一、强力霉素抑制前列腺癌PC-3细胞的体外侵袭作用（论文文献综述）
王晶[1]（2021）在《ApoA-I和SLPI促进前列腺癌去势抵抗及其机制研究》文中研究指明研究背景前列腺癌（prostate cancer,PCa）是老年男性的常见恶性肿瘤。PCa是全球男性第五大癌症死因,2015年我国PCa新发病例约60300例,死亡病例约26600例,因此研究前列腺癌具有普遍意义,可造福于广大老年男性群体。在初诊时,绝大部分前列腺癌依赖雄激素受体（androgenreceptor,AR）信号通路,激活下游大量靶基因表达以滋养肿瘤生长。雄激素剥夺治疗（androgendeprivation therapy,ADT）即去势治疗,可以降低患者体内的睾酮水平达90%以上。因此,即使失去手术机会的患者,依然可以通过ADT治疗获得相当不错的治疗效果。然而经过约2年的有效期,绝大部分PCa都将进入去势抵抗性PCa（castration-resistant prostate cancer,CRPC）阶段,在进一步使用新一代抗雄药物后,部分患者疾病进展,但肿瘤的组织学仍然保留腺泡细胞的特征,这部分肿瘤称为 CRPC-腺癌（CRPC-adenocarcinoma,CRPC-adeno）。另一部分患者进展为神经内分泌前列腺癌（neuroendocrine prostate cancer,NEPC）。作为CRPC的一种极具侵袭性的亚型,NEPC由于几乎不表达AR转导通路的标记物,因此对AR抑制无任何应答,临床无特效的治疗方法。目前绝大部分的PCa治疗均建立在AR通路的抑制上,急需寻找新的治疗靶点来缓解CRPC患者无药可用的窘境。前列腺癌的独特代谢特点和谱系可塑性是其转移和进展的重要机制。具体而言,前列腺癌的代谢不同于其他恶性肿瘤的代谢,可以利用谷氨酰胺和脂类物质通过三羧酸循环途径提供能量,以促进细胞生长和增殖。载脂蛋白A-I（Apolipoprotein A-I,ApoA-I）是高密度脂蛋白的主要组成成分,在前列腺癌脂质代谢调节中具有重要作用。谱系可塑性是PCa对去势治疗耐药和NEPC发生的重要机制之一,可通过转录因子SOX2介导,上调分泌性白细胞肽酶抑制剂（Secretory Leukocyte Peptidase Inhibitor,SLPI）的表达,使腺癌中的腔泡细胞转分化为NE细胞。我们拟从代谢调节和谱系可塑性两个角度阐述CRPC的进展机制和相应的治疗策略。第一部分ApoA-I通过调节肿瘤代谢促进前列腺癌进展研究目的:研究不同阶段PCa组织中ApoA-I的表达,研究其表达水平与肿瘤代谢的关系,探讨ApoA-I促进激素依赖性PCa向CRPC进展的可能机制。研究方法:1.采用生物信息学、免疫组化染色、Western blot等多种方法比较ApoA-I在不同阶段前列腺组织（正常前列腺组织、原发性腺癌、CRPC-腺癌和NEPC）中的表达。分析APOA1（ApoA-I的编码基因）与CRPC和NEPC中重要标记基因的相关性。2.过表达LNCaP细胞中的APOA1和敲低LNCaP、PC3和C4-2细胞中的APOA1,利用MTS法、克隆形成实验和细胞迁移实验了解ApoA-I表达水平对细胞活力、集落形成和侵袭能力的影响。ADT处理LNCaP细胞,利用β-半乳糖苷酶染色方法检测过表达ApoA-I后LNCaP细胞中衰老细胞的比例变化。3.利用酶联免疫吸附试验法测定细胞培养基中的高密度脂蛋白含量。利用液相质谱法分析细胞系中各种代谢物质的含量,了解不同细胞系中和不同ApoA-I表达水平下的细胞代谢状态有何不同。利用基因集富集分析法探索公共数据集,了解与原发性腺癌相比,PCa转移灶和NEPC中脂蛋白代谢通路激活情况。4.利用基因集富集分析探索N-Myc对PCa细胞中脂蛋白代谢通路的影响。过表达LNCaP细胞中的c-Myc和N-Myc,敲低PC3细胞中的c-Myc,通过Western blot验证基因修饰的效果,利用RT-qPCR测定APOA1 mRNA水平的变化。研究结果:1.ApoA-I在PCa组织中表达较正常前列腺组织中升高,在PCa转移组织和去势抵抗性PCa组织中较原发PCa病灶中表达升高。2.ApoA-I在正常前列腺上皮细胞系RWPE-1中表达较少,在激素敏感性PCa细胞系（LNCaP和LAPC4）中表达稍增高,而在具有去势抵抗性的PCa细胞系（C4-2,DU145和PC3）中表达显着升高。3.APOA1与经典肿瘤抑制基因表达呈负相关,与CRPC和NEPC进展相关的重要基因正相关。4.过表达APOA1可以促进LNCaP细胞的存活、增殖、集落形成和侵袭能力,并可使其对激素治疗产生抵抗。相反,敲低APOA1可以减弱PC3细胞的活力、增殖、集落形成和侵袭能力,减弱C4-2细胞的活力,但对LNCaP细胞的活力无影响,考虑与其较低的基线表达有关。5.基因集富集分析提示,相对于原发性腺癌,PCa转移组织和NEPC中的脂蛋白代谢通路显着激活,有利于肿瘤生长。6.PC3和DU145细胞培养液中的高密度脂蛋白含量显着高于其在LNCaP和LAPC4细胞培养液中的含量,提示PC3和DU145细胞可以利用APOA1生成更多的脂质代谢产物,为肿瘤生长提供能量来源。