧下刺参的生理行为变化特征 |
2.4 讨论 |
2.4.1 高温低氧胁迫下刺参消化功能相关变化 |
2.4.2 高温低氧胁迫下刺参免疫防御相关变化 |
2.4.3 高温低氧胁迫下刺参氧化应激相关变化 |
2.5 本章小结 |
第3章 高温低氧胁迫下刺参m RNA及 lnc RNA调控特征 |
3.1 研究背景 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 样品收集 |
3.2.2 建库及测序 |
3.2.3 数据质控、比对及鉴定 |
3.2.4 基因表达水平的定量及差异分析 |
3.2.5 差异表达基因(DEG)的GO和 KEGG富集分析 |
3.2.6 Real-time PCR验证及数据处理 |
3.2.7 靶向预测和验证 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 m RNA和 lnc RNA测序概况、鉴定及差异表达分析 |
3.3.2 差异lnc RNA和 m RNA的转录水平验证 |
3.3.3 DE-m RNA和 DE-lnc RNA的基因本体论(GO)和通路分析 |
3.3.4 m RNA和 lnc RNA的关联分析 |
3.4 讨论 |
3.5 本章小结 |
第4章 高温低氧胁迫下刺参micro RNA调控特征 |
4.1 研究背景 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 样品采集 |
4.2.2 小RNA文库的构建和测序 |
4.2.3 序列数据分析 |
4.2.4 Real-time PCR验证 |
4.2.5 mi RNA靶标预测、GO富集和KEGG通路分析 |
4.3 实验结果 |
4.3.1 mi RNA文库构建概况 |
4.3.2 差异mi RNA及 real-time PCR验证 |
4.3.3 差异mi RNA靶基因的GO和 KEGG通路富集分析 |
4.3.4 对环境胁迫响应的关键DE-mi RNA |
4.3.5 与高温和低氧胁迫相关的重要分子网络 |
4.4 讨论 |
4.5 本章小结 |
第5 章 高温低氧胁迫下刺参蛋白表达水平变动特征 |
5.1 研究背景 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 样品收集 |
5.2.2 样品处理及蛋白质提取 |
5.2.3 蛋白酶解、肽段标记及分离与质谱检测 |
5.2.4 蛋白质鉴定和定量 |
5.2.5 COG、GO和 KEGG通路富集分析 |
5.2.6 Real-time PCR及数据处理 |
5.3 实验结果 |
5.3.1 蛋白质表达谱概述及差异蛋白分析 |
5.3.2 基于差异蛋白的COG分析和KEGG富集分析 |
5.3.3 基于差异蛋白的GO分析及关键过程变化 |
5.4 讨论 |
5.4.1 信号转导 |
5.4.2 蛋白质合成 |
5.4.3 免疫防御 |
5.4.4 能量产生与转移 |
5.5 本章小结 |
第6 章 高温低氧胁迫下刺参代谢物变动特征 |
6.1 研究背景 |
6.2 材料与方法 |
6.2.1 样品收集 |
6.2.2 样品处理及代谢物提取 |
6.2.3 UPLC-MS分析 |
6.2.4 多元统计 |
6.3 实验结果 |
6.3.1 代谢组结果概述 |
6.3.2 各种环境胁迫下刺参关键响应差异代谢物 |
6.3.3 刺参应对高温低氧胁迫的潜在候选生物标志物 |
6.3.4 TCA循环中的关键代谢物水平分析 |
6.3.5 基于差异代谢物的关键通路分析 |
6.4 讨论 |
6.4.1 高温胁迫下刺参的代谢物水平变化 |
6.4.2 低氧胁迫下刺参的代谢物水平变化 |
6.4.3 高温低氧胁迫下刺参的代谢物水平变化 |
6.5 本章小结 |
第7 章 高温低氧胁迫下刺参关键免疫因子的响应特征 |
7.1 研究背景 |
7.2 材料与方法 |
7.2.1 样品收集 |
7.2.2 数据获取与分析 |
7.3 实验结果与讨论 |
7.3.1 NF-κB通路相关基因表达 |
7.3.2 蛋白酶相关基因表达 |
7.3.3 补体系统相关基因表达 |
7.3.4 热休克蛋白家族相关基因表达 |
7.3.5 转铁蛋白家族成员和其他免疫相关基因的表达 |
7.3.6 刺参免疫系统应对环境胁迫的响应 |
7.4 本章小结 |
第8 章 总结与展望 |
