一、小鼠肝癌H_(22)细胞LDLR的分析研究（论文文献综述）
王震[1]（2019）在《肿瘤靶向CTD聚合物胶束减毒作用研究》文中认为“以毒攻毒”是中医治疗恶性肿瘤的重要手段之一。中医临床实践已经证明斑蝥素（CTD）具有独特的肿瘤治疗效果,但由于其治疗剂量范围较为狭窄,抗肿瘤的有效成分也是毒性成分,应用不当会引发中毒,甚至危及生命。mPEG2000-PLGA2000聚合物胶束能够将CTD包载于疏水性内核中,降低药物对正常组织的毒副作用,提高其在肿瘤组织的富集,延长药物在体内的循环时间。我们前期研究已经构建了载CTD的mPEG-PLGA聚合物胶束,体内抗肿瘤实验结果表明mPEG-PLGA-CTD聚合物胶束能够减轻CTD对小鼠肾脏的毒性损伤。本课题将在前期的研究基础上,深入探究mPEG-PLGA-CTD聚合物胶束的安全用药剂量及增效减毒机制,为CTD的安全使用提供重要的临床指导。CTD聚合物胶束对小鼠的急性毒性研究。（1）正常小鼠急性毒性实验:取清洁级昆明小鼠144只,雌雄各半,随机分为正常组、空白胶束组、原药组、胶束组,共12组,每组12只,尾静脉注射给药（胶束溶液以CTD计,0.20 mL/10 g）。密切观察小鼠24小时内的体重、毒性反应和死亡情况,连续观察14天。采用急性毒性实验方法,Bliss法计算半数致死量LD50。（2）荷瘤小鼠急性毒性实验:取清洁级昆明小鼠156只,雌雄各半,建立小鼠肝癌H22皮下移植性肿瘤模型,随机分为模型组、原药组、胶束组,共13组,每组12只,尾静脉注射给药（胶束溶液以CTD计,0.20 mL/10 g）。密切观察小鼠24小时内的体重、毒性反应和死亡情况,连续观察14天。采用急性毒性实验方法,Bliss法计算半数致死量LD50。（3）胶束对荷瘤小鼠组织脏器的影响:取清洁级昆明小鼠36只,雌雄各半,建立小鼠肝癌H22皮下移植性肿瘤模型,随机分为模型组、原药组、胶束组3组,每组12只,给药为剂量600μg/kg,隔天尾静脉注射给药（胶束溶液以CTD计,0.20 mL/10 g）,并收集尿液置于4℃冰箱备用。给药14天后,对未死亡的小鼠采用摘眼球取血的方法收集血液,将收集的血液放置于4℃冰箱备用,取血后的小鼠颈椎脱臼处死,解剖并取出肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和胸腺组织称重。通过计算小鼠脏器系数,HE染色法观察各组织脏器的病理学变化,测定血清及尿液中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（A ST）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）水平,比较mPEG-PLGA-CTD胶束和CTD原药对小鼠的毒副作用。实验结果显示:正常小鼠胶束组LD50值为2.29 mg/kg,原药组LD50值为1.96 mg/kg,胶束组是原药组的1.17倍;荷瘤小鼠胶束组LD50值为2.55 mg/kg,原药组LD50值为1.66 mg/kg,胶束组是原药组的1.54倍。原药组与模型组相比,肝脏系数极显着性减小（P<0.01）,脾脏系数显着性减小（P<0.05）,胶束组与模型组相比则无差异。病理切片显示:原药组、胶束组同模型组相比,肾组织切片囊腔变大、肾小球体积增大、肾小管边缘模糊;肝组织切片中均出现明显炎性细胞浸润,但原药组的变化较胶束组更加明显;心脏组织切片均出现心肌细胞坏死（核溶解）且伴随出血现象、炎性细胞浸润。但原药组心、肝、肾的组织病变较胶束组更加严重。原药组和胶束组小鼠肺泡壁均有少许增宽、增厚,两组均出现明显炎性细胞浸润现象,胶束组与模型组相比无明显差异,原药组局部出现明显的淤血现象。原药组、胶束组小鼠的血清ALT与模型组相比较显着升高（P<0.05）,且原药组的变化较胶束组更加明显,AST、ALP则无显着性差异;原药组小鼠的血清UA与模型组相比显着升高（P<0.05）,而胶束组小鼠的血清UA与模型组相比无显着性差异;原药组、胶束组小鼠的尿液Cr、BUN与模型组相比较无显着性差异。综上所述,mPEG-PLGA-CTD胶束可以降低CTD在小鼠体内的毒性,减轻对组织脏器的毒副作用,且对荷瘤小鼠的减毒作用更加明显。CTD聚合物胶束在荷瘤小鼠体内的药动学研究。采用清洁级雌性昆明小鼠114只,建立小鼠肝癌H22皮下移植性肿瘤模型,随机分为19组,每组6只,尾静脉注射给药（胶束溶液以CTD计,0.20 mL/10 g）。分别于给药后5 min、15 min、30 min、1 h、2h、4 h、8 h、12 h、24 h眼眶取血,离心（4℃,3000 r/min,10 min）,分离上层血清。样品采用乙酸乙酯萃取的方法进行处理,选用安妥明为内标,GC-MS法进行测定,DAS2.0软件计算药代动力学参数,考察小鼠体内药动学性质。实验结果显示:GC-MS的方法专属性较高,血浆CTD在41000ng/mL范围内具有良好的线性关系,回归方程为Y=0.0081x+0.0695（R2=0.9979）,最低检测限为2 ng/mL,精密度及稳定性均符合要求。CTD饱和生理盐水溶液和mPEG-PLGA-CTD胶束溶液尾静脉给药后血药浓度均符合三室模型。CTD原药和mPEG-PLGA-CTD胶束在小鼠体内的药时曲线下面积AUC0–24 h分别为619.99、3771.56μg/L*h;达峰浓度Cmax分别是348.21、638.78μg/L;体内滞留时间MRT延长分别为2.25、9.82 h;消除半衰期t1/2γ分别为6.45、17.69 h;清除率CL分别为0.97、0.14 L/h/kg。与原药对比表明:mPEG-PLGA-CTD胶束能加快小鼠静脉注射后的药物吸收,有效延长药物在血液中的循环,胶束AUC0–24h是原药的608.32%。CTD聚合物胶束在荷瘤小鼠体内动态组织分布及肿瘤靶向性研究。小鼠分组及给药同药动学研究。分别于给药后各时间节点,颈椎脱臼处死小鼠,解剖取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤,采用蛋白沉淀法处理各组织,样品用乙酸乙酯萃取的方法进行处理。选用安妥明为内标,GC-MS法进行测定组织中药物含量。运用Origin 8.5软件处理数据,考察小鼠体内动态组织分布的特征,并进行靶向性评价。实验结果显示:GC-MS的方法专属性较高,组织CTD在4640 ng/mL范围内具有良好的线性关系:小鼠心脏、肝脏、肾脏组织中CTD的回归方程分别为Y=0.0081x+0.0983、Y=0.0078x+0.1006、Y=0.0075x+0.0969（R2在各组织中均大于0.99）,最低检测限为2 ng/mL,精密度及稳定性均符合要求。CTD饱和生理盐水溶液和mPEG-PLGA-CTD胶束溶液尾静脉给药后,CTD在各组织中均有分布,比对法显示:与原药相比,mPEG-PLGA-CTD胶束在各组织中的药物分布均较低;胶束和原药在肿瘤中的AUC分别为3276.63、1907.15μg/L*h,胶束是原药的1.72倍,药物在心、肝、脾、肺、肾、肿瘤中的靶向指数（TI）分别为0.75、0.88、0.71、0.49、0.39、1.71,总体靶向效率（TE）分别为12.88、31.73、9.71、2.20、3.11、19.18,相对总体靶向效率（RTE）分别为-29.27、-17.02、-33.63、-54.07、-63.45、59.70%,可以看出,胶束在肿瘤组织中的TE、TI均高于其他组织,各器官的相对总体靶向效率只有肿瘤为正值。结果表明mPEG-PLGA-CTD胶束不仅可以降低药物对正常组织的毒性,而且可以提高药物对肿瘤的靶向性,使CTD更好的富集于病变组织,从而提高其对肿瘤的治疗效果。CTD聚合物胶束在肿瘤组织中的渗透性研究。小鼠分组及给药同药动学研究。分别于给药后各时间节点,颈椎脱臼处死小鼠,解剖取出肿瘤组织,将完整的肿瘤组织等间距剪切成内、中、外三个不同层次的组织样品,采用蛋白沉淀法处理,样品用乙酸乙酯萃取的方法进行处理。选用安妥明为内标,GC-MS法（色谱及质谱条件同药动学研究）进行测定组织中药物含量。运用Origin 8.5软件处理数据,考察胶束在实体瘤中的渗透程度。实验结果显示:CTD饱和生理盐水溶液和mPEG-PLGA-CTD胶束溶液尾静脉给药后,在肿瘤组织的各个层面均可检测到CTD,胶束组肿瘤内、中、外层的AUC分别为2373.47、2947.06、3813.03μg/L*h,原药组肿瘤内、中、外层的AUC分别为1235.04、2289.94、2752.68μg/L*h;药物在肿瘤内、中、外层中的总体靶向效率分别为19.70、24.47、31.66。比对法显示:mPEG-PLGA-CTD胶束组较CTD原药组,药物在肿瘤各层面中的分布量均有一定程度的增高,且肿瘤最外层的分布最高,其次是中层,最后是内层。结果表明mPEG-PLGA-CTD胶束能够增强药物在肿瘤组织的渗透性,增强药物在肿瘤部位的富集,从而减少药物在其他部位的分布,降低其毒副作用,提高抗肿瘤疗效。综上所述,mPEG-PLGA-CTD胶束能够增加药物在肿瘤部位的蓄积,改善CTD的药代动力学特征,延长药物半衰期,增加药物在血液循环中的保留时间,降低其对机体的毒副作用,提高抗肿瘤疗效。
