一、5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的技术探讨（论文文献综述）
屈清[1]（2019）在《干预脑出血术后铁超载的角蛋白神经支架构建及性能评价》文中认为干细胞移植在组织修复应用和研究中已经得到广泛应用,但由于病理微环境与正常生理的差异,如何改善移植区域微环境使其更有利于干细胞的生长分化一直是干细胞相关产品开发和基础研究的热点。铁超载可因膳食或出血性疾病等原因导致局部的铁离子浓度过高,进而会因氧化应激而产生组织损伤,而在铁超载区域进行干细胞移植也会影响干细胞的生长分化。本课题基于脑出血术后铁超载的环境下,构建了一种双层角蛋白神经支架作为干细胞移植载体。外层支架为载米诺环素的低分子量角蛋白,目的是为了螯合脑组织中过载的铁离子从而改善局部脑环境,并且低分子量角蛋白还具有快速降解特性;而内层支架借助高分子量角蛋白为载体,同时包埋骨髓间充质干细胞和载生长因子的PLGA纳米粒,高分子量角蛋白降解较慢,可支撑干细胞在铁超载区域的生长分化。双层角蛋白支架设计可为脑出血后干细胞治疗提供一种新思路和治疗理念,也对铁超载区域的干细胞治疗提供实验基础。本课题的主要研究内容和相应结论如下所示:（1）TGA作为还原剂,从人发中提取得到角蛋白。利用超滤平板膜设备对所得到的角蛋白进行分子量的划分。SDS-PAGE显示共得到高分子量角蛋白（>50 kDa）和低分子量角蛋白（30-50 kDa）。角蛋白神经支架内层需要较长时间支撑干细胞生长分化,通过流变性能实验确定了内层凝胶为高分子量角蛋白组成,浓度为35%。外层凝胶选择低分子量角蛋白,其浓度通过铁离子吸附实验确定为45%。通过SEM对上述两种浓度的角蛋白凝胶进行观察,结果表明均具有高度的空隙性。体外进行降解实验表明内外两层凝胶具有不同的降解速率。通过分层注射体外制备双层角蛋白神经支架并观察,表明双层结构完整均一。同时利用双重乳化法制备了载生长因子EGF/b-FGF的PLGA纳米粒,体外药物释放实验表明PLGA纳米粒具有缓慢释放生长因子的效果。（2）角蛋白神经支架构建完毕后,于细胞水平上对其初步生物学性能进行评价。利用全骨髓法提取骨髓间充质干细胞。研究了双层神经支架的干细胞毒性,考察了在细胞水平铁超载环境下,载药角蛋白凝胶对骨髓间充质干细胞生长分化的保护作用。结果表明,以血红素浓度为25μM建立铁超载模型,在干细胞的生长过程中加入载药角蛋白凝胶进行孵育,随着载药角蛋白凝胶浓度的升高,干细胞的存活率随之上升,当载药凝胶浓度达到400 mg/mL时,干细胞存活率增至80.65±2.36%（P<0.01）。在干细胞的诱导分化过程中,同样建立铁超载模型并利用载药角蛋白凝胶进行保护,免疫荧光染色结果显示载药角蛋白凝胶对其铁超载毒性具有较强的拮抗作用。（3）进一步在动物模型水平上评价角蛋白神经支架的初步生物学性能,通过向SD大鼠脑中注入氯化亚铁建立铁超载模型,同时给予双层角蛋白神经支架和单层角蛋白神支架进行移植治疗。普鲁氏铁染显示双层角蛋白神经支架可以有效的去除脑组织中的过载铁离子。脑水肿测定实验显示双层神经支架的植入可以减轻脑水肿。尼氏染色表明双层神经支架可以降低脑萎缩。神经功能评分实验表明双层神经支架移植组,对其神经功能的恢复具有良好的效果。Brdu&NeuN免疫荧光显示,双层神经支架下移植的干细胞,其生长分化状态优于单层神经支架,对其干细胞移植修复脑组织具有更好的效果。
常青[2]（2019）在《体外构建三维血管化组织工程窦房结》文中研究表明目的探究体外诱导兔原代骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）分化为血管内皮细胞（vessel endothelial cells,VECs）和起搏样细胞（pacemaker-like cells）的方法和途径,构建体外三维血管化组织工程窦房结,为心血管疾病的生物起搏提供治疗策略。方法1提取兔骨髓间充质干细胞:提取骨髓,采用全骨髓贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,并观察其形态学及生长增殖情况。2诱导为起搏样细胞:分离兔心脏窦房结,并采用差速贴壁法联合5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Brd U）法分离纯化窦房结细胞,观察并记录生长情况;用反复冻融法制备窦房结细胞裂解液,以此作为诱导剂将骨髓间充质干细胞诱导为起搏样细胞,免疫荧光染色法检测诱导后的起搏样细胞表面标志物超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道HCN2（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation,HCN）的表达和免疫细胞化学染色法检测诱导后的起搏样细胞表面标志物肌钙蛋白T（c Tn T）的表达,以未诱导的骨髓间充质干细胞作为阴性对照组;并绘制骨髓间充质干细胞诱导为起搏样细胞生长曲线图。3诱导为血管内皮细胞:提取兔骨髓,分离纯化骨髓间充质干细胞,用内皮细胞培养液诱导骨髓间充质干细胞为血管内皮细胞,显微镜下观察其形态变化并检测细胞增殖情况;用免疫细胞化学染色法检测诱导后的血管内皮细胞因子CD31、CD34,以未诱导的骨髓间充质干细胞作为阴性对照组;并绘制骨髓间充质干细胞诱导为血管内皮细胞生长曲线图。4体外构建三维血管化组织工程窦房结:用CM-dil和DAPI荧光标记诱导后血管内皮细胞的胞膜、胞浆和起搏样细胞的胞核,按照不同分组（A组为血管内皮细胞:起搏样细胞为1:2;B组为血管内皮细胞:起搏样细胞为1:1;C组为血管内皮细胞:起搏样细胞为2:1）将诱导后的血管内皮细胞和起搏样细胞与支架材料Matrigel基质胶复合培养48 h后,倒置显微镜下观察复合体中“成血管现象”,并做统计学分析;并按照血管内皮细胞与起搏样细胞为1:1的比例在支架材料Matrigel基质胶上复合培养行体外构建,并将复合体行冰冻切片观察三维成像及形态学观察。结果1以全骨髓贴壁法可获得骨髓间充质干细胞。2将骨髓间充质干细胞分别经窦房结细胞裂解液诱导后可获起搏样细胞,经内皮细胞培养液诱导后可获得血管内皮细胞,经免疫荧光染色法和免疫细胞化学染色法检测诱导后细胞表面标志物HCN2、c Tn T、CD31、CD34均为阳性。3采用血管内皮细胞和起搏样细胞按照1:1比例在支架材料Matrigel基质胶上复合培养可体外构建三维血管化组织工程窦房结。结论采用窦房结细胞裂解液和内皮细胞培养液可将骨髓间充质干细胞诱导为起搏样细胞和血管内皮细胞,按照血管内皮细胞和起搏样细胞为1:1比例与支架材料Matrigel基质胶复合培养可体外构建三维血管化组织工程窦房结。图47幅;表4个;参105篇。
肖华[3]（2018）在《Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究》文中研究说明一、背景和目的目前构建心脏生物起搏细胞主要有两种策略:以基因为基础和以细胞为基础。前一种方法根据窦房结（SAN）细胞特异的离子通道和对胚胎SAN发育起关键作用的转录因子,采用单个基因或者多基因组合进行转染干预。过表达超级化激活环核苷酸门控（HCN）通道,产生对自主神经调节敏感的起搏电流（If）是以基因为基础的构建生物起搏点的策略之一,这种类型的通道产生的内向电流主要在舒张期,从而避免了对动作电位的干扰。T盒基因（Tbx）家族是心肌细胞形成和分化的主要调控因子,如Tbx3,Tbx5和Tbx18在胚胎SAN发育中起关键作用,而这些因子的上游是Tbx18,已有研究显示单用Tbx18转录因子即可将静止心肌诱导成心脏起搏样细胞并显示出该因子在构建心脏生物起搏器方面广阔的应用前景。后一种以细胞为基础构建的方法包括两个方面:直接将细胞转化为SAN样起搏细胞和将细胞作为基因的运输载体。骨髓间充质干细胞（MSCs）是心脏生物起搏器理想的干细胞来源,具有免疫豁免优势和相对电静止特性。且能够很容易通过缝隙连接与相邻的细胞进行偶联。MSCs具有直接分化为心肌细胞的能力,但这种能力非常弱。c-kit是心脏前体细胞的标记,在MSCs也有表达,犬MSCs（cMSCs）和心肌细胞一样都来自早期中胚层,不同的分化调控因子决定了其各自不同的分化方向。