一、人血管生成抑制因子canstatin基因的克隆及真核表达（论文文献综述）
史文荣,王雪雯[1]（2013）在《血管能抑素的应用及研究进展》文中认为血管能抑素是继血管生成抑制素、内皮抑素之后新发现的一种血管生成和肿瘤生长抑制因子。动物实验研究结果显示,血管能抑素通过抑制血管生成、阻断肿瘤生长的营养供应,从而抑制了多种肿瘤细胞的生长和转移。近年来因其具有良好的抗肿瘤血管生成活性而倍受关注,成为抗肿瘤治疗研究的新热点之一。本文就其作用机制尤其是在肿瘤治疗中的应用现状及研究进展进行综述和展望。
沈锦城[2]（2012）在《用Canstatin-N抑制大鼠视网膜血管增生的研究》文中研究表明糖尿病视网膜病变是糖尿病严重的并发症之一,是致盲的主要原因之一,严重地影响着人们的生存质量。糖尿病视网膜血管增生将最终致盲,Canstatin-N是一种分子量小而活性高的血管生成抑制因子。本论文研究应用Canstatin-N蛋白治疗糖尿病视网膜血管增生。应用PCR的方法克隆Canstatin-N基因,将Canstatin-N基因重组于毕赤酵母表达载体pGAP9K的多克隆位点,构建毕赤酵母组成型分泌型表达载体pGAP9K-canstatin-N。通过电转法将pGAP9K-canstatin-N转化于毕赤酵母GS115菌种,用基因特异引物PCR验证重组子,用G418抗性筛选出高拷贝的重组子作为工程菌。在发酵罐中进行高密度发酵GS115（pGAP9K-canstatin-N）工程菌分泌表达重组Canstatin-N。用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换纯化重组蛋白。经过纯化的重组Canstatin-N蛋白具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的生物学活性。应用DeadEndTM Fluorometric TUNEL System （Promega）分析证明浓度为0.12μg/mL的Canstatin-N蛋白诱发81%的血管内皮细胞凋亡（P<0.01）。成功构建用链脲佐菌素诱发SD大鼠糖尿病视网膜血管增生模型。分别应用滴眼法和皮下注射法治疗糖尿病SD鼠模型的视网膜血管增生。用药两月后,注射生理盐水对照组10个视野（40×）167条血管,注射Canstatin-N蛋白组10个视野（40×）110条血管（P<0.05）；滴生理盐水对照组10个视野（40×）177条血管,滴Canstatin-N蛋白眼药水组10个视野（40×）41条血管（P<0.01）；对注射法与滴眼法治疗后视网膜血管数量统计分析表明两组之间呈显着性差异（P<0.01）。以上结果表明Canstatin-N的注射给药法和滴眼给药都能有效地治疗SD大鼠糖尿病视网膜血管增生,但是滴眼法的疗效显着高于注射给药法。制备眼药水法简易易行,并且疗效显着,具有深入研究和开发Canstatin-N蛋白眼药水作为治疗人眼睛血管增生药物的前景。
傅文达[3]（2011）在《As2O3联合重组Canstatin蛋白对血管内皮细胞影响的研究》文中指出目的：通过重组canstatin蛋白、As203及二者联合方式分别干预人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和肿瘤血管内皮细胞（Td-EC）,探讨干预因素对HUVEC和Td-EC生物学影响,为As203联合用药方案抗肿瘤的可行性和有效性提供实验基础和理论依据。方法：1.分别培养稳定转染pcDNA3.1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒肝癌HepG2细胞、HepG2细胞72h,提取上清液经超滤浓缩后,用Western-blot鉴定上清液中canstatin蛋白表达情况；2、HUVEC分离培养及鉴定。3.用肝癌HepG2细胞培养上清液培养HUVEC 72h,收集细胞,RT-PCR检测TEM1和TEM8的表达情况。4.实验按干预因素不同分重组组（稳定转染pcDNA3. 1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒的肝癌HepG2细胞培养上清液）、As203组（2μmol/L）、联合组（重组canstatin与As203蛋白）、空白组（HepG2细胞培养上清液）,各因素分别干预HUVEC和Td-EC,通过绘制生长曲线、Transwell小室法、流式细胞术、内皮细胞成管实验等方法检测细胞生物学。结果：1.Western-blot检测重组质粒肝癌HepG2细胞培养上清液,可见大小约为26KD的Canstatin蛋白条带。2.培养的HUVEC经荧光免疫染色后,可见细胞质内有黄绿色荧光,表明人Ⅷ因子相关抗原存在;3.肝癌HepG2细胞培养上清液培养诱导HUVEC, RT-PCR扩增产物电泳显示约287 bp及460 bp的条带,提示细胞表达肿瘤血管内皮细胞标志物TEM1和TEM8,4.1.对细胞生长活力的影响：细胞每24h倒置显微镜下观察细胞生长情况、存活细胞计数,绘制细胞生长曲线；结果显示,HUVEC、Td-EC随培养时间延长,存活细胞数递减,呈时间依赖性,前后天存活细胞数比较p<0.05,实验组间比较p<0.05；重组组、As203组与对照组比较p<0.05,联合组与对照组比较p<0.01; Td-EC空白组存活细胞数增加比HUVEC空白组明显,二组间比较p<0.05; Td-EC实验各组存活细胞数减少比对应HUVEC实验各组明显,组间比较p<0.05。4.2对细胞凋亡的影响,凋亡率（HUVEC, Td-EC）,重组组（12.2±0.32%,16.43±0.27%）、As203组（9.76±0.17%,14.05±0.21%）和联合组（15.78±0.18%,20.69±0.23%）,空白组（6.30±0.13%,4.73±0.14%）,单一用药组间比较p<0.05,联合组分别与单一用药组比较p<0.01,实验各组与空白组比较p<0.01; Td-EC各组与对应的HUVEC各组比较p<0.05,空白组之间比较p<0.05。4.3对细胞迁移、管腔能力的影响,迁移细胞数（HUVEC, Td-EC）,重组组（29.20±1.30,27.60±0.55）、As203组（36.00±1.00,33.20±1.30）、联合组（24.33±1.36,21.00±1.26）、空白组（45.40±1.14,50.60±1.34）；管腔形成数（HUVEC, Td-EC）分别为,重组组（4.40±1.03,3.50±0.94）、As203组（6.00±1.14,4.96±0.93）、联合组（2.90±0.92,2.30±0.75）,空白组（13.23±0.89,14.13±1.28）,其中联合组迁移细胞数、管腔形成数最少,三组间比较p<0.05；实验各组与空白组比较p<0.01; Td-EC各组与对应的HUVEC各组比较p<0.05,两细胞空白组比较p<0.05。结论：1.稳定转染重组质粒的肝癌HepG2细胞培养上清液中有表达Canstatin蛋白.2. HUVEC经诱导鉴定为Td-EC.3. Td-EC比HUVEC具有更强细胞成活能力、血管形成能力及迁移能力。4.三个干预因素对内皮细胞有促进凋亡作用和抑制细胞成活能力、血管形成、迁移能力,并以联合组作用最强,同时Td-EC对上述作用的敏感性高于HUVEC.
