一、介绍一种霍乱弧菌检测的快速方法（论文文献综述）
胡玲,张顺,崔燕,朱鹏,郭泾[1]（2021）在《人体常见致病性弧菌检测技术研究进展》文中认为弧菌是一种常见的病原微生物,广泛存在于海水以及海洋类食品之中。近几十年来,弧菌对人体健康、食品卫生以及海产品养殖业造成的危害已愈来愈受到人们的重视。本文就近10年霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌等常见致病性弧菌的相关检测技术的研究报道,从聚焦于弧菌表征的传统常规检测方法如传统培养方法、免疫相关检测技术和基于核酸靶向分子或聚焦于新平台的新型检测方法如核酸检测技术、生物传感器检测技术、生物芯片检测技术等这2个方面对相关文献资料进行综述整理,通过总结新、旧技术未来在致病性弧菌检测方面的应用,预测今后致病性弧菌检测技术将向多技术联合检测与"一键化"检测2个方向拓展,期望本文能够为致病性弧菌快速检测这一领域的研究提供新的思路。
张君[2]（2021）在《溶藻孤菌LuxR介导的群体感应调控机制》文中研究指明溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种海洋动物条件致病菌,其主要宿主包括鱼类,为水产行业带来了巨大的危害。溶藻弧菌还可以响应海水温度变化引起珊瑚白化,也能够感染免疫力低下的病人引起肠胃炎及中耳炎等。群体感应（Quorum sensing,QS）系统是弧菌毒力表达的重要调控系统。目前,已鉴定到溶藻弧菌中多种细胞密度依赖性及非细胞密度依赖性毒力调控机制,这些毒力调控机制相关的信号转导通路基本上都通过调控群体感应中枢调控元件LuxR蛋白（Master quorum-sensing regulator,MQSR）的表达,参与调控毒力因子的表达,如外毒素Asp、溶血素、胞外产物、脂多糖、铁载体、分泌系统和生物被膜等等。然而,溶藻弧菌LuxR完整的调控元以及对靶基因调控的分子机制仍有待进一步研究。另外,溶藻弧菌如何利用非细胞密度依赖性的环境信号转导系统,并将其整合到复杂的群体感应系统中,精密调控毒力表达的相关机制也有待进一步探究。LuxR同源蛋白是属于TetR家族转录调控因子的群体感应中枢调控蛋白,可以激活或抑制数百种基因的表达,控制弧菌的群体行为,而其内在机制尚不清楚。为了阐明该类调控型蛋白如何控制各种靶基因的表达,我们采用RNA-seq、ChIP-seq和DNase I-seq等技术,发现溶藻弧菌LuxR调控～280个基因的表达,这些基因包含具有回文对称性（repDNA）或不完全对称性（actDNA）结合序列。激活型基因的LuxR结合位点的中位数几乎是抑制型基因的两倍。LuxR-repDNA和LuxR-actDNA两种复合物的晶体结构,揭示了 LuxR蛋白结合DNA的两种不同模式,主要表现为LuxR N-末端延伸臂区域（LuxR-arm）与不同类型DNA小沟的接触方式不同。当LuxR与repDNA或actDNA结合时,由Arg9和Arg11介导的N-末端-DNA相互作用模式不同,且导致其对抑制型靶DNA的结合亲和力更高。LuxR的结合位点特征和N-末端延伸臂区域等对受QS调控的表型有重要影响。这些结果有助于理解弧菌QS中LuxR高度灵活地激活或抑制众多靶基因表达的相关机制,为设计特异性的QS抑制剂,干扰LuxR调控功能,有效控制病原菌毒力奠定理论基础。在本课题组前期发现,温度通过受控的内膜蛋白水解（RIP）等信号转导通路调控LuxR的表达,但是其中机制并不清楚。本研究通过转座子插入测序（Transposoninsertion sequencing,TIS）技术,筛选鉴定到溶藻弧菌的大部分OMP-YxF是RIP途径中潜在的温度感应元件,包括OmpC和OmpU等蛋白。它们的不正确折叠可能触发了 RIP信号通路,激活DegS、DegP等周质/内膜蛋白酶切割RpoE的反sigma因子RseA,释放RpoE至胞质区,激活温度应激响应基因以及luxR基因的表达。本课题也发现,RpoE在弧菌中调控一种新型可替换σ因子RpoX,参与致病过程及对高温和低渗透压等环境应激的响应。RpoX还具备独立于RpoE之外的调控功能,体现在响应应激、运动性、生物被膜形成和溶血活性等。本研究还发现,LuxR的表达受到另外一种群体感应中枢调控蛋白VqsA的调控。VqsA除调控LuxR表达之外,还可以与群体感应无关地直接结合在Pasp上,调控其表达及活性,其调控元包含外毒素Asp、铁载体摄取、生物素合成、运动性及趋化性和T6SS等大量毒力相关基因,以及包括AphB在内的多个与酸应激和氧应激有关的因子。LuxR、VqsA和AphA三者形成重要的群体感应调控网络。总之,以上研究有助于我们更好地了解溶藻弧菌及其他相关弧菌在面对海洋变化多端的环境时,如何通过QS信号转导系统在响应细菌细胞密度的同时,精准地调控毒力相关基因的表达,发挥其对海洋宿主动物的条件致病行为。
钟宜科[3]（2020）在《基于HAND系统15种食源性致病菌多重实时PCR检测方法的建立》文中进行了进一步梳理近年来,食源性疾病的发病率居高不下,在全世界范围内都是一个日益严重的公共卫生问题。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）统计显示由病原微生物引起的食源性疾病比例达50%以上,因此急需建立一种有效的食源性致病菌检测方法。传统的食源性病原体检测和鉴定方法费时费力,不足以满足食品快速检测的要求。为阻止疾病的传播、监控食品的卫生安全,保障人民的安全,急需建立一种快速、简单和有效的检测技术。本文将肠粘附性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌、结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和福氏志贺氏菌为模式菌株,建立一种快速检测15种食源性致病菌的多重实时PCR技术。主要研究结果如下:（1）通过HAND系统建立了一种能够同时检测15种食源性致病菌多重实时PCR方法,具有特异性高、灵敏度好、重复性和稳定性高等特点,并且适用于复杂样本的检测;（2）通过玻璃化技术,将多重实时PCR中热不稳定成分（Taq酶、dNTP、染料和引物）玻璃化到PCR管盖上。实验表明,试剂的活性不受玻璃化的影响实验,并且被玻璃化成分高度稳定,能够在室温（25℃）下保存12年,从而克服了冷链运输和低温储存的局限性;（3）针对复杂样本的快速提取,研制了一种以Chelex-100和TritonX-100为主要裂解成分的核酸提取液,评价其对15种食源性致病菌核酸提取的效果,结果显示只需要在90℃裂解10 min,即可适用于荧光定量PCR检测技术,具有操作简便、裂解效果好、不影响后续反应的特点,且不受粪便和食品等复杂样本的影响。综上所述,本研究通过HAND系统与玻璃化技术相结合建立了一种能够同时检测15种食源性致病菌快速检测方法,具有良好的特异性与敏感性,解决了样本核酸提取和加样繁琐、复杂以及试剂在非低温环境下易失活的问题。
郑志伟[4]（2019）在《食品中弧菌的耐药性和致病性研究》文中研究指明弧菌属（Vibrio spp.）细菌是一群嗜盐、喜温、不耐酸的革兰氏阴性菌,因形状短小,弯曲成弧状而得名。本属细菌种类多,广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。作为一种重要的致病菌,弧菌不仅会对水产养殖业造成影响,而且能够对人类健康造成严重的威胁。当人们食用或伤口接触弧菌污染的水产品后,容易引发急性肠胃炎、败血症,严重者会导致死亡。本次研究选取位于我国沿海地区且对水产品需求量大的深圳市作为调查地点。从2015年8月至2017年4月,在近两年的时间内,对深圳市南山区市售生鲜肉类及活虾样品中的弧菌污染情况进行持续地监测,并研究弧菌分离株的耐药性、致病性及分子分型等遗传特征。在此基础上,利用第二代和第三代基因组测序技术获得代表性菌株较为完整的遗传信息,以此分析弧菌中存在的耐药基因和耐药基因相关的传播机制。最后通过建立动物模型和测定创伤弧菌生物被膜成膜能力,评价创伤弧菌分离株毒力的相对强弱,揭示生物被膜与创伤弧菌致病性之间的潜在关系。本次研究的主要内容和结果如下:（1）自2015年8月至2017年4月,在广东省深圳市南山区共随机采样2051个。其中,弧菌污染样品共计593个,污染率为28.9%。弧菌在鲜虾样品中的污染率（91.9%）明显高于牛肉、鸡肉和猪肉三类生鲜肉类样品。农贸市场（31.1%）的污染情况比超市（25%）更为严重。夏季样品污染率（37.1%）高于冬季样品污染率（22.6%）。（2）本次采样共保藏弧菌分离株1856株。其中,副溶血性弧菌1340株（72.2%）、溶藻性弧菌482株（26.0%）、霍乱弧菌22株（1.2%）、创伤性弧菌12株（0.6%）。药敏结果显示,在近两年的调查期间,所有弧菌分离株对于青霉素类抗生素的耐药率一直保持在非常高的水平,耐药率为92%;对于头孢类、四环素、喹诺酮类抗生素的耐药率呈逐年上升趋势,平均涨幅37.9%;没有发现对碳青霉烯类抗生素具有耐受性的弧菌。（3）本次研究对150株头孢类抗生素耐药副溶血性弧菌进行了MLST分型。结果显示,61株（40.7%）属于未知ST型;其余的89株分别属于17种已知ST型。表明该地区的副溶血性弧菌种群组成具有遗传多样性的特点。在已知的ST型中,ST163占比最高（31.5%）,是头孢类耐药副溶血性弧菌中的优势种群。（4）本次研究对270株深圳地区头孢类抗生素耐药弧菌进行了耐药基因检测。结果共检测出已知β-内酰胺酶基因20种以及两种新型金属β-内酰胺酶。其中,VEB型基因阳性率（48%）最高;TEM型、VIM型和IMP型占比最少。接合转移实验结果显示,270株弧菌分离株中,有71株弧菌（26.3%）的头孢耐药表型可以通过接合转移的方式转移至受体菌E.coli J53。