8.1 总结 |
8.2 创新性 |
8.3 存在问题 |
8.4 研究展望 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
(5)铜诱导斑马鱼髓鞘和轴突发育缺陷的分子调控机制(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略语表 |
1 前言 |
1.1 铜概述 |
1.1.1 水体中的铜及铜污染 |
1.1.2 铜的生物学功能 |
1.1.3 铜对生物体发育的影响 |
1.1.4 铜对神经系统的影响 |
1.2 神经系统发育 |
1.2.1 神经系统的形成 |
1.2.2 神经系统的结构 |
1.2.3 轴突发育 |
1.2.4 髓鞘发育 |
1.3 神经发育相关的信号通路 |
1.3.1 Wnt信号通路 |
1.3.2 Notch信号通路 |
1.4 甲基化研究 |
1.4.1 DNA甲基化 |
1.4.2 DNA甲基化与逆境胁迫 |
1.4.3 DNA甲基化对神经系统的影响 |
1.5 斑马鱼简介 |
1.6 研究的目的与意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验对象 |
2.1.2 所用载体和菌株 |
2.1.3 主要仪器设备 |
2.1.4 主要实验试剂 |
2.2 重金属铜胁迫 |
2.3 透射电子显微镜技术 |
2.4 电感耦合等离子体质谱(ICP-MS) |
2.5 运动行为检测 |
2.6 显微注射 |
2.7 RNA抽提 |
2.8 总cDNA的合成 |
2.9 荧光定量PCR |
2.10 质粒构建 |
2.10.1 探针质粒的构建 |
2.10.2 启动子缺失片段质粒的构建 |
2.11 反义mRNA探针的合成 |
2.12 胚胎整体原位杂交 |
2.13 转录组分析 |
2.13.1 基因芯片 |
2.13.2 转录组测序 |
2.14 胚胎总蛋白的提取 |
2.15 Western blot分析 |
2.16 基因组DNA提取 |
2.17 基因组甲基化检测 |
2.17.1 基因组甲基化测序 |
2.17.2 基因组DNA硫化处理 |
2.17.3 PCR验证 |
2.18 CRISPR/Cas9 基因编辑技术建立突变体 |
2.18.1 gRNA靶位点的选择和确认 |
2.18.2 gRNA合成 |
2.18.3 Cas9 mRNA的合成 |
2.19 突变体筛选 |
2.19.1 F0靶点突变效率检测 |
2.19.2 F0的可遗传筛选 |
2.19.3 筛选携带靶位点突变的F1成鱼 |
2.19.4 筛选携带靶位点突变的F2成鱼 |
2.20 细胞实验 |
2.20.1 细胞的培养与传代 |
2.20.2 细胞的冻存及复苏 |
2.20.3 细胞转染及双荧光素酶活性分析 |
3 实验结果 |
3.1 铜对斑马鱼胚胎发育的影响 |
3.2 铜的生物学效应 |
3.2.1 铜胁迫对斑马鱼神经和肌肉发育的影响 |
3.2.2 铜对斑马鱼胚胎的剂量效应 |
3.2.3 铜胁迫斑马鱼胚胎的转录组分析 |
3.3 铜对髓鞘细胞及轴突生长的影响 |
3.4 铜调控神经发育的信号因子的鉴定 |
3.5 Hoxb5b基因对胚胎神经发育方面的功能研究 |
3.5.1 Hoxb5b基因功能缺失对胚胎发育的影响 |
3.5.2 Hoxb5b基因功能缺失对髓鞘和轴突的影响 |
3.5.3 Hoxb5b过表达对铜胁迫幼鱼髓鞘和轴突发育的影响 |
3.6 铜调控神经发育的信号通路的鉴定 |
3.7 Wnt和 Notch信号通路在铜胁迫髓鞘和轴突发育缺陷胚胎中的功能研究 |
3.7.1 Wnt和 Notch信号通路的激活对铜胁迫后hoxb5b的影响 |
3.7.2 Wnt信号通路的激活对铜胁迫后髓鞘和轴突发育的影响 |
3.7.3 Notch信号通路的激活对铜胁迫后髓鞘和轴突发育的影响 |
3.8 铜胁迫斑马鱼胚胎的甲基化分析 |
3.8.1 铜胁迫斑马鱼胚胎的甲基化特征 |
3.8.2 铜胁迫胚胎高甲基化基因的转录表达特征 |
3.8.3 铜胁迫斑马鱼胚胎高甲基化基因与其转录表达的相关性 |
3.9 Fam168a和 fam168b在斑马鱼髓鞘发育中的功能研究 |
3.9.1 Fam168a和 fam168b在斑马鱼胚胎中的表达模式 |
3.9.2 fam168a和 fam168b突变体的构建 |