傅文达,王雪雯[4]（2010）在《canstatin抗肿瘤作用研究现状》文中提出肿瘤的生长及转移均依赖于血管新生[1]。抗血管生成治疗已成为肿瘤的治疗热点,目前以内源性血管生成抑制因子研究为主。血管能抑素（canstatin）是新近发现的一种来源于IV型胶原蛋白的内源性抗血管新生抑制因子,具有较强的抗血管新生作用而受到重视,现综述其抗肿瘤研究现状。
潘英文,张爱联,屈直,张添元,罗进贤[5]（2010）在《Canstatin-N基因在Pichia pastoris中表达及产物活性分析》文中认为目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统胞内表达canstatin-N蛋白。方法:通过PCR DNA合成技术以及DNA的酶切和连接技术,除去pPIC9K分泌型表达载体的信号肽,并使其载体的多克隆位点的3′端融合his6纯化标签,获得新的载体pPIC9Ki。以含canstatin N端序列的pET-CTN质粒为模版,PCR法扩增1～89个氨基酸的267bp的canstatin的N端基因片段,将其连接于pPIC9Ki的多克隆位点,获得重组表达质粒pPIC9Ki-CTN-N,用电转法将pPIC9Ki-CTN-N转化P.pastorisGS115,通过G418抗性筛选获得工程菌GS115（pPIC9Ki-CTN-N）。通过摇瓶发酵甲醇诱导表达Canstatin-N蛋白。用蜗牛酶裂解P.pastoris细胞,SDS-PAGE分析蛋白表达情况,在鸡胚中进行活性分析。结果:在pAOX1的调控下,canstatin-N基因能在P.pastoris中经甲醇诱导表达,摇瓶发酵表达量为65mg/L,纯化的目的蛋白具有显着的抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用。结论:实现应用P.pastoris表达Canstatin-N蛋白,为Canstatin-N蛋白的规模化生产和进一步的药用研究奠定了基础。
亓民[6]（2010）在《腺病毒介导canstatin基因抑制肝癌的实验研究》文中研究说明原发性肝癌是全球发病率很高的恶性肿瘤之一,目前据世界卫生组织统计,全世界每年新发现病例超过26万人,肝癌的发病率和死亡率均占我国癌症中的第三位。肝癌的发生经过多个环节调控,由启动、促癌和发展等多个步骤形成,涉及多个基因参与和突变,最终导致肝细胞由不典型增生直到肝细胞癌变,病因并不完全清楚。目前大部分研究认为肝细胞癌的发生与肝硬化结节、乙型和丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素、基因变异和地理环境因素密切相关。由于原发性肝癌经血及淋巴液转移早,局部侵润性强,多数确诊时已经发展到了中晚期,预后较差。绝大多数肝癌患者在明确诊断时往往已进入中、晚期,癌细胞已经在肝脏内外发生广泛的转移,虽然手术、介入、化疗及放疗等传统治疗手段在肝癌治疗方面取得一些重大进展,但肝癌患者的近期生存率和远期预后没有明显改善,因此,寻找新的治疗方法成为了临床医生和科研工作者最关注的问题。目前除了医院常用的传统手术、化疗和放射治疗之外,随着基因工程技术的日益成熟,许多医院逐渐开展了各种各样的基因介导治疗,这些基因治疗技术包括自杀基因治疗、免疫基因治疗、导入抑癌基因治疗、抗肿瘤血管基因治疗等等,其中以腺病毒介导抗肿瘤血管基因治疗方法已经成为目前的研究热点之一。早在二十世纪七十年代,Folkman首次提出了恶性肿瘤生长依赖于新生血管的形成,新生血管供给恶性肿瘤生长所需的营养,这种观点随后被大量研究证实。当肿瘤直径达到1mm时,如果没有新生血管支持其生长,肿瘤便进入休眠期或退化,如果新生的血管长入肿瘤组织,肿瘤将会快速生长达到失去控制的体积。新血管提供给肿瘤氧和各种营养并带走代谢废物。因此,抗肿瘤血管生成治疗可以直接切断肿瘤生长转移所依赖的营养供给,此种方法现在已成为肝癌研究领域新亮点。近年研究表明新生血管形成仅在少数组织中存在,除了女性生殖子宫内膜、胎盘组织和伤口修复等部位发生短暂的新生血管的现象,体内的血管系统大部分时间是保持静止状态的,体内的部分组织中血管是否发生主要取决于局部促血管发生因子和血管抑制因子之间的平衡状态。一方面促血管生长因子的上调促进血管生成,另一方面血管生长抑制因子水平的下调抑制血管生成。目前研究证明所有内源性血管生长抑制因子都能够抑制动物模型体内的肿瘤生长,但是直接应用血管生成抑制因子治疗恶性肿瘤目前仍面临许多问题：1)需要长期应用血管生成抑制因子；2)当大剂量应用可能会对人体产生有害的免疫反应。3)生产成本高导致巨额治疗费用使病人难易承担。基因治疗是通过生物载体或非生物技术将目的DNA或RNA转移到宿主细胞中使其能够有效的进行表达,即在宿主细胞内合成重组蛋白,作用于局部组织而发挥抗肿瘤的治疗作用。这种基因治疗的优点是：1)借助外源基因的导入,使宿主细胞本身可以合成重组蛋白,从而减少了生产成本；2)基因治疗是将目的基因导入肿瘤细胞内,使其能够有效表达,在肿瘤局部区域重组蛋白含量增多,明显提高治疗效果。如今,全世界正在进行的二百多个临床基因治疗试验项目中约有半数是针对于恶性肿瘤治疗的,而这其中又有一半的基因疗法又都是针对肿瘤细胞本身。目前应用抑制血管生成的基因治疗直接针对血管内皮细胞,因为血管内皮细胞遗传性十分稳定,目的基因可以在人体内稳定地表达数月或数年,并且这种基因治疗载体要比制造大量高纯度的蛋白质容易和减少许多花费。目前,腺病毒作为基因治疗中常用的载体工具,具有外源基因表达高效及转染率高等优点,重组腺病毒在局部肿瘤组织中大量表达重组蛋白,在局部抑制肿瘤血管的生成,同时腺病毒感染肿瘤细胞还能诱发宿主抗肿瘤免疫反应,可以从多种方面发挥抗肿瘤作用。近年,研究者发现了一种新的内源性血管生成抑制因子——canstatin蛋白,canstatin蛋白源于Ⅳ型胶原a2链C端非胶原区（NC1）结构域,对内皮细胞的增殖和迁移具有明显的抑制性作用,可诱导内皮细胞调亡,从而发挥抑制新生血管形成及其生长的作用。