S1-PFGE-Southern blot实验证实这些耐药基因的主要传播载体为接合型质粒。（5）本次研究共发现4种新型β-内酰胺酶基因,分别命名为blaCMY-2.1、blaVIM-55.1、blaVMB-1、blaVMB-2。并且,成功地利用基因工程技术对4种新型β-内酰胺酶基因进行了克隆表达,利用药敏实验和酶动力学参数对其功能进行了定性和定量分析。结果显示,除blaCMY-2.1之外,其余三种新型基因均具有不同程度地介导受体菌对于头孢噻肟和美罗培南耐药的能力。（6）本次研究完成270株头孢类耐药弧菌基因组的测序,共有6种β-内酰胺酶基因的基因环境得到确认,进而明确了这6种β-内酰胺酶基因在弧菌中的传播机制。其中,blaCTX-M-15、blaCTX-M-55、blaNDM-1和blaVMB-1基因均位于接合型IncC质粒之上;blaVIM-1基因位于未知类型的接合型质粒pVb1978（MG456577）之上;blaCTX-M-14基因的传播机制与插入序列ISEcp1和IS903B、新型IncP-1质粒pVb1636（MH548371）以及新型接合性整合元件ICEVpaChn0574（MN199028）有关。（7）本次研究对从海产品中分离得到的创伤弧菌分进行了致病性分析。毒力基因检测结果显示,本地区分离得到的食源性创伤弧菌大多数具有临床菌株的特征基因,表明本地区食源性创伤弧菌具有潜在的致病能力,会对人类健康造成威胁。通过比较创伤弧菌分别在大蜡螟幼虫模型和小鼠模型中的致死率,发现同一菌株在两种模型中的致死率结果并不一致。因此,大蜡螟幼虫模型可能不适合用于创伤弧菌的致病性研究。结合创伤弧菌生物被膜的成膜能力与其在小鼠模型中的致死率结果表明成膜能力强的菌株同样表现出强毒力的特征。
董晓妹[5]（2019）在《五种致病性弧菌快速高通量检测方法的建立》文中研究表明弧菌属（Vibrio）为一类嗜盐杆菌,呈革兰氏阴性,广泛分布在河口、海水和海洋动物体内。致病性弧菌主要通过海产品、海水等感染人类,能够引起人体发生感染性腹泻、耳和伤口感染甚至败血症。随着生活质量的提高,人们对海产品的需求量越来越大,弧菌已然成为我国食源性疾病的重要病原菌之一。为能够快速有效地检测样品中的致病性弧菌。本研究将免疫磁分离技术（Immunomagnetic separation,IMS）分别与多重PCR和液相芯片（Luminex xMAP）检测方法结合,建立了能够同时富集五种常见致病性弧菌（副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌以及溶藻弧菌）的免疫磁分离技术与多重PCR和Luminex xMAP检测方法,该方法具有快速、简单、高通量和高灵敏性等优点,为开展弧菌的现场检测提供技术支撑。1、免疫磁珠的制备与目的菌的捕获效果为优化样品前处理这一步骤,本研究将实验室保存的针对霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌以及拟态弧菌共同抗原表位的单克隆抗体2-1-D4与磁珠偶联制备免疫磁珠从而建立了针对上述五种弧菌的免疫磁分离快速富集技术。在该技术中,采用碳化二亚胺（3-ethylcarbodiimide,EDC）/琥拍酰亚胺（N-Hydroxysuccinimide,NHS）化学偶联法制备免疫磁珠对免疫磁珠的制备进行了优化并按实际捕获效果来确定最佳条件;对富集过程中免疫磁珠的工作用量、捕获时间等进行了优化,并评价免疫磁珠的特异性、敏感性及其在食品基质模拟样品中的捕获效果。试验结果表明,1mL体系中免疫磁珠最佳工作量为0.33 mg,最佳捕获时间为60 min;免疫磁珠对副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌的捕获率均在50%以上,且其与沙门氏菌、大肠杆菌等常见食源性致病菌及属内其它病原菌均无交叉反应,显示了该免疫磁珠良好的特异性。免疫磁珠作为样品前处理的步骤不仅能提高传统培养基检测的灵敏度和特异性,还能有效的减少人为操作的误差和提高检测的准确性。2、多重PCR快速检测水产品中五种致病性弧菌方法的建立本试验通过筛选引物、优化建立了五种致病性弧菌的多重PCR检测体系。试验根据五种致病性弧菌的种特异性基因设计引物,选择副溶血弧菌toxR基因、霍乱弧菌ompW基因、创伤弧菌vvh基因、拟态弧菌vm-toxR基因和溶藻弧菌va-coL基因作为靶基因设计引物,以细菌16S rRNA片段为扩增内标对照（internal amplification control,IAC）设计了 IAC引物。通过对多重PCR反应体系中退火温度和引物浓度进行了优化,确定了最佳退火温度（57℃）和引物浓度（0.1 μmol/L）。通过对多重PCR的敏感性和特异性评价,确定了多重PCR同时检测五种弧菌模板时检测限度为1.8×105CFU/mL,且试验过程中该方法与沙门氏菌、大肠杆菌等常见食源性致病菌及属内其它病原菌均无交叉反应。因此,建立的该检测方法具有特异性强,灵敏度高,操作简便,并且ICA的存在排除了多重PCR检测致病性弧菌可能导致的假阴性结果,提高了检测的精准度,在诊断与防范水产品食源性致病性弧菌传染方面具有重要意义。3、多重LuminexxMAP快速检测水产品中的五种致病性弧菌方法的建立本研究建立了同时检测副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌五种致病性弧菌的多重液相芯片检测技术,并对该方法进行了评价。分别设计带有生物素标记的针对这五种致病性弧菌种特异性基因和毒力基因的特异性引物,利用氨基标记的探针偶联羧基微球,通过该微球与生物素化的PCR产物杂交,Luminex 200分析系统能够分析编码微球的荧光分类和藻红蛋白的中强荧光值。通过对杂交时间和杂交温度进行优化确定了该反应最佳杂交条件为杂交温度52℃、杂交时间25 min。经过多次的实验结果证明,该方法均能对单一菌株样本和混合样本进行准确的检测鉴定。在重复试验中,其组内变异系数（CV%）为2.71%-7.68%,表明该方法具有较好的稳定性。同时对该方法的敏感性进行鉴定。结果表明多重Luminex xMAP在同时检测五种弧菌时,十组探针的敏感性在1.8×102 CFU/mL-1.8×104CFU/mL之间。以流式液相芯片技术为平台建立水产品中5种致病性弧菌的快速高通量检测体系,具有灵敏性高、重复性好、可控性强、节省样本和时间等优点,对于病原体的检测具有良好的应用前景。4、多重IMS-Luminex xMAP检测方法应用于模拟样品的检测及与多重IMS-PCR的比较本试验使用制备的免疫磁珠在最佳条件下捕获样品中的五种弧菌,提取捕获后的样品DNA,分别用多重PCR检测方法和多重Luminex xMAP检测方法进行检测。结果表明,在本次模拟样品检测试验中,当水产品中五种弧菌菌液含量为1.8 CFU/g时,IMS结合多重Luminex xMAP的检测方法可以在6-7 h内检测出五种弧菌,而IMS结合多重PCR检测方法则检测不出来;但当水产品中五种弧菌菌液含量为1.8×103 CFU/g时,IMS结合多重PCR检测方法可以在10 h内检测出五种弧菌。该结果证明IMS与多重Luminex xMAP相结合的检测方法,缩短了检测时间,降低了弧菌的检测限,提高了检测的精准度,为检测这五种弧菌提供了快速、简单、高通量及高灵敏性的检测技术。
唐毓祎[6]（2017）在《水产品弧菌的等温核酸扩增可视化检测方法的建立与应用》文中研究说明弧菌属是一类广泛存在于海水、海产品中的细菌。其中有十几种是能够引起人疾病的病原菌,引起最多死亡率的是霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌。海产品或其他食品中的弧菌是通过人摄入或者伤口感染至体内引起呕吐、腹泻等一系列胃肠道疾病或败血症甚至死亡。生食海鲜的文化根深蒂固,却成为弧菌等病原菌对人体健康不利的通道。随着生食饮食文化的传播,由弧菌引起的弧菌病报道也受到了关注。弧菌的快速检测和控制就成为了传承饮食文化和维护人们安全健康的一个特别重要的途径。由于传统的PCR方法的灵敏度、耗时等问题,受到了自身的限制,所以有越来越多的研究关注于寻求更加适合即时检测需求的方法。金纳米颗粒是符合量子点的具有良好光学性质一种材料。能够通过合成不同的尺寸和形状,来获得不同的光学性质。在近几年来,金纳米颗粒已经被引入生物感应器中,解决了实际问题,取得了很大的进展。近十几年来,等温核酸扩增的开发在各个领域得到了广泛的应用。金纳米颗粒在等温核酸扩增技术中的作用发挥势必会带了更大的突破。本研究以此为研究主旨,分析了环介导等温核酸扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）和重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）的反应体系中各个组分与金纳米颗粒之间的关系,摸索最佳反应条件。建立了基于重组酶聚合酶扩增技术对霍乱弧菌的检测,并引入了金纳米颗粒参与反应。构建了一套完整系统的方法,实现快速、低成本、灵敏可靠的可视化检测。为基础实验室和检测平台提供高效的技术手段,为食源性致病菌的防控和食品安全监测提供了技术支撑。主要研究结果如下:1、通过与qPCR方法对比,我们报道的RPA方法较为灵敏、快速和可靠,在不依赖昂贵设备仪器的条件下能够定量检测海产品中的霍乱弧菌。这种方法在10分钟内实现的检出限为5个拷贝,在八个独立的检测实验中具有很高的可重复性。基于lolB基因,RPA的特异性是霍乱弧菌物种内高度保守的。RPA在食品行业中的可应用性通过检测45个对虾样品来验证。总之,RPA方法是灵敏、快速的检测方法,甚至可以量化海产品中的霍乱弧菌。