本实验将SAN发育过程中重要的调控因子Tbx18在c-kit+cMSCs过表达,研究是否能介导c-kit+cMSCs向SAN细胞分化,从而具有天然SAN细胞相似的表观特征。同时研究Tbx18转染的c-kit+cMSCs在与犬心房肌共培养的环境中能否与其形成偶联,从而构成功能性的合胞体。心脏的电偶联由缝隙链接介导,缝隙连接蛋白（connexin,Cx）组成的跨膜通道聚合体构成了细胞间的缝隙链接。不同的聚合体由于排列方式的不同分为同聚体同侧型、同聚体异侧型、异聚体同侧型和异聚体异侧型四类。通过允许小分子和离子沿其电化学梯度扩散,缝隙链接为电冲动的扩步提供了低电阻路径。目前在人类发现的Cx有21种,它们各自具有不同的生物物理学性质,包括电导、电压、PH、对离子和小分子（荧光染料）的选择性通透。细胞间的偶联由Cx的数量和Cx所构成通道的活性所决定,这些都受到上游转录调控因子的严格管控。目前在心脏发现有4种Cx表达:connexin43（Cx43）,Cx40,Cx45和Cx37。这些Cx在心脏不同区域表达目的是传递不同的被动电学特性,其中Cx45主要在哺乳动物SAN细胞表达,是对缝隙链接处电压变化最敏感的Cx,当其细胞质相对于周围细胞电位偏负时,Cx45通道将关闭,这将有效防止周围心肌的除极电流返流入SAN细胞,干扰正常电冲动的传导顺序。以往的在体研究仅单纯用HCN4病毒载体转染MSCs,这种构建方式得到的生物起搏频率远远低于正常SAN的起博频率,本实验采用编码Cx45的缝隙连接蛋白α7（gap junction protein-alpha 7,GJA7）基因与HCN4基因两个慢病毒载体共转染cMSCs,研究是否能进一步促使单纯HCN4病毒载体转染cMSCs向SAN样细胞分化。将HCN2过表达的MSCs注射入房室传导阻滞犬的左心室游离壁可以获得满足生理需要的起搏频率和对儿茶酚胺药物的反应性,但该起搏功能在注射后8周即开始下降,由于没有发生排斥反应和细胞凋亡现象,考虑该原因是由于细胞从注射部位迁移。因此采用生物材料将细胞包裹固定是目前的研究热点,壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,其在37°℃能发生溶液-凝胶转变,具有较少的化学交联毒性。本实验选用壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,将这种可注射生物材料包裹病毒转染的cMSCs,去评价这种生物高聚物能否作为细胞的输送载体为细胞的存活和固定提供适宜的基质环境,观察细胞在温敏水凝胶内的存活增殖情况,为下一步在体动物实验研究打下基础。研究方法:1.培养 cMSCs 和分选 c-kit+cMSCs。cMSCs首先从新生犬股骨和胫骨分离和培养。一部分正常培养传代,一部分用流式活细胞分选技术从P3代cMSCs中分选出c-kit+cMSCs,并进行细胞表面抗原鉴定（CD45/CD29/CD44）。2.构建hTbx18慢病毒载体转染c-kit+cMSCs;构建hHCN4和hGJA7慢病毒载体单独或者共同转染cMSCs。2.1 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>hTBX18[NM 001080508.2]:T2A:{EYFP}作为实验组,构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>{EYFP}作为对照组。将已构建好的两组慢病毒载体分别转染c-kit+cMSCs获得Tbx18-EYFP-c-kit+c MSCs和EYFP-c-kit+cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybr ene的最适浓度。细胞转染4天后行RT-PCR实验验证hTbx18基因在Tbx18-EYFP-c-ki t+cMSCs中过表达。2.2 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>hHCN4[NM 005477.2]和 pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJC1[NM005497.3]作为实验组,构建pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-Null作为对照组。将构建好的慢病毒载体分别转染cMSCs得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和GFP-cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybrene的最适浓度。在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs首先通过2μg/mL的嘌呤霉素纯化5天,再加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJ C1进行共转染。以上步骤共构建成功:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs及其对照组EYFP-c-kit+cMSCs;HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 和 HCN4+GJA7-cMS Cs共转染组。3.进行犬SAN和犬心房肌细胞原代分离培养及体外共培养环境。犬SAN原代细胞被分离后制备成悬浮细胞,新鲜分离的细胞作为阳性对照组,6小时内用于后续实验。犬心房肌从新生犬右心房分离,采用差速贴壁及5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）方法纯化培养细胞。原代心房肌细胞培养24小时后,以4:1的比例（80%心房肌细胞）分别与上述转染细胞混合进行共培养。4.各组细胞的功能检测。4.1 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs在转染后4天分别收集进行SAN特异型特征的检测,并于新生犬SAN细胞进行对比;Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后进行细胞膜片钳检测各组If电流生成情况,用Lucifer荧光黄染料进行细胞间缝隙连接评价,并于新生犬SAN细胞进行对比。4.1.1细胞内环磷酸腺苷[1]分析:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs细胞内 cAMP水平。4.1.2 RT-qPCR:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中Cx45,Kir2.1,PLB 和α-actinin相对mRNA表达水平。4.1.3 WB:监测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs中HCN4,Cx45,PLB,p-PLB和α-actinin的蛋白表达水平。4.1.4 免疫荧光:检测Cx45在犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中的免疫荧光显像。4.1.5共培养环境下转染细胞的电生理检测:采用全细胞膜片钳和穿孔全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案记录特征性的If电流,评价该通道的激活和失活特性,测试其对异丙肾上腺素药物刺激的反应,染料转移实验评价缝隙连接情况。4.2 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后,加入2μgmL的嘌呤霉素连续五天以清除心房肌细胞,收集各组细胞行SAN细胞特异性指标检测和细胞膜片钳检测If电流生成情况。4.2.1 RT-qPCR:检测 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs中Cx45,Cx43,Tbx3,Tbx18和编码同源异型盒蛋白Nkx-2.5的基因（Nkx2.5）相对mRNA表达水平。