研究显示,canstatin蛋白可以明显抑制裸鼠人肾癌、前列腺癌、食管癌及卵巢癌的生长,但是canstatin蛋白对肝癌的抑制作用如何,由腺病毒介导的canstatin基因对人肝癌的治疗作用如何?这些问题目前国内外尚未见报道。在本研究中我们首先克隆了人canstatin基因,并构建了其原核表达载体和重组canstatin蛋白,继而证实了canstatin蛋白抑制肝癌生长的作用,然后我们又构建了携带canstatin基因的腺病毒载体,最后将携带canstatin基因的重组腺病毒注入小鼠肝癌移植瘤中,观察小鼠肝癌移植瘤体积变化、病理变化、微血管密度和肝癌组织中caspase-3及Flk-1达,探讨其在肝癌治疗中的作用。第一部分实验人canstatin cDNA基因的克隆目的：克隆人canstatin cDNA基因,分析其基因序列。方法：采用RT-PCR技术,从新鲜人胎盘组织中提取目的基因canstatin cDNA,进而克隆载体pGEM-T,然后获得重组质粒pGEM-T/canstatin,最后转化E.coliDH 5a,筛出阳性克隆基因,测定其序列。结果：1%琼脂糖凝胶电泳显示,人胎盘组织中mRNA有3条清晰条带（5S,18S,28S）；分光光度计测定显示,mRNA的A260=0.878, A280=0.411, A260/A280=2.136,计算总RNA浓度为1.76g/L。RT-PCR扩增物与目的基因canstatin长度基本一致。RT-PCR扩增产物与载体PGEM-T连接处理后,转化E.coli DH5a,可在有氨苄青霉素的LB平板上见到白色和蓝色菌落,挑选相对较好5个白色菌落做Bam HI和HindⅢ酶切鉴定,证实为阳性克隆。上海生物工程公司测定基因序列显示,重组质粒阳性克隆中的目的基因与GenBank公布的canstatin基因序列相同。结论：我们成功克隆了canstatin基因,为下一步利用canstatin蛋白抗肝癌治疗研究奠定了基础。第二部分实验原核表达并重组人canstatin蛋白目的：构建canstatin基因原核表达载体,表达并纯化重组人canstatin蛋白。方法：使用双酶切从重组质粒pGEM-T/canstatin上切下canstatin基因,插入到目的质粒pET-22b（+）相应位点,转化E.coli BL21,经过IPTG诱导重组人canstatin蛋白表达,使用SDS-PAGE电泳仪分析人canstatin蛋白表达情况。采用Ni-NTA柱亲和层析并纯化重组人canstatin蛋白,使用PBS对其透析复性。结果：从重组质粒PGEMT-T/canstatin切下目的基因canstatin cDNA,插入到质粒pET-22b（+）相应位点,转化E. coliBL21,挑选5个较好的菌落经Bam HI和HindⅢ双酶切后做电泳鉴定,显示所有菌落均含有2条特异性条带,分别与目的基因及原质粒对应。SDS-PAGE电泳仪分析结果显示在24KD出现新蛋白条带,诱导后1h、2h、3h和4h表达蛋白占菌体总蛋白的比例分别为17.2%,17.8%,21.0%和22.4%。Ni-NTA柱亲和层析显示,在125Mm和250mM洗脱液中均纯化出人canstatin蛋白.结论：canstatin原核表达载体可以被成功构建,并纯化出重组人canstatin蛋白。第三部分实验探讨重组人canstatin蛋白在体内治疗肝癌的疗效目的：探讨重组人canstatin蛋白在体内治疗肝癌的疗效。方法：利用SMMC-7721肝癌细胞株建立30只裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,当肿瘤长至直径2-3mm时,随机分3组,即PBS对照组,5-Fu治疗组和canstatin蛋白治疗组,各组均经瘤体内多点注射给药。治疗期间定期测量移植瘤大小及重量；治疗后取出瘤体做常规病理检查免疫组化染色,总疗程为21天。结果：从治疗第3天,canstatin治疗组及5-Fu治疗组移植瘤体积显着小于对照组（P<0.05）；治疗第6天,有非常显着差异P<0.01。疗程结束时,虽然5-Fu治疗组疗效最显着,但全身的毒副作用明显,病理证实肝脏损害严重。结论：重组人canstatin蛋白可显着抑制肝癌组织生长,没有明显毒副作用,是肝癌患者较为理想的治疗方法。第四部分实验构建携带canstatin基因的腺病毒载体目的：利用基因工程技术,构建携带canstatin基因的腺病毒载体Ad-canstatin.方法；使用聚合酶链式反应（PCR）技术,扩增PET/canstatin载体上canstatin基因,双酶切后插入到pCA13质粒相应的位点,成功构建pCA13-Cans穿梭载体；pCA13-Cans与腺病毒骨架pBGHE3共转染293细胞,经3次病毒空斑纯化得到重组腺病毒,利用聚合酶链式反应（PCR）技术鉴定重组腺病毒。经293细胞扩增重组腺病毒、采用氯化铯密度梯度法离心纯化重组腺病毒并使用TCH150检测重组腺病毒的滴度。结果：从PET/canstatin载体上成功扩增出709bp含canstatin基因的DNA片段,将其插入到pCAl3质粒中成功构建了pCA13-Cans质粒,并经PCR及酶切鉴定正确后,与腺病毒骨架pBGHE3在293细胞内同源重组获得重组腺病毒,再经PCR鉴定重组腺病毒构建正确,命名为Ad-canstatin,使用TCH150检测重组病毒的滴度为3.1×109pfu/ml。结论：获得了高滴度重组腺病毒Ad-canstatin为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。第五部分实验Ad-Canstatin治疗肝癌实验研究目的：观察Ad-Canstatin在小鼠肝癌瘤体内抑制肝癌疗效。方法：以SMMC-7721人肝癌瘤细胞建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型。