2、在霍乱弧菌RPA扩增反应的基础上,建立了一个基于RPA与纳米金材料的可视化检测方法。首先,发现在RPA反应体系中103个拷贝质粒标准品DNA在6 min后才扩增出,而AuNPs-RPA反应体系中同样浓度的质粒标准品DNA较RPA在5.3 min已有扩增信号,其他浓度下均出现AuNPs-RPA比RPA早起信号。说明金纳米材料可以提高RPA的反应速率,使得加速了反应启动。其次,阐述了RPA中蛋白组分和引物与金纳米颗粒之间的相互作用,为稳定金纳米材料提供一个理论基础。在扩增完成之后,观察颜色变化,发现不同加样顺序和是否进行引物孵育AuNPs过程会影响颜色的结果。结果发现,如果引物先与金纳米颗粒孵育,然后加上酶,会使对金的保护力保持在最高水平,这时将不会出现实验组和对照组的颜色对比。在酶失活后再加金,因酶的构象发生变化,此时再加金进去,体系中大量盐离子得以让金团聚;把溶液调至酶的等电点附近,实验组和对照组都发现了沉淀现象;在加酶前让引物和探针与金孵育过夜,实验组和对照组均始终保持红色,结果显示体系中的混合酶起到了保护金的作用而且是大分子的酶在空间上起到的保护和较强的吸附作用。为呈现定性可视化结果,需先加酶后加引物,最终有阳性结果的颜色为蓝色,阴性结果的颜色为紫红色。原因是重组酶缠绕引物形成引物-酶聚合物,使得引物和酶都失去了金保护功能。虽然发生扩增反应,双链DNA无法弥补一些保护功能,对照组因没有扩增使得重组酶和引物一直缠绕或始终处于缠绕释放的动态平衡。总之,金纳米颗粒能够提高RPA的反应速率,并能定性地显示结果,对RPA basic试剂盒的用户而言,缩短了终点分析的时间,降低了实验成本。所以,本研究可以给使用RPA基础试剂盒的研究者提供简便的终点分析可视化方法。3、基于SH修饰引物的AuNPs-LAMP体系的研究内容包括:首先确定了ssDNA、dsDNA、dNTP、Bst DNA聚合酶对AuNPs的影响。结果发现,ssDNA、dsDNA、dNTP能使AuNPs分散系稳定,而Bst DNA聚合酶对其有非特异性吸附,而使AuNPs之间因Bst DNA聚合酶而聚集在一起。其次建立的方法中包括较为特别的方式加入金,以提高金的稳定性和检测的方便度。用AuNPs稀释引物,形成红色引物,同时让SH修饰的引物与AuNPs自我组装,摒弃了繁琐的锚定步骤。摸索最佳反应条件:温度参数设置范围为61-65℃;时间范围在30-65 min内;选用16 nm直径AuNPs浓度2.3 nM、11.5 nM、23 nM、46 nM。获得最佳反应条件,即63℃55 min,采用AuNPs 23 nM。最终将该可视化方法应用于检测副溶血性弧菌,确定了它的最低检测限,在55 min内达到了定性和200 pg以上可半定量的结果,阳性结果和阴性结果可以根据管内产物颜色是否为红色或者蓝色鉴别。4、基于PEG空间位阻剂的未修饰AuNPs参与LAMP比色法检测,提出了采用PEG减少金纳米颗粒之间的碰撞几率,增加空间稳定性的机理,并用实验结果一一进行验证。摸索PEG浓度从9%至39%,最终发现最佳浓度为39%。基于两种原理,PEG-AuNPs和SH引物-AuNPs LAMP两种方法进行对比,发现颜色变化正好相反,阳性结果呈蓝色,阴性结果呈红色。以副溶血性弧菌和创伤弧菌为研究对象,加入两者各自的靶向引物,实现多重检测,PEG-AuNPs方法也能在63℃条件下55 min内100 fg以上的半定量检测,比SH引物-AuNPs较为灵敏。因此,PEG-AuNPs方法可成为半定量可视化检测手段,虽以弧菌的特异性检测为目的,但可普及到其他病原体或其他目标物的核酸检测,为基础实验室和检测平台提供高效的技术手段,为食源性致病菌的防控和食品安全监测提供了技术支撑。整体来看,金纳米颗粒材料参与的等温核酸扩增反应体系能够很好地适应即时检测的需求,不受大型仪器的束缚,在可视化检测中具有良好的应用前景。在可视化的同时,还能避免交叉污染、提高反应速率或进行多重检测。
吴斌[7]（2016）在《霍乱弧菌进入活的非可培养状态的影响因素及调控机制》文中指出为了在不利的环境中保持存活的能力,霍乱弧菌会进入一种活的非可培养（VBNC）状态。VBNC这一现象已经被认识30年了,但对研究者来说依然是待解开的谜团。为了更好的认识这一现象,我们以霍乱弧菌为模式菌,设计并实施了以下三个方面的研究来解释这一现象。在第一个部分的研究中,我们利用propidium monoazide（PMA）结合荧光定量PCR对VBNC状态的霍乱弧菌01群埃尔托性菌株C6706进行定量分析。首先对108/mL的鲜活细胞、死亡细胞和VBNC细胞对不同的PMA处理程序进行时间-剂量-反应关系分析。结果显示最优的PMA处理方案为20μM孵育20分钟,因为这可以最大限度的去除死亡细胞,但对鲜活细胞和VBNC细胞几乎没有影响。然后,我们评价了该方案在处理不同浓度细菌时的稳定性和检出下限,发现初始细菌的浓度对PMA处理的效果有很大影响。我们开发了一种利用108/mL的外源死细胞悬液来对抗初始细胞浓度副作用的方法。利用这个方案,消除了初始细胞浓度过低的影响,得到了稳定的计数结果,并将该方法对VBNC细胞计数的检出下限提升至10拷贝/μL。在第二部分的研究中,我们逐一评价了实验室常规使用的VBNC诱导条件的5个组成因素对VBNC诱导的影响,即菌株差异、生长期差异、通氧差异、不同的温度以及饥饿。其中菌株差异、生长期差异和通氧差异不影响VBNC状态的形成,但是影响其发展过程。霍乱弧菌O1群古典型的菌株比埃尔托型菌株进入VBNC的速度要快。以平台期细胞为初始细胞完全进入VBNC的时间（LCT100）要晚于对数期细胞。但是在诱导前期,对数期细胞可培养菌数下降的速度却比平台期要慢,这提示平台期细胞状态的不均一性可能在起作用。在诱导过程中,通氧可以快速使霍乱弧菌丧失可培养的能力,厌氧环境下的可培养细菌数可达到通氧条件的106倍。其余的两个因素（较高的温度和富营养）却可以阻止霍乱弧菌VBNC状态的发生。在22℃和37℃诱导时,霍乱弧菌快速丧失可培养能力,在可培养细菌数分别达到106/mL和105/mL时维持恒定。活菌数和总菌数的结果表明在这两个温度下,丧失可培养能力的霍乱弧菌没有进入VBNC状态,而是不断死亡和降解。当在ASW中加入LB时,VBNC的诱导也被阻止,但加入低营养的M9不影响。这表明LB和M9不同的成分可能会抑制VBNC的诱导。在第三部分的研究中,我们发现群体感应系统（QS）可以对抗霍乱弧菌VBNC状态的诱导。利用转座子突变技术,我们筛选到了一株在4℃ASW中可培养能力被延长的突变株,并发现该菌株的转座子插入位点为rpoN基因。进一步研究发现受rpoN基因调节的hapR基因被失活后,菌株进入VBNC状态的进程明显加快。而高表达HapR可以延缓霍乱弧菌可培养能力的丧失。缺失qrrs,lux0和rpoN均可使可培养细菌存在的时间相比hapR缺失株延长50天以上。然后我们发现野生株也利用上调表达hapR来对抗其在VBNC诱导过程中可培养能力的丧失。在野生株诱导过程中hapR的转录上调,使其可培养细菌存在的时间比hapR缺失株延长10天。当hapR缺失株回补hapR基因后,其hapR的转录和表达水平,以及可培养能力的变化群恢复到野生株水平。在天然QS突变株中,高表达HapR表现为对VBNC诱导过程中可培养能力丧失的抵抗;低表达或无表达HapR则表现为可培养能力丧失的加速。这些菌株的存在表明了生态环境的压力对霍乱弧菌QS进化的影响。这些研究将有助于将来对VBNC状态如何发生发展机制的研究。同时也帮助深入认识在VBNC诱导过程中霍乱弧菌进行了哪些生命活动,以及环境压力对不同VBNC发展能力的菌群的筛选。
吴莹莹[8]（2015）在《实时可视化PMA-LAMP方法检测三种食源性微生物活菌方法研究》文中研究指明当今社会,由食源性致病菌引起的食物中毒情况依旧十分严峻,对全世界尤其是发展中国家的食品卫生安全造成巨大的威胁。在世界范围内,沙门氏菌和副溶血性弧菌是最为常见的两种引起食物中毒的致病菌,而霍乱弧菌则时常引起霍乱的暴发流行,严重威胁着人们的生命财产安全。因此,建立相应的快速检测手段至关重要。目前,各类免疫、分子相关的快速检测技术逐渐趋于完善和成熟,但它们普遍存在需要专业人员、价格昂贵等缺点,并且不能区分食品中存在的活菌与死菌,这势必加大检测结果假阳性的可能性,造成不必要的恐慌和资源浪费。针对上述难题,本论文建立可视化PMA-LAMP快速检测技术来检测这三种食源性致病菌活菌,一方面解决LAMP技术存在的两个方法学基础问题,一方面为食品安全的诊断防治提供新思路和技术平支持。本研究根据霍乱弧菌thy A基因（Gen Bank登录号:AY143429.1）、副溶血性弧菌tox R基因（Gen Bank登录号:GQ228073.1）、沙门氏菌inv A基因（Gen Bank登录号:M90846.1）、沙门氏菌fim Y基因（Gen Bank登录号:JQ665438.1）的相关序列,分别设计LAMP和荧光定量PCR引物,并构建标准质粒。经过优化,确定可视化LAMP反应的体系如下:20 m M Tris-HCl（p H 8.8）,10 m M KCl,8 m M Mg SO4,10 m M（NH4）2SO4,0.1%Tween 20,0.8 M甜菜碱（Betaine）,d NTPs各1.4 m M,0.4μM F3/B3,3.2μM FIP/BIP,1.6μM LF/LB,0.3 M钙黄绿素（Calcein）,0.5 M Mn Cl2,8U Bst DNA聚合酶,2.5μL DNA模板。由于钙黄绿素的荧光特性和SYBR Green I相近,因此反应结果分别可以从荧光曲线和颜色变化两个方面进行鉴定,前者是实时半定量分析,后者是肉眼直接观察的定性分析。