4.2.2细胞膜片钳检测:采用全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案对比各组记录到的特征性的If电流。5.转染细胞与温敏水凝胶共培养及功能检测。5.1浸提实验和CCK-8检测:用来评价温敏水凝胶材料的细胞毒性。以不含细胞的纯培养基为空白对照组,以培养基中含有0.64%萘酚为阳性对照组,以不含浸提液的纯培养基为阴性对照组,每组均设6个复孔。5.2 CCK-8检测转染细胞胶内增殖情况:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别于转染后72小时和温敏水凝胶共培养,cMSCs,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组,每组均设6个复孔,CCK-8试剂于1天,4天,7天检测,观察胶内细胞增殖情况。5.3 激光共聚焦检测:观察 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶材料共培养4天后凝胶内细胞形态。5.4 iCelligence实时检测:评价Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 在凝胶内实时生长情况,cMSCs,Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组。结果:1.流式活细胞分选将c-kit+细胞分选出来,分选后分析显示c-kit+细胞纯度大于90%,死细胞数小于10%,细胞表面抗原鉴定显示CD29+,CD44+,CD45-。2.pLV-hTbx18-EYFP或pLV-EYFP使用5μg/mL polybrene,以MOI=100的浓度分别转染c-kit+cMSCs 24小时得到Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs。病毒转染后48小时,转染的c-kit+cMSCs展现黄色荧光,6个不同随机视野下激光共聚焦显微镜分析pLV-hTbx18-EYFP的转染效率为94±3.5%,pLV-EYFP-cMSCs的转染效率为96±2.5%。RT-PCR显示基于人Tbx1 8设计的引物可以在Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs中检测到Tbx1 8的表达。使用6μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度转染24小时得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs,GFP-cMSCs,病毒转染后72小时,转染的cMSCs分别展现绿色,红色和绿色荧光,6个不同随机视野下荧光显微镜分析三组细胞的转染效率均大于90%,在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs中加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1 A>hGJC1,用6 μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度进行共转染,用2μg/mL嘌呤霉素纯化转染细胞5天,6个不同随机视野下荧光显微镜分析共转染细胞表达黄色荧光,转染效率大于95%。3.新鲜分离的犬原代SAN细胞以细条钩形居多,细胞出现不规则节律性搏动,新鲜分离的犬原代心房肌细胞培养24小时可见完全贴壁生长,呈长杆状。按照4（心房肌细胞）:1的比例将Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs或EYFP-c-kit+cMSCs或HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs或GFP-cMSCs或HCN4+GJA7-cMSCs与心房肌分别混合,3天后各组共培养细胞生长成单层细胞。4.Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs具有天然SAN细胞的关键特征。Tbx18-EYFP-c-kit+cMS Cs同SAN细胞一样具有高的细胞内cAMP水平（n=3）。Cx45,Kir2.1,PLB,α-actinin的相对mRNA表达水平在Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs是上调的。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和SAN细胞的HCN4,Cx45,PLB,p-PLB,α-actinin蛋白表达水平相似,与EYFP-c-kit+c MSCs明显不同。其中HCN4和Cx45的蛋白水平在Tbx18-c-kit+cMSCs分别是EYFP-c-kit+cMSCs的12倍和5.6倍。Cx45免疫荧光显像示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相似SAN细胞有Cx 45 表达,而 EYFP-c-kit+cMSCs 未见 Cx45 表达。在与犬心房肌共培养三天后,If电流的特征被记录。通过构建回归模型发现Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和 SAN的If电流趋势极其相似（I=-89.368+82.306 V-19.975 V 2+0.868 V3,F=693.056,Sig.<0.01,R2=0.983 vs.I=-110.892+102.927 V-26.637 V2+1.204 V3,F=649.977,Sig.<0.01,R2=0.982）。If电流的激活曲线显示V1/2在Tbx 18-EYFP-c-kit+cMSC s和S AN细胞之间有明显差异（-82.5±4.6,n=22 vs.-77.2±6.3 mV,n=18;P<0.05）,但是斜率因子K没有达到统计学意义上的差异（-7.7±0.4,n=22 vs.-8.1±0.2 mV,n=18;P=0.573）。相比SAN细胞,Tbx18-c-kit+cMSCs 有更正的反转电位（-18.41±1.2 mV,n=12 vs.-23.19±1.6 mV,n=10;P<0.05）。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的激活时间常数在 660±27（-120mV）～1880±103（-80mV）毫秒,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的失活时间常数在 1000±99（-70mV）～210±19（-40mV）毫秒。给予3μmol/L异丙肾上腺素,If电流的激活时间（-120 mV）减少了26±2%（n=8）。V1/2朝向去极化方向移动了大约 6.1 mV（从-84.9±5.6到-78.8±4.8 mV,n=8;P<0.05）。染料注入细胞5分钟后,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相邻的两个心房肌细胞也出现荧光显影,而EYFP-c-kit+cMSCs周围没有心房肌细胞显影。SAN细胞周围有一个细胞显影。HCN4+GJA7-cMSCs 促进 HCN4-GFP-cMSCs 或 GJA7-RFP-cMSCs 向窦房结样细胞分化。RT-qPCR显示GJA7-RFP-cMSCs相较GFP-cMSCs上调Tbx3的表达（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5的表达下降（n=8;p<0.05）,HCN4和Tbx18表达水平两组细胞没有明显差异（n=8;p>0.05）。