首先培养人肝癌瘤细胞悬液,将24只裸鼠随机均分成3组,每只裸鼠左侧腋窝皮下注射瘤细胞悬液0.1ml（浓度为2×107/ml）,等到裸鼠肿瘤体积生长至50mm3左右时,将荷瘤裸鼠随机平均分成Ad-canstatin治疗组、PBS对照组和GFP空载组,每组有8只荷瘤裸鼠。每个肿瘤均行两次瘤内注射,间隔72小时,Ad-canstatin组和GFP空载组裸鼠瘤内注射病毒量分别为为8×109PFU,PBS对照组裸鼠注射0.1ml PBS。主要观察指标有：1、肿瘤生长抑制率2、肿瘤体积生长曲线。3、病理学检查：在注射药物30天后裸鼠均被处死,比较各组组织病理学变化。4、免疫组织化学方法检查：检测各组的肿瘤组织中caspase-3和Flk-1表达情况。结果：1.在注射Ad-canstatin基因治疗后第3天,Ad-canstatin组裸鼠的肿瘤体积明显小于PBS和GFP组（P<0.05）；其后观察发现,随着时间延长各组裸鼠肿瘤体积均增大,但Ad-canstatin组裸鼠的肿瘤生长速度和肿瘤体积均显着小于PBS和GFP组（P<0.05）。2.病理学检测显示,各组裸鼠瘤体内均见有不同程度的坏死组织,Ad-canstatin治疗组裸鼠瘤体内的坏死组织显着多于PBS和GFP组。3.Ad-Canstatin治疗组Flk-1的表达明显低于PBS组和GFP组,差别有统计学意义（x2=7.778,p<0.01）；4.Ad-canstatin治疗组caspase-3的表达明显高于GFP组和PBS组,差别有统计学意义（分别x2=6.563和x2=10.50,p<0.01）。结论：利用腺病毒载体Ad-Canstatin能够成功抑制裸鼠肝癌组织的生长,并能够降低肝癌组织中Flk-1的表达和提高caspase-3的表达。我们认为Ad-canstatin治疗肝癌的作用机制是：一方面在肿瘤组织中表达canstatin蛋白从而抑制肝癌血管的生成,另一方面,可能是降低Flk-1的表达和提高肝癌组织caspase-3的表达,促进了肝癌细胞的凋亡,从而也起到抑制肝癌细胞的生长。总之,canstatin蛋白作为新的内源性血管生成抑制剂有望成为治疗肝癌的新药物,利用腺病毒介导canstatin基因治疗肝癌不但能发挥强大的抗肿瘤作用而且能减少治疗费用,为肝癌治疗开辟了新方法,未来将会有良好的应用前景。
温镭,宋娜玲,贺欣,赵启仁[7]（2010）在《源于Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制剂》文中研究指明新血管生成是各种生理和病理过程发生的基础。在胚胎形成和胎盘发育等正常生理过程中,新血管的生成是至关重要的;然而对于一些疾病的产生,特别是肿瘤的生长、进展和转移,同样离不开血管生成的作用。伴随着"抗肿瘤血管生成疗法"的提出,控制血管生成"开关"的血管生成刺激因子和抑制因子成为研究的热点。Arresten、Canstatin、Tumstatin和Hexastatin是近些年发现的内源性的血管生成抑制因子,它们同系Ⅳ型胶原α链的非胶原区NC1,具有相似的结构和分子量大小,现有研究表明,它们能与内皮细胞表面整合素受体相结合,有效地抑制内皮细胞的增殖和迁移,降低肿瘤组织的微血管密度,切断肿瘤的营养和氧气供给,从而抑制肿瘤的生长和转移。对其作用机制的研究,将有助于肿瘤血管生成抑制剂新药的研发。
赵贵先[8]（2010）在《人canstatin基因转染及其对体外培养肝癌HepG2细胞凋亡及迁移的影响》文中进行了进一步梳理目的：构建含有canstatin基因的分泌型表达重组质粒并转染肝癌HepG2细胞,观察表达产物对体外培养肝癌细胞迁移能力和调亡的影响。方法：实验分为三部分。第一部分为含有canstatin重组质粒的构建,包括：1. Canstatin基因从胎盘组织中获取,RT-PCR扩增Canstatin cDNA及切胶回收并纯化,酶切pcDNA3. 1（-）-3flag载体质粒后,采用DNA定向连接技术构建含有canstatin的重组质粒pcDNA3. 1（-）-3flag/canstatin;2. pcDNA3. 1（-）-3flag/canstatin重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α；3.重组质粒的扩增及提取质粒DNA；4.质粒DNA经酶切鉴定及筛选后阳性质粒制成甘油菌送往公司测序；第二部分为pcDNA3.1（-）-3flag/canstatin重组质粒DNA转染至肝癌HepG2细胞及mRNA和蛋白水平表达的鉴定,包括：1.脂质体法共转染肝癌HepG2细胞,G418筛选稳定转染的肝癌HepG2细胞；2.实时定量PCR检测并比较canstatin在稳转后的肝癌HepG2细胞的表达;3. Western blot检测重组质粒转染后肝癌HepG2细胞的上清液中canstatin蛋白的表达；4.收集含有canstatin的重组质粒稳定转染后的肝癌HepG2细胞的上清液；第三部分为cantatin蛋白对体外培养的肝癌HepG2细胞凋亡和迁移能力的影响的检测,包括：1.实验分组：空质粒转染的上清液组,重组质粒转染表达的上清液组,稳转后肝癌HepG2细胞组,未转染肝癌HepG2细胞组（空白对照组）；2.各组作用于培养的肝癌HepG2细胞；3.流式细胞仪检测凋亡细胞、凋亡率；4. Trance well小室和划痕实验测定转染细胞对重组基底膜的迁移能力。。结果：1.于胎盘组织获得684bp人canstatin基因,测序证明canstatin cDNA编码序列与基因库中登录的中国人canstatin序列比较,符合率百分之百。构建的分泌型真核表达载体pcDNA3. 1（-）-3flag/canstatin经酶切可得到5000bp和700bp两个条带,与pcDNA3. 1（-）-3flag载体质粒5400bp和canstatin684bp相符合。2.将构建好的重组质粒pcDNA3. 