一、反义基因转染抑制骨肉瘤中血管内皮生长因子表达的研究（论文文献综述）
顾军权[1]（2021）在《抑制VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA干预骨肉瘤的研究》文中研究表明目的研究同时靶向VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA对骨肉瘤细胞株（MG-63和Saos-2）中VEGF和Survivin基因的抑制效应,和对细胞迁移,血管生成,增殖以及凋亡的影响。本研究通过探讨一链双靶siRNA的作用机制,拓展了目前的核酸干扰技术,为一链多靶核酸干扰技术的开发奠定了基础。本研究将为多靶siRNA核酸干扰相关药物的研发提供理论依据和技术支持。方法1.合成两个单靶siRNA（siRNA-Survivin和siRNA-VEGF）,在此基础上,设计并合成同时靶向VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA（siRNA-VEGF-&Survivin）。2.将靶向VEGF和Survivin两个单靶siRNA和同时靶向VEGF和Survivin一链双靶siRNA转染到骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）中,通过荧光显微镜检测转染效率。3.运用QRT-PCR和Western Blot技术检测各转染组细胞（MG-63和Saos-2）中VEGF和Survivin基因m RNA及蛋白的表达。4.免疫荧光法和免疫组化检测各转染组细胞（MG-63和Saos-2）中VEGF和Survivin蛋白的定位及表达,并检测其基因沉默效果。5.MTT法检测各转染组MG-63和Saos-2细胞的增殖水平,流式细胞术检测MG-63和Saos-2细胞凋亡水平。6.划痕试验测定各转染组MG-63和Saos-2的细胞迁移,血管形成试验检测各转染组MG-63和Saos-2细胞的血管形成。结果1..成功构建符合设计要求的靶向VEGF和Survivin的单靶siRNA和一链双靶siRNA序列。2.各组siRNA均成功地转染到MG-63和Saos-2细胞中,转染率达到80%。3.Western Blot、QRT-PCR、免疫荧光和免疫组化法分析显示:单靶siRNA组和一链双靶siRNA组中VEGF和Survivin m RNA和蛋白的表达水平均低于对照组和未转染组,差异有统计学意义（均P<0.05）。一链双靶siRNA组在m RNA和蛋白的表达水平上与各单靶siRNA组相似,差异无统计学意义（P>0.05）。4.双靶siRNA组具有较强的抑制肿瘤细胞增殖和血管形成,并阻抑肿瘤细胞迁移而促进肿瘤细胞凋亡,效果均明显优于单靶siRNA组。结论1.沉默VEGF和Survivin基因的单靶siRNA-VEGF、siRNA-Survivin和一链双靶siRNA均能有效下调MG-63和Saos-2细胞中VEGF和Survivin基因的表达。2.体外实验证实,单靶siRNA和一链双靶siRNA对骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）的迁移和血管生成具有明显的抑制作用。3.体外实验证实,单靶siRNA和一链双靶siRNA均能抑制骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）增殖,促进细胞凋亡。4.一链双靶siRNA能显着抑制骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）的增殖和血管形成,并阻抑骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）迁移而促进其凋亡,效果均明显优于单靶siRNA组。5.VEGF和Survivin基因无相关性,一链双靶siRNA较单靶siRNA发挥了双倍的抑制骨肉瘤细胞增殖和促进凋亡的效果。
刘利芬[2]（2019）在《IncRNA TUG1在子宫内膜癌中的生物学行为作用及机制研究》文中提出背景:子宫内膜癌是严重威胁我国女性健康的生殖道恶性疾病,其死亡率和发病率呈逐年上升趋势,其确切的发病原因及侵袭转移机制尚未明确。研究发现lncRNA分子在调控子宫内膜癌进展过程中不仅可以直接影响肿瘤细胞的生存能力,而且该调节过程也受到上游分子及通路的复杂调控。研究表明lncRNA TUG1通过调控mirRNA及其靶细胞基因参与多种癌症的发生和进展,但是在子宫内膜癌的研究中尚未见报道。目的:研究lncRNATUGl在子宫内膜癌瘤组织及对应正常组织中的转录情况,在细胞、动物水平验证lncRNA TUG1对子宫内膜癌细胞增殖作用的影响,最后对lncRNA TUG1影响子宫内膜癌的作用机制进行深入探讨。方法:通过qPCR方法,检测104例子宫内膜癌组织和其相对应的邻近正常组织lncRNA-TUGl的表达情况并进行分析;通过qPCR方法,检测30例子宫内膜癌患者的肿瘤组织检测lncRNA-TUG1和VEGFA的表达情况,并对其相关性进行分析;通过qPCR方法,检测30例子宫内膜癌患者肿瘤组织VEGFA和miR-299、miR-34a-5p的表达情况,并对其相关性进行分析;通过qPCR实验,检测子宫内膜癌细胞（HEC-l-A细胞和ishikawa细胞）和HEK293细胞系lncRNA-TUGl的表达情况;构建lncRNA TUGl和VEGFA的荧光素酶报告基因系统,在HEC-l-A细胞和ishikawa细胞中,敲低miR-299、miR-34a-5p的表达,然后通过荧光素酶报告基因系统评价miR-299、miR-34a-5p 对 lncRNA TUG1 和 VEGFA 的表达影响;在 HECM-A 细胞和 ishikawa 细胞中,敲低miR-299、miR-34a-5p的表达,然后通过qPCR方法检测lncRNA TUG1和VEGFA的含量;构建lncRNATUG1的敲低质粒和VEGFA基因表达的荧光素酶报告基因系统,共同转染HEC-l-A细胞和ishikawa细胞,检测lncRNATUGl敲低后对VEGFA基因表达的影响;在HEC-l-A细胞和ishikawa细胞中,通过shRNA方法转染细胞降低lncRNA TUG1的含量,然后检测转染的对照细胞和lncRNA TUG1敲低后的细胞增殖能力;将HEC-l-A细胞、ishikawa细胞、lncRNA-TUGl敲低的HEC-l-A细胞、lncRNA-TUG1敲低的ishikawa细胞在免疫缺陷的裸鼠体内进行皮下异种移植,然后检测各组细胞在皮下异种移植后的肿瘤生长情况。结果:在104例子宫内膜癌患者中,有71例子宫内膜癌患者肿瘤组织中的lncRNA-TUG1表达相比于其对应的邻近正常组织出现明显的增高（71/104,68.27%,P<0.05）;在30例子宫内膜癌患者肿瘤组织中,lncRNA-TUG1表达量增高,其VEGFA的表达量同样出现明显的上调,两者呈现正相关性（相关系数R2=0.33,P<0.05）;在30例子宫内膜癌患者的肿瘤组织中,miR-299表达越高,其VEGFA的表达则越低,miR-299与VEGFA之间呈现负相关性,具有统计学意义（R2=0.43,P<0.05）;同样在30例子宫内膜癌患者肿瘤组织中,miR-34a-5p表达越高,其VEGFA的表达越低,miR-34a-5p与VEGFA呈现负相关性,具有统计学意义（R2=0.48,P<0.05）;在HEC-1-A细胞和ishikawa细胞中,lncRNA-TUG1表达水平比对照组HEK-293细胞出现显着性的增加（P<0.05）;在HEC-1-A细胞和ishikawa细胞中,miR-299与miR-34a-5p能够分别作用于其靶基因VEGFA的3’UTR区域和lncRNA-TUG1的3’UTR区域,干扰VEGFA和lncRNA-TUG1的mRNA表达水平;在HEC-1-A细胞和ishikawa细胞中,敲低lncRNA-TUG1能够明显的抑制VEFGA的表达;lncRNA-TUG1与miR-299、miR-34a-5p能够特异性结合,从而起到竞争性抑制的作用;在HEC-1-A细胞和ishikawa细胞中敲低lncRNA-TUG1后,与正常子宫内膜癌细胞系相比,其活力值于第4天出现明显的降低（P<0.05）;最后,在动物水平,敲低lncRNA-TUG1后的子宫内膜癌细胞的肿瘤增殖,明显小于对照组的子宫内膜癌细胞的肿瘤增殖（lncRNA-TUG1敲低的HEC-1-A细胞/正常的HEC-1-A细胞:330±21.6 mm3/466.7±38.6 mm3/,P<0.05;lncRNA-TUG1 敲低的 ishikawa 细胞/正常的 ishikawa细胞:326.7±24.9 mm3/453.3±44.9 mm3,P<0.05）。结论:lncRNA-TUG1可以竞争性结合miR-299、miR-34a-5p,从而减弱miR-299、miR-34a-5p对其靶基因VEGFA的抑制作用,导致VEGFA基因过表达,加速子宫内膜癌细胞的增殖和转移,促进子宫内膜癌的发生、发展。
王继[3]（2009）在《血管生成素与碱性成纤维生长因子之间相互作用关系及其分子机制的研究》文中进行了进一步梳理血管生成素和碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）是重要的促血管生长因子,调节着细胞的增殖、分化和迁移,在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。目前关于血管生成素和bFGF之间相互作用关系的研究还很少,本论文的研究目的在于探究肿瘤细胞中血管生成素和bFGF之间的相互作用关系及其分子调控机制。我们首先在肝癌细胞中建立了高表达和低表达bFGF的细胞株,结果发现高表达bFGF的细胞株中血管生成素的表达降低,而低表达bFGF的细胞株中血管生成素的表达反而升高。在细胞增殖分析中,我们观察到高表达bFGF的细胞株细胞增殖增加,而低表达bFGF的细胞株细胞增殖降低。这一部分的实验结果表明,内源的bFGF负调控血管生成素的表达,并且对肝癌细胞的细胞增殖有促进作用。接着我们在HeLa细胞中稳定转染了血管生成素的正义和反义基因,建立了高表达和低表达血管生成素的稳定细胞株,检测bFGF的表达情况,发现转染正义血管生成素基因的细胞株bFGF的表达量降低了,而转染反义血管生成素基因的细胞株bFGF的表达量升高了,实验结果进一步证实了血管生成素对bFGF基因的表达有负调控作用。我们的工作证实了在肿瘤细胞中bFGF可以负调控血管生成素的表达,同时在转染血管生成素基因的细胞中也发现血管生成素负调节bFGF的表达,这在肿瘤血管生成因子的研究中是个新现象,探讨这两个因子之间相互作用关系的分子机制将有助于肿瘤血管生成方面的研究,对靶向肿瘤血管生成的肿瘤治疗有重要的指导意义。目前关于血管生成素和bFGF调控机制的线索还比较少,根据已有的信息我们提出了两个假设:1.血管生成素作为反式作用因子参与bFGF基因的调控;2.血管生成素与bFGF之间可能存在着负反馈调节。首先,我们在293T细胞中检测了血管生成素对bFGF启动子荧光素酶报告基因活性的影响,结果发现血管生成素抑制了bFGF启动子的活性,进而参与bFGF基因的表达调控。通过检测不同长度的bFGF启动子活性,进一步限定了血管生成素在bFGF启动子上的作用区间在?970bp与?834bp之间。其次,我们通过实验初步验证了血管生成素与bFGF之间存在着负反馈,用外源的bFGF刺激共转染血管生成素表达质粒和bFGF启动子质粒的293T细胞,结果发现外源bFGF的加入补偿了血管生成素对bFGF启动子活性的抑制。因此,我们的结论是血管生成素与bFGF之间的负反馈调节是血管生成素抑制bFGF启动子活性,下调bFGF蛋白的表达,进而又负反馈地抑制了bFGF的基因表达。本论文的研究结果为肿瘤血管生成方面的研究提供了有力的理论依据。