与LNCaP细胞系相比,PC3细胞系中与脂质代谢相关的通路（如有氧糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸代谢、脂肪酸合成和脂肪酸氧化等）普遍被激活。过表达LNCaP中的APOA1和敲低PC3中的APOA1可以显着影响细胞的脂质代谢通路（如脂肪酸合成、脂肪酸链延长和脂肪酸降解等）。7.基因集富集分析显示N-Myc可激活PCa细胞的脂蛋白代谢通路。公共数据集中 APOA1 与 MYCN（MYCN Proto-Oncogene）和 MYC（MYC Proto-Oncogene）的表达水平呈显着正相关。过表达LNCaP中N-Myc和c-Myc均可以上调APOA1,而敲低PC3中c-Myc可以抑制APOA1的转录。结论:1.从正常前列腺组织到PCa原发性腺癌,再到CRPC-腺癌及NEPC,ApoA-I表达呈阶梯式升高。同时,ApoA-I可以促进PCa细胞的存活、增殖、侵袭和激素耐药,说明ApoA-I是PCa发病和进展中的重要促癌因子。2.APOA1受MYC家族调控,其高表达可以显着影响PCa的脂质代谢通路,促使PCa转变为产脂表型,并从激素依赖性PCa向去势抵抗性PCa进展。第二部分SLPI通过谱系可塑性促进前列腺癌神经内分泌分化研究目的:神经内分泌前列腺癌（NEPC）常发生于前列腺癌经长期激素治疗之后,对激素治疗无应答,成为临床治疗的顽疾,但其具体机制尚未阐明。此部分我们将研究不同阶段PCa组织中SLPI的表达,研究其表达水平与腔泡表型及NE表型的关系,探讨SLPI促进腺癌向NEPC进展的可能机制。研究方法:利用 TCGA（The Cancer Genome Atlas）、GEO（Gene Expression Omnibus）、Oncomine、cBioPortal（The cBio Cancer Genomics Portal）和 CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia）等数据库中的数据,首先利用生物信息学分析SLPI在正常前列腺组织、原发性腺癌、CRPC-腺癌及NEPC中的表达,然后通过免疫组织化学染色、Western blot等方法验证表达趋势,了解SLPI在PCa发生和进展中的作用。分析SLPI的表达与AR标记物和NE标记物的不同相关性趋势,了解SLPI在AR通路和NE通路中的不同作用。敲低PC3中的SLPI观察其NE标记物的变化,过表达LNCaP中的SOX2,观察SLPI、NE标记物及AR相关标记物的表达变化。研究结果:1.相比正常前列腺组织,SLPI在AR通路活跃的原发性腺癌中表达下调,表明SLPI在病灶局限的原发性腺癌中被抑制。2.相比低分期（T2c及以下）PCa,高分期（T3a及以上）PCa中SLPI的表达出现上调,表明SLPI可能在进展期PCa中发生作用转变,而起致癌作用。3.相比原发性腺癌组织,SLPI在AR通路被抑制的PCa转移组织和NEPC中表达上调。通过免疫组化染色,我们发现SLPI在高级别（Gleason≥8分）PCa中的蛋白表达高于低级别（Gleason≤7分）PCa。与局限期肿瘤相比,小细胞神经内分泌 PCa（small cell neuroendocrine PCa,S CNC,NEPC的一种组织学类型）组织含有更多的SLPI 阳性细胞。与上述结果一致,Western blot实验显示SLPI在两种不同的具有一定NE特性的细胞系（PC3和C4-MDVR）中的蛋白表达均明显高于激素敏感的PCa细胞系（LNCaP和LAPC4）。公共数据集分析结果显示,相比原发性腺癌,SLPI在转移灶和NEPC组织中的表达显着上调。4.由于SLPI在AR通路激活的腺癌中低表达,而在AR阴性的NEPC中高表达,我们进一步分析SLPI与AR及NE通路的关系。通过对TCGA、GEO和CCLE等多个PCa公共数据集的分析,我们发现SLPI与AR通路中的重要基因（AR,KLK3,KLK2,NKX3-1及TMPRSS2）的表达呈显着负相关,基因集富集分析表明SLPI表达与AR通路呈负性调控关系。反之,SLPI与NE通路中的重要基因（ENO2,NCAM1,CXCR2及SOX2）呈正相关,基因集富集分析表明SLPI的上调可以激活PCa中的NE通路。5.通过对公共数据集的分析,我们发现随着ADT处理时间的延长,腔泡细胞中SLPI的表达逐渐升高,同时诱导NE标记物的表达,并抑制腔泡标记物的表达,细胞从腔泡表型逐渐转分化为NE表型。为了验证这一过程是可逆的,我们敲低NE细胞系PC3中的SLPI,发现经典NE标记物ENO2和SYP的转录水平也出现显着下调。6.SOX2是调控PCa细胞谱系可塑性的关键因子。SLPI与SOX2在PCa中表达呈正相关,且这种相关性在PCa转移灶和NEPC中表现的更加显着。随后我们利用在线工具 MEME（Multiple Em for Motif Elicitation,http://meme-suite.org/）中的MAST工具,在SLPI的启动子区域找到SOX2的特异性结合位点。过表达LNCaP中的SOX2可以上调SLPI及NE标记物,同时下调AR相关标记物。因此我们推断SLPI可能受转录因子SOX2的调控来介导谱系可塑性。结论:1.SLPI表达与PCa的AR通路活性有关,在原发性腺癌中表达下调,而在AR通路被抑制的转移组织和NEPC中表达上调。2.SLPI与AR通路负相关,与NE通路正相关。3.SLPI由SOX2介导通过谱系可塑性促进PCa细胞谱系转变及NE分化,敲低SLPI可以逆转其NE特征。