HCN4+GJA7-cMSCs 共转染组的HCN4,Cx45,Tbx3表达水平比HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs组高（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5表达水平比单纯转染组低（n=8;p<0.05）,Tbx18表达水平在共转染组与单纯转染组之间无明显差异（n=8;p>0.05）。在与犬心房肌共培养三天后,全细胞膜片钳记录If电流的特征。GFP-cMSCs与GJA7-RFP-cMSCs均未记录到特征性的If电流HCN4+GJA7-cMSCs记录到的If 电流,其幅值增加（-1173.8±18.4 vs.-1057.9±14.6 mV,,与HCN4-GFP-cMSCs相比,n=3;p<0.05）,电流激活曲线右移,半数最大激活电压明显变正（-92.6±3.6 vs.-101.9±4.0 mV,n=3;P<0.05）,If通道的反转电位绝对值增加（-29.6±3.9 vs.-26.8±3.2 mV,n=3;p>0.05）。5.浸提实验第7天显示光密度（OD）值在12.5%,25%,50%,100%浸提液组分别为4.6247±0.099,4.5911±0.101,4.0057±0.087,4.5144±0.088,所有检测组的相对细胞增殖率均大于90%显示材料的细胞毒性在0～I级。CCK-8检测显示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.6754±0.10501,4.3294±0.20432,3.7682±0.41215,HCN4-GFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在 1 天,4天,7天分别为3.2820±0.00686,4.4947±0.23174,4.3849±0.43016,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.0181±0.31104,4.1634±0.26420,4.1348±0.36887,所有转染细胞在凝胶中存活4天达到增殖高峰,7天左右生长趋于平稳。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别与温敏水凝胶共培养4天后于激光共聚焦显微镜下观察,可见黄色、绿色、红色荧光细胞在凝胶内不同层面分布生长。iCelligence检测示不同时间点温敏水凝胶内细胞的平均细胞指数未见明显变化。结论:1.Tbx18过表达c-kit+cMSCs介导其向SAN样细胞分化。2.HCN4+GJA7共转染cMSCs通过增强If电流的幅值,利于电信号的扩步促进HCN4-GFP-cMSCs向S AN样细胞分化。3.温敏水凝胶对生物起搏细胞的存活和生长提供了适宜的环境。
崔国宁,刘喜平,曾庆涛[4]（2018）在《骨髓间充质干细胞表面标记物研究进展》文中研究表明骨髓间充质干细胞之表面标记并不是唯一的,而是兼具间充质、内皮细胞、肌肉细胞的特征。骨髓间充质干细胞可表达多种表面标记物,如黏附分子、生长因子、细胞因子、受体与整合素,但是迄今为止未发现独特的骨髓间充质干细胞表面标记物。因骨髓间充质干细胞具有自我更新与多向分化之潜能,因而相关表达的阳性CD分子及相应基因表达可间接作为骨髓间充质干细胞的检测指标。目前与骨髓间充质干细胞相对应的表面标记物被广泛应用,可用于骨髓间充质干细胞标记的有相应的表面标记物、反映骨髓间充质干细胞的基因以及骨髓间充质干细胞表面阳性CD分子的表达。
卢成康[5]（2015）在《异氟醚麻醉抑制海马齿状回神经干细胞的增殖及分化》文中指出背景:异氟醚由于起效快、苏醒迅速、无积蓄等优点在儿科手术也逐渐被推广使用,然而其安全性还需要进一步观察。目的:观察异氟醚麻醉对新生大鼠海马齿状回神经干细胞增殖及神经元分化的影响。方法:将大鼠随机分为异氟醚组和对照组,分别予以异氟醚吸入麻醉和仅吸入空气。分别在给药前及停止给约后对动物予以5-溴脱氧球苷（Brd U）腹腔注射,第2次注射后24 h处死大鼠,获得脑组织,检测Brd U+和脑内神经源性分化因子表达情况。结果与结论:停止麻醉处理之后进行血糖以及动脉血气检测,发现异氟醚组大鼠Pa CO2出现轻度上升,p H值出现轻微下降,而Pa O2、BE、Sa O2以及血糖水平则均未出现改变。与对照组相比,异氟醚组经异氟醚麻醉之后,未出现明显的缺氧表现,包括紫绀和呼吸抑制等。大鼠海马齿状回神经干细胞大多分布在门区,异氟醚组的Brd U阳性细胞数少于对照组（P<0.05）。两组大鼠海马齿状回存在大量新生细胞表达Neuro D,门区Neuro D+/Brd U+阳性细胞数明显高于颗粒细胞下区,且异氟醚组显着高于对照组（P<0.05）。结果证实,异氟醚麻醉会对新生大鼠海马齿状回神经干细胞增殖及神经元分化产生一定的影响,抑制其增殖,并促进其神经元分化。
李琳[6]（2015）在《川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用》文中提出目的 观察川芎嗪（Ligustrazine）预处理促进骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用,并探讨其可能作用机制。方法①采用全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代,流式细胞仪检测BMSCs阳性抗原（CD29和CD90）及阴性抗原（CD34和CD45）鉴定BMSCs纯度,不同终浓度BrdU（5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L）标记BMSCs24 h、48h和72 h,检测BrdU标记率。②采用线栓法诱导大鼠右侧大脑中动脉阻塞模型,缺血90min,缺血24 h后除假手术组外,随机分为模型组,MCAO+未预处理BMSCs组（BMSCs组）,MCAO+50 μM川芎嗪预处理BMSCs组（50μM川芎嗪组）,MCAO+100μM川芎嗪预处理BMSCs组（100 μM川芎嗪组）,50 μM川芎嗪预处理BMSCs+CXCR4拮抗剂AMD3100组（AMD3100）,每组各12只,模型组和假手术组,经尾静脉缓慢注射1 mLPBS,其它各组经尾静脉缓慢注射1mL细胞悬液（1×106mmL）。③在缺血后第1、7、14和28d采用改良神经损伤严重程度评分、粘胶揭除试验和角试验进行神经功能评价。④缺血后第28 d,采用免疫荧光法检测缺血周边区BMSCs数量,采用甲苯胺蓝染色检测脑缺血梗死体积。⑤缺血后第14 d,采用免疫荧光法检测缺血周边区BMSCs数量、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、血管性血友病因子（vWF）、血管内皮生长因子（VEGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。结果①采用全骨髓贴壁法,可得到生长良好,形态均一性的BMSCs,第3代BMSCs的表型鉴定CD29、CD90、CD34和CD45阳性表达率分别为99.0%、99.3%、0.2%和4.1%,符合BMSCs的特点,说明是分离培养纯度较高的BMSCs。②在缺血后第7 d、14 d和28 d,川芎嗪预处理（50 μM和100 μM）组显着改善大鼠脑缺血后神经症状（P<0.01或<0.05）,减少大鼠黏胶揭除时间（P<0.01或P<0.05）,大鼠右转次数显着减少（P<0.01或P<0.05）。③缺血后第28 d,与模型组和BMSCs组比较,川芎嗪预处理（50 μM和100 μM）组大鼠脑缺血的梗死体积显着性减少（P<0.01或P<0.05）。④缺血后第14 d,与模型组、BMSCs组和AMD3100组比较,川芎嗪预处理（50μM和100μM）组缺血周边区的BrdU、SDF-1、vWF、VEGF和BDNF免疫阳性细胞明显增加（P<0.01）。结论 川芎嗪（50 μM和100 μM）预处理BMSCs治疗脑缺血的疗效优于BMSCs,川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移,促进神经功能恢复,缩小脑梗死体积,机制可能与促进脑缺血周边区血管生成及上调脑缺血周边区的SDF-1、VEGF和BDNF的表达有关。