姚航[4]（2007）在《KDR启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸治疗乳腺癌的实验研究》文中指出研究背景乳腺癌是威胁女性健康的主要疾病之一,且其发病率在世界范围内有上升趋势。传统的手术、放疗、化疗和内分泌治疗方法有其自身的局限性,因此寻找新的疗法迫在眉睫。随着肿瘤生物学及分子生物学等新兴学科的发展,肿瘤的基因治疗成为一种新的治疗模式,其中自杀基因疗法是较为有效和颇具临床应用潜力的治疗策略。自杀基因疗法是利用基因工程技术将一些病毒或细菌等原核生物含有,而哺乳动物细胞中不含有或表达水平极低的前药转换酶基因导入肿瘤细胞进行表达,其产物可使无毒性的前药变成细胞毒物质,从而达到杀伤肿瘤细胞的作用。基因治疗要求目的基因能在肿瘤细胞特异性表达而不在正常细胞中表达,一个能达到这一目的的方法是应用靶向技术向肿瘤区域精确目的基因。有研究利用肿瘤细胞特异性基因调控元件调控自杀基因表达,如以erbB-2启动子驱动乳腺癌的自杀基因治疗,AFP基因启动子用于原发性肝癌自杀基因疗法等。但上述策略只能针对某一特殊类型肿瘤,且仅靶向肿瘤细胞。随着人们对肿瘤新生血管在肿瘤生长及转移中的重要作用的认识,许多学者将治疗靶点转移到肿瘤血管上,通过抑制肿瘤新生血管生成,切断肿瘤供养来抑制肿瘤生长,减少肿瘤的浸润和转移。研究表明:肿瘤血管的生长速度是正常组织的50-100倍,肿瘤血管之所以能持续生长关键在于其血管内皮细胞的增殖能力,在肿瘤血管内皮细胞的增殖中,血管内皮生长因子（vascularendothelial cell growth factor,VEGF）是最重要的因子,VEGF促进肿瘤血管的生长必须与血管内皮细胞表面的VEGF第二受体（kinase-domain insert containingreceptor,KDR）相结合方能促使血管内皮细胞分裂、增殖。KDR高表达于增生活跃的肿瘤血管内皮细胞及多数肿瘤细胞,而在正常组织不表达或表达甚微,因此,以KDR启动子序列驱动自杀基因,可使自杀基因在肿瘤血管内皮细胞及肿瘤细胞特异性表达,从而达到双重靶向治疗作用。这样,放大治疗作用的同时,又适应于多种肿瘤治疗。利用KDR启动子驱动的双自杀基因特异性杀伤肿瘤和抑制其血液供应,国内外已有报道并取得良好疗效。现代分子生物学研究表明,肿瘤是一个多因素、多环节、多阶段、多基因参与的复杂疾病,而且在癌组织内可存在多种克隆的肿瘤细胞,不同类型的瘤细胞对不同基因治疗体系的敏感性有差异,所以单基因治疗常常不能取得良好的疗效。因此,联合基因治疗已成为目前肿瘤基因治疗的发展方向。联合基因治疗是指同时采用两种或两种以上的基因治疗策略来治疗肿瘤,利用各个基因治疗的优点,提高治疗效果,降低对机体正常组织的副作用。目前认为肿瘤不仅是细胞增殖分化异常性疾病,也是凋亡异常性疾病。凋亡调控失调可以异常地延长细胞的生存时间,促进有转化作用的基因突变的积累,并协助细胞抵抗免疫系统的监视作用,从而导致肿瘤的发生。随着对细胞凋亡调控异常在肿瘤发病学中的重要性的认识,在肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因己构成肿瘤基因治疗中最诱人的策略之一。Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白,survivin在凋亡调节中起着重要作用。survivin在人胚胎组织中高度表达并参与胚胎发育过程中的组织分化和器官形成,而在终末分化的成人组织中检测不到,却又广泛表达于多种肿瘤组织。同时Survivin在非增殖性的毛细血管内皮中的表达量极低,而体内增殖性血管内皮中survivin的表达量很高。因此,Survivin可作为另一个肿瘤血管及肿瘤细胞双重治疗的理想靶点。目前,利用survivin反义寡核苷酸特异性诱导肿瘤细胞和其供血血管内皮细胞凋亡的研究已成为肿瘤治疗研究方面的热点。尽管自杀基因和survivin反义寡核苷酸肿瘤治疗上均取得一定的疗效,但肿瘤的复杂性和多样性决定了单一基因治疗常常不能取得良好的疗效。基于上述研究,为弥补单基因治疗的不足,发挥联合基因靶向治疗的优势,本课题拟联合应用腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统和survivin反义寡核苷酸,并观察两者单独及联合应用对乳腺癌MCF-7细胞及血管内皮ECV304细胞的体外靶向杀伤作用及其体内抑瘤效应,为进一步开展联合基因治疗乳腺癌的研究提供实验依据。注:本课题来源于:广东省科技计划项目基金（2005831201009）。目的研究KDR启动子驱动的双自杀基因在乳腺癌细胞MCF-7、血管内皮细胞ECV304内的转染及表达,给予前药后体外杀伤细胞的作用。观察survivin反义寡核苷酸对MCF-7和ECV304细胞中survivin基因表达的封闭作用和细胞的生长抑制作用。研究联合应用KDR启动子驱动的双自杀基因和survivin反义寡核苷酸作用MCF-7、ECV304细胞,观察两种基因在细胞内的表达及对细胞的增殖抑制作用。最后,以MCF-7细胞株建立裸鼠皮下移植瘤动物模型,观察联合基因治疗体系的体内抗肿瘤和抑制血管再生作用。方法一、重组腺病毒的包装、扩增、纯化及其滴度测定和鉴定携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdEsayKDRP-CDglyTK在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,通过荧光显微镜下293细胞中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达观察重组病毒的包装与复制,并以PCR方法鉴定重组腺病毒。二、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用用重组腺病毒AdKDR-CDglyTK感染MCF-7细胞、ECV304细胞及LS174T细胞（对照）,观察腺病毒的感染效率,RT-PCR方法检测目的基因的表达。在前药5-氟胞嘧啶（5-FC）和更昔洛韦（GCV）作用下,测定肿瘤细胞和血管内皮细胞的存活率,观察旁观者效应。三、survivin反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对MCF-7、ECV304细胞的生长抑制效应。针对survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸,采用脂质体介导转染MCF-7、ECV304细胞,采用western blot、RT-PCR方法检测survivin反义寡核苷酸对MCF-7、ECV304细胞survivin蛋白及mRNA表达的作用。测定转染前后细胞增殖活性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。四、KDR启动子驱动双自杀基因和survivin反义寡核苷酸联合应用对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用将重组腺病毒AdKDR-CDglyTK体外感染表达KDR的MCF-7、ECV304细胞株,同时用survivinASODN转染同一细胞株,观察腺病毒的感染效率和ASODN的转染情况,应用RT-PCR方法检测CDglyTK mRNA的表达,western blot方法检测基因转染对细胞survivin蛋白表达的影响。给予前药5-氟胞嘧啶（5-FC）和更昔洛韦（GCV）后,MTT法测定两者联合应用对细胞株的杀伤效应和旁观者效应,透射电镜观察细胞超微结构变化。五、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统联合survivin反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应采用BALB/C雌性裸鼠,4～6周龄,对数生长期的MCF-7细胞接种于裸鼠左侧腋窝皮下,建立乳腺癌动物模型,当肿瘤达0.5cm直径时,将荷瘤裸鼠随机分为4组,A组:阴性对照组(瘤体及瘤周注射LipolifectmainTM2000与前药5-FC、GCV);B组:survivinASODN治疗组（瘤体及瘤周注射survivin反义寡核苷酸）;C组:AdKDR-CDglyTK腺病毒治疗组（瘤体及瘤周注射重组腺病毒与前药5-FC和GCV）;D组:survivinASODN+AdKDR-CDglyTK腺病毒治疗组（瘤体及瘤周注射重组腺病毒与前药5-FC、GCV+survivin反义寡核苷酸）。治疗前后测量肿瘤体积,治疗结束后测肿瘤重量,计算肿瘤抑瘤率,观察该治疗体系的体内抑瘤效应。治疗结束后行组织内CDglyTK基因和survivin基因表达的检测、肿瘤组织透射电镜观察肿瘤细胞的超微结构变化及微血管密度（microvesseldensity,MVD）检查。结果一、重组腺病毒的包装、扩增、滴度测定及鉴定pAdEsay-KDR-CDglyTK经PacⅠ酶切线性化后,以LipolifectmainTM2000介导转染293细胞,24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达,3～5d表达达到高峰,7～10d多数细胞变圆并出现噬菌斑后收集细胞,反复冻融4次。收集上清液再次感染293细胞以大量扩增病毒。所得病毒纯化后滴度达2×1012pfu/ml。PCR鉴定:扩增出2.4kb的CDglyTK基因片断和580bp的KDR启动子片断。二、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用1.重组腺病毒对细胞的感染效率采用不同感染复数（multiple of infection,MOI）的重组腺病毒Ad-KDR-CDglyTK分别感染MCF-7、ECV304及LS174T细胞,72h后观察发现:细胞的感染率随腺病毒滴度的增加而递增,当MOI=10时,仅少数细胞有荧光;当MOI=100时,80%以上的GFP表达;MOI=200时,95%以上细胞被感染,重组腺病毒对三种细胞具有相似的感染效率。2.重组腺病毒感染细胞CDglyTK基因表达通过RT-PCR检测发现,除感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞外,余各组均检测到目的基因的表达。3.重组腺病毒对各细胞的体外抑制效应以MOI=100的重组腺病毒AdKDR-CDglyTK感染各细胞株,加入不同浓度的前药后MTT法检测细胞生长抑制率。结果:感染腺病毒AdKDR-CDglyTK的MCF-7及ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,转基因细胞的存活率随前药浓度的增加而递减,呈浓度-效应关系。而感染腺病毒AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感,转基因细胞的存活率不随前药浓度的改变而变化,细胞存活率差异无统计学意义（P=0.816）。;当GCV浓度高于40μg/ml,5-FC浓度高于250μg/ml时,在相同前药浓度下,MCF-7、ECV304细胞存活率低于LS174T细胞,差异有统计学意义（P＜0.001）。4.旁观者效应将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系对MCF-7和ECV304细胞存在旁观者效应,对LS174T细胞无旁观者效应。在转基因细胞所占比例相同的情况下,MCF-7和ECV304细胞存活率低于LS174T细胞存活率,差异有统计学意义（P＜0.001）。三、survivin反义寡核苷酸对MCF-7、ECV304细胞的生长抑制效应1.MTT法检测各组MCF-7、ECV304细胞生长抑制率空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组之间相比,细胞生长抑制率差异无统计学意义（P＞0.05）。Survivin反义寡核苷酸作用的三组分别与空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组相比,细胞生长抑制率显着升高（P＜0.001）。经不同浓度的survivinASODN处理的细胞均受到抑制,随着survivinASODN浓度的增加,抑制作用越来越明显,呈浓度-效应关系,不同浓度ASODN组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。2.MCF-7、ECV304细胞survivin mRNA的表达对照组和survivinASODN处理组均在191bp处出现特异性的survivin条带。空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组之间比较,survivin mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml survivinASODN转染后,survivin mRNA表达与三组对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。随着ASODN浓度的增加,survivin mRNA的表达呈逐渐降低的趋势,不同浓度ASODN组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。3.MCF-7、ECV304细胞survivin蛋白的表达Survivin蛋白在MCF-7、ECV304细胞中有高度表达。空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml survivinASODN转染后survivin蛋白与三组对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。