3.9.3 fam168a和 fam168b基因敲降胚胎的转录组分析 |
3.9.4 fam168a和 fam168b功能缺失对髓鞘和轴突发育的影响 |
3.10 转录因子hoxb5b与表观调控因子在胚胎发育中调控关系的鉴定 |
3.11 铜胁迫对铜转运突变体胚胎中髓鞘和轴突发育的影响 |
3.11.1 铜胁迫对cox17~(-/-)突变体胚胎中髓鞘和轴突发育的影响 |
3.11.2 铜胁迫对atp7a~(-/-)突变体胚胎中髓鞘和轴突发育的影响 |
3.11.3 铜胁迫对atp7b~(-/-)突变体胚胎中髓鞘和轴突发育的影响 |
4 讨论 |
4.1 铜导致斑马鱼胚胎CNS髓鞘和轴突发育缺陷 |
4.2 铜通过下调Wnt&Notch-hoxb5b诱导斑马鱼CNS髓鞘和轴突发育缺陷 |
4.3 铜诱导的fam168/pou3f1 DNA高甲基化及其转录水平下调促进髓鞘发育缺陷的形成 |
4.4 铜诱导的fam168b高甲基化及其转录水平下调之间的调控关系 |
4.5 铜通过cox17/atp7b调控Wnt/Notch-hoxb5b及表观调控因子fam168a/fam168b/pou3f等诱导髓鞘和轴突发育缺陷 |
4.6 总结及展望 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
(6)受体酪氨酸激酶TIE在脉管系统发育和稳态维持中的作用及机制(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
第一章: 受体酪氨酸激酶TIE在调节小鼠出生后血管生长过程中的作用及机制分析 |
前言 |
材料与方法 |
1. 实验材料 |
2. 实验方法 |
结果 |
1. Tie1敲除对出生后视网膜血管生长的影响 |
2. 出生后敲除Tie2对视网膜静脉生长的影响 |
3. 出生后敲除Tie2对维持已形成静脉的影响 |
4. 出生后敲除Tie2对维持静脉内皮细胞身份的影响 |
5. Tie2敲除抑制静脉生长的机制分析 |
6. Tie1敲除结合Tie2杂合突变对出生后视网膜血管生长的影响 |
讨论 |
参考文献 |
第二章: 受体酪氨酸激酶TIE2在小鼠胚胎淋巴管发育中的作用研究 |
前言 |
材料与方法 |
1. 实验材料: 参考第一章 |
2. 实验方法 |
结果 |
1. 内皮细胞特异性诱导敲除Tie2对胚胎淋巴管生长的影响 |
2. 淋巴管内皮细胞特异性诱导敲除Tie2对胚胎淋巴管生长的影响 |
3. 胚胎期诱导敲除Tie2导致淋巴管异常的机制分析 |
讨论 |
参考文献 |
动静脉分化与淋巴管发育的分子调控机制 |
参考文献 |
攻读博士学位期间发表的论文 |
中英文缩略词汇 |
致谢 |
(7)性别相关基因(Sex-Related Gene)在暗纹东方鲀生殖发育过程中的调控机理研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
引言 |
第一章 文献综述 |
1.1 暗纹东方鲀 |
1.2 性别决定与性别分化 |
1.2.1 性腺的分化 |
1.2.2 性染色类型 |
1.2.3 性别决定机制 |
1.3 性别分化相关基因的研究进展 |
1.3.1 雄性分化相关基因 |
1.3.2 雌性分化相关基因 |
1.4 本研究的目的及意义 |
第二章 暗纹东方鲀幼鱼遗传性别的鉴定 |
2.1 实验材料与仪器 |
2.1.1 实验用鱼 |
2.1.2 实验试剂 |
2.1.3 实验仪器 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 表型性别鉴定 |
2.2.2 引物设计 |
2.2.3 等位基因片段的PCR反应 |
2.2.4 ARMS-PCR 引物特异性鉴定及反应条件优化 |
2.3 结果 |
2.3.1 表型性别的鉴定 |
2.3.2 性别差异等位基因序列片段的PCR扩增 |
2.3.3 ARMS-PCR引物特异性的鉴定及反应条件的优化 |
2.4 讨论 |
第三章 暗纹东方鲀早期发育阶段的性腺转录组分析 |
3.1 实验材料与仪器 |
3.1.1 样品采集 |
3.1.2 实验试剂 |
3.1.3 实验仪器 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 cDNA文库构建和上机测序 |
3.2.2 测序数据处理 |
3.2.3 转录组数据生物信息学分析 |