张慧[2]（2020）在《下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展》文中研究说明背景能量代谢重编是肿瘤重要特点,脂肪酸代谢异常是其中之一。近年多项研究表明,肿瘤普遍存在脂肪酶过度表达的状况,众多研究拟探索脂肪酶抑制剂作为癌症潜在治疗方法。本研究旨探索乙酰辅酶A羧化酶A（Acetyl-CoA Carboxylase-A,ACACA）基因对前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）细胞及线粒体功能,代谢产物和动物体内肿瘤形成影响。方法免疫组织化学检测ACACA在人前列腺癌组织芯片中的表达,评估不同临床分期病理分级中的情况。公共数据库GEPIA分析ACACA在人前列腺癌及非癌中的表达。细胞功能实验检测前列腺癌低表达ACACA细胞系功能及代谢组学变化。WB检测脂肪酸及酯类代谢途径相关蛋白表达。海马实验检测细胞系线粒体潜能及能量产生变化。流式细胞术和荧光显微镜检测线粒体染色情况。qRT-PCR检测线粒体DNA（mtDNA）。流式细胞术检测细胞活性氧（ROS）水平。比色法检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）水平。动物体内探讨ACACA对裸鼠肿瘤形成影响。结果1、ACACA在前列腺癌组织中高表达,临床TNM分期显示晚期PCa患者ACACA表达水平强于低级别患者。T3强于T2、T1,N1强于N0,M1强于M0,均有统计学差异。GEPIA统计显示前列腺癌患者中ACACA表达明显高于健康者。2、细胞功能实验显示,与对照组相比敲低ACACA基因后,DU145细胞和PC3细胞迁移能力,侵袭能力,增殖能力明显减弱,细胞周期G1期延长。均有统计学意义。3、代谢组学检测显示,敲低ACACA基因后,DU145细胞中有94种代谢物质发生改变,PC3细胞中105种物质发生改变,两种细胞中39种物质同时发生改变。ATP水平在两种细胞中均降低。PC3细胞中敲低ACACA基因后,脂肪酸代谢产物L-棕榈酰肉碱和硬脂肉碱水平减少,相关途径蛋白（FAS,Lipin1,ATP-CL,P-ATP-CL,AceCS1,ACSL1）水平下调。均有统计学意义。4、海马实验显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中ATP产量,基础呼吸,最大呼吸,储存呼吸能力均下降。实时ATP检测中发现,DU145细胞总ATP产生率下降,线粒体ATP产生率显着下降。5、线粒体荧光染色显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞线粒体染色及平均荧光强度均减弱。DU145和PC3细胞mtDNA均明显降低。且均有统计学差异。6、NAD+/NADH检测发现,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中该比值均上升,且细胞内ROS水平均高于对照组,均有统计学差异。7、裸鼠成瘤模型中,实验组肿瘤在各个时间点体积明显小于对照组,肿瘤重量也明显小于对照组,均有统计学差异。结论:ACACA基因的高表达与前列腺癌的TNM分期呈正相关。结果证实,前列腺癌细胞中ACACA的下调通过干扰NAD+/NADH,线粒体ATP产量,mtDNA和ROS水平的平衡而影响线粒体潜力,从而降低了肿瘤细胞的增殖能力。测试线粒体潜力和ACACA的表达可能会在将来成为预测目标和治疗方法。
宋慧娜[3]（2020）在《线粒体靶向的雷公藤甲素衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究》文中研究指明肿瘤（Tumor）严重威胁着人类的生命健康和生活质量。肿瘤细胞的显着特征为不死性（无限增殖）,迁移性和接触抑制现象消失。线粒体是重要的能量代谢和生物合成的工厂,对细胞正常功能和人类健康至关重要,肿瘤细胞的线粒体明显异于正常细胞的线粒体,肿瘤细胞的特殊表现与线粒体功能异常有密切的关系,如今,癌症也被认为是一种线粒体代谢疾病,线粒体成为肿瘤细胞治疗的重要靶点。相关研究表明,肿瘤细胞的线粒体膜电位远大于正常细胞。电子移位亲脂性阳离子化合物（DLCs）可以利用肿瘤细胞膜电位这一差异在肿瘤细胞线粒体内选择性地积聚,而小分子抗肿瘤活性化合物可与DLCs连接作为线粒体靶向性化合物,实现一定肿瘤细胞选择性,增强抗肿瘤活性。目前为止使用和研究最多的DLCs是三苯基膦盐（TPP+）,其靶向线粒体的功能被多篇文献报道证实。雷公藤甲素（Triptolide,TP）是从雷公藤根部提取分离得到的具有抗肿瘤活性的天然成分,但因水溶性差、全身毒性大、治疗窗口窄等缺点,使其不能在临床上得到系统应用。