特异性试验和灵敏度试验结果显示,霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的LAMP引物特异性良好,检出限分别为1.1×102 CFU/m L、5.0×101CFU/m L、6.3×102-6.3×103 CFU/m L。q PCR结果和LAMP结果一致。对于PMA的处理条件,确定暗室孵育时间为5 min,LED灯曝光时间为30min,然后对霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的PMA处理浓度及待处理的最高死菌浓度进行优化,得到PMA浓度分别为15μM、20μM和5μM,并且,PMA能高效处理最多105 CFU/m L浓度的死菌。将优化好的PMA处理步骤结合可视化LAMP,建立可视化PMA-LAMP,并与PMA-q PCR进行对照。在灵敏度试验中,将梯度稀释的活菌分别添加到105 CFU/m L的死菌基质中,制成死活菌混合液,所得霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的可视化PMA-LAMP检出限分别为1.1×102 CFU/m L、5.0×102 CFU/m L和6.3×103 CFU/m L,与PMA-q PCR结果吻合;在模拟食样试验中,按照上述死活菌混合液制备方法制备菌液,然后人工污染干净的鳕鱼或鸡蛋样品。数据显示,霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌可视化PMA-LAMP检出限则依次为1.7×102 CFU/m L、1.9×102CFU/m L和6.3×103 CFU/m L,结果与PMA-q PCR一致。在实际样品检测中,从市场上随机购得海产品、蛋类、蔬菜等新鲜样品,经过适当时间的前增菌步骤后,分用可视化PMA-LAMP方法、PMA-q PCR方法和行业标准或国家标准提供的检测方法进行检测,结果显示,霍乱弧菌的检出率依次为2.5%、2.5%和0%,副溶血性弧菌的检出率依次为23.6%、20.8%和20.8%,沙门氏菌的检出率依次为0%、0%和0%。由此可见,可视化PMA-LAMP方法检测时间短,加上至少6h的前增菌,最快只需要8 h不到的时间,且在仪器条件缺乏的情况下,可采取定性分析的方法来进行初筛,提高后续鉴定的效率。本研究将可视化LAMP技术与PMA染料结合,建立霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的可视化PMA-LAMP快速检测方法,不仅保留可视化LAMP快速简便、高特异性、高灵敏度、适合现场操作等优势,兼顾PMA染料低毒性和高特异性抑制死菌扩增等特点,并且对LAMP方法的荧光半定量检测做了一系列初探工作,在配备荧光定量PCR仪的条件允许下,可无需依赖新的仪器设备,对待测样品进行实时分析。该方法为检测食品中的活的致病微生物搭建了新的技术平台,为尤其是偏远落后地区的食品卫生安全提供新的检测思路。
倪鑫[9]（2013）在《霍乱弧菌Fosmid文库的构建、分析及应用》文中研究说明霍乱，又称为亚细亚霍乱或传染性霍乱，是主要由O1和O139血清型霍乱弧菌引起的一种烈性、猝发性的细菌性传染病，其危害仅次于鼠疫。随着环境和人类生活方式的转变，霍乱弧菌已经出现了细菌毒力、菌落特征等方面的变异。而随着分子生物学的发展，霍乱弧菌的检测方法也从传统的表型特征鉴定向遗传特征基因鉴定转变。为了能够准确、快速、安全的检测霍乱弧菌，特别是产毒型霍乱弧菌，本研究首先从分子生物学水平构建了包含霍乱弧菌全套基因的Fosmid文库，使霍乱弧菌遗传信息转移到易于培养的大肠杆菌中去；通过基因水平的筛选，获得了霍乱弧菌常见的5种高度保守特征基因。为了满足普通实验室对霍乱弧菌阳性对照的需求，本论文对筛选出的5种霍乱弧菌保守基因的Fosmid质粒进行稳定性研究，制备出可作为阳性对照的霍乱弧菌Fosmid质粒标准样品并以制备的tcpA-Fosmid质粒标准样品为模板，通过对传统切刻内切恒温扩增技术（NEMA）的优化和改良，建立一种新型的O1和O139型霍乱弧菌的切刻内切恒温扩增（NEMA）快速检测方法。1.选取O1和O139型霍乱弧菌为研究对象，利用低熔点琼脂糖包埋法获得高质量的O1和O139型霍乱弧菌基因组DNA，用随机剪切法将基因组进行片段化处理，脉冲电泳分离片段化DNA并切胶回收33kb48kb之间的DNA片段，然后对DNA片段进行末端平滑化和磷酸化处理，与pCC1FOS载体连接，经包装、转染、筛选阳性克隆构建霍乱弧菌Fosmid文库。所建的Fosmid文库库容量为355Mb，平均插入片段为35kb，共保存9600个克隆，空载率小于2%。经稳定性实验证明所建文库克隆能够稳定繁殖。为下一步O1和O139型霍乱弧菌目的基因的筛选、文库的应用研究奠定了基础。2.利用实时荧光PCR从霍乱弧菌Fosmid文库中筛选出含tcpA、ctxAB、hlyA、rfb-O1和rfb-O139保守性特征基因的阳性克隆菌株，通过提取Fosmid质粒并对其稳定性进行研究，最终研制出具有较好稳定性的含有霍乱弧菌tcpA基因、hlyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因的Fosmid质粒标准样品。该质粒标准品的研制基本满足了实验室对霍乱弧菌阳性对照的需求。3.选取已制备的tcpA-Fosmd质粒标准样品为阳性模板，对传统NEMA技术进行了优化和改良。在参考传统的NEMA反应体系基础上，对影响扩增效率的关键因素—如温度、缓冲环境、镁离子及DMSO浓度分别进行了优化。经试验确定，以磷酸钾缓冲液作为缓冲环境，反应温度59℃、镁离子和DMSO终浓度分别为5mmol/L、5%时扩增效率最高。为了弥补传统NEMA一步法容易形成引物二聚体的缺陷，本论文将传统的一步法体系改良为两步法，即在正式扩增前，引入了预反应步骤；用优化和改良的NEMA扩增体系对O1和O139型霍乱弧菌进行特异性和灵敏度研究，结果表明，所建立的NEMA技术对O1和O139型霍乱弧菌有很好的特异性和较好的灵敏度，随着该技术的进一步成熟，可以用于试剂盒等诊断产品的研发。
燕勇,罗建勇,朱心强,王恒辉,林云[10]（2012）在《霍乱及霍乱弧菌检测技术研究进展》文中认为当前,霍乱这个古老的肠道传染病仍是全球,特别是发展中国家面临的一个重大公共卫生问题[1],霍乱爆发的可能性依然存在,小流行及散发依然不断。我国南方,尤其水网发达的江南地区,更是成为霍乱的重要流行区,每年在霍乱防治上花费了大量的人力、物力。随着国家和相关部门的日益重视,建立
二、介绍一种霍乱弧菌检测的快速方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、介绍一种霍乱弧菌检测的快速方法（论文提纲范文）
（1）人体常见致病性弧菌检测技术研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 聚焦于弧菌表征的传统常规检测方法 |
| 1.1 基于形态学的方法 |
| 1.2 基于免疫学的分析检测方法 |
| 2 基于核酸靶向分子或聚焦于新平台的新型检测方法 |
| 2.1 基于特异性扩增弧菌靶标基因的检测方法 |
| 2.1.1 聚合酶链式反应 |
| 2.1.2 等温扩增技术 |
| 2.2 聚焦于新技术平台的弧菌快速检测方法 |
| 2.2.1 基于生物传感器的弧菌检测 |
| 2.2.2 基于生物芯片技术平台的弧菌检测 |
| 3 展望 |
（2）溶藻孤菌LuxR介导的群体感应调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 溶藻弧菌 |
| 1.2 哈维氏弧菌类群体感应系统 |
| 1.2.1 哈维氏弧菌的群体感应系统 |
| 1.2.2 霍乱弧菌的群体感应系统 |
| 1.2.3 哈维氏弧菌类MQSR蛋白 |
| 1.3 LuxR同源蛋白 |
| 1.3.1 LuxR同源蛋白对群体感应的调控 |
| 1.3.2 HapR/SmcR蛋白结构 |
| 1.3.3 LuxR同源蛋白的调控模式 |
| 1.4 弧菌科σ因子 |
| 1.4.1 σ~(70)家族结构 |
| 1.4.2 弧菌科σ因子的功能 |
| 1.5 本课题的研究内容和意义 |
| 第2章 LuxR调控元及结合位点的特征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株、质粒以及培养条件 |
| 2.2.2 引物 |
| 2.2.3 主要试剂及仪器 |
| 2.2.4 常用分析软件及方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌株构建 |
| 2.3.2 生物发光检测实验 |
| 2.3.3 DNase I-seq |
| 2.3.4 ChIP-qPCR |
| 2.3.5 LuxR蛋白纯化 |
| 2.3.6 杀菌实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 LuxR是群体感应的主要调控元件 |
| 2.4.2 LuxR蛋白调控元的鉴定 |
| 2.4.3 LuxR在靶基因启动子上结合位点的不同特征 |
| 2.4.4 验证LuxR介导的基因调控 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 LuxR-DNA复合物结构解析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 天然LuxR和硒代LuxR蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.2 蛋白结晶、数据收集及晶体结构解析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 LuxR-DNA复合物的整体结构 |