白伶伶[7]（2015）在《间充质干细胞来源的exosomes对实验性自身免疫性葡萄膜炎作用的研究》文中研究指明目的自身免疫性葡萄膜炎是一类最常见的致盲性眼病。实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveoretinitis,EAU）动物模型是研究自身免疫性葡萄膜炎病理机制和探索新型治疗方法的重要工具。此前我们研究发现自体和异体来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）能有效预防和治疗R16诱导的大鼠EAU的发生和发展。Exosomes是活细胞分泌至胞外的膜性小囊泡,含有大量与来源细胞功能相关的蛋白质和RNA成分。研究表明,MSCs来源的exosomes在特定动物模型中能下调免疫应答或诱导免疫耐受。本实验研究MSCs来源的exosomes对EAU的局部治疗效果并初步探究其作用机制,进一步优化基于MSC的治疗策略和方案,开发新型有效、适用于临床葡萄膜炎治疗的生物产品。方法1.培养人脐带（human umbilical cord,h UC）来源的MSCs,分离纯化并进行表型鉴定。2.Exosomes的收集:收集生长良好的第3-5代MSCs去除牛血清exosomes的完全培养液,梯度离心获得exosomes,0.22μm过滤后用BCA法测定浓度,存储于-80℃保存备用。3.EAU动物模型制备:光感受器间维生素A类结合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP）多肽片段R16与含有结核杆菌素H37RA 2.5 g/L的弗氏完全佐剂（Complete Freund’s adjuvant,CFA）等体积混合后充分乳化,每只大鼠用量0.2ml行单后肢足垫皮下注射建立EAU模型。4.Exosomes治疗:36只Lewis大鼠EAU造模后随机分为exosomes治疗组和模型对照组。预实验:治疗组从疾病初发期当日开始每日球旁sub-tenon囊注射不同浓度（10、20、50、100μg）的exosomes,连续注射7天,相应模型对照组注射等体积的PBS缓冲液,最终选取合适浓度进行后续试验。5.临床观察:各组大鼠于免疫后第6天开始每日在裂隙灯显微镜下观察双眼炎症表现,参照Caspi临床分级进行评分。6.视网膜组织病理学观察:Lewis大鼠免疫后第15天及第21天,各组大鼠处死后固定眼球行视网膜组织病理学HE染色,光学显微镜下观察大鼠葡萄膜及视网膜组织结构,参照Caspi病理学分级进行评价。7.视网膜视觉电生理检测:在免疫后第12天、第15天和第21天对各组大鼠进行视网膜视觉电生理检测,纪录a波和b波的振幅。8.流式细胞仪分析T细胞亚群和炎性细胞比例:免疫后第15天处死大鼠,取大鼠眼球和颈部引流淋巴结,制备单细胞悬液,小鼠抗大鼠CD4、白介素（interleukin,IL）-17,干扰素-γ（IFN-γ）,叉状头螺旋转录因子3（Foxp3）,巨噬细胞标记物（CD68）,中性粒细胞标记物（Gr-1）,自然杀伤（natural killer cell,NK）细胞标记物（CD161）荧光抗体染色,流式细胞仪分析T细胞亚群,包括CD4+IL-17+,CD4+IFN-γ+和CD4+Foxp3+细胞比例,以及炎性细胞,包括巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞百分比。9.5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu）测定T淋巴细胞增殖:免疫后第12天,即发病高峰期,取EAU大鼠脾脏T淋巴细胞。不同浓度梯度（0、1、10、30μg/ml）R16特异性抗原或不同浓度梯度（0、2.5、5、10μg/ml）刀豆蛋白（concanavalin A,Con A）非特异性抗原刺激条件与不同浓度梯度exosomes体外培养48小时,Brdu标记,继续培养24小时,加入Brdu抗体及显色工作液,酶标仪450nm波长处检测吸光度值。10.单核细胞趋化实验:取免疫后第12天大鼠脾脏,分离单个核细胞,体外用Transwell小室系统测定趋化效应,下方孔加入大鼠淋巴细胞趋化因子CCL21以及exosomes,4小时后流式细胞仪分析下孔中迁移的CD4+T细胞以及炎性细胞的比例。结果1.成功分离培养并鉴定h UC-MSCs。2.成功建立大鼠EAU模型。3.临床观察显示,exosomes治疗可降低EAU病程的临床平均分（P<0.05）。4.视网膜组织病理学改变与临床表现变化一致,exosomes治疗能够减轻炎性细胞浸润和视网膜组织结构的损伤,15天及21天组织病理学评分均显着低于模型对照组。（P<0.05）5.视网膜视觉电生理检测结果显示,exosomes治疗第12天、第15天和第21天检测指标暗适应的a波和b波治疗组振幅均明显高于对照组。6.流式细胞分析结果显示,exosomes治疗可以减少CD4+IL-17+,CD4+IFN-γ+细胞,NK细胞在眼部淋巴细胞的比例（P<0.05）,以及巨噬细胞在眼部吞噬细胞中的比例（P<0.05）。在颈部引流淋巴结中,两组之间各细胞比例未见明显差异。7.Brdu测定T淋巴细胞增殖显示,人脐带来源的exosomes对R16特异性抗原以及Con A非特异性抗原刺激的T淋巴细胞增殖均无明显抑制作用。8.单核细胞趋化实验结果显示,人脐带来源的exosomes可抑制CD4+T细胞和炎性细胞的迁移趋化能力。结论MSCs来源的exosomes局部注射可以有效治疗EAU,其机制可能与抑制局部炎性细胞的迁移相关。
苗宗宁,李芳,张学光,吕国忠[8]（2012）在《丝素蛋白材料复合骨髓间充质干细胞修复皮肤创面》文中研究说明背景:丝素蛋白材料具有良好的生物相容性。目的:观察丝素蛋白材料复合骨髓间充质干细胞修复大鼠全层皮肤缺损的可行性。方法:应用5-溴脱氧尿核苷标记SD大鼠骨髓间充质干细胞,并复合丝素蛋白材料培养。建立SD大鼠全层皮肤缺损模型,随机分组:实验组移植同种异体骨髓间充质干细胞与丝素蛋白材料复合物,细胞组移植骨髓间充质干细胞,对照组移植丝素蛋白材料,空白组不作处理。结果与结论:①大体观察:空白组术后8周仍可见坏死组织,且瘢痕挛缩明显;细胞组与空白组愈合情况相近。对照组术后8周未愈合,有少量瘢痕形成,与周围皮肤融为一体。实验组术后4周创面无明显瘢痕形成,术后8周愈合良好。②组织学观察:实验组术后4周免疫荧光染色显示带有5-溴脱氧尿核苷标记的骨髓间充质干细胞定位在重建的表皮和真皮组织中,术后8周创面愈合良好;细胞组免疫荧光染色显示少量带有5-溴脱氧尿核苷标记的骨髓间充质干细胞存在。表明丝素蛋白材料与骨髓间充质干细胞联合移植可修复大鼠全层皮肤缺损。
刘楠梅,田军,韩国锋,程劲,黄健,张金元[9]（2012）在《促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞移植修复小鼠急性肾损伤的作用机制》文中研究表明目的:构建缺血再灌注（I/R）诱导的急性肾损伤（AKI）小鼠模型,经尾静脉注射行骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）移植,观察外源性促红细胞生成素（EPO）对BM-MSCs移植修复AKI效应的调控,并探讨基质细胞衍生因子1（SDF-1）/CXCR4轴在调控中的作用。方法:C57BL/6小鼠100只,随机分为正常对照组、模型组（AKI组）、BM-MSCs移植组、EPO干预组、EPO干预+BM-MSCs移植组,移植BM-MSCs采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记。建模后1d、3d、7d、14d处死部分小鼠,检测血清尿素氮（BUN）及肌酐（SCr）水平,观察肾组织病理变化,行急性肾小管损伤程度评分（ATN评分）,免疫组织化学观察移植后其BM-MSCs在小鼠肾组织的分布,Western印迹法检测损伤肾组织中SDF-1水平。结果:与BM-MSCs移植组及EPO干预组比较,EPO干预+BM-MSCs移植组小鼠BUN、SCr及ATN评分降低幅度更大,至移植后第14d小鼠的BUN、SCr水平甚至接近正常对照组。免疫组化显示BM-MSCs移植组小鼠肾脏中可检出BrdU+细胞分布,以术后第7天最多（11.32%±1.38%）,在此基础上联合EPO干预可增加肾组织中BrdU+阳性细胞比例。AKI建模后肾组织SDF-1水平升高,建模后7d达高峰,EPO干预可显着增加SDF-1的表达。结论:EPO干预可增加BM-MSCs移植后受损肾组织中移植细胞数量,增强AKI的修复作用,其中肾脏中促干细胞归巢因子SDF-1表达增加为其可能机制之一。