1（-）-3f lag/canstatin转染肝癌HepG2细胞并用400μg/mlG418浓度筛选得到可以稳定传代的转染肝癌HepG2细胞,RT-PCR证实质粒pcDNA3.1（-）-3flag/canstatin已成功转染进入肝癌HepG2细胞,实时定量PCR结果显示转染后基因拷贝数为842128, Western blot检测转染后的细胞裂解液和上清液,在SDS-PAGE凝胶上均得到一条约26KD的新蛋白,与canstatin蛋白大小相接近。3.重组质粒转染后的细胞上清液作用的肝癌HepG2细胞组和转染后肝癌HepG2细胞组的凋亡率（分别为15.50±0.77和13.33±0.92）明显高于空质粒转染的细胞上清液作用组和正常培养的未转染组的凋亡率（分别为0.48±0.05和0.36±0.09）p<0.01,并且重组质粒转染后的细胞上清液作用组的凋亡率也高于稳定转染后肝癌HepG2细胞组的凋亡率（p<0.01）；而以上各组细胞24h和48h的迁移率之间都没有统计学的差异（p>0.05）。结论：1.成功购建重组质粒pcDNA3. 1（-）-3flag/canstatin;2. pcDNA3. 1-Canstatin-3Flag重组质粒经脂质体法转染到肝癌HepG2细胞获得了canstatin基因在m RNA水平表达,并且细胞培养的上清液获得了canstatin蛋白表达。3.转染了pcDNA3.1-Canstatin-3Flag重组质粒的肝癌HepG2细胞的上清液促进了体外培养的肝癌HepG2细胞的凋亡,而对肝癌HepG2细胞的迁移没有影响。
李贵[9]（2010）在《重组人canstatin基因对人食管癌裸鼠移植瘤的影响作用》文中进行了进一步梳理背景与目的食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,其病理类型以鳞状细胞癌居多。食管癌的发生与饮食习惯和遗传因素等有关,但确切的病因尚不明确。我国是食管癌的高发区。食管癌生长快,易转移,预后很差,尽管应用了手术、化疗、放疗或联合治疗等治疗手段,食管癌患者的5年生存率仍然很低,因此,迫切需要寻找新的治疗方法。1971年,Folkman首次提出肿瘤生长依赖于新生血管形成,并被大量研究证实。组织中的营养成分和氧气可通过弥散的方式供给半径大约150-200微米的范围,大部分的细胞生长在这个范围内。肿瘤的快速增长要求必需有新的血管的形成来提供充足的营养,肿瘤就是靠过度的血管生成来实现自身的生长的。如果没有新生血管长入,肿瘤组织将保持休眠状态。因此,通过阻断肿瘤的血管生成途径成为抑制肿瘤生长的新的研究方向。在肿瘤的生长过程中,肿瘤本身可以产生血管内皮生长因子和碱性成纤维因子等促进血管生成的因子来增强新生血管的生成,而同时机体也会产生一些如Arresten、Canstatin、Tumstatin等内原性血管生成抑制因子来抑制肿瘤的扩散,肿瘤的生长取决于两者之间的表达水平的对比,通过调节两类因子的表达水平可以有效抑制肿瘤新生血管形成抑制肿瘤生长转移。Arresten、Canstatin、Tumstatin和Endostatin等是从细胞外基质中分离出来的,这些因子是由胶原蛋白的α链的NC1区的基因编码的,而以往则认为NC1区为胶原的非功能区,实验证实它们对多种肿瘤的生长均具有抑制作用。Arresten能够通过抑制Bcl家族中的抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL的表达而促进内皮细胞的凋亡,从而抑制小鼠种植瘤的血管生成和肿瘤生长；在体内和体外实验发现Endostatin可以通过抑制细胞周期素D1（CyclinD1）的表达,诱导内皮细胞凋亡；促血管生成因子bFGF诱导的鸡绒毛膜尿囊膜血管的生长可以被Endostatin抑制；Tumstatin的大量表达可以在体内减缓蛋白水解酶的级联反应,包括基质金属蛋白酶类,尤其是MMP-2,MMP-9,MMP-13。2000年,哈佛大学Kamphaus等发现了一种新的内源性血管生成抑制因子Canstatin,它是Ⅳ胶原蛋白a2链的NC1区,分子量24KD。人类Canstatin重组基因可以在大肠杆菌和人胚肾293细胞中稳定表达,Canstatin可以成剂量依赖的抑制人类内皮细胞的增殖和促进内皮细胞凋亡,而对非内皮细胞无效。Canstatin可以抑制多种肿瘤的生长；目前,对Canstatin抑制血管生成的机制并不完全清楚,主要认为与通过各种途径诱导血管内皮细胞的增殖、迁移及诱导细胞凋亡有密切关系。Canstatin较强的血管抑制作用提示它有较高的研究价值,其临床应用的前景应该比目前发现的同类因子更为广阔。因此有必要进行进一步的研究。本研究将探讨人canstatin基因对人食管鳞状细胞癌移植瘤模型的抑制作用。材料和方法雌性BALB/c裸鼠21只,均为4-5周龄,体重16-20g,人食管癌KYSE150细胞建立裸鼠食管癌皮下移植瘤模型。当肿瘤长至50mm3时,将21只荷瘤裸鼠随机分成三组：实验组为腺病毒携带的canstatin基因治疗组（Ad-GFP-canstatin）,对照组为腺病毒携带的绿色荧光蛋白组（Ad-GFP）和磷酸盐缓冲液组（PBS）,采用肿瘤周围多点注射药物治疗。治疗期间每3天用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径和短径并记录；30天后处死裸鼠,切取肿瘤标本保存；应用RT-PCR技术检测肿瘤组织中bcl-x1、cyclin D1、bFGF和MMP-13的表达水平。结果在给予药物干预1周后,canstatin基因治疗组肿瘤体积显着小于其余两组（p<0.05）,对照组间差异无统计学意义,治疗第9天时抑瘤率达到最高的值为65%；canstatin基因治疗组bcl-x1、cyclinD1和MMP-13的mRNA的表达水平低于两个对照组,差异有统计学意义（p<0.05）；两个对照组间比较差异均无统计学意义（p>0.05）。而3组间的bFGF表达水平差异无统计学意义。结论1、裸鼠是理想的肿瘤移植动物模型,采用肿瘤细胞悬浮法建立皮下食管癌模型操作简单,成瘤率高。2、人canstatin基因对裸鼠食管癌移植瘤的生长具有明显抑制作用,其作用机制与抑制bcl-x1、cyclinD1、和MMP-13的表达有关,重组人canstatin不能直接抑制bFGF的表达抑制血管生成；为进一步的研究canstatin和实现临床应用提供帮助。