| 3.4.2 LuxR二聚体界面重排 |
| 3.4.3 LuxR对DNA的整体识别 |
| 3.4.4 LuxR-DNA骨架的相互作用 |
| 3.4.5 LuxR与DNA大沟碱基的相互作用 |
| 3.4.6 LuxR-arm与DNA小沟的相互作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 LuxR调控功能的体内外验证 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 攻毒实验 |
| 4.3.2 荧光检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LuxR-arm功能域影响LuxR识别DNA的体外验证 |
| 4.4.2 LuxR-arm功能域影响LuxR识别DNA及调控QS基因的体内分析 |
| 4.4.3 LuxR的结合特征与LuxR-arm功能域协调QS输出 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 群体感应系统受环境信号的调控机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 溶血活性检测 |
| 5.3.2 LD_(50)检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 TIS筛选潜在的温度感应元件OMP-YxF |
| 5.4.2 RpoX响应环境应激并调控毒力相关表型 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 VqsA的功能 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 VqsA能够直接调控外毒素Asp表达及活性 |
| 6.4.2 VqsA在群体感应调控中的作用 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 论文创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的论文成果 |
| 致谢 |
（3）基于HAND系统15种食源性致病菌多重实时PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 食源性致病菌 |
| 1.2 病原微生物常用鉴别方法 |
| 1.2.1 传统培养法 |
| 1.2.2 传统培养法的优化 |
| 1.2.3 免疫学检测 |
| 1.2.4 核酸检测 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 第2章 基于HAND系统食源性致病菌实时PCR检测技术的建立 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 菌株及来源 |
| 2.1.2 培养基和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌株的培养和模板DNA的制备 |
| 2.2.2 靶序列与引物 |
| 2.2.3 单重荧光定量PCR体系的建立 |
| 2.2.4 单重实时PCR的特异性 |
| 2.2.5 单重实时PCR的敏感性 |
| 2.2.6 单重实时PCR的重复性和稳定性 |
| 2.2.7 多重实时PCR体系的建立 |
| 2.2.8 多重时候PCR的特异性 |
| 2.2.9 多重实时PCR的敏感性 |
| 2.2.10 多重实时PCR的重复性和稳定性 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 单重荧光定量PCR体系的建立 |
| 2.3.2 单重荧光定量PCR特异性结果 |
| 2.3.3 单重实时PCR敏感性结果 |
| 2.3.4 单重实时PCR重复性和稳定性结果 |
| 2.3.5 多重实时PCR体系的建立 |
| 2.3.6 多重荧光定量PCR特异性结果 |
| 2.3.7 多重荧光定量PCR敏感性结果 |
| 2.3.8 多重荧光定量PCR重复性和稳定性结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 多重实时PCR体系的玻璃化 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 菌株及来源 |
| 3.1.2 培养基和试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌株的培养和模板DNA的制备 |
| 3.2.2 反应体系的玻璃化 |
| 3.2.3 玻璃化试剂稳定性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 反应体系的玻璃化 |
| 3.3.2 玻璃化试剂稳定性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 复杂样本的快速提取 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株及来源 |
| 4.1.2 培养基与试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 复杂样本快速提取方法 |
| 4.2.1 食品模拟样本 |
| 4.2.2 粪便模拟标本 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和科研成果 |
（4）食品中弧菌的耐药性和致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 食品中常见弧菌及其生物学特性 |
| 1.1.1 副溶血性弧菌 |
| 1.1.2 溶藻弧菌 |
| 1.1.3 霍乱弧菌 |
| 1.1.4 创伤弧菌 |
| 1.2 弧菌耐药性研究进展 |
| 1.2.1 常见弧菌的耐药性现状 |
| 1.2.2 弧菌常见的耐药机制 |
| 1.3 弧菌中的β-内酰胺酶 |
| 1.3.1 CIT型 AmpC酶 |
| 1.3.2 TEM、CTX-M、VEB、PER型 ESBLs |
| 1.3.3 IMP、VIM、NDM型金属β-内酰胺酶 |
| 1.4 创伤弧菌的致病特征及毒力因子 |
| 1.5 本课题研究目的及主要内容 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 深圳市南山区食品中弧菌流行病学与耐药性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 南山区食源性弧菌的总体检出情况 |
| 2.2.2 南山区食源性弧菌药敏实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 头孢类耐药弧菌遗传多样性分析及耐药基因鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 头孢类耐药弧菌遗传多样性分析结果 |
| 3.2.2 头孢类耐药弧菌耐药基因鉴定结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 新型β-内酰胺酶的检测、克隆表达及功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 金属β-内酰胺酶基因阳性菌产酶能力实验结果 |
| 4.2.2 新型β-内酰胺酶基因克隆表达与蛋白纯化结果 |
| 4.2.3 新型β-内酰胺酶药敏实验结果 |
| 4.2.4 新型金属β-内酰胺酶活力结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 弧菌中可移动遗传元件的生物信息学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果及分析 |
| 5.2.1 bla_(CTX-Ms)的基因环境分析结果 |
| 5.2.2 bla_(NDM-1) 的基因环境分析结果 |
| 5.2.3 bla_(VIM-1) 的基因环境分析结果 |
| 5.2.4 bla_(VMB-1) 的基因环境分析结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 食源性创伤弧菌的流行特征及毒力分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 创伤弧菌流行特征 |
| 6.2.2 毒力评价 |
| 6.2.3 生物被膜成膜能力检测结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）五种致病性弧菌快速高通量检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 1 研究背景 |
| 2 弧菌简介 |
| 2.1 致病性 |
| 2.2 常见的致病性弧菌 |
| 2.2.1 副溶血弧菌 |
| 2.2.2 霍乱弧菌 |
| 2.2.3 拟态弧菌 |
| 2.2.4 溶藻弧菌 |
| 2.2.5 创伤弧菌 |
| 3 致病性弧菌的分离检测方法 |
| 3.1 传统检测方法 |
| 3.2 免疫学检测方法 |
| 3.2.1 免疫磁珠分离法(Immunomagnetic separation,IMS) |