随着ASODN浓度的增加,survivin蛋白的表达呈逐渐降低的趋势,不同浓度ASODN组之问相比差异有统计学意义（P＜0.05）。4.Survivin ASOON对MCF-7、ECV304细胞凋亡率的影响经200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml survivinASODN处理MCF-7、ECV304细胞48h后,与空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组相比,survivinASODN组在G1期前出现明显的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率与三组对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。随着ASODN浓度的增加,细胞凋亡率呈逐渐上升的趋势,不同浓度ASODN组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。四、KDR启动子驱动双自杀基因和survivin反义寡核苷酸联合应用对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用1.SurvivinASODN对MCF-7、ECV304细胞的转染和重组腺病毒的感染效率转染400ng/ml survivin ASODN后,56%MCF-7细胞和51%ECV304细胞的胞核、胞浆见到棕色荧光。MOI=100的重组腺病毒感染细胞后,84%MCF-7细胞和78%ECV304细胞GFP表达阳性。SurvivinASODN和重组腺病毒联合作用后,52%MCF-7细胞和49%ECV304细胞内见到棕色荧光,与survivinASODN组比较无显着性差异（P＞0.05）;同时86%MCF-7细胞和72%ECV304细胞内有绿色荧光出现,与AdKDR-CDglyTK组比较无显着性差异（P＞0.05）。2.转基因MCF-7、ECV304细胞survivin蛋白表达Survivin蛋白在MCF-7、ECV304细胞中有高度表达。阴性对照组、AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）;但与survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。3.转基因细胞CDglyTK基因表达通过RT-PCR检测MCF-7和ECV304细胞,发现阴性对照组、survivinASODN组细胞中无CDglyTKmRNA表达,其余两组细胞中均有CDglyTKmRNA表达。4.基因转染对MCF-7、ECV304细胞的体外抑制效应阴性对照组细胞均对前药不敏感,当GCV、5-FC浓度分别高于40μg/ml、250μg/ml时,在相同GCV、5-FC浓度条件下,阴性对照组MCF-7、ECV304细胞存活率与其他组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。survivinASODN与AdKDR-CDglyTK基因联用后,随着前药浓度的增加,细胞存活率迅速下降,有显着性差异（P＜0.001）。当GCV、5-FC浓度分别高于40μg/ml、250μg/ml时,在相同GCV、5-FC浓度条件下,survivinASODN与AdKDR-CDglyTK基因联合作用组细胞存活率低于survivinASODN组或AdKDR-CDglyTK组,差异有统计学意义（P＜0.001）。但在GCV100μg/ml、5-FC2000μg/ml时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR-CDglyTK,两者间无显着差异（P＞0.05）。SurvivinASODN与AdKDR-CDglyTK两者联合使用的相互作用指数CDI值＜1,在GCV60μg/ml、5-FC500μg/ml时,CDI值＜0.7,但在GCV100μg/ml、5-FC2000μg/ml时,CDI值＞1。5.旁观者效应阴性对照组无旁观者效应,在相同比例混合细胞和相同前药浓度下,survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组细胞存活率均低于AdKDR-CDglyTK组和survivinASODN组（P＜0.05）,提示联合基因治疗组较单一基因治疗具有更强的旁观者效应。6.联合基因治疗后MCF-7及ECV304细胞的电镜观察电镜下观察:可见部分细胞体收缩、染色质边聚,有些胞核形态不规则,核发生碎裂,胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片（凋亡小体）,有些整个凋亡细胞被吞噬和降解。五、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统联合survivin反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应1.基因治疗对裸鼠移植瘤的抑制作用开始治疗前,阴性对照组、survivinASODN组、AdKDR-CDglyTK组、SurvivinASODN+AdKDR-CDglyTK组肿瘤平均体积无显着性差异（P＞0.05）。治疗结束时,阴性对照组肿瘤体积较治疗前显着增大（P＜0.001）,其他3组治疗组肿瘤体积均低于治疗前,有显着性差异（P＜0.05）。3组治疗组肿瘤体积均低于阴性照组肿瘤体积,有显着性差异（P＜0.001）。联合基因治疗组肿瘤体积与单一基因组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗结束后处死裸鼠,剥离肿瘤测重量,survivinASODN组、AdKDR-CDglyTK组、SurvivinASODN+AdKDR-CDglyTK组肿瘤重量较阴性对照组有不同程度的降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）。联合基因治疗组肿瘤重量与单一基因组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。抑瘤率测定可见联合基因治疗组明显高于survivinASODN组和AdKDR-CDglyTK组,差异在统计学上均有显着性意义（P＜0.05）。2.裸鼠移植瘤MVDCD34抗体染色大部分毛细微血管和单个内皮细胞。SurvivinASODN、AdKDR-CDglyTK组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组移植瘤MVD显着低于阴性对照组MVD（P＜0.05）,survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组肿瘤MVD最少,与survivinASODN组、AdKDR-CDglyTK组比较均有显着性差异（P＜0.05）。3.裸鼠移植瘤细胞survivin蛋白表达Survivin蛋白在裸鼠移植瘤细胞中有高度表达。阴性对照组、AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）;但与survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。4.裸鼠移植瘤细胞CDglyTK mRNA表达通过RT-PCR检测裸鼠移植瘤细胞,发现阴性对照组、survivinASODN组细胞中无CDglyTKmRNA表达,其余两组细胞中均有CDglyTKmRNA表达。5.裸鼠移植瘤细胞的电镜观察联合基因治疗组细胞皱缩,细胞膜微绒毛消失。细胞核膜亦发生皱缩或消失,染色质浓缩,沿核膜下排列成不同形状和大小的块状,或发生断裂,致密的凋亡小体亦较多见。结论1.本实验构建了KDR驱动CD/TK自杀基因系统的重组腺病毒,重组腺病毒对MCF-7细胞、ECV304细胞及LS174T细胞均具有较高的转染率,且对三者转染率相似;2.重组腺病毒能将KDR驱动的CD/TK融合基因转入MCF-7细胞及ECV304细胞中并进行有效表达,对MCF-7细胞及ECV304细胞具有靶向杀伤作用,这种杀伤作用具有浓度依赖性;3.该治疗体系的作用机制为对靶细胞的直接杀伤作用及旁观者效应;4.脂质体介导转染针对survivin mRNA的反义寡核苷酸可在mRNA及蛋白两个水平上有效地降低MCF-7,ECV304细胞内survivin的表达;5.经不同浓度的survivinASODN处理的MCF-7,ECV304细胞的增殖均受到抑制,随着survivin ASODN浓度的增加,抑制作用越来越明显,呈浓度-效应关系;survivinASODN的作用机制为诱导靶细胞的凋亡;6.KDR启动子驱动的双自杀基因重组腺病毒与survivinASODN可同时作用于MCF-7、ECV304细胞,而相互并不影响各自携带的基因在细胞内的转染;7.KDR启动子驱动的双自杀基因重组腺病毒和survivinASODN相互不影响各自携带的基因在MCF-7、ECV304细胞内的表达;8.在前药浓度较低时,AdKDR-CDglyTK和survivinASODN联合基因作用较单一基因对MCF-7,ECV304细胞具有更强的杀伤作用,并且两基因存在协同作用;9.AdKDR-CDglyTK和survivinASODN联合治疗组较单一基因表现出更强的旁观者效应;10.腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统和survivinASODN对乳腺癌裸鼠移植瘤及其MVD均具有明显的抑制作用,联合基因较单一基因具有更强的抗肿瘤和抑制MVD作用;11.Survivin蛋白在裸鼠移植瘤细胞中有高度表达,SurvivinASODN可下调survivin蛋白表达。重组腺病毒能将KDR驱动的CD/TK融合基因导入乳腺癌裸鼠移植瘤细胞中并进行有效表达;12.携带双自杀基因的重组腺病毒与survivinASODN可同时作用于乳腺癌裸鼠移植瘤细胞,而相互并不影响各自携带的基因在肿瘤细胞内的表达。
宋金娜[5]（2006）在《血管生成素对黑色素瘤细胞生长及对碱性成纤维生长因子表达的影响》文中研究表明血管生成素基于其促血管发生活性,最早作为肿瘤血管生成因子被分离出来。已知血管生成素在血管内皮细胞中进行核转移作用,在核仁中发生积累并刺激rRNA的转录,进而诱发内皮细胞的增殖促进血管发生。目前对于血管生成素的研究主要集中在其如何诱发肿瘤的血管发生,进而促进肿瘤的进一步生长和恶化。本文中我们研究血管生成素在黑色素瘤细胞生长中的作用,并分析血管生成素对于另一血管生成因子bFGF表达及功能的影响。我们将血管生成素的基因分别以正向和反向转入人黑色素瘤A375细胞中,得到了稳定的低表达和高表达血管生成素的细胞株。我们发现在转入反义血管生成素基因的细胞株中,细胞的增殖受到了抑制,同时bFGF诱发的细胞增殖也受到了抑制,但是bFGF的表达水平却提高了。相反,在转染正义血管生成素基因的细胞株中,细胞的增殖提高了,同时bFGF诱发的细胞增殖也提高了,但是bFGF的表达水平下降了。另外我们利用免疫荧光实验进行了血管生成素的核转移分析,发现血管生成素在A375细胞中能够进行核转移作用。进一步的免疫透射电镜实验分析表明血管生成素进入细胞核后,其在核仁的分布与rDNA的分布及rRNA的合成区域相同,可能其作用与rDNA相关。另外我们发现一种氨基糖苷类抗生素新霉素能够抑制血管生成素在A375细胞中的核转移作用。新霉素通过抑制血管生成素的核转移作用进而抑制细胞的增殖。综上,我们的结果表明血管生成素通过核转移作用促进A375细胞的增殖,并且参与bFGF诱发的细胞增殖作用。所以血管生成素除了其具有血管发生活性而对黑色素瘤的生长发挥重要作用外,还可以直接促进肿瘤细胞的增殖。而且我们还发现血管生成素对bFGF的表达具有负调节作用。因此以血管生成素为靶点可能会找到治疗黑色素瘤的新方法。