为考察TPP+的线粒体靶向性是否可以保持雷公藤甲素的抗肿瘤活性,增加其对肿瘤细胞选择性,从而降低毒性,本论文设计并合成了雷公藤甲素的TPP+衍生物,进而评价了其体内外抗肿瘤活性。经过活性筛选发现我们设计并合成的5个雷公藤甲素TPP+衍生物中,Mito-TP-2不仅能保持雷公藤甲素的抗肿瘤活性,在肝正常细胞HL-7702与肝肿瘤细胞HepG-2中的表现显示一定的肿瘤细胞选择性;RP-HPLC法测定细胞内的积聚量,发现Mito-TP-2在HepG-2细胞线粒体的积聚量约是母药雷公藤甲素的3倍,证明其有一定的线粒体靶向性。进一步实验结果表明Mito-TP-2将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期,并能引起细胞内LDH释放量增加,ROS升高,线粒体膜电位降低。在斑马鱼HepG-2移植瘤模型中,1 μM Mito-TP-2具有与TP相当的抑制作用,且对斑马鱼幼鱼无明显毒性影响,而同等剂量的TP对斑马鱼幼鱼毒性大,可见明显心包水肿。雷公藤甲素与Mito-TP-2的毒性试验还显示,雷公藤甲素在较低浓度组即出现致畸现象,随着浓度加大孵化率和体长均不断降低,且具有明显的肝脏毒性;而Mito-TP-2在同等剂量下的各浓度组均未出现明显毒性。在化合物Mito-TP-2高浓度发育毒性实验中发现,当化合物Mito-TP-2浓度高达12 μM时偶有心包水肿出现,但在浓度≤12 μM时,Mito-TP-2对斑马鱼的死亡率、孵化率、畸形率和体长均没有影响。说明化合物Mito-TP-2保持母药的抗肿瘤活性的同时降低了母药的毒性。本论文是对保持雷公藤甲素抗肿瘤药效的同时降低其毒性的探索,为基于天然产物的药物开发提供了研究基础与思路。
张亿达[4]（2020）在《Piperlongumine通过免疫原性死亡途径增强PD-1抑制剂在前列腺癌治疗中抗癌效果的研究》文中认为背景:前列腺癌居男性癌症发病率的第二位,也是全世界男性五大主要的死亡原因之一。激素抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC）预后差,治疗方式主要包括:内分泌治疗、Sipuleucel T、化疗、镭223等,但患者很难持久获益,尚没有治愈的方法,急需更有效的治疗措施。肿瘤的免疫治疗近些年取得了巨大的进步,作用于PD-1/PD-L1途径的免疫检查点抑制剂疗效确切,在晚期肿瘤患者的治疗中取得了空前的成功,但在激素抵抗性前列腺癌的临床试验中尚未取得满意的治疗效果,这可能与前列腺癌的肿瘤微环境阻止T细胞浸润,肿瘤组织中缺乏细胞毒性T细胞有关。而某些化疗药物可以诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）,从而有效的增加肿瘤组织中淋巴细胞的数量和细胞毒性CD8+T细胞的比例。故ICD与PD-1抑制剂结合有可能通过增强适应性免疫反应,改变肿瘤免疫微环境,增加T细胞活化、浸润,从而将非免疫原性肿瘤（例如CRPC）转变为免疫应答性肿瘤,促进抗癌免疫反应,这将有利于免疫系统产生持久的效应,延长激素抵抗性前列腺癌患者的生存期。第一部分Piperlongumine通过激活ROS--ER stress通路诱导前列腺癌细胞凋亡目的:通过细胞实验明确Piperlongumine（PL）对前列腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法:1.将不同浓度的PL（100--3μM）分别作用于人前列腺癌细胞系PC3、DU145以及小鼠前列腺癌细胞系RM-1,利用MTT以及克隆形成实验检测药物对前列腺癌细胞生长以及克隆形成的抑制作用,通过流式细胞术、荧光探针以及Western Blot的方法,检测PL诱导前列腺癌细胞凋亡的能力及途径。2.通过荧光探针以及流式细胞术检测PL作用后细胞内ROS含量、Caspase 3凋亡分子表达,Western Blot检测cleaved caspase 3蛋白表达;再利用ROS抑制剂NAC预处理前列腺癌细胞,检测细胞凋亡水平的变化,明确ROS在PL诱导前列腺癌细胞凋亡中的作用。3.Western Blot检测经PL诱导的前列腺癌细胞中p-EIF2α、ATF4、chop蛋白的表达量差异;chop siRNA或者NAC提前预处理前列腺癌细胞,再经PL作用,使用流式细胞术、Western Blot以及荧光探针检测前列腺癌细胞凋亡的变化,利用Western Blot分析p-EIF2α、ATF4、chop蛋白的表达差异,明确在PL作用下ROS与内质网应激、凋亡之间的关系。结果:1.PL主要通过剂量依赖的方式抑制不同种类前列腺癌细胞PC3、DU145和RM-1的增殖以及克隆形成。PL通过细胞凋亡的途径抑制前列腺细胞的生长,并且也随着剂量的增加而上调前列腺癌细胞的凋亡比例。2.PL可以增加细胞内活性氧的含量,NAC可以抑制PL诱导细胞凋亡的效果,说明PL主要通过ROS通路而诱导细胞凋亡。