| 3.2.2 酶联免疫吸附检测技术(ELISA) |
| 3.2.3 免疫荧光技术(IFA) |
| 3.2.4 蛋白质印迹法(Western Blot) |
| 3.3 核酸检测技术 |
| 3.4 液相芯片技术研究概况 |
| 3.4.1 微球编码与反应原理 |
| 3.4.2 检测原理 |
| 3.4.3 液相芯片的特点 |
| 4 本研究的试验目的及试验意义 |
| 研究内容一 针对五种致病性弧菌的免疫磁珠的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 试验菌株 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试验相关溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 单抗克隆抗体的筛选 |
| 2.2 免疫磁珠的制备 |
| 2.3 免疫磁珠富集菌液 |
| 2.4 免疫磁珠捕获条件的优化 |
| 2.5 免疫磁珠性能的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 单抗克隆抗体的筛选 |
| 3.2 免疫磁珠捕获条件的优化 |
| 3.3 免疫磁珠性能的测定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 多重PCR快速检测水产品中五种致病性弧菌方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 试验菌种 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 靶基因的扩增 |
| 3.2 引物特异性验证 |
| 3.3 多重PCR性能测定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 多重Luminex xMAP快速检测水产品中五种致病性弧菌方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 菌种 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针设计 |
| 2.2 PCR扩增 |
| 2.3 杂交偶联验证 |
| 2.4 引物与探针特异性验证 |
| 2.5 优化Luminex测定 |
| 2.6 建立液相芯片技术多重检测方法 |
| 2.7 多重液相芯片性能测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 引物特异性检测 |
| 3.2 优化Luminex测定 |
| 3.3 建立液相芯片技术多重检测方法 |
| 3.4 截止值的确定 |
| 3.5 多重液相芯片性能测定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容四 多重 IMS-Luminex xMAP检测方法应用于模拟样品的检测及与多重IMS-PCR的比较 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试验材料 |
| 1.2 试验菌株 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 多重PCR检测方法对模拟样品的检测 |
| 3.2 多重Luminex xMAP对模拟样品的检测 |
| 3.3 多重Luminex xMAP与多重PCR模拟样品检测结果比较 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）水产品弧菌的等温核酸扩增可视化检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 水产品中主要致病菌弧菌概述 |
| 1.2 金纳米材料在DNA检测中的应用 |
| 1.2.1 金纳米材料简介 |
| 1.2.2 纳米金与DNA之间的相互作用 |
| 1.2.3 等温核酸扩增技术概述 |
| 1.2.4 金纳米材料在等温核酸扩增中的应用 |
| 1.3 主要研究目的、意义及创新点 |
| 第二章 基于重组酶聚合酶等温核酸扩增技术的水产品中霍乱弧菌快速检测方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒标准品制备 |
| 2.2.2 实时RPA实验 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.2.4 RPA方法的灵敏度、特异性和重复性验证 |
| 2.2.5 虾样样品的检测 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 qPCR实验 |
| 2.3.2 RPA探针和引物的设计优化 |
| 2.3.3 特异性验证试验 |
| 2.3.4 RPA方法的灵敏度、特异性和重复性验证 |
| 2.3.5 虾样样品检测测试 |
| 2.3.6 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 金纳米颗粒参与的RPA比色法检测的条件优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株来源 |
| 3.1.2 主要试剂、仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 金纳米颗粒的合成及表征 |
| 3.2.2 AuNPs-RPA条件 |
| 3.2.3 AuNPs-RPA组分对显色结果的影响 |
| 3.2.4 AuNPs-RPA的特异性、灵敏度和比色特性 |
| 3.2.5 AuNPs-RPA在水产品中霍乱弧菌的检测上的应用 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 金纳米颗粒的形态特征描述 |
| 3.3.2 AuNPs-RPA原理 |
| 3.3.3 AuNPs-RPA特异性、灵敏度和比色特性 |
| 3.3.4 AuNPs-RPA在模拟霍乱弧菌污染水产品中的检测上的应用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于SH修饰引物和未修饰金纳米颗粒参与的LAMP可视化检测的条件优化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株来源 |
| 4.1.2 主要试剂、仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 金纳米颗粒的合成及表征 |
| 4.2.2 弧菌LAMP扩增 |
| 4.2.3 AuNPs-LAMP条件优化 |
| 4.2.4 AuNPs-LAMP特异性、灵敏度、比色特性 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 基于未修饰AuNPs的LAMP检测方法的机理探讨 |
| 4.3.2 金纳米颗粒的形态特征描述 |
| 4.3.3 AuNPs-LAMP的条件优化 |
| 4.3.4 基于SH修饰引物的AuNPs-LAMP的特异性、灵敏度和比色特性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 空间位阻介导未修饰金纳米颗粒参与的LAMP比色法检测的条件优化 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株来源 |
| 5.1.2 主要试剂、仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 金纳米颗粒的合成及表征 |
| 5.2.2 弧菌LAMP扩增条件优化 |
| 5.2.3 AuNPs-LAMP条件优化 |
| 5.2.4 AuNPs-LAMP特异性、灵敏度、比色特性 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 基于未修饰AuNPs的LAMP检测方法的机理探讨 |
| 5.3.2 金纳米颗粒的形态特征描述 |
| 5.3.3 基于PEG的AuNPs-LAMP反应 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 AuNPs-LAMP在水产品中弧菌检测上的应用及AuNPs-等温核酸扩增方法的比较 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 水产品样品 |
| 6.1.2 菌株来源 |
| 6.1.3 实验仪器 |
| 6.1.4 实验试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 水产品中弧菌模拟样品 |
| 6.2.2 DNA提取与PCR鉴定 |
| 6.2.3 SH-primers AuNPs -LAMP在水产品中弧菌的检测上的应用 |
| 6.2.4 PEG AuNPs -LAMP在水产品中弧菌的检测上的应用 |
| 6.3 实验结果与讨论 |
| 6.3.1 水产样品体征的描述 |
| 6.3.2 水产品副溶血性弧菌DNA模拟样品的DNA提取和PCR扩增 |
| 6.3.3 SH-primers AuNPs -LAMP在模拟污染的副溶血性弧菌水产品检测上的应用 |
| 6.3.4 PEG AuNPs -LAMP在模拟污染的弧菌水产品检测上的应用 |
| 6.3.5 AuNPs -LAMP在水产品中弧菌的检测上的应用 |