仲召阳[6]（2005）在《DNA损伤修复基因APE1 RNA干扰提高骨肉瘤抗血管生成治疗敏感性的研究》文中研究指明骨肉瘤是多发于青少年的富含血管的高度恶性肿瘤,其生长很大程度上依赖于血管的供应。目前疗效不佳,其中重要原因是瘤内存在伴发性肿瘤抵抗,而伴发性肿瘤抵抗和肿瘤血管生成特性相关。抗肿瘤血管生成治疗耐药性的获得可能与多种低氧反应性基因有关。DNA 损伤修复基因脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE1 具有核酸内切酶及氧化还原双功能,系低氧诱导细胞凋亡的重要保护基因,推测与抗肿瘤血管生成的耐药性有关。RNA 干扰（RNAi）技术阻断基因表达具有高稳定、高效率和高特异的特点,完全有可能作为一种新的分子生物学工具成为肿瘤基因治疗的新手段。通过RNAi 技术抑制肿瘤DNA 损伤修复基因APE1 表达,增加肿瘤细胞抗血管生成敏感性,有效清除肿瘤细胞,是肿瘤基因治疗的一项重要策略。本项目应用免疫组化检测骨肉瘤中APE1 表达,分析APE1 与骨肉瘤演进以及血管生成的关系。并应用RNA 干扰技术,构建人体APE1 siRNA 表达载体pSilence APE1,“敲除”骨肉瘤细胞APE1 基因的表达。通过裸鼠荷瘤实验,荷瘤生长曲线观察、蛋白印迹和免疫组化等技术,探讨APE1“敲除”骨肉瘤细胞对抗血管生成治疗的反应。研究目的1、探讨DNA 损伤修复基因APE1 在骨肉瘤中的表达及其与肿瘤演进、血管生成及患者预后的关系。2、构建骨肉瘤APE1 siRNA 表达载体pSilence APE1,并检测其对HOS 和9901骨肉瘤细胞APE1 蛋白表达的敲除作用,同时探讨其在抑制内皮细胞迁移过程中的作用。3、通过肿瘤生长、病理组织学、免疫组化以及激光共聚焦等技术,观察pSilenced APE1 对ES 抗裸鼠骨肉瘤移植瘤血管生成协同作用。研究内容和方法1、APE1 蛋白在骨肉瘤细胞中的表达及其与血管生成的关系。免疫组化SP 法检测五种骨肉瘤细胞株（HOS、U-2OS、Sa-OS-2、9901、9706）、10 例正常骨、10 例良性骨瘤和60 例骨肉瘤组织中APE1 蛋白表达,并根据CD34 和F
郑凯[7]（2004）在《Angiostatin对膀胱肿瘤新生血管抑制作用的实验研究》文中研究说明血管生成（angiogenesis）是指从已存在的血管床中产生出新生血管系统的复杂过程。正常血管形成被严格限定于某些特定短暂的生理过程，如胚胎发生、伤口愈合、女性月经期和妊娠期等，血管内皮细胞经过短暂的增殖后很快回到正常的静止状态。而持续的血管生成则是某些病理改变的特征，如慢性炎症、糖尿病性视网膜病变和肿瘤等，由于正常的血管生成调控机制失衡，血管生成变得十分活跃，这是疾病状态得以维持、延续和发展的基础。研究表明，实体肿瘤的生长不仅具有血管依赖性，而且在肿瘤转移过程中，血管生成也起着至关重要的作用。肿瘤形成早期（血管前期），没有血管生长，此期肿瘤不超过0.4mm3，呈缓慢的线性生长。当肿瘤大小超过0.4mm3时（血管期），肿瘤开始形成自身的血管系统，肿瘤生长加速，呈快速的近指数生长。因此，在“血管期”抑制肿瘤血管生成，切断肿瘤营养“供给线”，就能控制其生长和转移。抗血管生成治疗现已成为治疗肿瘤的研究热点。随着基因技术的迅速发展，血管治疗与基因治疗的结合应用在肿瘤治疗中显示出广阔的应用前景。 膀胱肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见实体瘤之一，临床上虽采取积极的手术治疗，并辅以放疗和化疗，但疗效不佳，死亡率较高，迫切需要开展新的治疗方法，以改善患者预后。尽管目前已开展了多种膀胱肿瘤的生物治疗方案，如过继免疫疗法、免疫导向疗法、细胞因子疗法、肿瘤疫苗、单克隆抗体及其交链物、基因治疗、基因重组药物等，但由于膀胱肿瘤细胞具有高度异质性和遗传突变性，往往使针对肿瘤细胞的生物治疗出现耐药性和毒副作用，严重影响了疗效。采用抗血管生成治疗膀胱肿瘤，具有其独特优势：1．内皮细胞较少变异，是遗传稳定的治疗靶；2．不产生耐药性；3．毒副作用小。抗血管生成治疗已有近30年历史，近十年来第四军医大学博士论文在血，管生成抑制因子研究方面取得了较大进展。 .Angiostatin是o’Reiliy等在1 994年研究小鼠低转移型路易氏肺癌（Lewis lungeareinoma-low metastase，LLe一LM）的皮下肿瘤时发现的。经研究证实angiostatin是纤维蛋白溶酶原（Plasminogell，Pgn）的氮末端序列，由Pgn的前4个kringles（K）区组成。angiostatin可抑制多种实体瘤血管生成和肿瘤生长，显示了良好的临床应用前景。目前，在治疗肿瘤过程中，多采用angisotatin及其片段的蛋白形式，需要剂量较大（最大用至IOom叭g），国外多以真核细胞（杆状病毒）表达angiostatin及其片段，过程烦琐，表达量较低，难以满足临床需要。为克服上述不足，本课题进行了以下研究:l目的l:探讨膀肤肿瘤患者血液及尿液中血管抑素含量与膀胧癌发展、转移、疗效及预后的关系及抗血管生成基因治疗人膀肤肿瘤的可行性。I方法l: 1.采用赖氨酸一酶联免疫吸附分析（切sine一ELISA）法检测膀肤移行细胞癌患者治疗前血清及尿液中血管抑素（angiostatin）的水平，以及治疗后血清中血管抑素的水平。 2.应用RT一PCR方法，以人胚胎肝细胞RNA为模板扩增获得含信号肤序列的劫git)statin基因片段，并将此基因片段构建在PcDNA3 .1（+）载体上; 3.利用脂质体基因转染技术将含人angiostatin基因片段的真核表达载体peDNA3 .1（+）一angiostatin转染入人膀肤肿瘤Blu一87细胞中，G4 15筛选，获得阳性克隆。 4.检测angiostatin转染的人膀肤肿瘤BIU一87细胞的生物学特性及体内外抑制血管的活性。[结果]: 1.膀肤移行细胞癌患者治疗前血清及尿液中血管抑素的水平明显高于正常对照组（尸<0.01），并与肿瘤大小、临床分期、分级及有无远处转移密切相关。膀耽移行细胞癌患者治疗后24h血清中血管抑素的水平并无显着降低（P>0.05），治疗后1周血管抑素水平明显降低，与治疗前差异显着（尸<0.01）。兰州军区总医院全军泌尿外科中心 2.经酶切和序列测定，表明人血管抑素基因已成功地克隆入真核表达载体peDNA3 .1（+），其阅读框正确，为人纤溶酶原（Pgn）N一末端的如ngles（l一4）片段，约1 Ikb。 3.采用原位杂交和RT一PcR等方法证实己成功地将PcDNA3.l.Angiostatin转染入BIU一87细胞;westem blot、免疫组化、免疫荧光等方法证实Angiostatin基因在实验组BIU一87膀肤肿瘤细胞中获得表达。 4.比较实验组、空载体组和对照组瘤细胞的生物学活性，发现上述三组体外培养的瘤细胞在超微结构、细胞周期和细胞生长速度上无显着差异（P>0.05）。表明血管抑素对人膀肤肿瘤细胞BIU一87本身生长无抑制作用。 5.脐静脉内皮细胞抑制实验（meth贝thiazol尹tetraZolium，MTT）和鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验（chick embryo chorioallantoic membrane，cAM）证实，在体外，该蛋白可抑制脐静脉血管内皮细胞生长;在体内，可抑制鸡胚血管生成。I结论l: 以上结果说明，膀耽移行细胞癌患者血液和尿液中血管抑素的水平在一定程度上可以反应膀肤移行细胞癌的发展及治疗情况。血管抑素angiostatin cDNA对Blu-87瘤细胞本身的生长无明显影响;在体外，其分泌的蛋白可抑制脐静脉血管内皮细胞生长;在体内，可抑制鸡胚血管生成。该结果说明，Angiostatin是一
买买艾力·玉山[8]（2020）在《rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究》文中研究表明目的:1)建立一个合理的可重复的大鼠负重长骨牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）模型,为今后进一步探讨和深入研究促进牵张成骨区骨再生与矿化的方法以及分子机制奠定基础;2)建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的获取和体外培养体系,并进一步扩增,纯化及鉴定。通过人重组血小板衍生生长因子-BB（rhPDGF-BB）基因慢病毒体外转染BMSCs并观察对BMSCs的影响;3)以大鼠自体BMSCs作为载体,通过体外携带rhPDGF-BB基因的慢病毒转染后,将rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs导入大鼠股骨牵张间隙中,探讨rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs对大鼠股骨牵张间隙新生骨再生矿化的影响,进一步为临床上应用牵张成骨技术（骨传送技术）治疗四肢大段骨缺损探讨一种快速而有效的缩短治疗周期的治疗方法。方法:1)大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立:选择雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠为实验动物,<6月龄,350-400g。使用自行研制的延长型外固定器,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,选择大鼠右侧股骨中段行截骨后用4枚螺钉固定延长型外固定器。术后经过7天潜伏期后进行缓慢牵张,速度为0.5mm/天（分两次）,连续牵张14天,共牵张延长7mm,牵张结束后固定牵张器。分别于牵张结束后第0周,2周,4周及8周四个时间点处死3只动物,处死前麻醉状态下行X线检查,处死后取出右侧股骨标本进行大体观察,组织学HE染色及番红固绿染色观察;2)大鼠BMSCs的分离培养,鉴定及rhPDGF-BB基因体外转染:大鼠自体BMSCs的培养和传代,通过细胞活性检测,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色方法进行细胞鉴定,通过应用密度梯度离心法获取生长状态良好第3代大鼠BMSCs经上述方法鉴定后进一步应用基因转染和下一步的治疗。构建同时携有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因和rhPDGF-BB基因的重组慢病毒载体后经体外扩增,纯化后转染大鼠BMSCs观察其体外对BMSCs的影响;3)rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs促进大鼠股骨牵张成骨效果的检测:应用自行研制的延长型外固定器将54只SD大鼠随机分为3组,每组于术后21天分别在牵张区局部注射等剂量rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs（实验组）,骨髓MSCs（实验对照组）,PBS（空白对照组）,活体X线检查于DO牵张结束后不同时间点进行4次,检测时间点为牵张结束（术后天21天）,矿化期2周（术后第35天）,矿化期4周（术后第49天）,矿化期8周（术后第77天）。矿化期第8周末处死动物取双侧股骨,并小心剔除骨组织表面肌肉进行Micro-CT,生物力学及组织病理学检测分析。结果:1)纳入本次实验研究的实验动物活体观察提示所有入组实验动物均耐受手术且顺利完成术后牵张成骨过程,观察期间所有实验动物的饮食及大小便均正常,牵张结束后延长侧股骨较对侧相比达到预定目标长度。通过标准X线检查和组织学观察证实大鼠股骨牵张模型牵张间隙成骨良好;2)应用密度梯度离心法成功分离了大鼠BMSCs,细胞活性检测结果提示细胞生长良好,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色结果提示表达高水平的ALP活性,矿化细胞外基质,形成矿化结节。构建出的rhPDGF-BB基因体外转染鉴定过的大鼠BMSCs,转染后对细胞的生长无明显影响;3)rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs局部应用于大鼠股骨牵张模型。X线片显示,矿化期第8周实验组10只延长区均达到骨性愈合,实验对照组和空白对照组分别为5只和4只达到骨性愈合的标准。生物力学测试（三点力学测试）结果表明实验组所有抗扭强度指标均显着优于其他两个对照组,且实验组抗扭强度指标与自体对侧未牵张正常股骨的抗扭强度相当。Micro-CT扫描后获得的数据结果分析提示矿化期第8周实验组牵张区间隙内新生骨骨痂的主要构成结构由皮质骨构成而松质骨结构极为少见,此外牵张间隙新生骨矿化区可见骨髓腔部分或全部与牵张两骨端骨髓腔基本贯通,其构成和结构与自身长骨管状骨的结构基本类似,而其他两对照组牵张区间隙内新生的骨组织以松质骨结构为主且骨髓腔结构改建较差。矿化期第8周获取的股骨标本行组织学切片后HE和Safranin O染色结果提示,实验组牵张间隙新生骨痂内软骨组织残留较少而两个对照组牵张区间隙新生骨组织结构上仍有部分软组织结构,新生骨已经矿化,皮质骨已连续,骨髓腔开始重建,提示rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs治疗处理后新生骨痂矿化明显。免疫组化结果提示三组中实验组OPN、OCN、VEGF和CD31表达高于两对照组。结论:1)自制延长型外固定器能够满足大鼠单侧股骨牵张的要求,牵张成骨的潜伏期成骨与骨折愈合过程类似,但牵张成骨在其特有的牵张期和矿化期的时间段里牵张区间隙新骨再生具有其特有的组织学变化特点。本实验部分通过所获得的大鼠股骨参数,自制研发出适用于研究SD大鼠股骨牵张成骨模型的微型单边可延长型外固定装置,并顺利构建出可重复性较高适合大批量SD大鼠DO实验研究的动物模型,为今后利用DO动物实验模型并通过细胞或基因治疗缩短治疗周期或DO过程中的细胞分子机制的研究提供动物模型实验平台;2)密度梯度离心法获取的大鼠BMSCs体外培养结果提示其增殖活性较强,鉴定结果提示其可作为本次实验研究进行细胞治疗以及基因治疗较为理想的种子细胞。目的基因靶细胞转染后在不同时间点通过不同倍数荧光显微镜下观察结果提示,脂质载体介导的瞬时转染可以使rhPDGF-BB基因在BMSCs中成功表达;3)X线,Micro-CT,生物力学,组织学和免疫组织化学观察都证实,与单纯BMSCs及PBS相比,rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs可较为有效的促进大鼠股骨牵张间隙区成骨过程中新骨的形成和矿化。应用rhPDGF-BB基因体外转染BMSCs于牵张结束后局部应用能够促进牵张成骨中的骨再生从而缩短DO治疗周期,为临床上应用牵张成骨（骨传送）技术治疗骨缺损提供了一个新的策略。