3.3 结果 |
3.3.1 转录组测序质量评估 |
3.3.2 测序序列与参考基因组序列的比对分析 |
3.3.3 unigene功能注释 |
3.3.4 新转录本预测 |
3.3.5 差异基因表达分析 |
3.3.6 差异表达基因的富集分析 |
3.4 讨论 |
3.4.1 转录组数据分析 |
3.4.2 与性腺发育相关的通路 |
3.4.3 性腺差异表达基因的分析 |
第四章 暗纹东方鲀性别相关基因的克隆及分析 |
4.1 实验材料与仪器 |
4.1.1 实验用鱼 |
4.1.2 实验试剂 |
4.1.3 实验仪器 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 cDNA的合成 |
4.2.2 cDNA保守片段扩增 |
4.2.3 5 ˊ-RACE和3ˊ-RACE cDNA的克隆 |
4.2.4 序列分析 |
4.3 结果 |
4.3.1 amhr2的c DNA克隆和氨基酸序列特征分析 |
4.3.2 cyp19a的 c DNA克隆和氨基酸序列特征分析 |
4.3.3 dmrt1的c DNA克隆和氨基酸序列特征分析 |
4.3.4 sox9a和 sox9b的 c DNA克隆和氨基酸序列特征分析 |
4.4 讨论 |
4.4.1 暗纹东方鲀Amhr2 蛋白的功能域分析 |
4.4.2 暗纹东方鲀Cyp19a蛋白信号肽的结构预测及功能分析 |
4.4.3 暗纹东方鲀DM结构域的特征及功能分析 |
4.4.4 暗纹东方鲀Sox9 蛋白的功能域分析 |
第五章 暗纹东方鲀性别相关基因的表达研究 |
5.1 实验材料与仪器 |
5.1.1 样品采集 |
5.1.2 实验试剂 |
5.1.3 实验仪器 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 引物设计 |
5.2.2 cDNA合成 |
5.2.3 Real-Time PCR扩增 |
5.2.4 数据处理 |
5.3 结果 |
5.3.1 暗纹东方鲀amhr2 基因的表达特征 |
5.3.2 暗纹东方鲀cyp19a基因的表达特征 |
5.3.3 暗纹东方鲀dmrt1 基因的表达特征 |
5.3.4 暗纹东方鲀sox9a基因的表达特征 |
5.3.5 暗纹东方鲀sox9b基因的表达特征 |
5.4 讨论 |
5.4.1 暗纹东方鲀amhr2 基因的表达分析 |
5.4.2 暗纹东方鲀cyp19a基因的表达模式 |
5.4.3 暗纹东方鲀dmrt1 基因的表达分析 |
5.4.4 暗纹东方鲀sox9a和 sox9b的组织表达分析 |
小结 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
科研成果 |
(8)鸡胸肌组织发育过程中差异基因的筛选及功能验证(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
高频词汇中英文对照表 |
第一章 文献综述 |
1.1 鸡骨骼肌生长发育 |
1.1.1 鸡骨骼肌生长发育的形态学变化 |
1.1.2 鸡骨骼肌发育不同时期的调控因子 |
1.2 鸡肌肉组织的转录组学研究概况 |
1.2.1 转录组及其研究方法 |
1.2.2 鸡肌肉组织mRNAs研究进展 |
1.2.3 lncRNAs对鸡肌肉生长发育的作用 |
1.3 G蛋白偶联受体GPR133 的研究进展 |
1.3.1 GPCRs的发现和分类 |
1.3.2 GPR133 的结构和表达特征 |
1.3.3 GPR133 的功能 |
1.4 SH3BP5 基因的研究进展 |
1.4.1 SH3BP5 概述 |
1.4.2 SH3BP5 基因功能的研究进展 |
1.5 本研究的选题背景、目的意义及主要内容 |
1.5.1 选题背景 |
1.5.2 目的意义 |
1.5.3 主要内容及技术路线 |
第二章 鸡肌肉组织mRNAs和 lncRNAs的鉴定及差异分析 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 试验动物 |
2.1.2 主要仪器设备与试剂 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 鸡胚胎性别鉴定 |
2.2.2 组织石蜡切片制备及HE染色 |
2.2.3 总RNA提取及质量检测 |
2.2.4 RNA-seq文库构建和测序 |