韩金玲[10]（2011）在《骨髓基质细胞治疗脑缺血过程中血管内皮生长因子对其趋化性作用的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:体外分离培养骨髓基质细胞（BMSCs）,5-溴脱氧尿苷（BrdU）体外标记细胞,观察其不同时间点的标记率;线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型（MCAO）,TTC染色及HE染色确定脑缺血部位;枕大池注射BMSCs及血管内皮生长因子（VEGF）,探讨BMSCs枕大池注射治疗MCAO中VEGF对其趋化性作用。方法:从2月龄大鼠的后肢骨骨髓中取原代BMSCs,经体外扩增培养、鉴定,BrdU体外标记细胞并观察标记率。线栓法制作大鼠MCAO模型（n=30）, 2h后再灌注。24h后BMSCs治疗组（n=10）及BMSCs+VEGF治疗组（n=10）枕大池注射1×106个BMSCs,对照组（n=10）枕大池注射生理盐水。48h、72h、96h时BMSCs+VEGF组分3次枕大池注射VEGF20ng。每组分别在1周和4周的时间点上各取5只大鼠经心脏灌注后取脑固定,石蜡包埋,在前囟附近切4um厚脑片2张,分别做HE染色和BrdU免疫组织化学染色,观察不同处理组梗塞灶周围的BrdU免疫组织化学染色阳性细胞数。结果:BrdU标记BMSCs在24h、48h及72h的标记率分别为43%、58%、96%。生理盐水组各时间点未见明显阳性细胞。2个治疗组在1周时梗塞灶周围的BrdU阳性细胞数目均较4周时多。在治疗1周和4周时,应用BMSCs+VEGF治疗组均较单独应用BMSCs治疗组在梗塞灶周围的BrdU阳性细胞数目多。P<0.001,差异有显着性意义。结论:BrdU标记BMSCs在标记72h时标记率较高,达到96%。BMSCs枕大池注射治疗大鼠MCAO时,移植细胞向脑缺血部位迁移,加用外源性VEGF对BMSCs向梗塞灶周围迁移有趋化性作用。
二、5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的技术探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的技术探讨（论文提纲范文）
（1）干预脑出血术后铁超载的角蛋白神经支架构建及性能评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英汉缩略名词对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题研究背景 |
| 1.1.1 干细胞市场现状 |
| 1.1.2 组织铁超载研究现状 |
| 1.1.3 铁超载对干细胞的损伤研究现状 |
| 1.1.4 铁超载的治疗策略 |
| 1.1.5 干细胞移植治疗脑出血研究现状 |
| 1.2 课题的研究意义 |
| 1.3 课题的主要内容和技术路线 |
| 2 角蛋白神经支架的制备与表征 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 不同分子量还原角蛋白的提取 |
| 2.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.3 角蛋白凝胶流变性能考察 |
| 2.2.4 角蛋白凝胶表面形貌观察(SEM) |
| 2.2.5 双层角蛋白神经支架制备 |
| 2.2.6 角蛋白凝胶对铁离子的吸附行为考察 |
| 2.2.7 载药凝胶释药行为考察 |
| 2.2.8 角蛋白凝胶降解性能考察 |
| 2.2.9 载生长因子PLGA纳米粒制备及性能考察 |
| 2.2.10 载药率和包封率测定 |
| 2.2.11 载药纳米粒释药行为测定 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 人发中角蛋白的提取 |
| 2.3.2 角蛋白神经支架的制备与表征 |
| 2.3.3 外层角蛋白神经支架的性能考察 |
| 2.3.4 PLGA纳米粒制备与性能考察 |
| 2.4 小结 |
| 3 角蛋白神经支架的细胞毒性及保护作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 BMSCs的获取与培养 |
| 3.3.2 空白角蛋白凝胶毒性作用 |
| 3.3.3 载药角蛋白毒性作用 |
| 3.3.4 铁超载模型建立 |
| 3.3.5 载药角蛋白凝胶对骨髓间充质干细胞的保护作用 |
| 3.3.6 载药角蛋白凝胶对骨髓间充质干细胞的保护作用 |
| 3.3.7 Brdu标记实验 |
| 3.3.8 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 骨髓间充质干细胞的提取 |
| 3.4.2 角蛋白凝胶对骨髓间充质干细胞的毒性考察 |
| 3.4.3 载药角蛋白凝胶对骨髓间充质干细胞的保护作用 |
| 3.4.4 Brdu对骨髓间充质干细胞的标记实验 |
| 3.5 小结 |
| 4 角蛋白神经支架的脑组织保护作用评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 载MSC角蛋白神经支架制备 |
| 4.3.2 动物模型建立 |
| 4.3.3 冰冻切片制备 |
| 4.3.4 脑组织含水量测定 |
| 4.3.5 普鲁氏铁染 |
| 4.3.6 尼氏染色 |
| 4.3.7 神经功能评分 |
| 4.3.8 Brdu&NeuN免疫荧光双染 |
| 4.3.9 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 铁超载动物模型 |
| 4.4.2 脑组织含水量测定 |
| 4.4.3 普鲁氏铁染色 |
| 4.4.4 尼氏染色 |
| 4.4.5 神经功能评分 |
| 4.4.6 Brdu&NeuN免疫荧光双染 |
| 4.5 小结 |
| 5 全文总结与后续工作建议 |
| 5.1 全文的主要结论 |
| 5.2 后续工作建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B.作者在攻读学位期间参与的科研项目 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（2）体外构建三维血管化组织工程窦房结（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物及试剂 |
| 1.1.2 兔骨髓间充质干细胞分离、培养及形态学观察 |
| 1.1.3 兔血管内皮细胞的分离、培养、诱导及鉴定 |
| 1.1.4 兔原代窦房结细胞分离、培养及形态学观察 |
| 1.1.5 兔窦房结细胞裂解液的制备 |
| 1.1.6 兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为起搏样细胞的培养、鉴定 |
| 1.1.7 体外构建三维血管化组织工程窦房结 |
| 1.1.8 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 兔骨髓间充质干细胞的原代培养 |
| 1.2.2 兔原代骨髓间充质干细胞传代培养 |
| 1.2.3 兔原代骨髓间充质干细胞诱导为血管内皮细胞 |
| 1.2.4 兔原代窦房结细胞的分离、提取及细胞形态学观察 |
| 1.2.5 兔骨髓间充质干细胞诱导成起搏样细胞 |