李胜[9]（2019）在《唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路对骨肉瘤细胞系凋亡的作用》文中进行了进一步梳理目的:骨肉瘤来源于间叶组织,多发生在骨组织,是一种常见于青少年或儿童的恶性骨肿瘤,男性患者多于女性,它的病程进展快、肺部转移早、预后不良、易复发,甚至死亡。目前骨肉瘤的治疗包括通过手术措施尽量完整切除病灶以及围手术期的抗肿瘤的综合辅助治疗。新辅助化疗作为化疗的首选,其不仅可以增加手术的安全性,而且能够为患者量身定制合适的假体做好准备。但目前化疗的药物品种有限,常伴随明显的全身毒副反应,给患者带来痛苦,寻找更多有效、副作用小的药物以及阐明其作用原理势在必行。唑来膦酸是具有代表性的、副作用小的第三代二膦酸盐,它具有骨代谢调节的特性,在体外能够起到抑制破骨细胞活动的作用,进而导致破骨细胞调亡,所以能够抑制骨破坏活性增加诱发的骨质吸收。另外有研究显示,唑来膦酸还可以抑制或粘滞肿瘤细胞基质释放的多种刺激因子引起的破骨细胞活动增强和骨钙释放,从而减缓骨转移的进展和发生,并可一定程度上的导致骨肉瘤细胞的死亡。PI3K/AKT信号通路是参与多数细胞的分化调节、生长、繁殖的信号转导通路。AKT别称蛋白激酶B在活化后,继续激活它的下游因子（GSK-3β等）,起到调节细胞周期、凋亡的作用。糖原合成激酶3β是关键的糖原合成酶,依赖其底物的磷酸化调节多个重要的细胞信号通路。大量的研究结果表明GSK-3β在骨肉瘤中表达增高,抑制其活性骨肉瘤细胞凋亡发生改变。Wnt信号通路参与骨髓基质干细胞的分化与更新,影响成骨及破骨细胞的生成分化,调节骨骼修复,对骨骼的生长发育、再生、重塑起到关键作用。Wnt信号通路能够引起β-连环蛋白β-Catenin的降解复合体包括Axin、APC、CK1、GSK-3β等,使细胞内β-Catenin积累、游离的β-Catenin进入细胞核,从而调节基因表达。本文旨在研究唑来膦酸对骨肉瘤细胞系的生物学行为的影响;唑来膦酸作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞后PI3K-AKT、Wnt信号通路相关重要蛋白、基因表达影响。研究方法:1、采用MTT法检测骨肉瘤MG-63细胞在分别加入0、25、50、100、200μmol/L唑来膦酸后24、48、72h后细胞活力变化;在50%抑制率药物浓度时间作用后,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞活力变化。2、划痕实验明确骨肉瘤MG-63细胞在分别加入0、25、50、100、200μmol/L唑来膦酸,24、48、72h后细胞侵袭迁移力及凋亡状态;3、透射电镜观察骨肉瘤MG-63细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡情况变化;4、流式细胞仪检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡情况变化;5、蛋白印迹方法Western Blot检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用48h后,随着唑来膦酸作用药物浓度的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达情况;检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸100μmol/L作用24、48、72h后,随着唑来膦酸作用时间的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达情况;检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在给予唑来膦酸50%抑制率药物浓度时间后（100μmol/L、48h）,对照组、实验药物组、单纯GSK-3β抑制剂组、GSK-3β抑制剂+实验药物组β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1的蛋白表达情况。结果:1、MTT结果显示,骨肉瘤MG-63细胞随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,细胞活力抑制率及凋亡程度增加,50%抑制率约为药物100μmol/L作用48h;单纯GSK-3β抑制剂组与对照组比较无明显差异,GSK-3β抑制剂+实验药物组结果能够抑制细胞活力,但与相同条件实验药物组比较具有保护细胞活力的作用。2、划痕实验结果显示,骨肉瘤MG-63细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用24、48、72h后,随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,细胞迁移能力受到抑制,细胞出现明显凋亡变化。3、透射电镜结果显示,骨肉瘤MG-63细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组细胞结构完整;实验药物组及GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡明显,以实验药物组效果显着。4、流式细胞仪检测结果显示,骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组细胞轻度凋亡,实验药物组及GSK-3β抑制剂+实验药物组细胞凋亡程度明显,以实验药物组凋亡率更高。5、蛋白印迹方法Western Blot结果显示骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在100μmol/L唑来膦酸作用48h后,对照组及单纯GSK-3β抑制剂组β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1蛋白结果表达相当;实验组及GSK-3β抑制剂+实验药物组的β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1蛋白表达下降,以实验组显着;骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸0、25、50、100、200μmol/L作用48h后及100μmol/L作用24、48、72h后的结果显示,随着唑来膦酸作用时间及药物浓度的增加,P-AKT、P-GSK-3β的蛋白表达降低。结论:1、唑来膦酸在体外具有抑制骨肉瘤MG-63细胞生长、促进其凋亡的作用;2、唑来膦酸作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞后,GSK-3β下游的蛋白β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1表达降低;实验组给予GSK-3β抑制剂Li2CO3后,β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1的表达较实验组升高,说明唑来膦酸通过GSK-3β/β-Catenin信号通路影响骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡。3、唑来膦酸可以使P-AKT、PGSK-3β表达下降,进而影响其下游蛋白β-Catenin、c-Myc、Cyclin-D1表达下调,说明唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路影响骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡。
流小舟[10]（2016）在《Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究》文中认为研究背景作为一种恶性的成骨性肿瘤,骨肉瘤的主要来源是骨组织,通常其多见于骨生长活跃的年轻人当中,由于其恶性程度高,侵犯范围较大,而且容易发生早期肺部的转移,因此往往治愈难度大,过去单一治疗效果不够理想,五年内存活率不足两成,尽管有关新辅助化疗以及保肢手术的探究日益深化,愈来愈多的骨肉瘤病患能够保留自身的肢体,延续自己的生命年限。但是在诊断方面,到目前仍然没有可识别性标志物,在骨肉瘤分化比较差的时候仅仅通过观察形态来作出诊断,因此病理判断的精确性不够。同时肿瘤的复发和转移等恶性生物学行为仍然是很大程度上影响着患者的预后、导致骨肉瘤患者生存率不理想,进而导致骨肉瘤患者治疗失败的主要因素。目前相关的基础研究对骨肉瘤病因及转移发展机制仍未有重要的突破,在临床上也没有新的药物和新的治疗模式产生,因此寻找新的研究突破点、探讨人骨肉瘤的侵袭和转移机制显得至关重要。既往针对肿瘤细胞的杀伤主要包括化疗和放疗介导的细胞凋亡,而这正是由肿瘤细胞可以抑制自身凋亡、促进自身存活力增强的共同特征所决定的。正常细胞的凋亡机制受到抑制导致肿瘤的发生,而肿瘤细胞的凋亡机制紊乱导致肿瘤的不断增殖是困扰和限制临床治疗及肿瘤基础学研究进一步发展的核心问题。究其根本,包括IAPs家族在内的多种凋亡抑制基因参与其中、相互协调作用是该问题的关键。IAPs家族负责编码一组结构相似、功能相关的蛋白,这一家族的大多数成员可以借助直观层面的联合与阻止特定的Caspase来抑制细胞凋亡,是调控启动Caspase和效应Caspase的唯一内源性蛋白。迄今为止,在人体新发现的IAPs家族有8个成员,即NAIP、XIAP（ILP-1/MIHA）、cIAP-1（HIAP-2/MIHB）、Survivin（TIAP）、Apollon（Bruce）、cIAP-2（HIAP-1/MI-HC）、ILP-2（Ts-IAP）与Livin（ML-IAP/KIAP）。其中Survivin是近几年发现的一个IAPs家族中的成员,因其在正常人体的组织内均无明显表达,而在恶性肿瘤组织中呈特异性高表达,因此将Survivin作为连接细胞凋亡和细胞周期的纽带,同时作为促进骨肉瘤细胞凋亡、治疗骨肉瘤组织生长的针对性靶点是我们未来研究骨肉瘤靶向疗法的潜在性突破口和该领域研究的热点。Survivin基因由Ambrosini等借助ECPR1内的cDNA自人类基因库内选取,该基因全长15kb,其位置在17q25染色体上,存在的外显子数量是4个,内含子的数量是3个,在进行一定的编码程序以后,就会产生内含142个氨基酸的Survivin蛋白,有别于IAP家族的其他成员,截止到目前,Survivin不仅是家族中最新发现,也是分子量最低的凋亡抑制蛋白。因此其在功能上也一定程度的有别于IAP家族的其他成员,即:干预细胞凋亡的同时也参与细胞有丝分裂及其他细胞阶段性的周期变化,还在肿瘤滋养血管出现和转移性生长进入其它器官的过程中发挥作用:（1）遏制细胞凋亡的功效:①Survivin借助BIR功能区的妨碍凋亡相关的氨基酸残基Trp67、Pro33和Cys84直接作用于Caspase-3、Caspase-7,在干扰他们活力的同时可以进一步起到干扰凋亡的作用。②Survivin借助和细胞附件控制因子CDK4产生Survivin-CDK4,这种混合产物可以使P21自CDK4内能够被释放出来,而P21可以和Caspase-3发生关联,进而能够对Caspase产生一定的约束性,防止细胞出现凋敝的情况。③近几年研究指出,Survivin是周期蛋白激酶p34cdc-cyclinBl在有丝分裂阶段中形成的底物,磷酸化Survivin Thr34之后可以再和Caspase-9发生关联,防止依赖于Caspase-9发挥作用的相关细胞凋亡因子的转导传输。