3.PL可以通过EIF2α--ATF4--chop通路诱导前列腺癌细胞产生内质网应激而导致细胞凋亡,且可以被chop siRNA或者NAC抑制。证明PL通过ROS-ER stress通路调解细胞凋亡。结论:PL主要通过诱导前列腺癌细胞发生氧化应激从而激活ER-stress通路,并通过上调chop蛋白的表达而引起细胞凋亡。第二部分PL增强PD-1抑制剂抗癌效果的机制研究目的:通过体外以及体内实验探索PL引起细胞免疫原性死亡的机制,在前列腺癌体内实验中评估PL是否可以改善PD-1抑制剂的抗癌效果。方法:1.在体外实验中使用不同浓度的PL作用于三种前列腺癌细胞系（DU145,PC3,RM-1）,利用流式细胞术检测细胞表面钙网蛋白的表达情况,通过荧光探针检测细胞外液中ATP含量,以及使用ELISA的方法检测细胞外液中HMGB1的变化,明确细胞免疫原性死亡分子的表达。利用NAC或者chop siRNA抑制活性氧以及内质网应激凋亡通路,再观察PL对于前列腺癌细胞PC3的作用,检测钙网蛋白、ATP以及HMGB1的表达,观察PL作用下ROS-ER stress通路对前列腺癌细胞的免疫原性死亡的影响。2.鼠源性前列腺癌细胞RM-1用于评估PL在动物免疫疫苗实验中的作用。将21只C57BL/6小鼠分为三个组,每个组7只:（1）经PL处理的疫苗组;（2）经5-fu处理的疫苗组;（3）PBS组。将上述经不同处理的3X105 RM-1疫苗种植于准备好的C57BL/6小鼠的左侧背部,1周后活的2X106个RM-1细胞种植于C57BL/6小鼠的右侧背部。每3天使用卡尺测量一次右侧肿瘤大小。当肿瘤的体积达到2000mm3时处死小鼠,统计肿瘤体积及生存期。3.PL体内治疗实验:将小鼠前列腺癌肿瘤细胞RM-1分别接种于6--8周的雄性野生型C57BL/6小鼠和NSG小鼠的背部,14天后待肿瘤直径达到50 mm3时,将12只C57BL/6小鼠随机分为2个组:（1）PL治疗组;（2）PBS组;每组6只。（3）6只NSG小鼠经PL治疗。给予治疗后当小鼠肿瘤直径达到2000mm3时,统一处死所有小鼠。流式细胞术、免疫组织荧光检测C57BL/6小鼠的肿瘤组织,脾脏中CD4、CD8、DC、巨噬细胞等淋巴细胞的比例变化。并统计肿瘤体积差异。4.PL联合PD-1抑制剂抗前列腺肿瘤生长的研究。RM-1肿瘤接种14天后,将20只野生型C57BL/6小鼠随机分配至以下治疗组,每组5只。（1）IgG同型对照组。腹腔注射,每周一次,共3次;（2）PL肿瘤局部注射,每周两次。共3周;（3）PD-1抗体,腹腔注射。每周一次,共3次。（4）根据上述治疗的过程,PL+PD-1抗体。常规监测肿瘤的生长,统计生存期。结果:1.PL主要通过剂量依赖的方式诱导前列腺癌细胞PC3、DU145、RM-1产生损伤相关分子模式:钙网蛋白、ATP和HMGB1,并且这种分泌主要依赖于ROS--ER stress通路。2.在动物免疫疫苗实验中发现:经过PL处理的前列腺癌细胞RM-1所得的疫苗,在免疫小鼠后,表现出良好的肿瘤控制,PL处理组肿瘤体积对比PBS组减小73%,而5-fu组比PBS组减少9%,且PL处理组肿瘤组有3/7只小鼠完全没有肿瘤生长。3.在PL体内治疗实验中发现:对比对照组,PL治疗组C57BL/6小鼠肿瘤体积缩小69%,而NSG小鼠肿瘤体积缩小了24%,且流式细胞术检测发现:在具有正常免疫系统的C57BL/6小鼠中,PL治疗组脾脏以及肿瘤组织中的CD8+T细胞的比例比PBS组明显增加,差异显着,肿瘤组织的免疫荧光检测同样发现PL治疗组中CD8+T细胞浸润明显增加。同时在PL治疗组脾脏和肿瘤组织中DC细胞比例对比PBS治疗组显着增加。4.在PL联合PD-1抑制剂的联合治疗中发现:单独使用PD-1抑制剂肿瘤体积较未处理组减少50%,但并未改善小鼠的生存期;而PL治疗组同样具有明显的减少肿瘤体积的作用,但仍未改善生存期。PL联合PD-1抑制剂治疗组肿瘤体积对比未处理组减少了89%,且2/5只小鼠无肿瘤存留,明显改善前列腺肿瘤的生存期,达到治愈的目的。结论:PL可以通过免疫原性死亡途径抑制前列腺癌肿瘤细胞增殖以及体内实体肿瘤的生长,并且可以有效的增强PD-1抑制剂在前列腺癌中的抗肿瘤效果,是一种有前途的治疗方式。
赵婧[5]（2020）在《RNA结合蛋白Musashi2稳定雄激素受体促进前列腺癌细胞增殖的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:分析Musashi2（MSI2）在前列腺癌中的表达特点;明确MSI2在前列腺癌中的生物学功能,探讨其能否作为前列腺癌治疗的新靶点;探索MSI2在前列腺癌细胞中增强AR表达的作用机制,确认MSI2与AR的结合位点。方法:1.利用TCGA、GTEx、GEO和Oncomine数据库中前列腺癌的相关数据集,筛选出在前列腺癌与正常前列腺组织中表达差异显着的RBPs,发现与AR的表达高度正相关的Musashi2（MSI2）;应用免疫组化、免疫荧光、蛋白质免疫印迹（Western blotting）等实验验证前列腺癌手术标本、前列腺癌组织芯片及前列腺上皮细胞系中MSI2与AR的表达相关性,并研究MSI2表达与前列腺癌Gleason评分（GS）的关系;构建稳定敲低MSI2的雄激素依赖性LNCa P细胞株与雄激素非依赖性C4-2B/22RV1细胞株,利用qRT-PCR、Western blotting检测AR及AR下游基因PSA、NKX3.1的表达。