2.2.5 测序数据的统计与分析 |
2.2.6 mRNAs的鉴定与分析 |
2.2.7 lncRNAs的鉴定与分析 |
2.2.8 相关性分析 |
2.2.9 lncRNA-mRNA共表达调控网络分析 |
2.2.10 RT-q PCR验证 |
2.3 试验结果 |
2.3.1 组织石蜡切片HE染色结果 |
2.3.2 mRNAs的鉴定及分析 |
2.3.3 lncRNAs的鉴定及分析 |
2.3.4 mRNAs和 lncRNAs联合分析 |
2.3.5 RT-qPCR验证结果 |
2.4 分析与讨论 |
2.4.1 鸡转录组mRNAs与 lncRNAs表达量及基因组特征 |
2.4.2 鸡肌肉组织差异mRNAs的生物学功能 |
2.4.3 lncRNAs对 mRNAs的调控作用 |
2.5 小结 |
第三章 GPR133 基因的克隆及其可变剪切的功能验证 |
3.1 前言 |
3.2 试验材料 |
3.2.1 试验动物 |
3.2.2 试验细胞 |
3.2.3 主要仪器设备及试剂 |
3.2.4 所用PCR引物信息 |
3.3 试验方法 |
3.3.1 总RNA的提取 |
3.3.2 GPR133 的克隆 |
3.3.3 生物信息分析 |
3.3.4 定量表达谱分析 |
3.3.5 细胞转染 |
3.3.6 细胞增殖检测 |
3.3.7 荧光定量检测 |
3.4 试验结果 |
3.4.1 GPR133 基因的克隆与鉴定 |
3.4.2 GPR133 基因对鸡骨骼肌卫星细胞增殖的作用 |
3.4.3 GPR133 对鸡骨骼肌卫星细胞分化的作用 |
3.5 分析与讨论 |
3.5.1 GPR133 基因的生物信息学分析 |
3.5.2 GPR133 两个亚型存在组织特异性分布 |
3.5.3 GPR133 不同亚型对鸡卫星细胞增殖的影响 |
3.5.4 GPR133 不同亚型对鸡卫星细胞分化的影响 |
3.6 小结 |
第四章 SH3BP5 对卫星细胞增殖和分化的影响 |
4.1 前言 |
4.2 试验材料 |
4.2.1 试验细胞 |
4.2.2 主要试剂和仪器 |
4.2.3 试验用载体 |
4.2.4 所用引物信息 |
4.3 试验方法 |
4.3.1 过表达载体的构建 |
4.3.2 重组质粒的提取 |
4.3.3 细胞转染 |
4.3.4 细胞增殖检测 |
4.3.5 荧光定量qPCR检测 |
4.4 试验结果 |
4.4.1 鸡骨骼肌卫星细胞的形态学观察 |
4.4.2 SH3BP5 对鸡骨骼肌卫星细胞增殖的作用 |
4.4.3 SH3BP5 对骨骼肌卫星细胞分化的作用 |
4.5 分析与讨论 |
4.5.1 SH3BP5 对鸡卫星细胞增殖的影响 |
4.5.2 SH3BP5 对鸡卫星细胞分化的影响 |
4.6 小结 |
第五章 主要结论与创新点 |
5.1 主要结论 |
5.2 创新点 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
作者简历 |
(9)斑马鱼tmp3,hprg1b和cxxc5基因在心脏发育中的功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 研究背景和文献综述 |
1.1 斑马鱼心脏发育概述 |
1.2 脊椎动物心脏发育的分子调控 |
1.2.1 GATA转录因子调控心脏祖细胞的迁移和心肌细胞分化命运 |
1.2.2 hand2 调控心脏细胞分化和形态建成 |
1.2.3 NKX2.5 维持心脏腔室的特性 |
1.2.4 Tbx20 对心祖细胞形成是必须的 |
1.2.5 诱导心脏祖细胞的信号通路 |
1.3 斑马鱼模型与人类先天性心脏病的研究 |
1.3.1 转基因斑马鱼技术 |
1.3.2 Morpholino基因敲减技术 |
1.3.3 基因敲除技术 |
1.4 本文的研究目的 |
第二章 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 主要试剂与材料 |
2.1.2 主要实验仪器与软件 |
2.2 方法 |
2.2.1常规分子生物学实验 |
2.2.2 动物实验技术与方法 |
第三章 tmp3 基因在心脏发育中的功能研究 |
3.1 前言 |
3.2 结果 |
3.2.1 tmp3 在斑马鱼胚胎心脏发育中的时空表达分析 |
3.2.2 tmp3 基因敲除斑马鱼品系的建立 |