邵丹[2]（2015）在《多功能纳米粒子在肝癌诊治一体化中的应用研究》文中指出肝癌是严重危害我国人民健康的恶性肿瘤之一，尽管以手术切除为基础、并辅助化疗、热疗等综合治疗部分改善了肝癌的治疗效果，但是肝癌患者的长期存活率仍然较低。由于大多数原发性肝癌患者的病情隐匿、潜伏期长、肿瘤生长迅速导致早期诊断困难，而且治疗后的耐药、复发和转移成为了肝癌患者死亡的主要原因。因此，早期精确诊断、提高药物的靶向性、降低治疗的毒副作用成为目前肝癌诊治的挑战。近年来，纳米技术的兴起为攻克临床上肝癌诊治的难题带来了新的机遇，而作为纳米技术和生物医学的结晶，纳米医学已成为当前最具有转化潜力的交叉学科之一。纳米药物载体是为纳米医学领域研究的热点，其中无机纳米粒子作为纳米材料领域的后起之秀，以其独特的纳米结构和性能以及良好的稳定性、高产量、低成本等优势备受纳米医学工作者的关注。目前整合了诊断和治疗特点的多功能纳米平台引起了研究者们的广泛关注，此类多功能无机纳米材料须具备以下三个特点：（1）通过多种分子影像学手段实现对肿瘤的早期精确诊断。（2）联合多种治疗手段协同治疗肿瘤，在提高治疗效果的同时降低副作用。（3）对药物的肿瘤靶向运输、释放和治疗效果进行实时示踪，指导并调整给药剂量，实现肿瘤的个体化治疗。基于无机纳米材料的上述优点，本博士论文紧绕改善肝癌诊治效果这一中心目标，针对临床肝癌诊治中早期诊断难、传统化疗毒性大、效果差以及基因治疗靶向性差三大挑战，分别以量子点和磁性介孔二氧化硅两种无机纳米粒子为基础，发展智能分子设计、纳米特性控制、靶向分子修饰等纳米药物技术，构筑高效、安全的多功能纳米平台，开发具有靶向肝癌的基因治疗和降低肝癌化疗毒副作用的新型纳米药物，揭示其选择性杀伤肝癌细胞的分子机制；利用分子影像学技术对药物在体内的运输和释放过程进行实时示踪，并对肝癌治疗效果与生物安全性进行系统性评价；终而实现肝癌的诊治一体化。本论文主要创新性研究成果概括如下：（1）为了实时示踪HSV-TK/GCV自杀基因系统，我们成功的将量子点偶联TK基因，证实生物偶联既不影响量子点的发光特性，也不影响TK基因的生物学活性，实时示踪发现TK基因于转染24h进入胞核并表达TK蛋白，确定24h为GCV的最佳给予时间，并在体内外成功对HSV-TK/GCV自杀基因系统的抗肝癌效果进行监测，提示量子点可以作为示踪HSV-TK/GCV自杀基因系统的理想载体。（2）为了实现自杀基因的靶向肝癌治疗，我们成功构筑叶酸脂质体担载量子点自杀基因复合体（FL/QD-TK），证实其可在体外靶向和选择性杀伤叶酸受体高表达肝癌细胞，并可在体内外可视化示踪TK基因运输和治疗效果，同时具备了较好的生物安全性，提示FL/QD-TK作为一种潜在的高效低毒的纳米基因药物有望应用于肝癌的诊治一体化。（3）为了驾驭镉系量子点的生物毒性用于肝癌治疗，我们成功的制备出量子点脂质复合体（QD-LC），证实其可通过巨胞饮途径大量内吞进入肝癌细胞产生大量的ROS，通过线粒体依赖的Caspase凋亡途径选择性杀伤肝癌细胞。QD-LC还可抑制肝癌微小瘤灶的形成，并在实现肝癌荷瘤有效治疗的同时具备了较好的生物安全性，提示可利用镉系量子点内源性毒性实现肝癌的选择性治疗。（4）为了提高化疗药物治疗肝癌的有效性并降低毒副作用，我们通过优化反应条件制备出粒径合适、形貌均一的Janus型磁性介孔二氧化硅纳米粒子（M-MSNs），担载化疗药物DOX得到的Janus型M-MSNs-DOX具备了外加磁场介导的作用，证实Janus型M-MSNs-DOX可在体内外实现选择性肝癌治疗的效果，并具备了较好生物安全性。我们还证实外加磁场可增强Janus型M-MSNs-DOX的肝癌细胞内吞作用和在肿瘤部位的富集，且不影响其生物安全性。最后我们在体内外成功实现了肝癌诊治一体化的目标，提示Janus型M-MSNs有望解决肝癌化疗靶向性差、毒副作用大的弊端，实现肝癌的诊治一体化。综上所述，本论文通过构筑多功能纳米诊治平台，对肝癌靶向自杀基因治疗的监测、利用纳米毒性选择性治疗肝癌以及实现高效低毒的肝癌化疗策略进行了系统而又深入的研究，不仅成功实现了肝癌的诊治一体化，也为早日实现肝癌的早期诊断和个体化治疗提供新方法和新思路。
邓向亮[3]（2015）在《枸杞多糖增强阿霉素抗小鼠肝癌的作用研究》文中认为一、研究目的肝癌在我国肿瘤发病率和死亡率排名中高居前三位,患病人数和死亡人数占全球的一半左右,素有“癌症之王”之恶名。手术、局部消融是肝癌早期的最佳治疗方式,然多数病人确诊时已处于晚期阶段,化疗成为主要治疗手段之一,但是目前肝癌治疗仍然缺乏特效药物。肝癌是多种因素综合作用下形成的,癌细胞通过多种方式或信号通路得以不断增殖和转移,而且肿瘤组织微环境错综复杂,使得单一治疗方式或药物不能有效控制肝癌发展,因此探寻多手段、多药物联合治疗成为肝癌治疗的新策略。阿霉素是肝癌细胞敏感的少数化疗药物之一,但会引起骨髓、免疫抑制为主的毒副反应,减轻其毒副反应有助于增强抗肿瘤免疫应答从而有助于提高肝癌治疗效果。从中药枸杞中提取的枸杞多糖具有增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学效应,而且还有减轻放化疗骨髓抑制的作用。现有研究提示枸杞多糖兼具抗肿瘤和化疗保护剂的功能,具有减轻阿霉素免疫毒性、增强其抗肝癌作用的潜能。然而中药多糖是从中药提取的由一系列不同分子量多糖组分组成的混合物,不同分子量多糖组分可能具有不同的生物学活性,枸杞多糖抗肿瘤和免疫调节作用的主要活性组分及作用机制尚未清楚,这也有待进一步研究。因此本研究的主要目的在于:（1）分析不同分子量枸杞多糖组分抗肿瘤和免疫调节活性,以筛选枸杞多糖中具有抗肿瘤和免疫调节作用的主要活性组分。（2）探讨枸杞多糖抑制小鼠肝癌移植瘤生长的免疫学机制。（3）在上述基础上验证枸杞多糖是否能改善阿霉素化疗引起的免疫抑制状态,以增强其抗小鼠肝癌的疗效。二、研究方法与结果1.枸杞多糖组分紫外、红外光谱及LPS含量分析本实验采用紫外光谱扫描法对5种不同分子量的枸杞多糖组分（LBP-1、LBP-2、LBP-3、LBP-4和LBP-5）中核酸和蛋白质进行定性分析;采用红外光谱扫描法分析多糖组分中糖苷键构型及其它官能团情况;采用ELISA试剂盒检测多糖组分中LPS含量。结果表明,5种多糖组分都含有蛋白质而没有核酸;5种多糖组分都出现了多糖官能团的红外吸收峰,LBP-2/3/5的糖苷键为α构型,LBP-4中α、β构型均有,而LBP-1则无法判断。5种多糖组分都未见检出LPS。2.枸杞多糖抗肿瘤与免疫调节作用活性组分的筛选2.1不同分子量枸杞多糖对小鼠肝癌细胞H22增殖的影响采用MTT法检测细胞活性,流式计数分析细胞增殖情况,Annexin V/PI试剂盒检测细胞凋亡,罗丹明（Rho123）染色检测细胞膜电位,PI染色分析细胞周期。结果发现不同分子量枸杞多糖均能降低H22细胞活性,抑制其增殖,其中LBP-3作用最显着。进一步研究发现LBP-3可以剂量依赖性地抑制H22细胞周期使其停滞在S期,同时使细胞线粒体膜电位下降,从而引起细胞凋亡。2.2不同分子量枸杞多糖组分对小鼠淋巴细胞功能的影响采用MTT法检测不同分子量枸杞多糖对细胞活性的影响,并结合罗丹明（Rho123）染色检测细胞膜电位。在此基础上采用流式细胞术检测不同分子量枸杞多糖对淋巴细胞表达CD69分子的影响,利用CFSE标记淋巴细胞后检测细胞增殖情况。最后通过CBA技术检测了不同分子量枸杞多糖对淋巴细胞分泌细胞因子的影响。实验结果表明本实验条件下不同分子量枸杞多糖不会抑制淋巴细胞活性,相反LBP-3、LBP-4、LBP-5具有提高淋巴细胞活性的作用。LBP-2和LBP-4对淋巴细胞线粒体膜电位无明显影响,而LBP-3和LBP-5各剂量组细胞膜电位均高于对照组。LBP-2不能提高淋巴细胞CD69表达水平,LBP-3/4/5能不同程度提高淋巴细胞各亚群CD69表达率,其中LBP-3表现出较强的活性;深入分析发现LBP-3虽然对T细胞中CD4-CD3+T细胞、CD4+CD3+T细胞都有作用活化作用,但对CD4-CD3+T细胞作用更明显。LBP-3、LBP-5可以剂量依赖性地刺激淋巴细胞增殖,其中LBP-3作用最强,而LBP-2和LBP-4未见刺激淋巴细胞增殖。进一步分析发现LBP-3、LBP-5主要刺激CD19+B细胞增殖,对CD3+T细胞的增殖无显着促进作用。在实验浓度下LBP-3可以剂量依赖性地刺激淋巴细胞释放IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ（P<0.001）,但是未见显着刺激淋巴细胞释放IL-2和IL-4。2.3不同分子量枸杞多糖组分对小鼠巨噬细胞功能的影响将巨噬细胞（RAW264.7）与不同分子量枸杞多糖共孵育24h,采用流式细胞术检测CD14、CD86、MHC-Ⅱ表达水平;采用Griess试剂检测巨噬细胞释放NO含量;RT-PCR检测一氧化氮合成酶mRNA表达水平;利用荧光探针DCFH-DA检测巨噬细胞内活性氧（ROS）生成水平;在此基础上采用CBA技术检测巨噬细胞释放细胞因子IL-6、TNF、IL-10水平;利用荧光显微技术观察巨噬细胞对荧光微球的吞噬作用,并采用流式细胞术对吞噬微球数量进行定量分析。实验结果显示LBP-2、LBP-3、LBP-4和LBP-5都可以显着提高巨噬细胞表面CD86、MHC-Ⅱ分子表达水平,其中LBP-3、LBP-4和LBP-5作用最强;LBP-3可以剂量依赖性地提高RAW264.7表面CD14表达强度、CD86和MHC-Ⅱ分子表达水平。LBP-3、LBP-4和LBP-5可以显着刺激RAW264.7细胞和小鼠原代腹腔巨噬细胞释放NO,其中LBP-3促NO分泌作用最强。进一步分析发现LBP-3显着提高巨噬细胞一氧化氮合成酶mRNA表达水平,其刺激巨噬细胞释放NO具有剂量-时间依赖性,。LBP3、LBP4、LBP5均能显着提高巨噬细胞活性氧生成量,与Control组比较差异具有统计学意义,而LBP-2未见此作用。LBP-3可以剂量依赖性地刺激巨噬细胞释放IL-6、TNF,在较高浓度时还可以促进细胞释放IL-10。此外,实验结果还显示LBP-3可以剂量依赖性地提高巨噬细胞吞噬功能,表现为经其处理过的巨噬细胞吞噬2个以上荧光微球的巨噬细胞数量显着增加,巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数均明显提高,与Control组比较差异具有统计学意义。2.4不同分子量LBP组分对小鼠肝癌移植瘤生长的影响BALB/C小鼠腋下接种H22细胞以构建肝癌移植瘤模型,分别采用LBP-1、LBP-2、LBP-3、LBP-4、LBP-5按剂量250mg/kg对小鼠进行治疗,或者采用不同剂量LBP-3对肝癌小鼠进行治疗,小鼠每天灌胃1次,连续十天。