（2）调节细胞周期的功效:Survivin与CDK4结合后,竞争性地抑制CDK4/p16（INK4a）复合物的形成,活化CDK2/cyclin E,磷酸化Rb,从而加快G1期向S期的转换。在G2/M期特异性表达,Survivin因其羧基末端无RING锌指结构,代之以一个长度为6.5nm、由40个氨基酸组成的α螺旋结构,在有丝分裂的初期,Survivin借助这一架构和有丝分裂纺锤体内存在的microtubule结构发生特定可饱和作用,加速有丝分裂、促进恶性肿瘤细胞繁殖的同时避免因先天遗传或后天突变引起的细胞自然或非自然死亡。（3）参与血管形成的功效:VEGF在肿瘤组织中可以导致肿瘤滋养血管的生成,而Survivin在该过程中具有保障血管内皮组织与新生血管出现的关键价值。0’ Connor等指出血管内皮细胞中的Survivin可以在VEGF与bFGF的介导下较呈现高表达状态。Tran等分析认为,在稳定细小血管网架构、保障血管内皮细胞性能、使肿瘤血管内皮细胞产生化疗药物耐药性等方面,Survivin均发挥了一定的作用。Coma等制备了针对Survivin的反义寡核苷酸,在沉默Survivin的表达后发现由TNF介导的VEGF的抗凋亡活性降低,而Survivin的表达与VEGF的表达又呈正相关,提示二者在骨肉瘤的血管生成过程中发挥协同作用。由此可见,肿瘤尤其是骨肉瘤的发生、发展及转移的确是一个十分复杂的过程,目前骨肉瘤发生及转移原因尚未得到阐明。细胞凋亡作为一种高度保守的细胞死亡机制,又被称为程序性细胞死亡,其具有组织、生化和形态学方面特性。由于肿瘤的生长和发展取决于肿瘤细胞的增殖率与凋亡率之间的平衡,这种平衡一旦打破,一方面,那些在生理状态下需要及依赖于凋亡程序发挥作用的组织内环境稳定性及胚胎细胞发育过程会发生紊乱。而另一方面,干扰细胞的凋亡又能够导致细胞存活时间很大程度延长,基因突变体的聚积从而诱发肿瘤的形成、促进肿瘤转移、增强肿瘤化疗耐药性。因此伴随着肿瘤分子遗传学、分子生物学,特别是靶向肿瘤分子学的进步,找到细胞凋亡机制中作用于骨肉瘤的发生、发展、侵袭、转移全过程的有效靶点是现今从事骨肉瘤研究的学者们迫切希望解决的重中之重。从当前的研究我们能够看出,骨肉瘤组织里的Survivin基因的异常表达有可能促使肿瘤细胞脱离生长监控的范围,克制肿瘤细胞的凋亡。有学者提出,Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。还有的研究利用Cox多变量回归模型展开剖析,对骨肉瘤病患的Survivin表达程度配合化疗前化疗敏感性的预期展开预估,最终得出Survivin蛋白表达的上调同骨肉瘤组织发生发展密切相关,且Survivin可以作为骨肉瘤诊断和判断预后的一个标志物。Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。因为凋亡遏制蛋白Survivin于肿瘤组织中选择性的高表达,我们可以这样进行假设:抑制Survivin有可能导致骨肉瘤细胞的自发性凋亡,我们在既往的实验中证实了在骨肉瘤细胞系U20S、SAOS及MG63中,Survivin的表达明显增加,这在我们后续对比骨肉瘤组织和正常组织中Survivin表达的实验中也得到证实。我们还发现采用Survivin反义寡核苷酸技术可以降低Survivin在骨肉瘤细胞中的表达,显着抑制骨肉瘤细胞增殖并呈现出浓度依赖性,从而诱导骨肉瘤中的细胞凋亡。根据以往研究结果,我们进一步提出假设:是否存在着一种下游信号传导通路元件,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用;而在体内环境中,抑制Survivin又能否影响骨肉瘤瘤体的生长。肿瘤的转移囊括了肿瘤细胞于间质里移动并且接触脉管、肿瘤细胞突破血管内皮还有内皮下的基底膜展开血流,而且在血液里存活、肿瘤细胞穿出血管,于组织里生长、增殖,产生转移灶。因此我们能够看到,肿瘤的转移和细胞之间、细胞同细胞之外基质二者之间的的粘附作用存在一定关系。但是此类相互辨别以及作用是需要CAMs在其中发挥其介导作用的。整个CAMs家族里的一个关键元素即整合素,它是利用非共价键将α以及β两种亚单位链接所组成的的异二聚体分子。根据该家族中当前所发现的二十五个α亚单位以及十一个β亚单位,可以一起构成不下数十种不一样的整合素。这两种亚基构造有相似之处,都是通过较长的胞外段（氨基端）、跨膜段、较短的胞内段（羧基端）三部分一起组成的。α亚基凭借其胞外段能够对于ECM的RGD序列加以辨别,介导细胞与ECM二者的粘附,而β亚基的胞内段同细胞骨架构连接在一起。整合素与配体结合发挥其功能,故整合素按识别配体的不同又可分为三大类,本文所讨论的整合素α 5属于其中识别非RGD序列的整合素,其配体为基底膜蛋白,例如层黏连蛋白（LN）以及纤维连接蛋白（FN）等,而胶原蛋白正是骨组织的主要细胞外基质成分,近来人们发现骨组织中整合素的表达水平对成骨和吸收具有调控作用,提示整合素与很多骨代谢疾病甚至成骨、溶骨病变的病理机制有关。除了介导细胞与基底膜、细胞与细胞的粘附,整合素同时具有通过与其配体结合后向细胞内传递信号,进而影响基因的表达,最后影响细胞的增殖代谢、基因转导、凋亡等生物学行为的功能。有文献报道,在整合素α 5和Survivin促进骨肉瘤细胞的增殖作用过程中,Caspase-3均起到介导作用;整合素α5和Survivin有可能直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程。三者可能共同参与骨肉瘤细胞的恶性生物学行为。可见,整合素很有可能对骨肉瘤的生长、发展、侵袭、转移过程产生非常重要的影响,而这种影响是在与Survivin相互协调、相互作用中完成的。当前针对Survivin的敲低或敲除实验为骨肉瘤靶向基因治疗提供了理论依据和方向。而相对于反义寡核苷酸技术来说,RNA干扰技术（RNAi）具有转染效率高、转染效果稳定、特异性强、浓度依赖性好、潜在毒性弱、作用时间充分、维持时间较长、实验准备及操作简便的优点。该项技术是由Fire于1998年首先在研究秀丽新小杆线虫（C.elegans）反义RNA的过程中发现并证实是一种由dsRNA介导的同源RNA降解过程,已逐渐成为公认的实验技术和治疗手段。其原理是在生物体细胞内,利用具备同源性的dsRNA诱使序列特异的特定基因的沉默,快速的防止目标基因活性。siRNA就是RNAi途径中间的产物,或者说也是RNAi发挥作用的必不可少的因素,现如今应用在现实治疗过程中的siRNA类型基本上有两种:体外形成的RNA干涉片段以及DNA干涉载体。由于前者转染效率还存在RNAi功效的瞬时性程度不够,现在大多数应用DNA载体于细胞里表达siRNA相关技术。杨彤涛等对于Survivin基因的RNA干涉特异性片段进行合成,利用骨肉瘤细胞体外生长还有体内移植成瘤试验,证明Survivin的特异性siRNA能够大大促进骨肉瘤细胞自行凋亡的过程。能够看出在有关骨肉瘤的实验性治疗过程里,RNAi能够对于癌基因的表达加以遏制、对于突变激活的癌基因进行清除、克制基因扩增的同时,还能够克制融合基因表达、克制其他肿瘤有关基因的表达。Zou等利用干扰RNA技术并且应用依泊托苷、阿霉素等有关的化疗药物,能够很明显的克制MG63细胞的产生,提升化疗的敏感程度,实验的结果显示出关于Survivin的干扰RNA技术能够提升化疗的效果,进而降低所使用化疗药物的数量,降低因药物所产生不良反应的发生,实现对骨肉瘤细胞生长的有效抑制,显示出抑制Survivin基因联合化疗治疗骨肉瘤的优越性。综上所述,我们拟进行对Survivin及整合素α 5与骨肉瘤恶性行为特性的关系的研究,评价针对Survivin的干扰RNA技术治疗后骨肉瘤细胞内整合素α 5表达的变化情况;分析Survivin与整合素α 5的上下游调控关系,观察上述治疗手段对骨肉瘤组织体内生长的影响,明确Survivin能否通过整合素α 5产生对骨肉瘤细胞的体外、体内作用,使Survivin-SiRNA及整合素α5特异性抗体成为骨肉瘤靶向治疗的新手段。第一章:针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株的制备及体外验证研究目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株,对比分析转染后Survivin在骨肉瘤细胞中的含量,以验证转染效果。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）和空白对照组（空脂质体转染）,再采用Western blot技术检测三组MG63细胞转染后Survivin蛋白的含量,并进行比较。结果:Western blot检测得出的结果显示出MG63细胞裂解液里具备特异性的Survivin蛋白条带。Survivin-SiRNA能降低MG63细胞内Survivin蛋白的表达,Survivin-SiRNA转染骨肉瘤细胞系MG63后Survivin蛋白的含量相比较于阴性对照组和空白对照组中细胞内Survivin蛋白的含量均是下降的。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着降低了骨肉瘤MG63细胞中Survivin蛋白的含量,进一步证实了 Survivin-SiRNA可以成功抑制Survivin的表达。该转染细胞株的制备为的后续体外细胞学及体内组织学实验积累了相关经验,奠定了理论基础。第二章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,再采用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。结果:Transwell实验结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,侵袭细胞数显着减少（P<0.01）。而细胞划痕实验结果也显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。进一步证实了抑制Survivin的表达可以影响骨肉瘤细胞的发生发展,提示Survivin不仅与骨肉瘤原位生长密切相关,而且可能参与了骨肉瘤远处转移的过程。第三章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5表达水平的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤中整合素α5表达水平的影响,验证整合素α 5是否为Survivin的下游信号传导通路元件。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,再采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平,并进行比较。结果:通过流式细胞术和荧光显微镜进行观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,整合素α 5的表达水平受到显着抑制（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5的表达水平。进一步证实了针对性抑制Survivin的表达可以下调骨肉瘤细胞中整合素α 5的表达,这说明Survivin可能是整合素α 5的一种上游调节剂,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用。第四章:靶向治疗整合素α 5对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的整合素α5-SiRNA转染细胞株,在验证转染效果后探讨整合素α 5-SiRNA以及靶向抗整合素α 5抗体对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向整合素α5的整合素α5-SiRNA对MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scrαmble RNA转染）,采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平以验证转染效果,之后利用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。再使用靶向抗整合素α 5抗体（M200）作用于骨肉瘤MG63细胞,通过Transwell实验及细胞划痕实验继续观察、比较靶向治疗后MG63细胞的侵袭和迁移能力。结果:Transwell实验结果显示经转染整合素α 5-SiRNA后以及抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞分别与阴性对照组进行比较,发现侵袭细胞数均显着减少（P<0.01）。而细胞划痕实验结果也显示抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降（P<0.01）;而阴性对照组在48h内的划痕区域中细胞迁移率甚至超出转染整合素α5-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞的两倍之多（P<0.01）。结论:无论是靶向干扰RNA还是靶向抗体治疗均显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。一方面证明了整合素α 5的表达与骨肉瘤细胞侵袭和转移的相关性。另一方面也提示靶向抑制整合素α 5的表达可以直接达到治疗效果,从而为更新骨肉瘤临床治疗方案提供了理论依据。第五章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞体内实验的影响目的:将针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株移植到裸鼠体内,建立了骨肉瘤动物模型,观察其体内生长成瘤情况。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,之后将两组细胞分别接种至裸鼠腹部的左、右两侧皮下。接种三个星期后,处死小鼠并称重肿瘤。观察肿瘤体积,计算肿瘤的平均重量,并进行比较。结果:通过肿瘤称重和肉眼观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞成瘤体积和重量均较阴性对照组明显缩小和下降（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的体内生长成瘤情况。进一步证实了抑制Survivin的表达可以减缓异种移植瘤的生长,提示Survivin在骨肉瘤增殖繁衍过程中的重要作用。