张志会[10]（2010）在《人Canstatin基因转染对肝癌HepG2细胞血管生成拟态的影响及机制研究》文中研究指明目的:通过肝癌HepG2细胞的体外三维培养,观察其形成血管生成拟态的能力,探讨重组人Canstatin基因表达产物对肝癌HepG2细胞血管生成拟态形成能力的影响及作用机制。方法：将pcDNA3.1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒,用Cacl2法转染到大肠杆菌DH5a,经AMP筛选,挑取阳性质粒酶切鉴定、测序,用脂质载体介导法将pcDNA3.1-Canstatin"3Flag转染人肝癌HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1转染肝癌HepG2细胞为对照,经G418培养基筛选获得阳性克隆,Western-blot鉴定转染细胞中Canstatin蛋白的表达。建立HepG2细胞基底膜基质凝胶体外三维细胞培养模型,以HepG2细胞在六孔板中常规培养为对照,观察HepG2细胞血管生成拟态形成能力。各组细胞（HepG2细胞组、空载体转染HepG2细胞组、重组载体转染HepG2细胞组）分别在96孔板中常规培养48h,MTT法检测各组增殖抑制率。各组细胞在基底膜基质凝胶进行体外三维培养,观察比较各组细胞的血管生成拟态形成能力,同时用免疫细胞化学法检测各组细胞MMp-2、VE-cadherin蛋白表达情况。结果：成功获得684bp人Canstatin基因,测序证明与Genbank中比对一致。PCR可检测出重组载体转染人HepG2细胞基因组中存在Canstatin基因,Western-blot可检测出Canstatin基因在重组载体转染人HepG2细胞中有特异性表达。人肝癌HepG2细胞在体外三维培养72h,直接在倒置显微镜下观察,可见细胞呈长梭形,周边长出多个伪足,彼此之间形成网状连接,形成环状或管状结构（血管生成拟态VM）,而人肝癌HepG2细胞在六孔板中常规培养下贴壁生长,未见VM结构。MTT法检测HepG2细胞组、空载体转染HepG2细胞组、重组载体转染HepG2细胞组490nm波长吸光度值并计算增殖抑制率分别为：0%、3.57%、14.80%。倒置显微镜下（x200）随机取上、下、左、右、中5个视野记录环状结构的数量,重组载体转染组VM结构的计数为（2.67±2.08）个,低于HepG2细胞组（9.67±3.51）个（P<0.01）,与空质粒转染组（11.00±3.61）个对比有统计学意义（P<0.01）,空质粒转染组与HepG2细胞组对比无统计学意义（P>0.01）。免疫细胞化学法检测各组细胞VE-cadherin蛋白表达灰度值为：重组载体转染组细胞（5.63±0.42）,低于空载体转染组（14.58±0.72）（P<0.01）,同时也低于HepG2细胞组（16.73±1.32）（P<0.01）,空载体转染组和HepG2细胞组VE-cadherin蛋白表达灰度值无差异（P>0.01）。HepG2组、空载体转染HepG2组、重组载体转染HepG2组MMp-2蛋白表达灰度值分别为27.53±1.03、25.72±0.83、27.02±2.13,各组间P值无显着性差异（P>0.01）。结论：1.人肝癌HepG2细胞株在体外常规培养下未见VM结构,在体外三维培养条件下具有血管生成拟态的形成能力；2.成功将pcDNA3.1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒转染至人HepG2细胞中,细胞中有Canstatin蛋白表达；3Canstatin蛋白可抑制人肝癌HepG2细胞的增殖；4Canstatin蛋白可抑制人肝癌HepG2细胞血管生成拟态的形成能力；5Canstatin蛋白可抑制体外三维培养条件下HepG2细胞VE-cadherin蛋白的表达,对MMp2的表达没有影响。
二、人血管生成抑制因子canstatin基因的克隆及真核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人血管生成抑制因子canstatin基因的克隆及真核表达（论文提纲范文）
（1）血管能抑素的应用及研究进展（论文提纲范文）
| 1 Canstatin的基本特征 |
| 2 Canstatin抑制血管新生的作用机制 |
| 2.1 抑制重要激酶的磷酸化 |
| 2.2 下调FLIP表达及诱导Fas配体过表达 |
| 2.3 血管生成调控因子的干预 |
| 2.4 其他 |
| 3 Canstatin研究治疗策略 |
| 3.1 重组Canstatin蛋白单独治疗 |
| 3.2 重组Canstatin蛋白联合其他疗法共同治疗 |
| 3.2.1 重组Canstatin蛋白联合化疗法共同治疗 |
| 3.2.2 重组Canstatin蛋白联合放疗法共同治疗 |
| 3.2.3 重组Canstatin蛋白联合中药共同治疗 |
| 3.3 重组Canstatin基因单独治疗 |
| 3.4 重组Canstatin基因治疗联合其他治疗共同治疗 |
| 4 问题及前景展望 |
（2）用Canstatin-N抑制大鼠视网膜血管增生的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 糖尿病视网膜病变的研究进展 |
| 1.1.1 糖尿病视网膜病变的分类 |
| 1.1.2 糖尿病视网膜病变的发病机制及危害 |