每天观察小鼠生活状态,实验结束后剥离肿瘤称重、计算抑瘤率;分离胸腺和脾脏以计算器官指数;取外周血检测白细胞数量;采用ELISA试剂盒检测血清中IL-2,IL-10,IFN-γ含量。结果表明LBP-3有效改善肝癌小鼠生活状态;在5个多糖组分中LBP-3能明显抑制小鼠移植瘤生长,表现为该组小鼠肿瘤质量显着减少,与模型组的比较差异具有统计学意义,肿瘤抑制率为37.97%,远高于其他多糖组分。不同分子量枸杞多糖处理的荷瘤小鼠脾和胸腺指数与模型组的比较均无显着差异,相反具有不同程度提高小鼠胸腺指数的趋势。LBP-2、LBP-5组小鼠血清中IL-2含量较模型组的高,而LBP-1、LBP-3组较模型组低,差异均有统计学意义。LBP-3组IL-10分泌水平明显低于模型组,然而LBP-5组的却显着高于模型组。LBP-3、LBP-5两组血清IFN-γ的含量显着低于模型组。进一步的研究发现不同剂量LBP-3对肝癌小鼠移植瘤均有不同程度的抑制作用,呈现剂量依赖性效应,LBP-3对荷瘤小鼠胸腺和骨髓无抑制作用,相反在一定剂量下可以改善荷瘤小鼠胸腺和骨髓抑制状态,增加外周血白细胞数量。33.从免疫学角度探讨枸杞多糖抑制小鼠肝癌发展的机制BALB/C小鼠腋下接种H22细胞以构建肝癌移植瘤模型,采用剂量250mg/kg的LBP-3进行干预,并设立正常对照和模型组。采用流式细胞术检测细胞表面CD3/CD19/CD8/CD4/CD69/PD-1/CD25分子表达水平;采用ELISA试剂盒检测血清TGF-β含量;将经CFSE标记的H22细胞与肝癌小鼠脾、肿瘤引流淋巴结（TDLN）淋巴细胞、腹腔巨噬细胞共孵育,流式检测H22细胞PI阳性比例。实验结果表明LBP-3显着提高肝癌小鼠外周血、TDLN和肿瘤组织CD3+T细胞比例。进一步分析发现在荷瘤小鼠外周血和TDLN中,CD8+T细胞和CD4+T细胞在T细胞中的比例没有发生变化,LBP-3也未见改变小鼠上述部位T细胞亚群的比例。然而,LBP-3可以增加荷瘤小鼠肿瘤组织CD8+T细胞比例,显着提高CD4+T细胞比例（P<0.001）。LBP-3显着提高肿瘤组织T细胞活化水平,通过进一步分析发现,LBP-3可以显着提高肝癌小鼠TDLN中CD8+T细胞和肿瘤组织中CD8-CD3+T细胞表达CD69分子的水平。LBP-3显着降低肝癌小鼠TDLN和肿瘤组织中CD3+T细胞表达PD-1分子比例。LBP-3可以明显下调TDLN和肿瘤组织中PD-1+CD25-CD4+Tregs比例,并且同时显着降低肿瘤组织中PD-1-CD25+CD4+Tregs的比例。LBP-3可以下调肝癌小鼠血清TGF-β1水平,与模型组比较差异具有统计学意义。进一步分析发现LBP-3显着增强肝癌小鼠脾细胞（主要是NK）、TDLN细胞（主要是CTL）和巨噬细胞杀伤H22细胞的功能,使得H22细胞死亡率明显高于模型组。4.LBP-3增强阿霉素抗小鼠肝癌移植瘤生长的作用研究4.1 LBP-3对阿霉素化疗小鼠免疫功能的影响采用腹腔注射阿霉素（5mg/kg）的方法构建阿霉素化疗小鼠模型,使用LBP3 250mg/kg、50 mg/kg进行干预治疗10天。每天记录小鼠体重及小鼠生存情况,观察小鼠活动状态、毛色、大便性质等一般情况。采用流式细胞术计数外周血白细胞相对数;分离胸腺计算小鼠胸腺指数;将小鼠脾细胞与CFSE标记的H22细胞共孵育24、48h,采用流式细胞术检测PI阳性的H22细胞比例以考察NK细胞杀伤功能。取正常对照组、Dox组和LBP-3 250 mg/kg组小鼠骨髓细胞进行细胞周期检测。实验结果LBP-3可以显着改善阿霉素化疗小鼠生活状态,促进小鼠体重恢复正常。LBP-3可以改善Dox诱导的小鼠胸腺和骨髓抑制状态,提高小鼠胸腺指数、促进小鼠外周血淋巴细胞数量恢复的作用。Dox化疗对小鼠NK细胞杀伤活性具有抑制作用,LBP-3两剂量组小鼠NK细胞杀伤活性基本恢复正常,表现为均较Dox组的显着提高,而与正常组的比较均无统计学意义,实验结果提示LBP-3具有改善Dox化疗小鼠NK细胞抑制状态的作用。4.2 LBP-3对阿霉素抗小鼠肝癌的影响BALB/C小鼠腋下接种H22细胞以构建肝癌移植瘤模型,分为模型组、阿霉素单独处理组、LBP-3 250mg/kg单独处理组及阿霉素与LBP-3联合处理组,小鼠ip阿霉素5mg/kg/次共2次,灌胃给予LBP-3连续10天。每天称取并记录小鼠体重,观察小鼠活动状态、毛色、粪便性状、生存情况等一般状况。实验结束时剥离肿瘤称重并计算抑瘤率;分离胸腺胸腺计算胸腺指数;采用流式细胞术对外周血淋巴细胞及其亚群相对细胞术进行检测;分别取ConA、LPS刺激脾淋巴细胞,流式计数细胞相对数,计算细胞增殖指数;将小鼠脾细胞、TDLN细胞与CFSE标记的H22细胞共孵育36h,采用流式细胞术检测PI阳性的H22细胞比例以考察NK细胞和CTL杀伤功能。实验结果显示LBP-3有效改善阿霉素化疗小鼠生活状态,表现为毛发光泽、活动状态、粪便性质较阿霉素单独处理组有所改善。与模型组比较,Dox、LBP-3、Dox和LBP-3联合处理组小鼠肿瘤质量均明显下降,差异均有统计学意义。在三个药物处理组中,Dox和LBP-3联合处理组小鼠肿瘤质量低于Dox和LBP-3单独处理组,差异具有统计学意义,其抑瘤率为79.06%,显着高于其他两组。在本实验条件下LBP-3未见显着改善Dox诱导的肝癌小鼠胸腺抑制状态,但可以改善小鼠骨髓抑制状态,表现为Dox和LBP-3联合处理组小鼠外周血总淋巴细胞及其各亚群淋巴细胞相对计数均较Dox组升高,其中总淋巴细胞、CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD8+CD3+T细胞和CD8-CD3+T细胞相对计数与Dox组的比较差异具有统计学意义。LBP-3可以提高Dox化疗肝癌小鼠T细胞增殖能力但对B细胞增殖能力没有影响。Dox组小鼠脾细胞杀伤功能明显下降,与模型组比较差异具有统计学意义。LBP-3单独处理组及LBP-3和联合Dox处理组小鼠脾细胞杀伤功能显着高于Dox组,差异均有统计学意义。此外实验还显示,Dox组小鼠CTL杀伤活性与模型组的比较并没有显着差异,而LBP-3组、LBP-3和Dox联合处理组CTL活性均高于Dox组,且差异均有统计学意义。三、结论综合上述实验结果,本研究得到以下结论:3.1 LBP-3是LBP中抗肿瘤和免疫调节作用的主要活性组分:体外实验结果表明LBP-3可以直接抑制小鼠肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡,同时可以促进淋巴细胞和巨噬细胞活化,分泌多种细胞因子;体内抑瘤实验结果显示相对枸杞多糖其他分子量组分,LBP-3显示出较高的抑制小鼠肝癌移植瘤生长的活性。体内外实验结果表明LBP-3是枸杞多糖中抗肿瘤和免疫调节的主要活性组分。33.2抑制肿瘤免疫抑制微环境形成,增强抗肿瘤免疫效应是LBP-3抑制小鼠肝癌移植瘤生长的免疫学机制LBP-3可以下调肝癌小鼠TDLN和肿瘤组织中T细胞PD-1分子表达水平,降低PD-1+CD25-CD4+Tregs和PD-1-CD25+CD4+Tregs比例,增强脾细胞（主要是NK）、TDLN细胞（主要是CTL）和巨噬细胞抗肿瘤活性,结果提示通过抑制肿瘤免疫抑制微环境形成,增强抗肿瘤免疫效应是LBP-3抑制小鼠肝癌移植瘤生长的免疫学机制。3.3 LBP-3在阿霉素抗小鼠肝癌中具有减毒增效的作用研究表明LBP-3可以有效改善阿霉素化疗导致的小鼠骨髓和免疫抑制状态;与阿霉素联合应用可以明显增强其抗肿瘤作用,这可能与增强阿霉素化疗肝癌小鼠抗肿瘤免疫功能有关。
李艳红[4]（2014）在《熊果酸抗肿瘤及作为小鼠肝癌细胞疫苗佐剂的作用研究》文中认为恶性肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一。目前主要的治疗方法包括手术、化疗和放疗等，但其毒副作用大，疗效差。因此，寻找毒副作用小、安全、高效的肿瘤治疗方法是目前肿瘤研究的重要趋势。熊果酸（Ursolic acid，UA）是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物，具有多种生物学功效。近年来研究发现熊果酸具有抗肿瘤及增强机体免疫功能作用。目前，其具体的抗肿瘤作用机制并不明确。本文研究了熊果酸体外抗肿瘤作用机制，体内肿瘤免疫调节作用及作为佐剂的肿瘤免疫预防作用，为熊果酸在抗肿瘤领域深入的应用开发提供可靠的实验依据。论文主要研究内容及结论如下：1.熊果酸对宫颈癌细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用研究目的探讨熊果酸对体外培养宫颈癌细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用。方法MTT法测定熊果酸对HeLa细胞增殖的影响；流式细胞术分析熊果酸作用HeLa细胞后细胞周期的变化及细胞凋亡情况；Western blot检测熊果酸作用HeLa细胞后caspase-3，caspase-8，caspase-9，cytochrome c，Bcl-2，Bcl-xL，Bak，Bax蛋白表达。Real-time PCR检测了熊果酸对宫颈癌HeLa和Siha细胞中HPV E6和E7基因的表达。结果熊果酸抑制HeLa细胞增殖呈浓度依赖性，40μM熊果酸作用48h后细胞增殖抑制率高达91.80±3.26%，IC50值为9.54±3.51μM。流式细胞术测定结果显示熊果酸阻滞HeLa细胞周期在G0/G1期，40μM作用48h效果最显着。熊果酸诱导HeLa细胞凋亡呈浓度依赖性，40μM和60μM作用48h后，细胞早期凋亡率分别为74.30±5.26%和83.87±2.27%，显着高于对照组2.20±1.15%（P<0.01）。Western blot结果显示UA作用HeLa细胞引起caspase-3和caspase-9激活，可观察到剪切形式的caspase-3和caspase-9出现；细胞质中cytochrome c蛋白表达量增加；Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达水平降低，Bax和Bak蛋白表达水平增加，均呈一定的时间依赖性。