3.2.3 tmp3 基因敲除导致斑马鱼心脏发育畸形 |
3.2.4 tmp3 基因调控心祖细胞的增殖 |
3.2.5 跨膜蛋白TMP3 的入核机制探究 |
3.2.6 tmp3 靶向gata4 调控早期心脏发育 |
3.2.7 TMP3 基因的缺陷与人类法洛氏四联症相关 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
第四章 hprg1b基因在心脏发育中的功能研究 |
4.1 前言 |
4.2 结果 |
4.2.1 hprg1b在斑马鱼胚胎心脏发育中的时空表达 |
4.2.2 hprg1b在早期胚胎心脏中的定位 |
4.2.3 hprg1b阳性心脏细胞类型鉴定 |
4.2.4 hprg1b阳性细胞在斑马鱼心脏中所占比值的测定 |
4.2.5 hprg1b过表达对斑马鱼干细胞分化命运的影响 |
4.3 讨论 |
4.4 小结 |
第五章 cxxc5 基因在心脏发育中的功能研究 |
5.1 前言 |
5.2 结果 |
5.2.1 cxxc5 基因在早期斑马鱼胚胎发育中的时空表达分析 |
5.2.2 敲减cxxc5 基因的表达导致斑马鱼心脏环化畸形 |
5.2.3 cxxc5 基因通过TGF-β信号调控斑马鱼心脏的环化发育 |
5.2.4 CXXC5 基因的缺陷与人类法洛氏四联症的相关性分析 |
5.3 讨论 |
5.4 小结 |
第六章 其它研究心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估 |
6.1 前言 |
6.2 结果 |
6.3 讨论 |
6.4 小结 |
第七章 结语 |
参考文献 |
附录 |
附录一 |
附录二 |
致谢 |
(10)2015年中国动物遗传学研究领域若干重要进展(论文提纲范文)
1基因组靶向操作技术在动物遗传学研究中的改进与应用 |
1.1在非人灵长类动物中利用CRISPR/Cas系统高效制备突变体和疾病模型 |
在食蟹猴生殖细胞中成功获得CRISPR/Cas介导的基因修饰 |
利用CRISPR/Cas系统一步产生p53双等位基因突变的食蟹猴 |
通过敲除DAX1基因在食蟹猴中构建人类AHC-HH的动物模型 |
利用CRISPR/Cas技术研制出杜氏肌营养不良症猕猴模型 |
利用灵长类胚胎干细胞(ESC)产生嵌合体猴 |
1.2利用CRISPR/Cas和TALEN技术改造哺乳类经济动物 |
利用TALE切口酶介导的同源重组培育抗结核病的转基因牛 |
世界首例基因编辑狗诞生 |
在雪貂中首次实现基于CRISPR/Cas系统的高效基因编辑 |
1.3 CRISPR/Cas系统在小鼠中的改进与应用 |
利用携带g RNA文库的单倍体胚胎干细胞进行小鼠基因突变筛选 |
在小鼠精原干细胞中利用CRISPR/Cas技术修复遗传病 |
通过分化基因修复的核移植胚胎干细胞产生可育的Kitw/Kitwv小鼠后代 |
利用CRISPR/Cas系统在哺乳动物中诱导基因组调控序列和基因簇的倒位与重复 |
1.4 CRISPR/Cas系统在非哺乳类模式动物中的优化与应用 |
在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9系统靶向内含子实现高效的基因敲入 |
在斑马鱼中通过Csy4-RNA加工扩大CRISPR/Cas基因组靶标位点 |
1.5利用d Cas9/g RNA系统调控基因表达 |
利用缺乏催化活性的Cas9在线虫和斑马鱼中调控内源基因表达 |
利用d Cas9/g RNA在人类体外培养细胞中对顺式调控元件进行功能注释 |
1.6在人类胚胎中首次实现基因编辑 |
2动物基因组序列测定与分析 |
2.1世界首个家鹅全基因组序列图谱绘制完成 |
2.2通过全基因组测序分析壁虎爬墙及断尾再生能力相关基因 |
2.3大黄鱼全基因组精细图谱绘制完成 |
2.4国际首例草鱼全基因组序列图谱绘制完成 |
2.5全基因组重测序揭示猪环境适应性的分子机理及可能的种间杂交现象 |
3无脊椎动物遗传机制研究进展 |
3.1线虫和果蝇的亚细胞结构与功能 |
利用CRISPR/Cas技术介导的条件性突变揭示动力蛋白在线虫纤毛中的功能 |
Ptd Ins(4,5)P2和Ptd Ins3P共同协调吞噬泡闭合以清除线虫凋亡细胞 |
Sec22对于果蝇内质网的形态维持和眼睛发育具有重要作用 |
3.2无脊椎动物的信号转导与基因表达调控 |
3.2.1果蝇卵子发生与生殖干细胞 |