二、反义基因转染抑制骨肉瘤中血管内皮生长因子表达的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反义基因转染抑制骨肉瘤中血管内皮生长因子表达的研究（论文提纲范文）
（1）抑制VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA干预骨肉瘤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题来源、研究目的、意义和国内外研究现状 |
| 1.2 论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 实验试剂配制 |
| 2.1.3 细胞计数 |
| 2.1.4 细胞株和siRNA |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验流程与方法 |
| 2.3.1 构建单靶和一链双靶siRNA |
| 2.3.2 MG-63和Saos-2 细胞的培养 |
| 2.3.3 MG-63和Saos-2 细胞的转染 |
| 2.3.4 QRT-PCR检测细胞mRNA表达 |
| 2.3.5 Western blot检测细胞蛋白表达 |
| 2.3.6 MTT法检测各转染组细胞的增殖水平 |
| 2.3.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.8 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 2.3.9 血管形成试验 |
| 2.3.10 细胞免疫组化染色 |
| 2.3.11 细胞免疫荧光染色及激光共焦距显微镜观察 |
| 2.4 统计学处理 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 骨肉瘤MG-63和Saos-2 细胞的培养 |
| 3.2 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞VEGF和Survivin m RNA和蛋白表达的影响 |
| 3.3 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.4 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞迁移的影响 |
| 3.5 VEGF siRNA,Survivin siRNA和一链双靶siRNA对 MG-63和Saos-2 细胞血管形成的影响 |
| 3.6 细胞免疫组化和细胞免疫荧光化学染色结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 在攻读博士学位期间公开发表的论文与参加的项目 |
| 致谢 |
（2）IncRNA TUG1在子宫内膜癌中的生物学行为作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一部分 lncRNA TUG1和VEGFA在子宫内膜癌组织、细胞中的表达 |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二部分 lncRNA TUG1通过竞争性结合miR-299和miR-34a-5p调控VEGFA |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 结论及展望 |
| 1. 全文结论 |
| 2. 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 lncRNA在子宫内膜癌细胞生物学行为调控机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表(Abbreviation) |
| 博士生期间完成的论文 |
| 致谢 |
（3）血管生成素与碱性成纤维生长因子之间相互作用关系及其分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一、肿瘤血管生成和血管生成因子简介 |
| （一） 肿瘤血管生成简介 |
| （二） 血管生成因子简介 |
| 二、血管生成素基因及其研究进展 |
| （一） 血管生成素的结构与性质 |
| （二） 血管生成素的生物学功能 |
| （三） 血管生成素的作用机制 |
| （四） 血管生成素与肿瘤 |
| 三、bFGF 基因及其研究进展 |
| （一） bFGF 的结构与性质 |
| （二） bFGF 的作用机制 |
| （三） bFGF 的生物学作用 |
| （四） bFGF 与肿瘤 |
| 四、本论文研究的内容和意义 |
| 第二部分 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| （一） 质粒 |
| （二） 哺乳动物细胞系 |
| （三） 主要试剂 |
| （四） 主要仪器 |
| 二、实验方法 |
| Ⅰ.分子生物学试验方法 |
| （一） 分子克隆 |
| （二） DNA 的琼脂糖电泳 |
| （三） 质粒的大量制备 |
| （四） 哺乳动物细胞基因组的提取及PCR |
| （五） 哺乳动物细胞总 RNA 的提取 |
| （六） 逆转录PCR（Reverse Transcription，RT-PCR） |
| Ⅱ.细胞生物学实验方法 |
| （一） 哺乳动物细胞系的培养 |
| （二） 真核生物细胞的瞬时转染和稳定转染 |
| （三） 真核生物细胞的瞬时转染和荧光素酶报告基因检测 |
| （四） 蛋白质的SDS-PAGE 和Western Blot 分析 |
| （五） 酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay， ELISA） |
| （六） MTT 细胞活性检测实验 |
| （七） 集落形成实验 |
| Ⅲ.统计分析 |
| 第三部分 实验结果与分析 |
| 一、bFGF 对血管生成素表达和肝癌细胞增殖的影响 |
| （一） 高表达和低表达bFGF 的H7402 稳定转染细胞系的建立 |
| （二） 稳定转染正义和反义bFGF 基因对血管生成素基因表达的影响 |
| （三） 稳定转染正义和反义bFGF 基因对H7402 细胞增殖的影响 |
| 二、血管生成素对bFGF 表达的影响 |
| （一） 高表达和低表达血管生成素的HeLa 稳定转染细胞系的建立 |
| （二） 血管生成素负调控bFGF 的表达 |
| 三、血管生成素与bFGF 相互作用关系的分子机制 |
| Ⅰ. 机制一：血管生成素作为反式作用因子参与BFGF 基因的调控 |
| （一） bFGF 启动子报告基因质粒的构建及鉴定 |
| （二） 血管生成素抑制bFGF 基因启动子的活性 |
| （三） 血管生成素在bFGF 基因启动子上作用区间的确定 |
| Ⅱ. 机制二：血管生成素与bFGF 之间可能存在着负反馈调节 |
| （一） bFGF 刺激自身启动子的活性 |
| （二） 外源的bFGF 补偿了血管生成素对bFGF 启动子活性的抑制 |
| 第四部分 讨论 |
| 一、bFGF 在蛋白水平负调控血管生成素的表达 |
| 二、血管生成素负调控bFGF 的表达 |
| 三、血管生成素与bFGF 相互作用关系的分子机制 |
| 主要结论和创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
| 在学期间参加科研项目情况 |
（4）KDR启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸治疗乳腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动双自杀基因对MCF-7及ECV304细胞的靶向杀伤作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Survivin反义寡核苷酸对MCF-7及ECV304细胞的增殖抑制作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 KDR启动子驱动双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对MCF-7及ECV304细胞的体外特异性杀伤作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 KDR启动子驱动双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对乳腺癌裸鼠的体内抑瘤作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述(1) |
| 综述(2) |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）血管生成素对黑色素瘤细胞生长及对碱性成纤维生长因子表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 一、血管生成因子与肿瘤的关系 |
| (一) 血管生成简介 |
| (二) 血管生成与肿瘤 |
| (三) 抗血管生成的肿瘤治疗 |
| (四) 血管生成因子简介 |
| (五) 血管生成因子对肿瘤的生长、转移及预后的意义 |
| 二、血管生成素的结构功能及与肿瘤的关系 |
| (一) 血管生成素的结构与性质 |
| (二) 血管生成素的生物学功能 |
| (三) 血管生成素的作用机制 |
| (四) 血管生成素与肿瘤 |
| (五) 血管生成素的抑制剂 |
| 三、bFGF的结构功能及与肿瘤的关系 |
| (一) bFGF的结构与性质 |
| (二) bFGF的作用机制 |
| (三) bFGF的生物学作用 |
| (四) bFGF与肿瘤 |
| 四、黑色素瘤的研究进展 |
| (一) 黑色素瘤简介 |
| (二) 黑色素瘤与血管生成因子 |
| (三) 血管生成素在黑色素瘤中的表达及其作用 |
| (四) bFGF在黑色素瘤中的表达及其作用 |
| (五) 抗血管生成因子的黑色素瘤治疗 |
| 第二章 引言 |
| 一、研究背景和立题依据 |
| 二、本文的研究内容和意义 |
| 第三章 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| (一) 细胞和质粒 |
| (二) 主要试剂 |
| (三) 主要仪器 |
| 二、实验方法 |
| (一) 大量制备质粒的方法 |
| (二) 哺乳动物细胞培养 |
| (三) 哺乳动物细胞转染 |
| (四) 哺乳动物细胞基因组的提取 |
| (五) 哺乳动物细胞总RNA的提取 |
| (六) 逆转录PCR (RT-PCR) |
| (七) 酶联免疫吸附实验 |