| 1.1.3 目前治疗糖尿病视网膜病变的主要方法及优缺点 |
| 1.1.4 糖尿病视网膜病变的老鼠模型实验研究 |
| 1.2 血管生物抑制因子 |
| 1.2.1 血管生成抑制因子 |
| 1.2.2 Canstatin及Canstatin-N的研究 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点 |
| 1.3.2 pAOX1表达系统 |
| 1.3.3 pGAP表达系统 |
| 1.4 本研究的意义、内容以及技术路线 |
| 1.4.1 研究的意义 |
| 1.4.2 研究的内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第2章 CN基因的克隆及表达载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 质粒与菌株 |
| 2.1.1.2 实验常用酶和试剂 |
| 2.1.1.3 实验常用培养基 |
| 2.1.1.4 质粒提取试剂 |
| 2.1.1.5 核酸电泳溶液 |
| 2.1.1.6 主要实验仪器 |
| 2.1.2. 实验方法 |
| 2.1.2.1. PCR扩增canstatin-N基因 |
| 2.1.2.2 PCR反应体系及反应条件 |
| 2.1.2.3 PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.1.2.4 DNA的琼脂糖凝胶回收 |
| 2.1.2.5 载体质粒的提取 |
| 2.1.2.6 质粒载体及目的基因的酶切 |
| 2.1.2.6.1 pGAP9K载体质粒酶切 |
| 2.1.2.6.2 PCR产物的酶切 |
| 2.1.2.7 连接与转化 |
| 2.1.2.7.1 载体与目的基因的连接 |
| 2.1.2.7.2 E.coli感受态的制备 |
| 2.1.2.7.3 转化 |
| 2.1.2.8 重组子的鉴定 |
| 2.1.2.8.1 酶切鉴定 |
| 2.1.2.8.2 菌液PCR鉴定 |
| 2.1.2.9 测序比对分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 扩增CN基因 |
| 2.2.2 表达载体的提取 |
| 2.2.3 表达载体pGAP9K-CN的构建 |
| 2.2.4 重组子的鉴定 |
| 2.2.4.1 酶切鉴定 |
| 2.2.4.2 PCR鉴定 |
| 2.2.5 测序分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 CN重组蛋白的生产及治疗视网膜血管增生 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料及试剂 |
| 3.1.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.2 实验常用的酶和试剂 |
| 3.1.1.3 常用培养基 |
| 3.1.1.4 主要实验仪器 |
| 3.1.1.5 质粒提取试剂 |
| 3.1.1.6 核酸与蛋白电泳溶液 |
| 3.1.1.7 蛋白纯化主要试剂 |
| 3.1.1.8 实验中常用的其他试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 重组质粒线性化 |
| 3.1.2.2 毕赤酵母感受态的制备 |
| 3.1.2.3 清洗电击杯的流程 |
| 3.1.2.4 重组表达载体电转化毕赤酵母 |
| 3.1.2.5 重组子的筛选 |
| 3.1.2.5.1 高拷贝转化子的筛选 |
| 3.1.2.5.2 菌液PCR法筛选 |
| 3.1.2.6 组成型摇瓶表达 |
| 3.1.2.7 重组酵母的高密度发酵 |
| 3.1.2.8 表达产物的TCA沉淀法 |
| 3.1.2.9 重组蛋白的检测 |
| 3.1.2.10 重组蛋白的初步纯化 |
| 3.1.2.11 纯化后的高密度蛋白的透析处理 |
| 3.1.2.11.1 透析袋的使用前处理 |
| 3.1.2.11.2 纯化后的透析处理 |
| 3.1.2.12 重组蛋白对CAM血管生成抑制活性的测定 |
| 3.1.2.13 内皮细胞凋亡的试验 |
| 3.1.2.14 重组蛋白对糖尿病视网膜病变的治疗 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 表达载体线性化 |
| 3.2.2 菌落PCR筛选重组子 |
| 3.2.3 重组酵母工程菌的摇瓶表达 |
| 3.2.4 重组子的高密度发酵和表达蛋白纯化 |
| 3.2.5 重组蛋白对CAM血管生成抑制活性的测定 |
| 3.2.6 重组蛋白对人脐带静脉细胞的抑制作用 |
| 3.2.7 重组蛋白治疗糖尿病视网膜增生 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 Canstatin蛋白治疗血管增生 |
| 4.1.2 表达体系的选择 |
| 4.1.3 注射法与滴眼法治疗的比较 |
| 4.1.4 本研究中值得深入探讨的问题 |
| 4.2 本研究的结论 |
| 4.3 本研究的主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录：缩写词(Abbreviation) |
| 致谢 |
（3）As2O3联合重组Canstatin蛋白对血管内皮细胞影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（4）canstatin抗肿瘤作用研究现状（论文提纲范文）
| 1 canstatin发现、结构和命名 |
| 2 canstatin生物学特征 |
| 2.1 抑制血管新生作用 |