Procaspase-8蛋白表达量也降低，但未检测到剪切形式的caspase-8条带。Real-time PCR结果显示宫颈癌HeLa和SiHa细胞中HPV E6基因的表达量均显着降低（P<0.01），E7基因的表达未出现显着性改变。表明，熊果酸在体外对宫颈癌细胞有较好的增殖抑制活性，可以通过诱导细胞凋亡达到体外抗肿瘤作用，对其抗凋亡途径的研究表明UA可以通过线粒体途径诱导宫颈癌细胞凋亡。UA抗宫颈癌的靶点可能在于能够抑制HPV病毒E6基因的表达和促进细胞凋亡的发生。2.熊果酸诱导HeLa细胞凋亡中MAPK信号通路作用及细胞因子的变化目的熊果酸诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制并不清楚。本文探讨了MAPK信号通路在熊果酸诱导HeLa细胞凋亡中的作用及细胞凋亡中细胞因子变化。方法Western blot检测了不同浓度熊果酸作用HeLa细胞48h后MAPK信号通路中p38，p-p38，ERK，p-ERK，JNK，p-JNK蛋白的表达； ERK1/2抑制子U0126对ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响和p38抑制子SB203580对p38，p-p38蛋白表达的影响；U0126和SB203580对细胞凋亡相关Bax、Bcl-2、caspase-3、cytochrome c蛋白表达的影响；Real-time PCR检测了熊果酸对DUSP基因表达的影响；ELISA检测熊果酸作用HeLa细胞培养液中IL-2、IL-4细胞因子含量。结果熊果酸降低p-ERK1/2和p-p38蛋白的表达，呈浓度依赖性，对p-JNK蛋白的表达无改变；ERK1/2抑制子U0126显着增强熊果酸诱导Bax/Bcl-2比率与熊果酸组比较（P<0.05），增强线粒体cytochrome c的释放和剪切的Caspase-3蛋白的表达；p38抑制子SB203580作用效果不明显。Real-time PCR结果显示熊果酸增强DUSP1,2,4,5,6,7,9,10基因的表达。ELISA结果显示熊果酸改变细胞培养液中细胞因子的分泌但无规律性。表明，ERK1/2信号通路参与熊果酸诱导的细胞凋亡，熊果酸可能通过增强DUSPs基因表达，抑制ERK1/2和p38磷酸化来诱导细胞凋亡，同时能够通过改变细胞因子的分泌调控细胞凋亡。3.熊果酸对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制及免疫调节作用目的探讨熊果酸对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用及免疫功能的影响。方法体外细胞培养，MTT法检测熊果酸对H22细胞的增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡作用；建立H22荷瘤小鼠动物模型，根据小鼠体重，进行区组随机化分组，共分为模型组、环磷酰胺组（CTX，25mg/kg.d）、熊果酸高（40mg/kg.d）、中（20mg/kg.d）和低剂量（10mg/kg.d），腹腔注射连续给药15天后处死小鼠，计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数，MTT法检测T、B淋巴细胞增殖能力，流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞亚群含量及比例，ELISA法检测白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-4（IL-4）的表达量。结果体外熊果酸对H22细胞生长的增殖抑制呈浓度依赖性，最高抑制率达75.27±3.36%；诱导H22细胞凋亡呈时间依赖性，20μM作用48h后的凋亡率为36.4%±0.2，与对照0.9%±0.1比较，存在极显着性差异（P<0.01）。在体内，与模型组相比，高剂量的熊果酸可显着抑制肿瘤生长（P<0.01），降低荷瘤鼠异常增大的脾指数（P<0.05）；高剂量熊果酸可显着增强T、B淋巴细胞增殖能力（P<0.01），显着提高淋巴细胞亚群CD4+T细胞表达及CD4+/CD8+T细胞亚群比例（P<0.01），对CD8+T细胞表达作用不明显（P>0.05）；高剂量熊果酸促进血清IL-2、TNF-α表达（P<0.05），降低IL-4表达（P<0.01）。表明，熊果酸可抑制H22肿瘤细胞生长，在体内可以提高荷瘤小鼠的免疫能力，其抗肿瘤作用可能与其免疫调节作用相关。4.熊果酸增强小鼠肝癌细胞免疫原性的作用目的探讨熊果酸作为免疫佐剂对小鼠肝癌肿瘤疫苗免疫原性的增强作用。方法UA和H22细胞共培养，制备肝癌细胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，观察肿瘤生长曲线，记录小鼠存活情况，MTT法测定脾淋巴细胞增殖能力，ELISA法测定血清IL-2、IL-4细胞因子含量，流式细胞术测定CD4+、CD8+T细胞亚群百分率，免疫荧光法测定血清中抗肿瘤特异性抗体的产生，ELISA法测定特异性抗体的水平，Western blot检测血清特异性抗体结合能力。结果免疫小鼠后，与模型组相比，荷瘤小鼠肿瘤的生长明显抑制（P<0.05），小鼠的生命延长率明显高于模型组（P<0.01）；与模型组相比，T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力显着升高（P<0.01），CD4+/CD8+T细胞含量比例明显升高（P<0.01），血清中细胞因子IL-2、IL-4含量明显升高（P<0.01）。免疫鼠血清可检测到较高水平特异性抗体，抗体亚型IgG2a/IgG1比值明显升高（P<0.01）；Western blot出现四条大小约为95kDa、60kDa、50kDa和34kDa杂交条带。表明，UA作为佐剂能够提高小鼠H22肝癌细胞疫苗的免疫原性，增强小鼠抗肿瘤细胞免疫和体液免疫能力。综上所述，熊果酸能够通过线粒体内源性途径诱导宫颈癌细胞凋亡，ERK1/2信号通路在该过程中发挥重要作用。熊果酸能够提高H22荷瘤小鼠的免疫调节能力，激发小鼠对肿瘤生长的抑制作用。熊果酸能够促进H22肝癌细胞产生免疫原性，激发正常小鼠强烈且长效的抗肝癌免疫保护作用，熊果酸在保护性抗原制备中可能起到了免疫佐剂的作用。该研究为熊果酸作为抗肿瘤药物及肿瘤疫苗免疫佐剂的开发提供了良好的理论基础。
金洲祥,王向昱[5]（2013）在《三氧化二砷联合5-氟尿嘧啶对小鼠肝癌H22细胞株的抑制作用》文中认为目的:探讨三氧化二砷（As2O3）联合5-氟尿嘧啶（5-FU）对小鼠肝癌H22细胞株的抑制作用,为提高治疗肝癌的临床效果、降低毒性和克服耐药提供实验依据。方法:采用MTT法检测不同浓度（终浓度为0.5、1.0、2.0μg/mL）的As2O3、5-FU（终浓度为20 mg/L）和以上各浓度As2O3联合5-FU体外作用于小鼠肝癌H22细胞24、48、72 h后对细胞增殖的影响,并计算细胞生长抑制率和两药物相互作用系数（CDI）;采用TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡,观察各组细胞凋亡情况并计算凋亡率。结果:体外As2O3或5-FU单药对小鼠肝癌H22细胞有显着抑制增殖及诱导凋亡的作用,并呈一定的时间、浓度依赖性。As2O3联合5-FU对小鼠肝癌H22细胞的抑制增殖及诱导凋亡作用较同时间内相应单药组效果明显提高。计算两药CDI值,各浓度As2O3与5-Fu联合作用H22细胞24和48 h时,均为CDI<1,作用72 h时,均为CDI=1,说明两者在48 h内具有协同作用,72 h时为相加作用。结论:体外As2O3和5-FU对小鼠肝癌H22细胞有明显地抑制增殖和诱导凋亡作用,并且呈时间和剂量依赖性;联合应用较单药效果明显增强,在48 h内两药具有协同作用,72 h时两药作用相加。
张志明,冯钟煦,周敏,刘剑勇,赵荫农,张春燕,唐凯,吕丽琼,罗善超[6]（2013）在《小鼠肝癌全细胞抗原致敏骨髓DC激活TIL抗癌机制的研究》文中指出目的:通过分析小鼠肝癌H22细胞全细胞性抗原致敏小鼠骨髓树突状细胞（DC）前后DC表型变化及其分泌细胞因子的变化,探讨肝癌细胞全细胞性抗原致敏DC激活肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）的抗癌机制。方法:取得小鼠骨髓细胞并诱导生成DC,用冻融法制备的小鼠肝癌H22细胞全细胞抗原致敏,然后用已致敏的DC激活TILs,测定DC致敏前后DC表面抗原CD80、CD86、CD40和MHCⅡ表达变化及DC分泌细胞因子IL-12、IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平,评估激活前后TIL对H22细胞的杀伤活性,同时以小鼠脾淋巴细胞作为杀伤对照。结果:致敏后小鼠骨髓DC表面抗原CD80、CD86、CD40和MHCⅡ表达率分别为（57.55±7.32）%、（54.49±14.20）%、（46.79±8.25）%和（53.94±13.94）%,明显高于未致敏DC的（20.01±5.22）%、（24.56±9.08）%、（18.06±5.13）%和（30.24±8.39）%,P值均<0.05;DC上清液中IL-12、IL-2、IFN-γ和TNF-α浓度分别为（80.40±1.33）、（94.67±3.36）、（29.83±1.20）和（75.01±4.10）ρg/mL,明显高于未致敏DC的（19.35±0.99）、（11.25±0.50）、（1.05±0.09）和（2.02±0.27）ρg/mL,P值均为0.000。经致敏后成熟DC激活的TIL对H22细胞杀伤率为（81.80±2.90）%,明显高于未激活TIL、激活或未激活小鼠脾淋巴细胞的（62.64±3.94）%、（47.35±3.40）%和（28.45±2.56）%。结论:H22细胞全细胞抗原致敏DC后,其表型变化及细胞因子分泌增多是其诱导活化TIL抗癌活性的可能机制。