| (八) SDS-PAGE 电泳及Western Blotting |
| (九) 免疫荧光 |
| (十) 免疫胶体金透射电镜 |
| (十一) MTT法 |
| 第四章 实验结果与分析 |
| 一、稳定转染血管生成素基因的细胞株的获得 |
| (一) 质粒的制备及电穿孔转染与筛选 |
| (二) 阳性细胞克隆的鉴定 |
| 二、外源血管生成素基因的转入对细胞内源血管生成素表达的影响 |
| (一) 外源血管生成素基因的转入对细胞内源血管生成素m RNA 表达的影响 |
| (二) 外源血管生成素基因的转入对细胞内源血管生成素蛋白表达的影响 |
| 三、血管生成素对A375 细胞生长的影响 |
| (一) MTT 法实验条件的确定 |
| (二) 血管生成素对细胞增殖的影响 |
| 四、血管生成素在A375 细胞中进行核转移作用 |
| (一) 血管生成素核转移作用的免疫荧光分析 |
| (二) 免疫电镜分析血管生成素在细胞核中的定位 |
| 五、新霉素对A375 细胞的增殖具有抑制作用 |
| (一) 新霉素抑制血管生成素在A375 细胞中的核转移作用 |
| (二) 新霉素抑制A375 细胞的增殖 |
| 六、血管生成素对bFGF 表达的影响 |
| (一) 外源血管生成素基因的转入对细胞bFGF mRNA 表达的影响 |
| (二) 外源血管生成素基因的转入对细胞bFGF 蛋白表达的影响 |
| 七、血管生成素对bFGF 诱发的细胞增殖的作用 |
| 第五章 讨论 |
| 一、外源血管生成素基因的转入影响细胞内源血管生成素的表达 |
| (一) 稳定转染细胞系的建立 |
| (二) 外源血管生成素基因的转入影响细胞内源血管生成素的表达 |
| 二、血管生成素对A375 细胞的增殖具有促进作用 |
| 三、血管生成素通过核转移作用促进A375 细胞的增殖 |
| (一) 血管生成素在A375 细胞中进行核转移作用 |
| (二) 新霉素抑制血管生成素在A375 细胞中的核转移作用 |
| (三) 新霉素对A375 细胞的增殖具有抑制作用 |
| 四、血管生成素对bFGF 表达具有负调节的作用 |
| 五、血管生成素对bFGF 诱发的细胞增殖具有促进作用 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
| 在读期间参加科研项目情况 |
（6）DNA损伤修复基因APE1 RNA干扰提高骨肉瘤抗血管生成治疗敏感性的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 DNA 损伤修复基因APE1 RNA 干扰提高骨肉瘤抗血管生成治疗敏感性的研究 |
| 前言 |
| 第一部分 DNA 损伤修复基因APE1 在骨肉瘤中的表达及其与临床病理和血管生成的关系 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 APE1 siRNA 表达载体构建及其对血管内皮细胞迁徙的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 APE1 RNA 干扰提高骨肉瘤抗血管生成治疗敏感性动物实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨肉瘤血管生成及抗血管生成研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文情况 |
（7）Angiostatin对膀胱肿瘤新生血管抑制作用的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 肿瘤血管生成及调节机制 |
| 第二部分 肿瘤抑制血管生成治疗 |
| 第三部分 血管抑素结构与生物学活性 |
| 实验部分 |
| 第一部分 膀胱移行细胞癌中微血管密度(MVD)及血管抑素的定量检测 |
| 1 材料设备 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 pcDNA3.1(+)-Angiostatin真核表达载体的构建 |
| 1 材料设备 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 稳定转染Angiostatin基因的膀胱肿瘤细胞系的建立 |
| 1 材料设备 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 Angiostatin基因转染对膀胱肿瘤细胞生物学行为的影响 |
| 1 材料设备 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 附图 |
（8）rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物及伦理 |
| 1.4 单边可延长式微型外固定架的设计与研制 |
| 1.5 大鼠股骨牵张成骨模型的建立 |
| 1.6 观察与检测指标 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及慢病毒介导RHPDGF-BB体外转染 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验材料与试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 rh PDGF-BB基因转染BMSCS促进大鼠股骨牵张成骨区新生骨矿化的作用 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验动物及分组 |
| 1.5 观察与检测指标 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（9）唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路对骨肉瘤细胞系凋亡的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 耗材 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 实验细胞 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.1.1 细胞复苏 |
| 2.5.1.2 细胞传代 |
| 2.5.1.3 细胞冻存 |
| 2.5.1.3.1 配制冻存液 |
| 2.5.1.3.2 消化收取细胞 |
| 2.5.1.3.3 进行冻存 |
| 2.5.2 采用MTT法检测骨肉瘤MG-63 细胞活力变化 |
| 2.5.2.1 MTT法 |
| 2.5.2.2 MTT配制方法 |
| 2.5.2.3 磷酸缓冲液(PBS)配制 |
| 2.5.2.4 贴壁细胞MTT法 |
| 2.5.2.5 MTT注意事项 |
| 2.5.3 划痕实验观察骨肉瘤MG-63 细胞的迁移能力、凋亡改变 |
| 2.5.4 透射电镜观察骨肉瘤MG-63 细胞在100μM唑来膦酸作用48h后细胞凋亡改变 |
| 2.5.4.1 透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)的原理 |
| 2.5.4.2 取材 |
| 2.5.4.3 固定 |
| 2.5.4.4 脱水 |
| 2.5.4.5 浸透 |
| 2.5.4.6 包埋和聚合 |
| 2.5.4.7 超薄切片 |
| 2.5.4.8 染色 |
| 2.5.5 流式细胞仪检测骨肉瘤MG-63、U-2OS细胞在100μM唑来膦酸作用48 h后,细胞的凋亡变化 |
| 2.5.5.1 流式细胞技术(flow cytometry,FCM) |
| 2.5.5.2 流式实施步骤 |
| 2.5.5.3 流式注意事项 |
| 2.5.6 蛋白印迹方法Western Blot(WB)检测骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞在唑来膦酸作用后,对AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路的影响 |
| 2.5.6.1 蛋白印迹方法原理 |
| 2.5.6.2 WB实验分组 |
| 2.5.6.3 收集细胞蛋白 |
| 2.5.6.4 测定蛋白浓度 |
| 2.5.6.5 电泳 |
| 2.5.6.6 转膜 |
| 2.5.6.7 抗体杂交 |
| 2.5.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 唑来膦酸(ZOL)抑制骨肉瘤MG-63 细胞增殖和细胞迁移 |
| 3.2 唑来膦酸通过抑制AKT/GSK-3β通路作用骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞 |
| 3.3 观察在抑制GSK-3β后,唑来膦酸对骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3.1 GSK-3β可以介导唑来膦酸对骨肉瘤MG-63 细胞的增殖 |
| 3.3.2 GSK-3β可以介导唑来膦酸对骨肉瘤MG-63、U-2 OS细胞的凋亡 |
| 3.4 观察在抑制GSK-3β后,唑来膦酸对Wnt/β-Catenin通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 针对骨肉瘤MG63细胞系的SURVIVIN-SIRNA转染细胞株的制备及体外验证研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料及步骤 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及步骤 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞中整合素A5表达水平的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及步骤 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 靶向治疗整合素A5对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料及步骤 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞体内实验的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料及步骤 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录 |
| 附件 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 成果 |
| 致谢 |
四、反义基因转染抑制骨肉瘤中血管内皮生长因子表达的研究（论文参考文献）
- [1]抑制VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA干预骨肉瘤的研究[D]. 顾军权. 苏州大学, 2021(06)
- [2]IncRNA TUG1在子宫内膜癌中的生物学行为作用及机制研究[D]. 刘利芬. 苏州大学, 2019(04)
- [3]血管生成素与碱性成纤维生长因子之间相互作用关系及其分子机制的研究[D]. 王继. 东北师范大学, 2009(11)
- [4]KDR启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸治疗乳腺癌的实验研究[D]. 姚航. 第一军医大学, 2007(09)
- [5]血管生成素对黑色素瘤细胞生长及对碱性成纤维生长因子表达的影响[D]. 宋金娜. 东北师范大学, 2006(09)
- [6]DNA损伤修复基因APE1 RNA干扰提高骨肉瘤抗血管生成治疗敏感性的研究[D]. 仲召阳. 第三军医大学, 2005(01)
- [7]Angiostatin对膀胱肿瘤新生血管抑制作用的实验研究[D]. 郑凯. 第四军医大学, 2004(04)
- [8]rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究[D]. 买买艾力·玉山. 新疆医科大学, 2020(07)
- [9]唑来膦酸通过AKT/GSK-3β/β-Catenin信号通路对骨肉瘤细胞系凋亡的作用[D]. 李胜. 中国医科大学, 2019(04)
- [10]Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究[D]. 流小舟. 南方医科大学, 2016(04)