| 2.2 诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 2.3 作用机制 |
| 3 canstatin的抗肿瘤体内研究 |
| 3.1 canstatin单独应用抗肿瘤作用 |
| 3.2 联合其他疗法抗肿瘤作用 |
（5）Canstatin-N基因在Pichia pastoris中表达及产物活性分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂和工具酶 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人血管能抑素基因的克隆及表达载体的构建 |
| 2.2 构建含人血管能抑素基因的P.pastoris工程菌 |
| 2.3 人canstatin-N基因在P.pastoris中的表达 |
| 2.4 表达产物免疫活性分析 |
| 2.5 抑制鸡胚CAM新生血管生成活性分析 |
| 3 讨论 |
（6）腺病毒介导canstatin基因抑制肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 人Canstatin cDNA的克隆、纯化及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Canstatin基因原核表达载体的构建及表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 重组人Canstatin蛋白治疗肝癌实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 携带Canstatin基因的腺病毒载体的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 腺病毒介导Canstatin基因治疗肝癌的实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述一 内源性肿瘤血管生成抑制因子研究进展 |
| 综述二 原发性肝癌的基因治疗研究进展 |
| 个人简历 |
| 博士学位在读期间已发表论文 |
| 致谢 |
（7）源于Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制剂（论文提纲范文）
| 1 Arresten |
| 2 Canstatin |
| 3 Tumstatin |
| 4 Hexastatin |
| 5 问题和展望 |
（8）人canstatin基因转染及其对体外培养肝癌HepG2细胞凋亡及迁移的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系及其他 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 实验耗材 |
| 1.5 培养基 |
| 1.6 常规溶液及试剂 |
| 1.7 引物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 构建重组质粒 |
| 2.2 重组质粒转染 |
| 2.3 转染后肝癌HepG_2细胞凋亡和迁移能力的检测 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师评阅表 |
（9）重组人canstatin基因对人食管癌裸鼠移植瘤的影响作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文部分 重组人canstatin基因对人食管癌裸鼠移植瘤的影响作用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述部分 Ⅳ型胶原相关的血管生成抑制因子 |
| 参考文献 |
| 后记部分 |
| 缩略词表 |
| 个人简历 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（10）人Canstatin基因转染对肝癌HepG2细胞血管生成拟态的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师审阅表 |
四、人血管生成抑制因子canstatin基因的克隆及真核表达（论文参考文献）
- [1]血管能抑素的应用及研究进展[J]. 史文荣,王雪雯. 现代肿瘤医学, 2013(01)
- [2]用Canstatin-N抑制大鼠视网膜血管增生的研究[D]. 沈锦城. 海南大学, 2012(03)
- [3]As2O3联合重组Canstatin蛋白对血管内皮细胞影响的研究[D]. 傅文达. 石河子大学, 2011(05)
- [4]canstatin抗肿瘤作用研究现状[J]. 傅文达,王雪雯. 中国现代医药杂志, 2010(08)
- [5]Canstatin-N基因在Pichia pastoris中表达及产物活性分析[J]. 潘英文,张爱联,屈直,张添元,罗进贤. 生物技术, 2010(03)
- [6]腺病毒介导canstatin基因抑制肝癌的实验研究[D]. 亓民. 郑州大学, 2010(05)
- [7]源于Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制剂[J]. 温镭,宋娜玲,贺欣,赵启仁. 中国生物工程杂志, 2010(05)
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- [9]重组人canstatin基因对人食管癌裸鼠移植瘤的影响作用[D]. 李贵. 郑州大学, 2010(06)
- [10]人Canstatin基因转染对肝癌HepG2细胞血管生成拟态的影响及机制研究[D]. 张志会. 石河子大学, 2010(03)