吴丹[7]（2013）在《蛹虫草炮制汤剂体系表征及抗肿瘤研究》文中提出目前,从天然产物中提取分离的单组分物质是抗肿瘤药物的重要来源,已广泛应用于肿瘤的治疗。蛹虫草是天然的药食兼用真菌,类似于名贵中药冬虫夏草,具有广泛的药理活性,虫草素是其重要的活性组分之一,但虫草素进入体内容易被腺苷脱氨酶降解为无活性的物质,使其药效大大降低。为了解决虫草素在体内易降解的问题,通过炮制蛹虫草,研究蛹虫草汤剂理化性质,初步探究其抑制肿瘤作用机制,为虫草素的开发利用提供参考。本文通过中药炮制方法制备了蛹虫草汤剂,采用酶标仪测定蛹虫草炮制过程汤剂吸光值变化,原子力显微镜观察蛹虫草汤剂体系颗粒物,激光粒度仪测定汤剂体系颗粒数量、粒径、均一度和体系Zeta电位,液相色谱法测定汤剂体系物质及虫草素含量变化。实验结果表明,蛹虫草炮制过程发生美拉德反应,形成纳米级颗粒,炮制60min汤剂体系最稳定、颗粒数量最多、颗粒集中分布：蛹虫草汤剂体系呈现pH值响应,汤剂随pH值的变化胶体颗粒具有包埋和释放分子的能力。采用MTT法探究蛹虫草汤剂和虫草素对人不同肿瘤细胞（肝癌细胞HepG-2、肾癌细胞NCI和白血病细胞K562）和小鼠肝癌细胞H22细胞毒性作用,并对人肝癌细胞HepG-2和小鼠肝癌细胞H22增殖抑制作用试验。实验结果表明,蛹虫草汤剂和虫草素对HepG-2、NCI、K562和H22肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用；对人肝癌HepG-2细胞和小鼠肝癌H22细胞具有生长抑制作用,并呈现明显的剂量和时间依赖性,作用时间越长或浓度越高抑制效果愈好。蛹虫草汤剂对肿瘤细胞的抑制效果好于好于纯虫草素。采用倒置显微镜、吉姆萨染色或瑞氏.吉姆萨染色、吖啶橙/溴化乙锭染色法等观察细胞形态结构,琼脂糖凝胶电泳分析肿瘤细胞DNA降解情况,流式细胞仪分析细胞周期和胞内游离钙离子含量。实验结果表明,蛹虫草汤剂和虫草素均能诱导人肝癌细胞HepG-2和小鼠肝癌细胞H22形态结构呈现一系列凋亡特征,DNA电泳图谱呈现典型的DNA ladder条带,细胞周期阻断在G2/M期,其中H22细胞出现“亚G1期”峰即凋亡峰,细胞内游离钙离子浓度升高。蛹虫草汤剂和虫草素对人肝癌HepG-2细胞和小鼠肝癌H22细胞的抑制作用是通过诱导促进细胞凋亡的途径来实现,蛹虫草汤剂诱导肿瘤细胞凋亡效果好于纯虫草素。构建小鼠肝癌H22实体瘤和腹水瘤小鼠模型,观察蛹虫草汤剂和虫草素对小鼠肿瘤的抑制作用,通过小鼠脾脏指数和胸腺指数反应其对免疫器官的影响,采用苏木精-伊红染色观察肿瘤组织病理形态的变化。实验结果表明,蛹虫草汤剂和虫草素对小鼠肝癌H22实体瘤具有不同程度的抑制作用,均能增强小鼠的免疫力,但蛹虫草汤剂作用效果好于虫草素；实体瘤组织呈现凋亡病理学特征；对小鼠肝癌H22腹水瘤生存寿命有一定的延长作用,并对肿瘤小鼠无明显的毒副作用,汤剂作用效果略好于虫草素。蛹虫草汤剂通过诱导H22肿瘤细胞凋亡和增强肿瘤小鼠免疫力进行体内抗肿瘤抑制作用,但蛹虫草汤剂作用效果好于虫草素。综上所述,蛹虫草炮制汤剂是一个美拉德反应胶体体系,形成的胶体颗粒稳定了虫草素的结构,使其在体内不容易被降解。蛹虫草汤剂抗肿瘤作用效果好纯虫草素,蛹虫草汤剂在一定程度上提高了虫草素的药效。
丁毅[8]（2012）在《靶向小鼠肝癌干/祖细胞免疫治疗的实验研究》文中研究表明研究背景：现有研究表明，肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展的重要根源之一。虽然手术、放疗和化疗等方法能够有效清除实体肿块或减低肿瘤负荷，取得了一定临床疗效。但肿瘤干细胞的自我更新、高增殖和耐化疗药等自我保护的特性，使得常规手段难以清除组织、血液等机体内残留的肿瘤干细胞，成为肿瘤复发和转移的隐患。过继细胞免疫疗法（ACI）作为继手术、放疗、化疗之后第四大治疗措施已应用于临床肿瘤的治疗。2010年针对去势术后复发前列腺癌的DC疫苗研究与临床应用取得了中位生存期延长的历史性突破。但至今关于靶向肿瘤干细胞的治疗性研究特别是免疫治疗的报道很少。由于肿瘤干细胞与正常组织干细胞均比较原始且十分相似，免疫细胞难以识别，这给靶向肿瘤干细胞的免疫治疗提出了挑战。我们认为，肿瘤组织是由非均质细胞构成的，其中包含数量极少的干细胞和初步分化并启动增殖的祖细胞。这些进入快速细胞分裂状态、初步分化的，且保留干性的肿瘤祖细胞，对于肿瘤形成和发展具有重要的生物学意义；与原始的肿瘤干细胞相比更能被免疫细胞有效识别，具有重要的治疗意义。因此，我们假设肿瘤祖细胞可以成为肿瘤免疫治疗的特异性标靶，由其作为抗原诱导的肿瘤免疫治疗，可能阻止肿瘤的复发和转移。研究目的：利用干细胞中ALDH（乙醛脱氢酶）高表达的特性，在肿瘤细胞中分选ALDHhigh、ALDHlow及ALDHneg细胞亚群，鉴定其生物学特性，以不同干性细胞亚群作为抗原，制备DC疫苗并诱导肿瘤特异性CTLs，评价其治疗效果，为靶向肿瘤干/祖细胞的免疫治疗奠定基础。研究方法：1)以流式细胞术检测小鼠肝癌H22，人胃癌BGC-823、结肠癌LS-174T、肝癌SMMC-7721细胞以及胰腺癌SW-1990和Panc-1细胞系中ALDH+细胞的表达；2)在确定ALDH阳性表达的细胞中，以ALDH表达的高低差异，将小鼠肝癌H22细胞分选并定义为ALDHhigh、ALDHlow、ALDHneg细胞亚群；3)对分选出的小鼠肝癌H22细胞系中三种细胞亚群进行CD133&CD44表型分析；4)对分选出的小鼠H22三种细胞亚群进行细胞周期分析；5)将分选出的小鼠肝癌H22各亚群细胞在干细胞培养基中培养，观察球体形成；6)将分选出的小鼠肝癌H22各亚群细胞分别以不同数量级在小鼠背部皮下注射致瘤，观察成瘤情况并绘制生长曲线；7)分别以分选出的小鼠肝癌H22不同亚群细胞作为抗原制备小鼠CTL细胞，于H22肝癌细胞荷瘤昆明小鼠的瘤周进行注射，观察疗效，计算抑瘤率、脾指数及胸腺指数。研究结果：1)在小鼠肝癌H22细胞、人结肠癌LS-174T细胞、胰腺癌SW-1990细胞和Panc-1细胞中存在着ALDH阳性表达，而在人胃癌BGC-823细胞和肝癌SMMC-7721细胞中未见ALDH表达。2)在小鼠肝癌H22细胞中能明确分选出存在荧光差异的三群细胞即ALDHhigh，ALDHlow和ALDHneg细胞亚群。3)H22细胞的ALDHhigh，ALDHlow，ALDHneg三个亚群中CD133&CD44表达存在差异，其表达比例依次减少。4)H22细胞中ALDHhigh亚群主要处于G0/G1期，ALDHlow亚群处于S期，而ALDHneg亚群则处于G2/M期；5)ALDHhigh亚群细胞可形成细胞球体， ALDHlow和ALDHneg亚群细胞不能形成球体；6)ALDHlow亚群在接种2×102个细胞和2×104个细胞时，肿瘤的生长趋势和平均体积均高于其它两亚群。7)以ALDHlow亚群细胞作为抗原制备的小鼠CTL细胞抑瘤率达到71%，高于ALDHhigh（56%）和ALDHneg亚群细胞（51%）（P<0.01），其脾指数与胸腺指数较其它两亚群增高，但无统计学差异。研究结论：1)在小鼠肝癌H22细胞、人结肠癌LS-174T细胞、胰腺癌SW-1990细胞和Panc-1细胞中存在着ALDH阳性的肿瘤干细胞；2)在小鼠肝癌H22细胞中能明确分选出干性不同的ALDHhigh（干细胞），ALDHlow（祖细胞）和ALDHneg（终末细胞）亚群；3)小鼠肝癌H22细胞中存在的祖细胞，是肿瘤发生发展的关键亚群细胞，且以其为抗原诱导DC制备的CTL细胞具有较高的抑瘤率。
南淑蕾,吴国欣,黄鹭强,程涛,张福华[9]（2011）在《芥子碱对小鼠肝癌H22的体内抑制作用初探》文中研究说明目的:研究芥子碱对小鼠肝癌H22的体内抑制作用及其机制初探。方法:昆明小鼠接种H22细胞,分别建立腹水型肝癌H22模型和小鼠肝癌H22实体瘤模型,观察芥子碱对小鼠肝癌H22的体内抑制作用,HE染色法观察细胞形态。通过检测胸腺指数、脾脏指数探究芥子碱对小鼠免疫器官的影响,并采用丫啶橙染色观察细胞凋亡形态,琼脂糖凝胶电泳及免疫组织化学法研究芥子碱的诱导细胞凋亡机制。结果:芥子碱大、中、小剂量组对小鼠肝癌H22实体瘤的抑制率分别为40.3%、28.4%、20.8%,与NS组比较有统计学意义（P<0.05）但芥子碱对腹水型H22小鼠的生命延长率的影响则无显着提高;芥子碱组促凋亡因子Bax的表达量增加、抗凋亡因子Bcl-2的表达量减少。结论:芥子碱对小鼠肝癌H22实体瘤有显着的抑制作用,存在剂量依赖效应,且未出现明显毒副作用。免疫增强和促细胞凋亡是芥子碱实现对小鼠肝癌H22实体瘤的抑制作用的可能途径。
汪淑晶,樊建慧,于生金,张嘉宁[10]（2011）在《下调窖蛋白-1表达抑制小鼠肝癌H22细胞侵袭能力》文中提出窖蛋白-1在不同肿瘤中发挥作用不同.本研究以小鼠肝癌细胞H22为研究对象,观察下调窖蛋白-1表达对H22细胞侵袭能力的影响,并探讨其可能的分子机制.利用RT-PCR和Western印迹法检测了窖蛋白-1在H22及小鼠正常肝细胞IAR20中的表达.结果显示,窖蛋白-1在H22中的表达高于其在IAR20中的表达,提示窖蛋白-1高表达可能与H22细胞恶性表型有关.RNA干扰和凝集素印记实验结果显示,窖蛋白-1-siRNA能够有效抑制窖蛋白-1mRNA和蛋白表达,并抑制细胞表面N-聚糖β1,6GlcNAc分支形成.Transwell细胞迁移和侵袭实验结果显示,与未转染组和siRNA对照组比较,转染窖蛋白-1-siRNA的H22细胞迁移和侵袭数目明显减少.本研究证明,下调窖蛋白-1表达可抑制H22细胞表面N-聚糖β1,6GlcNAc分支形成,从而抑制细胞迁移和侵袭能力.