2.应用平板克隆、CCK-8实验检测LNCa P/C4-2B/22RV1-sh MSI2稳定株的体外增殖情况;向sh MSI2稳定株转染AR过表达质粒,利用CCK-8实验研究其增殖恢复程度;通过Transwell实验检测sh MSI2稳定株的迁移、侵袭能力;利用小鼠皮下成瘤实验检测sh MSI2稳定株的成瘤能力、肿瘤体积及重量。3.采用RNA Decay实验检测MSI2对AR mRNA稳定性的调节;利用RIP实验确认MSI2与AR mRNA的直接结合关系;根据MSI2结合序列选取AR mRNA UTR序列中可能的结合位点,构建携带结合位点的报告基因载体质粒,利用双荧光素酶报告基因实验缩小结合位点范围;将结合位点突变,构建携带突变结合位点的报告基因质粒,利用双荧光素酶报告基因实验进一步确定结合位点,并进行RIP实验、RNA pulldown实验再次验证此位点与MSI2的结合关系;采用CHX实验检测MSI2对AR及AR下游分子PSA、NKX3.1蛋白稳定性的调节;应用Co-IP实验研究MSI2与AR是否具有直接结合关系;分别加入MG132,3-MA和氯喹,比较sh MSI2稳定株中AR的表达差异。结果:1.利用生物信息学技术,筛选出12种在前列腺癌与正常前列腺组织中表达差异显着的RBPs,并发现MSI2与AR及其下游PSA、NKX3.1等分子的表达高度相关;发现前列腺癌组织中MSI2的表达明显高于癌旁组织,GS≥7组中MSI2的表达明显高于GS<7组,并验证了MSI2与AR的表达相关性（前列腺癌手术标本中,r=0.75,p<0.05;前列腺上皮细胞系中,r=0.69,p<0.05;前列腺癌组织芯片中,r=0.61,p<0.05）;qRT-PCR、Western bloting实验发现LNCa P/C4-2B/22RV1-sh MSI2稳定株中AR及AR下游基因PSA、NKX3.1的表达均降低。2.平板克隆、CCK-8实验发现LNCa P/C4-2B/22RV1-sh MSI2稳定株的细胞增殖速度明显下降,但AR过表达后细胞增殖能力明显恢复;Transwell实验证实sh MSI2稳定株的迁移、侵袭能力均显着下降;小鼠皮下成瘤实验发现sh MSI2稳定株的成瘤能力、肿瘤体积及重量均明显下降。3.RNA Decay实验证实MSI2可增强AR mRNA的稳定性;RIP实验发现了MSI2与AR mRNA的直接结合关系;根据MSI2结合序列选取AR mRNA UTR序列中可能的20个结合位点、构建携带结合位点的报告基因载体质粒,利用双荧光素酶报告基因实验将待筛选的结合位点范围缩小至3个;将此3处结合位点突变,构建携带突变结合位点的报告基因质粒,利用双荧光素酶报告基因实验进一步确定结合位点为M15,并应用RIP实验、RNA pulldown实验进一步证实了M15与MSI2的直接结合关系;CHX时间梯度实验发现,sh MSI2稳定株的AR及下游分子PSA、NKX3.1的蛋白降解明显加快;Co-IP实验确认MSI2与AR无直接结合关系;分别加入MG132,3-MA和氯喹,发现只有MG132可以增强sh MSI2稳定株中AR的表达,猜测MSI2可能通过抑制蛋白酶体途径来阻遏AR的蛋白降解。结论:1.MSI2在前列腺癌中高表达,在GS≥7组前列腺癌中的表达明显高于GS<7组;AR的表达水平与MSI2高度正相关。2.MSI2可促进雄激素依赖性LNCa P细胞株与雄激素非依赖性C4-2B/22RV1细胞系的体外细胞增殖能力,促进22RV1细胞系的体内成瘤能力。3.机制上,MSI2可直接结合AR mRNA的3’-UTR序列导致AR mRNA稳定性增强;MSI2也可能通过抑制蛋白酶体途径来阻遏AR的降解,增强AR的蛋白稳定性。
罗生军[6]（2020）在《NPRL2通过调控自噬参与去势抵抗前列腺癌对多西他赛耐药的机制研究》文中研究指明背景和目的前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）是男性最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤,我国发病率虽低于欧美地区,但呈逐年增长趋势。约15%的Pca患者确诊时已处于进展期或出现远处转移,这类患者的基础治疗方案是雄激素剥夺治疗（Androgen deprivation therapy,ADT）。但很多患者在ADT治疗一段时间后都出现激素抵抗,并进展为去势抵抗型前列腺癌（castration resistant prostate cancer,CRPC）,预后差。以多西紫杉醇为基础的化疗方案是指南推荐治疗CRPC的一线方案,但几个疗程治疗后出现化疗耐药仍不可避免。