| 6.3.6 讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 基于AuNPs的RPA可视化检测 |
| 7.2 基于AuNPs的LAMP可视化检测 |
| 7.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的相关论文与工作成果 |
（7）霍乱弧菌进入活的非可培养状态的影响因素及调控机制（论文提纲范文）
| 缩略词(ABREVIATION) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 霍乱弧菌活的非可培养状态的定量鉴定 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1. 菌株与培养条件 |
| 2.2. 稀释所使用的介质 |
| 2.3. 鲜活细菌悬液的制备 |
| 2.4. 死亡细菌悬液的制备 |
| 2.5. VBNC状态细菌悬液的制备 |
| 2.6. PMA的处理程序 |
| 2.7. DNA的提取 |
| 2.8. 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.9. DNA质粒标准品的制备 |
| 2.10. 数据统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 实时荧光定量PCR对霍乱弧菌的检测 |
| 3.2. PMA的浓度和孵育时间对活菌定量计数的影响 |
| 3.3. 最优PMA处理条件的检出下限和检测稳定性 |
| 3.4. PMA-qPCR在对VBNC状态霍乱弧菌定量计数中的应用 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二部分 霍乱弧菌VBNC状态诱导条件的单因素作用分析 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1. 实验用菌株和VBNC诱导前的准备 |
| 2.2. 诱导VBNC状态的介质 |
| 2.3. 诱导VBNC状态条件 |
| 2.4. 可培养细胞计数 |
| 2.5. 活细胞计数 |
| 2.6. 活细胞/死细胞染色 |
| 2.7. 数据统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. VBNC状态的诱导过程具有菌株特异性 |
| 3.2. 处于不同生长期的细菌对VBNC状态的诱导过程的影响 |
| 3.3. 厌氧环境可以延长霍乱弧菌VBNC状态的发展过程 |
| 3.4. 低温是霍乱弧菌VBNC状态在ASW中的诱导的必要条件 |
| 3.5. 富营养的诱导条件会导致霍乱弧菌VBNC状态诱导的失败 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三部分 群体感应系统对抗霍乱弧菌进入VBNC状态的调控机制及其影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1. 实验所使用的菌株 |
| 2.2. 转座子库的建立 |
| 2.3. 转座子库VBNC状态的诱导和筛选 |
| 2.4. 转座子插入位点的确定 |
| 2.5. 可培养细菌的计数 |
| 2.6. 活细菌细菌的计数 |
| 2.7. 活细菌/死细菌染色 |
| 2.8. 基因转录水平分析 |
| 2.9. 相关基因缺失细菌株的构建和回补 |
| 2.10. HapR表达水平分析 |
| 2.11. 数据统计和分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1. 转座子插入失活rpoN基因可以延长可培养细菌存在的时间 |
| 3.2. rpoN基因的缺失上调群体感应调控基因hapR转录水平 |
| 3.3. 群体感应系统通过HapR来对抗VBNC状态的发展 |
| 3.4. 群体感应天然突变株VBNC进程与其HapR表达水平一致 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 细菌活的非可培养状态研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士期间文章 |
| 致谢 |
（8）实时可视化PMA-LAMP方法检测三种食源性微生物活菌方法研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词汇总 |
| 1 绪论 |
| 1.1 霍乱弧菌 |
| 1.1.1 霍乱弧菌分类 |
| 1.1.2 霍乱弧菌的生物学特性 |
| 1.1.3 霍乱弧菌的毒理作用和主要毒力因子 |
| 1.1.4 霍乱弧菌流行病学 |
| 1.1.5 霍乱弧菌检测方法研究进展 |
| 1.1.5.1 常规检测方法 |
| 1.1.5.2 免疫学方法 |
| 1.1.5.3 分子生物学方法 |
| 1.2 副溶血性弧菌 |
| 1.2.1 副溶血性弧菌生物学特性 |
| 1.2.2 副溶血性弧菌的致病机理及相关基因 |
| 1.2.3 副溶血性弧菌流行病学 |
| 1.2.4 副溶血性弧菌检测方法现阶段研究进展 |
| 1.2.4.1 常规生化方法 |
| 1.2.4.2 免疫学方法 |
| 1.2.4.3 分子生物学方法 |
| 1.3 沙门氏菌 |
| 1.3.1 沙门氏菌分类 |
| 1.3.2 沙门氏菌生物学特性 |
| 1.3.3 沙门氏菌毒力因子 |
| 1.3.4 沙门氏菌流行病学 |
| 1.3.5 沙门氏菌检测方法研究进展 |
| 1.3.5.1 常规生化方法 |
| 1.3.5.2 免疫学方法 |
| 1.3.5.3 分子生物学方法 |
| 1.4 环介导等温扩增技术（LAMP）概述 |
| 1.4.1 LAMP技术介绍 |
| 1.4.1.1 LAMP的原理 |
| 1.4.1.2 LAMP引物设计 |
| 1.4.1.3 LAMP技术的特点 |
| 1.4.2 LAMP反应产物鉴定 |
| 1.4.3 基于钙黄绿素染料的实时可视化LAMP技术介绍 |
| 1.4.4 LAMP技术的应用 |
| 1.5 死活菌检测技术研究进展 |
| 1.5.1 死活菌检测现状及相关检测方法 |
| 1.5.1.1 基于RNA水平的检测 |
| 1.5.1.2 基于DNA结合染料的检测 |
| 1.6 本论文研究内容及意义 |
| 1.6.1 本论文研究内容 |
| 1.6.2 本论文研究意义 |
| 2 食品中霍乱弧菌实时可视化PMA-LAMP方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样本的制备 |
| 2.2.1.1 细菌培养 |
| 2.2.1.2 基因组DNA模板的提取 |
| 2.2.1.3 相关菌液的制备 |
| 2.2.2 LAMP引物和qPCR引物设计 |
| 2.2.3 目的片段的PCR扩增 |
| 2.2.4 PCR产物回收及纯化 |
| 2.2.5 标准质粒构建 |
| 2.2.5.1 回收纯化的PCR产物与载体连接 |
| 2.2.5.2 转化 |
| 2.2.5.3 菌液PCR初步鉴定 |
| 2.2.5.4 重组质粒测序与同源性比对分析 |
| 2.2.5.5 重组质粒提取 |
| 2.2.6 实时可视化LAMP体系和qPCR体系的建立 |
| 2.2.6.1 qPCR反应体系的建立 |
| 2.2.6.2 可视化LAMP反应体系的建立 |
| 2.2.7 可视化LAMP反应体系的优化 |
| 2.2.8 可视化LAMP体系特异性实验及与qPCR体系的比较 |
| 2.2.9 可视化LAMP体系灵敏度及与qPCR体系的比较 |
| 2.2.10 PMA处理条件优化 |
| 2.2.11 实时可视化PMA-LAMP体系的灵敏度及与PMA-qPCR体系的比较30 |
| 2.2.12 模拟食样实时可视化PMA-LAMP体系与PMA-qPCR体系灵敏度的比较 |
| 2.2.13 实际样品检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 标准质粒构建与鉴定 |
| 2.3.1.1 目的片段电泳鉴定 |
| 2.3.1.2 标准质粒测序鉴定 |
| 2.3.2 霍乱弧菌可视化LAMP体系优化和建立 |
| 2.3.2.1 Mg~(2+)终浓度优化 |
| 2.3.2.2 甜菜碱终浓度优化 |
| 2.3.2.3 内外引物浓度比优化 |
| 2.3.2.4 钙黄绿素终浓度优化 |
| 2.3.2.5 Mn~(2+)终浓度优化 |
| 2.3.3 霍乱弧菌可视化LAMP和qPCR分析方法特异性比较 |
| 2.3.4 霍乱弧菌可视化LAMP和qPCR分析方法灵敏度比较 |
| 2.3.5 PMA浓度优化 |
| 2.3.5.1 PMA浓度范围初步确定 |
| 2.3.5.2 PMA工作浓度优化 |
| 2.3.6 基质中细胞浓度对PMA处理效果的影响 |
| 2.3.7 霍乱弧菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较 |
| 2.3.8 模拟食样中霍乱弧菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较 |
| 2.3.9 实时可视化PMA-LAMP检测方法在实际样品中的应用 |
| 2.4 小结 |
| 3 食品中副溶血性弧菌实时可视化PMA-LAMP方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 菌种 |