二、小鼠肝癌H_(22)细胞LDLR的分析研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠肝癌H_(22)细胞LDLR的分析研究（论文提纲范文）
（1）肿瘤靶向CTD聚合物胶束减毒作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 1 有毒中药及肿瘤治疗的研究现状 |
| 2 靶向制剂 |
| 3 聚合物胶束 |
| 4 CTD的研究现状 |
| 4.1 理化性质 |
| 4.2 药理作用 |
| 4.3 CTD的毒性 |
| 4.4 CTD纳米新剂型 |
| 5 有毒中药安全性评价 |
| 5.1 有毒中药的毒性分级 |
| 5.2 有毒中药毒性综合评价 |
| 6 立题依据 |
| 第二章 CTD聚合物胶束对小鼠的急性毒性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验动物及细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原药及胶束溶液的制备 |
| 2.2 CTD聚合物胶束的急性毒性实验 |
| 2.3 CTD聚合物胶束对荷瘤小鼠脏器组织的影响 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CTD聚合物胶束的急性毒性实验结果 |
| 3.2 CTD聚合物胶束对荷瘤小鼠脏器组织的影响结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 CTD聚合物胶束在荷瘤小鼠体内的药动学研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验动物及细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 建立小鼠肝癌H22 皮下移植性肿瘤模型 |
| 2.2 原药及胶束溶液的制备 |
| 2.3 CTD血浆样品GC-MS分析方法的建立 |
| 2.4 方法学考察 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 CTD聚合物胶束在荷瘤小鼠体内动态组织分布及肿瘤靶向性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验动物及细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 建立小鼠肝癌H22 皮下移植性肿瘤模型 |
| 2.2 原药及胶束溶液的制备 |
| 2.3 CTD组织样品GC-MS分析方法的建立 |
| 2.4 方法学考察 |
| 2.5 统计学处理及靶向性评价 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 荷瘤小鼠体内动态组织分布实验结果 |
| 3.2 荷瘤小鼠肿瘤靶向性实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 CTD聚合物胶束在肿瘤组织中的渗透性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验动物及细胞 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 建立小鼠肝癌H22 皮下移植性肿瘤模型 |
| 2.2 原药及胶束溶液的制备 |
| 2.3 CTD组织样品GC-MS分析方法的建立 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间参与了以下项目目录 |
| 攻读硕士学位期间参与发表的论文目录 |
（2）多功能纳米粒子在肝癌诊治一体化中的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肝癌的诊治现状 |
| 1.3 基于纳米平台的肿瘤诊治一体化 |
| 1.4 选题依据和研究思路 |
| 1.5 参考文献 |
| 第2章 量子点标记自杀基因靶向治疗肝癌的体内外研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 肝癌的自杀基因治疗 |
| 2.1.1.1 自杀基因治疗的分类及原理 |
| 2.1.1.2 HSV-TK 自杀基因治疗的应用 |
| 2.1.1.3 自杀基因治疗肝癌的挑战 |
| 2.1.2 量子点的在基因治疗中的应用 |
| 2.1.2.1 量子点的性质、修饰和标记 |
| 2.1.2.2 量子点示踪基因的运输和表达 |
| 2.1.2.3 量子点在诊治一体化的肿瘤基因治疗中的应用 |
| 2.1.3 叶酸脂质体在肿瘤基因治疗中的应用 |
| 2.1.3.1 叶酸受体的分布和性质 |
| 2.1.3.2 叶酸脂质体的特性和靶向策略 |
| 2.1.3.3 叶酸脂质体在基因治疗中的应用 |
| 2.1.4 肝癌自杀基因治疗中当前尚未解决的问题与面临的挑战 |
| 2.1.5 本部分论文的研究目的、研究内容和创新性 |
| 2.1.5.1 研究目的 |
| 2.1.5.2 研究内容 |
| 2.1.5.3 创新性 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 主要药品和试剂 |
| 2.2.1.2 仪器 |
| 2.2.1.3 试剂配制 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 CdTe/CdS 核壳 QD 的合成 |
| 2.2.2.2 JM109 感受态细胞的制备 |
| 2.2.2.3 HSV-TK 质粒的转化与提取 |
| 2.2.2.4 QD-TK 的偶联 |
| 2.2.2.5 FL/QD-TK 的制备 |
| 2.2.2.6 QD-TK 和 FL/QD-TK 的表征 |
| 2.2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.2.8 分组给药和细胞活性检测 |
| 2.2.2.8.1 细胞转染 |
| 2.2.2.8.2 CdTe/CdS 核壳量子点细胞毒性的分组和给药 |
| 2.2.2.8.3 CdTe/CdS QD-TK 联合 GCV 抗肿瘤的分组和给药 |
| 2.2.2.8.4 近红外量子点细胞毒性的分组和给药 |
| 2.2.2.8.5 近红外 QD-TK 联合 GCV 抗肿瘤的分组和给药 |
| 2.2.2.8.6 FL/QD-TK 细胞毒性的分组和给药 |
| 2.2.2.8.7 FL/QD-TK 联合 GCV 抗肝癌的分组和给药 |
| 2.2.2.8.8 MTT 法检测细胞活性 |
| 2.2.2.9 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞和治疗效果 |
| 2.2.2.9.1 激光共聚焦荧光显微镜检测 QD-TK 细胞内吞 |
| 2.2.2.9.2 激光共聚焦荧光显微镜检测 FL/QD-TK 内吞 |
| 2.2.2.9.3 激光共聚焦荧光显微镜观察 QD-TK 联合 GCV 抗肿瘤作用 |
| 2.2.2.10 流式细胞术定量检测细胞凋亡率 |
| 2.2.2.11 Western Blot 法分析 TK 蛋白表达 |
| 2.2.2.12 动物饲养和裸鼠肝癌皮下移植瘤模型的构建 |
| 2.2.2.12.1 动物饲养 |
| 2.2.2.12.2 BALB/c 裸小鼠人肝癌皮下荷瘤模型的建立 |
| 2.2.2.13 HepG2 微小瘤灶形成实验 |
| 2.2.2.14 Bel-7402 荷瘤裸鼠活体成像及生物分布检测 |
| 2.2.2.15 Bel-7402 皮下移植瘤模型的分组和给药 |
| 2.2.2.16 Bel-7402 皮下移植瘤模型的分组治疗效果和安全性评价 |
| 2.2.2.16.1 Bel-7402 皮下移植瘤模型的分组治疗效果 |
| 2.2.2.16.2 Bel-7402 皮下移植瘤模型的安全性评价 |
| 2.2.2.17 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 CdTe/CdS QD-TK 的合成和表征 |
| 2.3.2 CdTe/CdS QD-TK 的细胞毒性研究 |
| 2.3.3 CdTe/CdS QD-TK 联合 GCV 对 Hela 细胞的杀伤作用研究 |
| 2.3.4 细胞水平监测 CdTe/CdS QD-TK 对 Hela 细胞的杀伤作用 |
| 2.3.5 近红外 QD-TK 的合成、表征和细胞毒性 |
| 2.3.6 近红外 QD-TK 的细胞分布和表达研究 |
| 2.3.7 细胞水平评价和监测近红外 QD-TK 联合 GCV 抗肝癌作用 |
| 2.3.8 整体水平监测和评价近红外 QD-TK 联合 GCV 抗肝癌作用 |
| 2.3.9 FL/QD-TK 的合成和表征 |
| 2.3.10 FL/QD-TK 的细胞毒性作用检测 |
| 2.3.11 FL/QD-TK 的肝癌细胞靶向性研究 |
| 2.3.12 FL/QD-TK 联合 GCV 选择性杀伤肝癌细胞的研究 |
| 2.3.13 FL/QD-TK 体内肝癌靶向成像和生物分布研究 |
| 2.3.14 FL/QD-TK 联合 GCV 体内靶向抗肝癌作用和生物安全性研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第2章 量子点脂质复合体选择性治疗肝癌的体内外研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 镉系量子点与生物系统的相互作用 |
| 3.1.1.1 镉系量子点的暴露途径 |
| 3.1.1.2 镉系量子点的生物分布、代谢、排泄过程 |
| 3.1.1.3 镉系量子点的细胞内吞和分布 |
| 3.1.2 镉系量子点的生物毒性和分子机制 |
| 3.1.2.1 镉系量子点的细胞毒性 |
| 3.1.2.2 镉系量子点的体内毒性 |
| 3.1.2.3 镉系量子点的毒性机制 |
| 3.1.2.4 展望和小结 |
| 3.1.3 利用纳米粒子内源毒性治疗肿瘤 |
| 3.1.3.1 肿瘤细胞——微环境的同与不同 |
| 3.1.3.2 纳米粒子——打破肿瘤微环境平衡 |
| 3.1.3.3 以毒攻毒——肿瘤治疗的新策略 |
| 3.1.4 利用量子点选择性治疗肝癌当前尚未解决的问题与面临的挑战 |
| 3.1.5 本部分论文的研究目的、研究内容和创新性 |
| 3.1.5.1 研究目的 |
| 3.1.5.2 研究内容 |
| 3.1.5.3 创新性 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 主要药品和试剂 |
| 3.2.1.2 仪器 |
| 3.2.1.3 试剂配制 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 QD-LC 的合成和表征 |
| 3.2.2.2 细胞培养 |
| 3.2.2.3 分组给药和细胞活性检测 |
| 3.2.2.4 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞 |
| 3.2.2.5 流式细胞术定量检测细胞内吞 |
| 3.2.2.6 流式细胞术定量检测细胞凋亡率 |
| 3.2.2.7 ELISA 定量检测 ROS 水平 |
| 3.2.2.8 Western Blot 法分析蛋白表达 |
| 3.2.2.9 动物饲养和小鼠肝癌皮下移植瘤模型的构建 |
| 3.2.2.9.1 动物饲养 |
| 3.2.2.9.2 ICR 小鼠肝癌 H22 皮下荷瘤模型的建立 |
| 3.2.2.10 H22 微小瘤灶形成实验 |
| 3.2.2.11 激光共聚焦荧光显微镜研究 QD-LC 在 H22 皮下移植瘤重分布研究 |
| 3.2.2.12 H22 皮下移植瘤模型的分组和给药 |
| 3.2.2.13 H22 皮下移植瘤模型的分组治疗效果和安全性评价 |
| 3.2.2.13.1 H22 皮下移植瘤模型的分组治疗效果 |
| 3.2.2.13.2 H22 皮下移植瘤模型的安全性评价 |
| 3.2.2.14 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 QD-LC 的合成和表征 |
| 3.3.2 QD-LC 的细胞毒性作用研究 |
| 3.3.3 QD-LC 对细胞的内吞作用和机制研究 |
| 3.3.4 QD-LC 对杀伤肝癌细胞机制研究 |
| 3.3.5 QD-LC 对微小瘤灶生长影响的研究 |
| 3.3.6 QD-LC 对小鼠肝癌 H22 皮下移植瘤的治疗作用研究 |
| 3.3.7 QD-LC 治疗小鼠肝癌 H22 皮下移植瘤的安全性评估 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第4章 磁性介孔二氧化硅在肝癌诊治一体化中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 M-MSNs 的分类和合成 |