Nitrogen permease regulator-like2（NPRL2）基因是本课题组一直研究的抑癌候选基因,我们前期意外发现NPRL2在PCa和CRPC组织和细胞中呈异常高表达,而在正常良性前列腺组织中却呈低表达甚至不表达的状态,并与PCa临床分期以及Gleason评分成正相关,还发现NPRL2高表达能促进PCa细胞生长,并降低多西他赛对PC3细胞的细胞毒性。同时研究发现NPRL2能影响自噬相关蛋白LC3-II/I、p62的表达,增强自噬。课题组前期验证NPRL2在前列腺癌中与mTORC1信号通路的关系,发现该基因能下调mTORC1信号通路中效应蛋白p-mTOR、p-S6K的表达,抑制mTORC1信号通路。NPRL2在CRPC细胞中高表达,NPRL2能增强自噬并抑制mTOR通路,而mTOR通路负向调节自噬,因此,我们设想NRPL2通过mTOR信号途径调控自噬参与去势抵抗性前列腺癌对多西他赛耐药。方法1.为研究多西他赛耐药,首先需要建立稳定耐多西他赛的CRPC细胞模型。通过不同浓度的多西他赛间断诱导培养前列腺癌细胞6个月,建立稳定耐多西他赛CRPC细胞（LNPER-DR和PC3-DR）,CCK-8法检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞在10nmol/l多西他赛中的细胞增殖率,流式细胞术检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞在10nmol/L多西他赛中的细胞凋亡率。2.为研究NPRL2对耐多西他赛CRPC细胞的生长及与自噬的相关性,通过Western blotting检测化疗耐药CRPC细胞和非化疗耐药CRPC细胞中NPRL2、自噬相关蛋白和mTOR相关蛋白的表达,激光共聚焦显微镜计数耐药和非耐药细胞中LC3荧光小点的数量变化,透射电镜拍摄耐药和非耐药细胞中自噬小体的数量变化。沉默NPRL2和/或抑制自噬后,CCK-8法检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞在10nmol/L多西他赛中的细胞增殖率,流式细胞术检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞在10nmol/L多西他赛中的细胞凋亡率,Western blotting检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞中自噬有关蛋白（LC3-II、LC3-I和p62）的表达差别。3.为探索NPRL2参与CRPC耐多西他赛的机制,通过沉默NPRL2和/或抑制mTOR后,CCK-8法检测干预后各组细胞在10nmol/L多西他赛中的细胞增殖率,流式细胞术检测干预后各组细胞在10nmol/l多西他赛中的细胞凋亡率,Western blotting检测干预后各组细胞中NPRL2、mTOR相关蛋白和自噬相关蛋白的表达差别,激光共聚焦显微镜计数干预后各组细胞中LC3荧光小点的数量改变,透射电镜拍摄干预后各组细胞中自噬小体的数量改变。4.最后构建裸鼠成瘤模型,利用沉默NPRL2的耐药细胞株进行动物实验,观察沉默NPRL2后是否增加耐多西他赛CRPC细胞对多西他赛的敏感性。结果1.在前期已经建立LNPER-DR模型基础上,通过多西他赛连续诱导建立了耐多西他赛PC3细胞模型（PC3-DR）,CCK-8证明两种耐药细胞在10nmol/L多西他赛中细胞增值率高于非耐药组,流式细胞术证明两种耐药细胞在10nmol/L多西他赛中凋亡也高于非耐药组。2.Western blot结果显示,在LNPER-DR和PC3-DR细胞中NPRL2的表达量明显高于在LNPER和PC3细胞中的表达量,对应的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增高、p62降低,mTOR相关蛋白p-mTOR、p-s6k降低,提示LNPER-DR和PC3-DR细胞中NPRL2过表达,自噬增强,mTOR通路减弱。免疫荧光和电镜也证实LNPER-DR和PC3-DR细胞中自噬明显增强。沉默NPRL2或抑制自噬后增加了多西他赛对耐药细胞的敏感性,自噬流实验显示自噬流通畅。3.mTOR抑制剂torin1能降低NPRL2沉默的多西他赛耐药细胞株对多西他赛的敏感性,沉默NPRL2能影响多西他赛耐药细胞mTOR信号通路,并抑制自噬,而NPRL2沉默的耐药细胞使用mTOR抑制剂能增强自噬,证明NPRL2通过mTOR信号通路参与调控多西他赛耐药细胞株的自噬。4.沉默NPRL2后能明显抑制多西他赛干预下LNPER-DR裸鼠的皮下瘤体生长速度和瘤体大小,Western blot结果显示沉默NPRL2的LNPER-DR细胞瘤体中mTOR通路表达加强,自噬受到抑制,结果与细胞实验一致。结论NPRL2通过mTOR调控自噬参与CRPC多西他赛耐药。靶向调控NPRL2可提高CRPC的化疗敏感性或延长化疗耐药时间。