mi R-318在果蝇卵子发生中调控图式形成和基因扩增 |
Pelo-Hbs1 m RNA监测复合体为果蝇生殖细胞转座子沉默所必需 |
COP9通过Hedgehog信号通路调节果蝇生殖干细胞谱系分化 |
Ci在卵巢体细胞中通过拮抗Hippo信号通路促进果蝇生殖干细胞分化 |
组蛋白H1通过调控H4K16乙酰化促进果蝇生殖干细胞的自我更新 |
3.2.2果蝇肠道稳态与肠干细胞 |
转录抑制因子Ttk69在果蝇肠干细胞分化中抑制肠内分泌细胞的特化 |
Windpipe通过促进受体内化与降解调控JAK/STAT信号通路以维持果蝇肠道稳态 |
Su(dx)通过介导Pez降解调控果蝇中肠稳态 |
3.2.3果蝇Hippo信号通路的其他新调控机制 |
果蝇成虫盘中Hippo信号抑制Slmb对Expanded的降解作用 |
Hippo信号通路与JNK信号通路在果蝇中的相互作用 |
3.2.4线虫和果蝇基因组的结构、变异与演化 |
解析果蝇DNA腺嘌呤N6-甲基化修饰 |
表达谱和基因的进化年龄在果蝇中共同决定提早终止密码子突变的产生 |
全基因组范围构建C.briggsae与C.nigoni的杂交不亲和图谱 |
3.2.5线虫和果蝇基因表达的转录后调控 |
解析线虫RNA编辑组图谱 |
果蝇内含子中保守的U1 sn RNA结合序列促进反式剪接发生 |
3.2.6无脊椎动物其他基因表达调控与信号转导 |
在线虫中小RNA通过Nrde通路介导组蛋白H3K27的三甲基化 |
果蝇Pelle调节细胞凋亡的新功能 |
胰岛素受体调控褐飞虱翅多型性发育的分子机制 |
甲基法尼酯在果蝇变态中的双重功能 |
细胞非同步分裂和命运不对称的遗传基础 |
3.3线虫和果蝇的神经、免疫与行为 |
电压门控性钙通道通过调控自噬泡与溶酶体融合维持神经元稳态 |
细胞支架蛋白Anillin通过介导Rho G信号向肌动蛋白细胞骨架的传导来调控线虫神经细胞迁移和神经突生长 |
线虫COE转录因子UNC-3调控谱系特异的细胞凋亡和神经突生长 |
钙离子传感分子synaptotagmin 1通过协调突触囊泡胞吐与Rab3循环调控神经递质的重复释放 |
S6激酶家族成员S6KL通过促进BMP受体Tkv的降解抑制果蝇突触发育和功能 |
线虫ASH和ASI感觉神经元之间通过相互抑制调控痛觉和回避行为 |
神经肽受体NPR-1和NPR-2调控线虫对水杨酸甲酯的回避反应 |
代谢型GABA信号调控线虫寿命 |
线虫表皮损伤导致STA-2释放与天然免疫的激活 |
CDK12通过调控异染色质重塑影响果蝇的求偶学习 |
章胺介导饥饿诱导的成体果蝇运动增强 |
4非哺乳类脊椎动物遗传机制研究进展 |
4.1以斑马鱼为主的造血与血管发育机制研究进展 |
G蛋白偶联受体Gpr183通过抑制Notch1促进内皮细胞向造血命运转变 |
炎症信号调节脊椎动物中造血干/祖细胞的发生 |
Top BP1在斑马鱼定向造血中保证造血干/祖细胞的存活 |
kri1l突变通过诱导依赖于PERK的过度自噬导致定向造血缺陷 |
Idh1调节斑马鱼造血发育 |
Irf4在胚胎发育过程中调控T淋巴前体细胞与髓系细胞的命运抉择 |
时空谱系追踪揭示斑马鱼胚胎和成体小胶质细胞的不同起源 |
CD146作为netrin-1的受体促进血管发育与新生 |
UXT通过抑制Notch信号促进血管新生 |
4.2以鱼类为主的其他组织器官发育与基因表达调控机制研究进展 |
Jag1b通过调控组织形态分离和抑制细胞死亡参与内耳感觉壶腹嵴发育 |
TGFβ/Smad5信号通路调控斑马鱼侧线发育 |
Y染色体特异的TGF-β家族基因amhy决定尼罗罗非鱼的雄性性别分化 |
p53异构体Δ113p53/Δ133p53通过促进DNA双链断裂修复防止细胞死亡或衰老 |
p53基因内含子中4 bp的天然缺失产生了一系列具有抗凋亡作用的新型p53异构体 |
全面鉴定斑马鱼低温胁迫反应的遗传调控网络与顺式调控元件 |
4.3爪蛙早期胚胎与组织器官发育机制研究进展 |
赖氨酸去甲基化酶Kdm2a/b通过调节核内β-catenin的稳定性调控Wnt信号通路和非洲爪蛙体轴的发育 |
Jmjd6通过解除Tcf7l1对Wnt靶基因的转录抑制作用调控非洲爪蛙体轴的形成 |
在非洲爪蛙中SCP3通过去磷酸化R-Smad的接头区域促进TGF-β介导的胚层诱导 |
Ets1通过结合HDAC1弱化BMP信号调控非洲爪蛙神经嵴发育 |