| 3.1.1.2 仪器设备 |
| 3.1.1.3 主要试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 样本的制备 |
| 3.1.2.2 副溶血性弧菌LAMP引物和qPCR引物设计 |
| 3.1.2.3 副溶血性弧菌标准质粒的制备 |
| 3.1.2.4 实时可视化LAMP体系和qPCR体系的建立 |
| 3.1.2.5 实时可视化LAMP和qPCR特异性和灵敏度分析 |
| 3.1.2.6 PMA浓度优化 |
| 3.1.2.7 培养基对PMA处理效果的影响 |
| 3.1.2.8 PMA处理上限 |
| 3.1.2.9 实时可视化PMA-LAMP的灵敏度及与PMA-qPCR的比较 |
| 3.1.2.10 实时可视化PMA-LAMP与PMA-qPCR方法模拟食样实验 |
| 3.1.2.11 实际样品检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 标准质粒构建与鉴定 |
| 3.2.1.1 目的片段电泳鉴定 |
| 3.2.1.2 标准质粒测序鉴定 |
| 3.2.2 副溶血性弧菌可视化LAMP和qPCR分析方法特异性比较 |
| 3.2.3 副溶血性弧菌可视化LAMP和qPCR分析方法灵敏度比较 |
| 3.2.4 PMA处理条件优化 |
| 3.2.4.1 PMA浓度优化 |
| 3.2.4.2 PMA处理菌液浓度上限 |
| 3.2.4.3 不同培养基对PMA处理效果的影响 |
| 3.2.5 副溶血性弧菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较 |
| 3.2.6 模拟食样中副溶血性弧菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较 |
| 3.2.7 实时可视化PMA-LAMP检测方法在实际样品中的应用 |
| 3.3 小结 |
| 4 食品中沙门氏菌实时可视化PMA-LAMP方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 菌种 |
| 4.1.1.2 仪器设备 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 样本的制备 |
| 4.1.2.2 沙门氏菌LAMP引物和qPCR引物设计 |
| 4.1.2.3 沙门氏菌标准质粒的制备 |
| 4.1.2.4 实时可视化LAMP体系和qPCR体系的建立 |
| 4.1.2.5 实时可视化LAMP和qPCR特异性和灵敏度分析 |
| 4.1.2.6 PMA浓度优化 |
| 4.1.2.7 细菌浓度对PMA处理效果的影响 |
| 4.1.2.8 实时可视化PMA-LAMP的灵敏度及与PMA-qPCR的比较 |
| 4.1.2.9 实时可视化PMA-LAMP与PMA-qPCR方法模拟食样实验 |
| 4.1.2.10 实际样品检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 标准质粒构建与鉴定 |
| 4.2.1.1 目的片段电泳鉴定 |
| 4.2.1.2 标准质粒测序鉴定 |
| 4.2.2 沙门氏菌可视化LAMP和qPCR分析方法特异性比较 |
| 4.2.3 沙门氏菌可视化LAMP和qPCR分析方法灵敏度比较 |
| 4.2.4 PMA处理条件优化 |
| 4.2.4.1 PMA浓度优化 |
| 4.2.4.2 PMA处理菌液浓度上限 |
| 4.2.5 沙门氏菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较 |
| 4.2.6 模拟食样中沙门氏菌实时可视化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法灵敏度的比较 |
| 4.2.7 实时可视化PMA-LAMP检测方法在实际样品中的应用 |
| 4.3 小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 LAMP引物设计 |
| 5.2 实时LAMP的初步探索 |
| 5.3 样品的前增菌和稀释 |
| 5.4 基因组DNA提取 |
| 5.5 钙黄绿素染料的注意事项 |
| 6 总结、创新与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（9）霍乱弧菌Fosmid文库的构建、分析及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 0 前言 |
| 0.1 霍乱弧菌的致病性 |
| 0.1.1 霍乱弧菌的致病机理 |
| 0.1.2 霍乱弧菌常用于检测的靶基因 |
| 0.2 宏基因组学简介 |
| 0.2.1 宏基因组学的概念 |
| 0.2.2 宏基因组文库的分类 |
| 0.2.3 宏基因组文库的构建及筛选 |
| 0.3 质粒标准样品的制备 |
| 0.4 核酸恒温扩增技术 |
| 0.4.1 常见核酸恒温扩增技术发展现状 |
| 0.4.2 切刻内切酶新型核酸恒温扩增技术 |
| 0.5 本研究的主要内容及目的意义 |
| 0.5.1 本研究的主要内容 |
| 0.5.2 本研究的目的及意义 |
| 1 两种血清型霍乱弧菌 Fosmid 文库的构建与分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.2.1 两种霍乱弧菌的来源 |
| 1.2.2 主要试剂及仪器 |
| 1.2.3 常规溶液及缓冲液的配制 |
| 1.2.4 常规培养基的配制 |
| 1.2.5 Fosmid 文库构建方法 |
| 1.2.6 阳性克隆菌的筛选及 Fosmid 文库的保存 |
| 1.2.7 Fosmid 文库库效率及稳定性评价 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 霍乱弧菌总 DNA 的提取条件的优化 |
| 1.3.2 MO45 和 N16961 基因组 DNA 大小确定 |
| 1.3.3 回收的末端修复 DNA 片段大小的确定 |
| 1.3.4 文库滴度的测定 |
| 1.3.5 Fosmid 阳性克隆的涂布与筛选 |
| 1.3.6 Fosmid 文库稳定性及库效率的评价 |
| 1.3.7 文库末端测序 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 2 目的基因的筛选及质粒核酸标准样品的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 样品来源 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 克隆菌 fosmid 质粒的提取 |
| 2.2.5 目的基因的筛选 |
| 2.2.6 Fosmid 质粒标准样品的制备及稳定性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 克隆菌 Fosmid 质粒的提取 |
| 2.3.2 实时荧光 PCR 筛选目的基因 |
| 2.3.3 Fosmid 质粒标准品的制备 |
| 2.3.4 Fosmid 质粒标准样品的保存 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 O1 和 O139 型霍乱弧菌 NEMA 检测技术的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验菌株 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 NEMA 反应体系的优化结果 |
| 3.3.2 霍乱弧菌 NEMA 快速检测技术的验证 |
| 3.3.3 NEMA 检测技术的评价 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 结论 |
| 本论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、介绍一种霍乱弧菌检测的快速方法（论文参考文献）
- [1]人体常见致病性弧菌检测技术研究进展[J]. 胡玲,张顺,崔燕,朱鹏,郭泾. 食品安全质量检测学报, 2021(16)
- [2]溶藻孤菌LuxR介导的群体感应调控机制[D]. 张君. 华东理工大学, 2021(08)
- [3]基于HAND系统15种食源性致病菌多重实时PCR检测方法的建立[D]. 钟宜科. 河北工程大学, 2020(02)
- [4]食品中弧菌的耐药性和致病性研究[D]. 郑志伟. 西北农林科技大学, 2019(02)
- [5]五种致病性弧菌快速高通量检测方法的建立[D]. 董晓妹. 扬州大学, 2019(01)
- [6]水产品弧菌的等温核酸扩增可视化检测方法的建立与应用[D]. 唐毓祎. 上海海洋大学, 2017(01)
- [7]霍乱弧菌进入活的非可培养状态的影响因素及调控机制[D]. 吴斌. 中国疾病预防控制中心, 2016(01)
- [8]实时可视化PMA-LAMP方法检测三种食源性微生物活菌方法研究[D]. 吴莹莹. 中国计量学院, 2015(06)
- [9]霍乱弧菌Fosmid文库的构建、分析及应用[D]. 倪鑫. 中国海洋大学, 2013(03)
- [10]霍乱及霍乱弧菌检测技术研究进展[J]. 燕勇,罗建勇,朱心强,王恒辉,林云. 上海预防医学, 2012(08)