| 4.1.1.1 核壳 M-MSNs |
| 4.1.1.2 空心 M-MSNs |
| 4.1.1.3 卫星 M-MSNs |
| 4.1.1.4 沉积 M-MSNs |
| 4.1.2 M-MSNs 与成像 |
| 4.1.2.1 M-MSNs 与核磁共振 T1 加权成像 |
| 4.1.2.2 M-MSNs 与核磁共振 T2 加权成像 |
| 4.1.2.3 M-MSNs 与多模式成像 |
| 4.1.3 M-MSNs 与治疗 |
| 4.1.3.1 M-MSNs 用于磁靶向输送药物 |
| 4.1.3.2 M-MSNs 用于可控释放药物 |
| 4.1.3.2.1 基于磁核的 M-MSNs 磁热响应性释药 |
| 4.1.3.2.2 基于介孔表面功能化的 pH、酶、氧化还原响应性释药 |
| 4.1.3.2.3 基于 M-MSN 外表面的质子泵响应释药 |
| 4.1.3.3 M-MSNs 用于磁热治疗 |
| 4.1.3.4 M-MSNS 用于诊治一体化 |
| 4.1.4 Janus 型 M-MSNs |
| 4.1.4.1 Janus 型纳米粒子 |
| 4.1.4.2 Janus 型 M-MSNs |
| 4.1.5 肝癌化疗中当前尚未解决的问题与面临的挑战 |
| 4.1.6 本部分论文的研究目的、研究内容和创新性 |
| 4.1.6.1 研究目的 |
| 4.1.6.2 研究内容 |
| 4.1.6.3 创新性 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 主要药品和试剂 |
| 4.2.1.2 仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 Fe3O4纳米粒子的合成 |
| 4.2.2.1.1 Fe3O4纳米粒子的合成原理 |
| 4.2.2.1.2 Fe3O4纳米粒子的合成步骤 |
| 4.2.2.2 Janus 型 M-MSNs 的合成 |
| 4.2.2.2.1 Janus 型 M-MSNs 的合成原理 |
| 4.2.2.2.2 Janus 型 M-MSNs 的合成步骤 |
| 4.2.2.3 FITC 标记的 Janus 型 M-MSNs 的合成达 |
| 4.2.2.4 羧基化的 JANUS 型 M-MSNS 的合成 |
| 4.2.2.5 PEG 化的 Janus 型 M-MSNs 的合成 |
| 4.2.2.6 药物吸附、释放和浓度测定 |
| 4.2.2.6.1 DOX 吸附实验 |
| 4.2.2.6.2 DOX 释放试验 |
| 4.2.2.6.3 DOX 浓度测定 |
| 4.2.2.6.4 DOX 与 M-MSNs-PEG 作用测定 |
| 4.2.2.7 Janus 型 M-MSNs-DOX 表征 |
| 4.2.2.8 细胞培养 |
| 4.2.2.9 分组给药和细胞活性检测 |
| 4.2.2.9.1 M-MSNS 的分组和给药 |
| 4.2.2.9.2 M-MSNs-DOX 的分组和给药 |
| 4.2.2.9.3 SRB 法检测细胞活性 |
| 4.2.2.10 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞和药物释放 |
| 4.2.2.10.1 激光共聚焦荧光显微镜检测细胞内吞 |
| 4.2.2.10.2 激光共聚焦荧光显微镜检测 DOX 释放 |
| 4.2.2.11 流式细胞术检测细胞内吞和药物释放 |
| 4.2.2.11.1 流式细胞术定量检测细胞内吞 |
| 4.2.2.11.2 流式细胞术检测细胞内吞机制 |
| 4.2.2.11.3 流式细胞术检测定量 DOX 的释放 |
| 4.2.2.12 普鲁士蓝染色法检测细胞内吞 |
| 4.2.2.13 生物透射电镜研究细胞内吞 |
| 4.2.2.14 动物饲养和小鼠肝癌模型的构建 |
| 4.2.2.14.1 动物饲养 |
| 4.2.2.14.2 BALB/c 裸小鼠人肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型的建立 |
| 4.2.2.14.3 ICR 小鼠肝癌 H22 原位荷瘤模型的建立 |
| 4.2.2.15 小鼠肝癌核磁共振成像 |
| 4.2.2.16 小鼠肝癌模型的分组和给药 |
| 4.2.2.16.1 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型的分组和给药 |
| 4.2.2.16.2 ICR 小鼠肝癌 H22 原位荷瘤模型的分组和给药 |
| 4.2.2.17 小鼠肝癌模型治疗效果的评价 |
| 4.2.2.17.1 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型治疗效果的评价 |
| 4.2.2.17.2 ICR 小鼠肝癌 H22 原位荷瘤模型治疗效果的评价 |
| 4.2.2.18 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型安全性评价 |
| 4.2.2.19 BALB/c 裸小鼠肝癌 HepG2 皮下荷瘤模型的生物分布检测 |
| 4.2.2.19.1 普鲁士蓝染色法检测组织脏器铁分布 |
| 4.2.2.19.2 ICP-OES 检测组织脏器铁含量 |
| 4.2.2.19.3 激光共聚焦荧光显微镜检测 M-MSN-FITC 组织脏器分布 |
| 4.2.2.19.4 激光共聚焦荧光显微镜检测 DOX 组织脏器分布 |
| 4.2.2.20 M-MSN-DOX 溶血性评价 |
| 4.2.2.21 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 不同形貌 M-MSNs 的生物分布和溶血性研究 |
| 4.3.2 M-MSNs-PEG 的合成与表征 |
| 4.3.3 M-MSNs-PEG 的细胞毒性作用检测 |
| 4.3.4 M-MSNs-PEG 的细胞内吞作用检测和机制研究 |
| 4.3.5 磁场增强 M-MSNs-PEG 的细胞内吞研究 |
| 4.3.6 M-MSNs-PEG 的载药和释药研究 |
| 4.3.7 磁场增加 M-MSNS-DOX 体外抗肿瘤作用研究 |
| 4.3.8 M-MSNs-DOX 增强肝癌体内 MR 成像效果研究 |
| 4.3.9 磁场增强 M-MSNs-DOX 治疗裸鼠肝癌皮下移植瘤的效果研究 |
| 4.3.10 M-MSNs-DOX 治疗肝癌皮下移植瘤的安全性评价和生物分布研究 |
| 4.3.11 磁场增强 M-MSNs-DOX 治疗小鼠原位肝癌的效果和药物分布研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第5章 全文总结与研究展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 不足之处 |
| 5.3 研究展望 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 作者简介 |
| 在学期间发表的学术论文 |
| 在学期间主要承担和参与的项目 |
| 在学期间获得的专利 |
| 在学期间获得的奖励 |
| 在学期间参加的会议和活动 |
| 致谢 |
（3）枸杞多糖增强阿霉素抗小鼠肝癌的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景和立题依据 |
| 1 研究背景 |
| 2 立题依据 |
| 第二部分 枸杞多糖(LBP)组分紫外、红外光谱及LPS含量分析 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 枸杞多糖(LBP)抗肿瘤与免疫调节作用活性组分的筛选 |
| 第一章 不同分子量枸杞多糖组分对小鼠肝癌细胞增殖的影响 |
| 第二章 不同分子量LBP组分对淋巴细胞功能的影响 |
| 第三章 不同分子量LBP组分对巨噬细胞功能的影响 |
| 第四章 不同分子量LBP组分对小鼠肝癌移植瘤生长的影响 |
| 本部分小结 |
| 第四部分 枸杞多糖抑制小鼠肝癌移植瘤生长的免疫学机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 第五部分 枸杞多糖增强阿霉素抗小鼠肝癌移植瘤生长的作用研究 |
| 第一章 枸杞多糖对阿霉素化疗小鼠免疫功能的影响 |
| 第二章 枸杞多糖对阿霉素抗小鼠肝癌抑制瘤生长的影响 |
| 本部分小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（4）熊果酸抗肿瘤及作为小鼠肝癌细胞疫苗佐剂的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 UA 抗肿瘤作用研究 |
| 2 肿瘤及肿瘤的治疗 |
| 3 疫苗佐剂的研究 |
| 第二章 UA 对宫颈癌细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第三章 UA 诱导 HELA 细胞凋亡中 MAPK 信号通路作用及细胞因子变化 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第四章 UA 对小鼠肝癌 H22 移植瘤抑制及免疫调节作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第五章 UA 增强小鼠肝癌细胞疫苗免疫原性的作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及科研成果 |
| 导师评阅表 |
（5）三氧化二砷联合5-氟尿嘧啶对小鼠肝癌H22细胞株的抑制作用（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 MTT法检测药物对小鼠肝癌H22细胞生长的抑制作用 |
| 1.2.1细胞培养: |
| 1.2.2 MTT法检测药物对小鼠肝癌H22细胞增殖率的影响: |
| 1.3 TUNEL荧光染色法检测药物对小鼠肝癌H22细胞凋亡率的影响 |
| 1.4统计学处理方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 MTT法检测药物对H22细胞增殖的影响 |
| 2.2 TUNEL荧光染色法检测药物对H22细胞株凋亡的影响 |
| 3 讨论 |
（6）小鼠肝癌全细胞抗原致敏骨髓DC激活TIL抗癌机制的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器与试剂 |
| 1.2 荷瘤小鼠的建立 |
| 1.3 H22细胞与TIL的分离与培养 |
| 1.4 制备小鼠脾淋巴细胞 |
| 1.5 小鼠肝癌H22细胞全细胞抗原的制备 |
| 1.6 小鼠树突状细胞体外培养和致敏及鉴定 |
| 1.7 致敏DC激活淋巴细胞 |
| 1.8 体外杀伤实验 |
| 1.9 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 DC致敏前后的形态变化 |
| 2.2 细胞表型分析 |
| 2.3 DC分泌细胞因子的检测结果 |
| 2.4 TIL和脾淋巴细胞激活及杀伤效果的观察 |
| 3 讨论 |
（7）蛹虫草炮制汤剂体系表征及抗肿瘤研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中文文摘 |
| 绪论 |
| 1. 中药炮制研究进展 |
| 1.1 炮制简介 |
| 1.2 中药炮制对药效的影响 |
| 1.3 中药炮制在临床应用 |
| 1.4 美拉德反应在中药炮制中的影响 |
| 1.5 现代中药简介 |
| 2. 美拉德反应研究进展 |
| 2.1 美拉德反应简介 |
| 2.2 美拉德反应产物理化性质研究 |
| 3. 蛹虫草及虫草素研究进展 |
| 3.1 蛹虫草研究概况 |
| 3.1.1 蛹虫草简介 |
| 3.1.2 蛹虫草化学成分 |
| 3.1.3 蛹虫草药理活性 |
| 3.2 虫草素概况 |
| 3.2.1 虫草素简介 |
| 3.2.2 虫草素代谢特点 |
| 3.2.3 延缓虫草素在体内代谢的研究进展 |
| 3.2.4 虫草素抗肿瘤机制研究进展 |
| 4. 本课题研究主要内容 |
| 4.1 课题研究目的与意义 |
| 4.2 主要内容 |
| 4.3 创新性 |
| 第一章 蛹虫草汤剂制备及虫草素测定 |
| 1.1 材料、仪器与试剂 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 蛹虫草汤剂的制备 |
| 1.3.2 虫草素的提取与纯化 |
| 1.3.3 超高效液相色谱(UPLC)法检测虫草素 |
| 1.3.4 高效液相色谱(HPLC)法检测虫草素 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 蛹虫草汤剂体系理化性质表征 |
| 2.1 材料、仪器与试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蛹虫草炮制及取样方法 |
| 2.2.2 紫外-可见分光光度计全波长扫描 |