| 1.2.6 体外构建血管化组织工程窦房结 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 兔骨髓间充质干细胞体外诱导为起搏样细胞 |
| 1.3.2 兔骨髓间充质干细胞体外诱导为血管内皮细胞 |
| 1.3.3 体外构建血管化组织工程窦房结 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 心脏起搏样细胞的分子机制 |
| 2.2 心脏起搏样细胞和HCN通道 |
| 2.3 生物起搏器构建的种子细胞 |
| 2.4 构建生物起搏的常用方式 |
| 2.4.1 干细胞诱导 |
| 2.4.2 基因转染 |
| 2.4.3 细胞融合 |
| 2.5 生物起搏器的支架材料 |
| 2.6 生物起搏器的移植方式 |
| 2.7 生物起搏器的存在问题 |
| 2.8 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
（3）Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 转录因子Tbx18介导c-kit~+犬间充质干细胞(cMSCs)在体外共培养环境中定向分化为窦房结样细胞的实验研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 使用流式细胞仪分选c-kit~+c MSCs犬窦房结、犬心房肌细胞原代分离培养.. |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 构建Tbx18 慢病毒载体转染c-kit~+cMSCs |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Tbx18 过表达促使c-kit~+cMSCs向窦房结样细胞分化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第二部分 HCN4和GJA7共转染cMSCs体外诱导分化 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCN4和GJA7慢病毒载体构建与转染cMSCs |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 HCN4和GJA7共转染cMSCs体外诱导分化及检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第三部分 温敏水凝胶对Tbx18、HCN4、GJA7 基因转染cMSCs生物学活性的影响 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 壳聚糖/β甘油磷酸钠温敏水凝胶体外细胞毒性检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 壳聚糖/β甘油磷酸钠温敏水凝胶内细胞生长情况评价 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 心脏生物起搏器的研究进展和展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文及期刊 |
| 致谢 |
（4）骨髓间充质干细胞表面标记物研究进展（论文提纲范文）
| 1 MSCs标记及相应指标 |
| 2 与MSCs相关的CD分子表达 |
| 3 结语 |
（5）异氟醚麻醉抑制海马齿状回神经干细胞的增殖及分化（论文提纲范文）
| 文章亮点: |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 设计: |
| 时间及地点: |
| 材料: |
| 实验动物: |
| 实验方法: |
| 实验分组: |
| 异氟醚吸入麻醉: |
| 5-溴脱氧尿苷处理: |
| 免疫荧光染色和观察: |
| Neuro D和Brd U双重荧光染色的鉴定: |
| 主要观察指标: |
| 统计学分析: |
| 2 结果Results |
| 2.1 实验动物数量分析 |
| 2.2 大鼠一般情况变化 |
| 2.3 大鼠海马齿状回神经干细胞增殖情况 |
| 2.4 大鼠海马齿状回神经干细胞向神经元分化情况 |
| 3 讨论Discussion |
| 作者贡献: |
| 利益冲突: |
| 伦理要求: |
| 学术术语: |
| 作者声明: |
（6）川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 川芎嗪预处理BMSCs移植提高脑缺血的治疗作用 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验仪器 |
| (四) 实验方法 |
| 1. 骨髓间充质干细胞分离培养 |
| 2. 骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 |
| 3. 骨髓间充质干细胞预处理 |
| 4. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
| 5. 动物分组及BMSCs移植 |
| 6. 行为学评价 |
| 7. 梗死体积检测 |
| 8. 统计学分析 |
| 二、结果 |
| (一) 骨髓间充质干细胞的形态学观察 |
| (二) BMSCs表面标记物鉴定 |
| (三) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠mNSS评分的影响 |
| (四) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠粘胶揭除试验评分的影响 |
| (五) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠角试验的影响 |
| (六) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠脑梗死体积的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 骨髓间充质干细胞的分离与鉴定 |
| 1. 骨髓间充质干细胞的分离、培养 |
| 2. 骨髓间充质干细胞的的鉴定 |
| 3. 骨髓间充质干细胞预处理 |
| (二) 川芎嗪预处理BMSCs移植改善脑缺血大鼠的神经功能 |
| 1. 川芎嗪预处理BMSCs移植改善了大鼠的行为学功能 |
| 2. 川芎嗪预处理BMSCs移植减少大鼠的梗死体积 |
| 四、小结 |
| 第二部分 川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验仪器 |
| (四) 实验方法 |
| 1. BrdU标记骨髓间充质干细胞 |
| 2. BMSCs预处理 |
| 3. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
| 4. 动物分组及BMSCs移植 |
| 5. BMSCs向脑缺血损伤区归巢的检测 |
| 6. SDF-1免疫荧光检测 |
| 7. BrdU和SDF-1免疫阳性细胞计数 |
| 8. 统计学分析 |
| 二、结果 |
| (一) BrdU标记骨髓间充质干细胞的阳性标记率 |
| (二) 川芎嗪预处理对BMSCs向脑缺血损伤周边区迁移的影响 |
| (三) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区SDF-1表达的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) BMSCs体外BrdU标记的最佳时间和浓度的筛选 |
| (二) 川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移 |
| 1. 川芎嗪预处理促进BMSCs归巢 |
| 2. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后SDF-1的表达 |