Hspa5通过作用于RA信号通路调控爪蛙前肾的发育 |
5哺乳动物遗传机制研究进展 |
5.1哺乳动物生殖和胚胎发育 |
单细胞RNA转录组分析小鼠植入前胚胎的线性和环状RNA |
组蛋白甲基转移酶GLP激活的新机制 |
CCNYL1而非CCNY协同CDK16调节小鼠精子发生 |
m TORC1通过Notch信号通路阻止前成骨细胞分化 |
Zbtb20通过抑制Sox9调节肥大软骨细胞的终末分化 |
转录中介体Med23基因通过BMP信号通路抑制胚胎干细胞向神经细胞分化 |
树突棘的协同修剪与成熟由树突棘间对cadherin/catenin复合体的竞争所介导 |
组蛋白去乙酰化在小鼠神经诱导中的作用及其调控机制 |
水通道蛋白AQP5/8介导的植入前宫腔液体过多是激素紊乱导致胚胎植入失败的原因 |
5.2哺乳动物代谢与组织稳态维持 |
高尔基体蛋白PARQ3通过促进Scap/SREBP复合体的形成调节胆固醇稳态 |
CREB的转录激活因子CRTC2通过SREBP1调控肝脏脂代谢 |
肝细胞在肝纤维化中的作用 |
脂联素通过促进M2巨噬细胞增殖增强冷刺激诱导的皮下脂肪组织棕色化 |
凝血酶的天然抑制蛋白 |
Egr3是正常造血干细胞增殖的抑制因子 |
次要类型Ⅳ型胶原蛋白促进癌症进展 |
低氧通过抑制Hippo信号影响肿瘤发生 |
外泌体环状RNA可作为癌症诊断分子标志 |
人类面部三维形态作为可靠的衰老标志 |
5.3哺乳动物细胞分裂与细胞内吞和自噬 |
有丝分裂后纤毛组装的调控 |
微管绑定蛋白TPX2通过调节微管通量维持细胞有丝分裂中期纺锤体长度 |
VPS33AD251E突变导致自噬体?溶酶体融合缺陷 |
CRL4泛素连接酶在卵母细胞减数分裂中的作用 |
E3泛素连接酶RNF152通过使Rag A GTPase泛素化抑制哺乳动物m TORC1激活 |
TGF-βⅠ型受体内化进入caveolin-1和EEA1双阳性早期内体 |
5.4哺乳动物炎症和细胞死亡 |
细胞焦亡的关键分子机制 |
程序性坏死过程中RIP3激活的新机制 |
5.5哺乳动物组织损伤修复和再生 |
急性炎症参与启动新生小鼠心肌再生应答 |
非平滑肌肌球蛋白重链Myh9可通过限制Lgr5+干细胞介导结肠炎诱导的肠上皮细胞损伤 |
促炎因子组合可促进肌肉干细胞长期扩增 |
mi R-184氧化修饰有助其靶向调节Bcl-x L和Bcl-w |
5.6哺乳动物神经、认知与行为 |
小清蛋白阳性的兴奋性视觉通路触发小鼠恐惧反应 |
转录因子COUP-TFI和COUP-TFII是小鼠嗅球颗粒细胞产生所必需的 |
β-Arrestin偏好的信号通路介导记忆再巩固 |
神经活性诱导的Glu N2A-NMDAR突触递送依赖内质网伴侣蛋白Bip,而且与恐惧记忆有关 |
动物磁感应遗传机制研究的重大突破——首次报道Mag R的磁感应功能 |
四、脊椎动物心肌基因表达的分子调控(论文参考文献)
- [1]孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中的作用研究[D]. 兰聪. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究[D]. 王芹. 山东农业大学, 2020(01)
- [3]天祝白牦牛肌肉生长和肌内脂肪沉积相关基因筛选与鉴定[D]. 石斌刚. 甘肃农业大学, 2020
- [4]刺参应对高温低氧胁迫的生理响应与分子调控特征[D]. 霍达. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2020(01)
- [5]铜诱导斑马鱼髓鞘和轴突发育缺陷的分子调控机制[D]. 张婷. 华中农业大学, 2019(02)
- [6]受体酪氨酸激酶TIE在脉管系统发育和稳态维持中的作用及机制[D]. 储蔓. 苏州大学, 2019(06)
- [7]性别相关基因(Sex-Related Gene)在暗纹东方鲀生殖发育过程中的调控机理研究[D]. 高莹莹. 上海海洋大学, 2019(03)
- [8]鸡胸肌组织发育过程中差异基因的筛选及功能验证[D]. 田凯. 四川农业大学, 2018
- [9]斑马鱼tmp3,hprg1b和cxxc5基因在心脏发育中的功能研究[D]. 彭夕洋. 湖南师范大学, 2017(01)
- [10]2015年中国动物遗传学研究领域若干重要进展[J]. 张博,陈晓芳,黄勋,杨晓. 遗传, 2016(06)