| 2.2.3 多功能酶标仪测定蛹虫草汤剂体系吸光度 |
| 2.2.4 激光粒度分析法测定蛹虫草汤剂体系颗粒和Zeta电位 |
| 2.2.5 原子力显微镜(AFM)分析 |
| 2.2.6 蛹虫草汤剂pH值响应 |
| 2.2.7 利用UPLC和HPLC法检测蛹虫草汤剂的物质 |
| 2.2.8 数据分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 蛹虫草炮制过程对汤剂体系理化性质的影响 |
| 2.3.2 蛹虫草炮制汤剂体系pH值响应 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 蛹虫草汤剂体外抗肿瘤研究 |
| 3.1 材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 药品与试剂 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养及传代 |
| 3.2.2 细胞冻存与复苏 |
| 3.2.3 细胞毒性作用 |
| 3.2.4 细胞生长抑制作用 |
| 3.2.5 细胞形态观察 |
| 3.2.6 DNA凝胶电泳分析 |
| 3.2.7 流式细胞仪分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 蛹虫草汤剂和虫草素对人不同肿瘤细胞毒性作用 |
| 3.3.2 蛹虫草汤剂和虫草素对人肝癌HepG-2细胞形态观察 |
| 3.3.3 蛹虫草汤剂和虫草素对人肝癌HepG-2细胞增殖抑制作用 |
| 3.3.4 蛹虫草汤剂和虫草素对人肝癌HepG-2细胞DNA凝胶电泳分析 |
| 3.3.5 蛹虫草汤剂和虫草素对人肝癌细胞HepG-2细胞周期分析 |
| 3.3.6 蛹虫草汤剂和虫草素对人肝癌HepG-2细胞内Ca~(2+)的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 蛹虫草汤剂对小鼠肝癌H22细胞体外抗肿瘤研究 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试剂与溶液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞毒性作用 |
| 4.2.2 细胞生长抑制作用 |
| 4.2.3 瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.2.4 吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染 |
| 4.2.5 琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 4.2.6 细胞周期检测 |
| 4.2.7 细胞内Ca~(2+)的检测 |
| 4.2.8 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 蛹虫草汤剂和虫草素对小鼠肝癌H22细胞毒性作用 |
| 4.3.2 蛹虫草汤剂和虫草素对小鼠肝癌H22细胞增殖抑制作用 |
| 4.3.3 蛹虫草汤剂和虫草素对小鼠肝癌H22细胞形态影响 |
| 4.3.4 小鼠肝癌H22细胞DNA琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 4.3.5 蛹虫草汤剂和虫草素对小鼠肝癌H22细胞周期影响 |
| 4.3.6 蛹虫草汤剂和虫草素对小鼠肝癌H22细胞内Ca~(2+)的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 蛹虫草汤剂对小鼠肝癌H22体内抗肿瘤研究 |
| 5.1 材料、仪器与试剂 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 试剂与药物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠肝癌H22实体瘤模型的构建及分组 |
| 5.2.3 肿瘤抑制率 |
| 5.2.4 免疫器官指数 |
| 5.2.5 肿瘤组织细胞形态学观察 |
| 5.2.6 蛹虫草汤剂和虫草素对小鼠肝癌H22腹水瘤的影响 |
| 5.2.7 数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 蛹虫草汤剂和虫草素作用肝癌H22实体瘤小鼠生活状况观察 |
| 5.3.2 蛹虫草汤剂和虫草素对肝癌H22实体瘤小鼠肿瘤抑制作用 |
| 5.3.3 蛹虫草汤剂和虫草素对肝癌H22实体瘤小鼠免疫器官的影响 |
| 5.3.4 蛹虫草汤剂和虫草素对肝癌H22实体瘤小鼠肿瘤组织病理学观察 |
| 5.3.5 蛹虫草汤剂和虫草素对肝癌H22腹水瘤小鼠生存寿命的影响 |
| 5.3.6 蛹虫草汤剂和虫草素对肝癌H22腹水瘤小鼠生存质量的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）靶向小鼠肝癌干/祖细胞免疫治疗的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 消化道肿瘤细胞 ALDH 表达鉴定 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 消化道肿瘤细胞系细胞制备 |
| 2.2.2 消化道肿瘤细胞 ALDEFLUOR 荧光染色 |
| 2.2.3 流式细胞术检测各消化道肿瘤细胞 ALDH 表达 |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 ALDH 阳性表达的肿瘤细胞 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 小鼠肝癌 H22 细胞中不同干性亚群的分选与鉴定 |
| 第一节 试剂材料 |
| 3.1.1 细胞株及实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 小鼠肝癌 H22 细胞的复苏及传代培养 |
| 3.2.2 小鼠肝癌 H22 细胞 ALDEFLUOR 荧光染色 |
| 3.2.3 流式细胞术分选小鼠肝癌 H22 细胞的 ALDH~(high)/ALDH~(low)/ALDH~(neg)细胞亚群 |
| 3.2.4 H22 细胞 ALDH~(high)/ALDH~(low)/ ALDH~(neg)亚群的 CD133 和 CD44 检测 |
| 3.2.5 H22 细胞 ALDH~(high)/ALDH~(low)/ ALDH~(neg)亚群的细胞周期分析 |
| 3.2.6 H22 细胞 ALDH~(high)/ALDH~(low)/ALDH~(neg)细胞亚群细胞成球观察 |
| 3.2.7 ALDH~(high)/ALDH~(low)/ALDH~(neg)细胞亚群致瘤性观察 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠肝癌 H22 细胞分选后 ALDH~(high)/ALDH~(low)/ ALDH~(neg)表达的比率 |
| 3.3.2 H22 细胞 ALDH~(high)/ALDH~(low)/ ALDH~(neg)亚群 CD133+/CD44+比例 |
| 3.3.3 H22 细胞 ALDH~(high)/ALDH~(low)/ ALDH~(neg)亚群细胞周期差异 |
| 3.3.4 小鼠肝癌 H22 细胞各亚群细胞球体形成 |
| 3.3.5 各亚群细胞致瘤性分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 靶向小鼠肝癌 H22 干/祖细胞免疫治疗研究 |
| 第一节 试剂材料 |
| 4.1.1 实验动物及细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂： |
| 4.1.3 主要仪器设备： |
| 第二节 实验方法 |
| 4.2.1 小鼠肝癌 H22 细胞的复苏与传代 |
| 4.2.2 昆明小鼠皮下 H22 肿瘤模型建立 |
| 4.2.3 流式细胞术分选小鼠肝癌 H22 不同干性亚群细胞 |
| 4.2.4 小鼠肝癌 H22 不同干性亚群 CTL 细胞制备 |
| 4.2.5 不同干性亚群 CTL 细胞对皮下荷瘤昆明鼠的治疗 |
| 4.2.6 数据处理 |
| 第三节 实验结果 |
| 4.3.1 不同干性细胞抗原 CTL 对小鼠 H22 皮下瘤的抑瘤效果 |
| 4.3.2 脾指数与胸腺指数 |
| 第四节 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（9）芥子碱对小鼠肝癌H22的体内抑制作用初探（论文提纲范文）
| 1 材料与药品 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物 |
| 1.1.2 细胞株 |
| 1.1.3 主要实验器材 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 芥子碱对小鼠肝癌H22 实体瘤生长的影响 |
| 2.2 免疫器官指数(脾指数和胸腺指数) |
| 2.3 肿瘤组织细胞形态学观察 |
| 2.4 芥子碱对腹水型肝癌H22 小鼠生命延长率的影响[3] |
| 2.5 丫啶橙染色观察芥子碱对肿瘤细胞形态的影响 |
| 2.6 琼脂糖电泳法分析芥子碱对H22 细胞DNA的影响 |
| 2.7 免疫组化技术检测芥子碱肿瘤细胞Bax和Bcl-2 蛋白表达的影响 |
| 2.7.1 石蜡切片制作 |
| 2.7.2 免疫组化处理 |
| 2.7.3 免疫组织化学结果判定 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 芥子碱显着抑制小鼠肝癌H22 实体瘤生长 |
| 3.2 芥子碱对肝癌H22 荷瘤小鼠的免疫器官无明显毒性 |
| 3.3 芥子碱促进肿瘤细胞的凋亡 |
| 3.4 芥子碱对腹水型肝癌H22 小鼠生存寿命无显着改善 |
| 3.5 芥子碱对腹水型肝癌H22 小鼠生存质量的影响呈动态变化 |
| 3.6 芥子碱促进肿瘤细胞凋亡 |
| 3.7 芥子碱诱导肿瘤细胞DNA降解 |
| 3.8 芥子碱调节肿瘤细胞Bax和Bcl-2 蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
（10）下调窖蛋白-1表达抑制小鼠肝癌H22细胞侵袭能力（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.3 RT-PCR检测窖蛋白-1 m RNA水平的表达 |
| 1.4 Western印迹检测窖蛋白-1蛋白的表达 |
| 1.5 窖蛋白-1特异性si RNA转染H22细胞 |
| 1.6 凝集素印记 (Lectin-blot) 分析N-聚糖β1, 6Glc NAc分支 |
| 1.7 Matrigel细胞侵袭检测 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 窖蛋白-1在小鼠IAR20和H22细胞中的表达 |
| 2.2 RNAi下调窖蛋白-1在H22细胞中的表达 |
| 2.3 窖蛋白-1下调抑制H22细胞表面N-聚糖β1, 6Glc NAc分支的形成 |
| 2.4 窖蛋白-1下调抑制H22细胞的迁移和侵袭能力 |
| 3 讨论 |
四、小鼠肝癌H_(22)细胞LDLR的分析研究（论文参考文献）
- [1]肿瘤靶向CTD聚合物胶束减毒作用研究[D]. 王震. 河南大学, 2019(01)
- [2]多功能纳米粒子在肝癌诊治一体化中的应用研究[D]. 邵丹. 吉林大学, 2015(08)
- [3]枸杞多糖增强阿霉素抗小鼠肝癌的作用研究[D]. 邓向亮. 广州中医药大学, 2015(05)
- [4]熊果酸抗肿瘤及作为小鼠肝癌细胞疫苗佐剂的作用研究[D]. 李艳红. 石河子大学, 2014(03)
- [5]三氧化二砷联合5-氟尿嘧啶对小鼠肝癌H22细胞株的抑制作用[J]. 金洲祥,王向昱. 温州医学院学报, 2013(10)
- [6]小鼠肝癌全细胞抗原致敏骨髓DC激活TIL抗癌机制的研究[J]. 张志明,冯钟煦,周敏,刘剑勇,赵荫农,张春燕,唐凯,吕丽琼,罗善超. 中华肿瘤防治杂志, 2013(13)
- [7]蛹虫草炮制汤剂体系表征及抗肿瘤研究[D]. 吴丹. 福建师范大学, 2013(S2)
- [8]靶向小鼠肝癌干/祖细胞免疫治疗的实验研究[D]. 丁毅. 中国人民解放军医学院, 2012(01)
- [9]芥子碱对小鼠肝癌H22的体内抑制作用初探[A]. 南淑蕾,吴国欣,黄鹭强,程涛,张福华. Proceedings of 2011 International Conference on Biomedicine and Engineering（ISBE 2011 V4）, 2011
- [10]下调窖蛋白-1表达抑制小鼠肝癌H22细胞侵袭能力[J]. 汪淑晶,樊建慧,于生金,张嘉宁. 中国生物化学与分子生物学报, 2011(04)