| 四、小结 |
| 第三部分 川芎嗪预处理BMSCs移植治疗脑缺血的机制研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验仪器 |
| (四) 实验方法 |
| 1. BMSCs预处理 |
| 2. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
| 3. 动物分组及BMSCs移植 |
| 4. 脑缺血损伤周边区血管生成检测 |
| 5. VEGF和BDNF免疫荧光检测 |
| 6. vWF、VEGF和BDNF免疫阳性细胞计数 |
| 7. 统计学分析 |
| 二、结果 |
| (一) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠血管生成的影响 |
| (二) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区VEGF表达的影响 |
| (三) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区BDNF表达的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 川芎嗪预处理BMSCs移植提高脑缺血治疗作用的机制探讨 |
| 1. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后的血管生成 |
| 2. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后的神经营养因子分泌 |
| 四、小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（7）间充质干细胞来源的exosomes对实验性自身免疫性葡萄膜炎作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1.实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 间充质干细胞(MSCs)培养与鉴定 |
| 2.2 Exosomes的鉴定和扫描电镜观察 |
| 2.3 h UC-MSCs来源的exosomes治疗减轻EAU临床表现 |
| 2.4 h UC-MSCs来源的exosomes治疗改善EAU组织病理学表现 |
| 2.5 视网膜视觉电生理检测 |
| 2.6 h UC-MSCs-exosomes对 T淋巴细胞增殖无显着影响 |
| 2.7 h UC-MSCs来源的exosomes能下调眼部致炎性T细胞和炎症细胞的比例 |
| 2.8 人脐带来源的exosomes可抑制CD4~+T细胞和炎性细胞的迁移趋化功能 |
| 3.讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 葡萄膜炎免疫机制研究现状及进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）丝素蛋白材料复合骨髓间充质干细胞修复皮肤创面（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 骨髓间充质干细胞的培养结果 |
| 2.2 骨髓间充质干细胞的表面抗原测定结果 |
| 2.3 5-溴脱氧尿核苷标记骨髓间充质干细胞的结果 |
| 2.3 各组皮肤创面修复结果比较 |
（9）促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞移植修复小鼠急性肾损伤的作用机制（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
（10）骨髓基质细胞治疗脑缺血过程中血管内皮生长因子对其趋化性作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 目录 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究历史与现状 |
| 1.3 研究内容及技术难点 |
| 1.4 预期目标及研究意义 |
| 第2章 技术方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 BMSCs 的分离、原代培养、扩增与鉴定 |
| 2.3 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine BrdU)外标记细 胞,行免疫细胞化学染色观察标记率 |
| 2.4 大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型的构建和评价 |
| 2.5 枕大池注射骨髓基质细胞及血管内皮生长因子 |
| 2.6 心脏灌注取脑固定 |
| 2.7 脑组织石蜡切片HE染色及BrdU免疫组织化学染色 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 骨髓基质细胞的形态学观察 |
| 3.2 骨髓基质细胞表面标志物的鉴定 |
| 3.3 免疫组化染色检测 5-溴脱氧尿苷标记率 |
| 3.4 大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型的评价 |
| 3.5 枕大池移植细胞及注入血管内皮生长因子 |
| 3.6 经心脏灌注取材 |
| 3.7 BrdU 免疫组织化学染色 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 骨髓基质细胞的细胞学特点及分离、纯化、标记 |
| 4.2 骨髓基质细胞治疗脑缺血时的移植途径 |
| 4.3 大鼠脑缺血模型的建立 |
| 4.4 VEGF在中枢神经系统的作用 |
| 4.5 VEGF 促进 BMSCs 迁移的机制 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 个人简介 |
四、5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的技术探讨（论文参考文献）
- [1]干预脑出血术后铁超载的角蛋白神经支架构建及性能评价[D]. 屈清. 重庆大学, 2019(01)
- [2]体外构建三维血管化组织工程窦房结[D]. 常青. 华北理工大学, 2019(01)
- [3]Tbx18、HCN4和GJA7介导cMSCs体外诱导分化及温敏凝胶对细胞活性影响的研究[D]. 肖华. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [4]骨髓间充质干细胞表面标记物研究进展[J]. 崔国宁,刘喜平,曾庆涛. 山西中医学院学报, 2018(02)
- [5]异氟醚麻醉抑制海马齿状回神经干细胞的增殖及分化[J]. 卢成康. 中国组织工程研究, 2015(19)
- [6]川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用[D]. 李琳. 浙江中医药大学, 2015(01)
- [7]间充质干细胞来源的exosomes对实验性自身免疫性葡萄膜炎作用的研究[D]. 白伶伶. 天津医科大学, 2015(05)
- [8]丝素蛋白材料复合骨髓间充质干细胞修复皮肤创面[J]. 苗宗宁,李芳,张学光,吕国忠. 中国组织工程研究, 2012(51)
- [9]促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞移植修复小鼠急性肾损伤的作用机制[J]. 刘楠梅,田军,韩国锋,程劲,黄健,张金元. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2012(05)
- [10]骨髓基质细胞治疗脑缺血过程中血管内皮生长因子对其趋化性作用的实验研究[D]. 韩金玲. 汕头大学, 2011(01)