张清富[7]（2020）在《氯硝柳胺及其衍生物在去势抵抗性前列腺癌中的作用及机制研究》文中提出目的:前列腺癌是男性最常见的肿瘤之一,雄激素去势治疗仍是目前无法手术根治患者的有效治疗手段,但1218个月后不可避免出现的耐药现象是导致患者预后欠佳的重要因素。目前,针对去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC）常用药物有:1.细胞毒性药物,如卡巴他赛,埃玻霉素等微管抑制剂,但毒副作用大;2.雄激素受体拮抗剂,如醋酸阿比特龙及恩杂鲁胺等,然而在治疗过程中均可出现不同程度的耐药现象。因此,探寻研发对CRPC治疗有效且毒副作用小的新型药物具有重要的临床意义。氯硝柳胺是目前美国FDA唯一推荐使用的灭螺药和治疗蠕虫的药物,其作用机制是通过抑制虫体细胞内线粒体的氧化磷酸化过程,阻碍吸收和摄取葡萄糖,杀死寄生虫。近年来,高通量药物筛选平台发现氯硝柳胺可能是潜在的抗癌剂,在人体内耐受性良好,毒副作用小。氯硝柳胺的抗肿瘤增殖活性已在多种肿瘤的细胞系中被证实如乳腺癌,去势抵抗性前列腺癌,急性髓性白血病,非小细胞肺癌,多发性骨髓瘤,肝细胞癌,肾上腺皮质癌,卵巢癌和胶质母细胞瘤。提示我们氯硝柳胺有望作为一种新的癌症治疗药物,目前美国FDA批准其联合恩杂鲁胺作为去势抵抗性前列腺癌治疗的Ib/II期临床试验。然而,氯硝柳胺作为抗癌剂具有一定的局限性:1.由于安全性需要,氯硝柳胺目前只适用于口服,但其水溶性差,在雄性大鼠中口服生物利用度仅为10%。2.氯硝柳胺的血浆半衰期（t1/2）在大鼠中为6.7±2.0小时。因此,低口服生物利用度和宽范围的血清浓度可导致氯硝柳胺在使用时出现抗癌功效的变化,而限制其临床抗癌的应用。我们通过保留氯硝柳胺的活性成份,构建了一种能显着增加口服给药时的血浆浓度和暴露持续时间,增强其抗肿瘤活性的氯硝柳胺新型衍生物DK419,本研究我们将探究氯硝柳胺及其衍生物DK419在去势抵抗性前列腺癌中的治疗作用及其潜在可能的分子机制。研究方法:1.体外研究氯硝柳胺及其衍生物（DK419）对前列腺癌细胞系的作用。我们选取了多种前列腺癌细胞系:Ln CAP细胞系是来源于雄激素依赖（去势敏感）的腺癌;C4-2细胞系来源于小鼠Ln CAP的雄激素非依赖型前列腺癌细胞系,它具有AR突变并且是AR独立的（去势抵抗）;C4-2MDR是抗恩扎鲁胺的C4-2细胞;C4-2B细胞在含恩扎鲁胺的培养基中长期暴露于浓度增加的恩扎鲁胺（5-40μM）中超过12个月;PC3是一种神经内分泌小细胞癌,无雄激素受体（去势抵抗和恩扎鲁胺抵抗）。DU145细胞系具有高度转移潜能,缺乏内源性的雄激素受体的细胞系。运用MTT检测氯硝柳胺及其衍生物（DK419）对上述不同前列腺癌细胞系的作用;同时我们检测联合应用恩杂鲁胺及氯硝柳胺/其衍生物（DK419）对前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞系的作用。2.通过动物实验研究氯硝柳胺（NIC）及其衍生物（DK419）对恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞系的作用,分组如下:1)对照组:6只小鼠,PEG300 90%,NMP 10%,口服+腹腔注射PBS+DMSO;2)氯硝柳胺组:6只小鼠,77mg/kg氯硝柳胺口服+腹腔注射PBS+DMSO;3)DK419组:6只小鼠,1mg/kg DK419口服+腹腔注射PBS+DMSO;4)DK419+恩扎鲁胺组:小鼠6只,1mg/kg DK419口服+腹腔注射恩扎鲁胺1mg/kg;5)恩扎鲁胺组:6只小鼠,PEG300 90%,NMP 10%,口服+腹腔注射恩扎鲁胺1mg/kg。给药周期:成瘤至0.5cm后,连续灌胃6天,间断1天,维持4周左右或根据伦理学要求终止动物实验。检测:1.肿瘤体积（每周三次,使用卡尺）2.小鼠体重（每天测量）3.在实验结束时,收集的各器官和肿瘤。各器官HE染色:毒理学研究;肿瘤组织行免疫组化染色。3.研究氯硝柳胺及其衍生物在去势抵抗性前列腺癌中的作用机制1)应用安捷伦Seahorse XF细胞线粒体分析仪检测不同前列腺癌细胞系线粒体代谢功能状态2)检测氯硝柳胺及其衍生物对前列腺癌细胞系线粒体功能的影响3)通过无糖培养基处理后,检测氯硝柳胺及其衍生物对前列腺癌细胞系的作用4)联合应用2DG及氯硝柳胺/其衍生物（DK419）对前列腺癌细胞系的作用。5)western blot检测氯硝柳胺/其衍生物（DK419）对前列腺癌细胞系Wnt/β-连环蛋白,AR,p-STAT3相关信号通路的作用结果:1.在前列腺癌细胞系中,氯硝柳胺/其衍生物（DK419）能够显着抑制雄激素依赖Ln CAP细胞系及雄激素非依赖型C4-2细胞系的细胞增殖能力,对于抗恩扎鲁胺的C4-2 MDR及C4-2B细胞也有一定的杀伤作用;但是对于神经内分泌分化PC3细胞系及高度转移潜能,缺乏内源性的雄激素受体的DU145细胞系杀伤作用有限。体外联合运用恩扎鲁胺及氯硝柳胺/其衍生物（DK419）能够增强对前列腺癌细胞系的杀伤作用。2.动物实验显示氯硝柳胺衍生物（DK419）在去势抵抗性前列腺癌治疗作用优于氯硝柳胺,且安全有效。但是联合应用恩杂鲁胺及氯硝柳胺衍生物（DK419）体内并未增强对去势抵抗性前列腺癌治疗作用。3.氯硝柳胺及其衍生物（DK419）对前列腺癌细胞杀伤作用与前列腺癌细胞系线体功能代谢状态相关4.蛋白免疫印迹检测发现氯硝柳胺及其衍生物在敏感细胞系C4-2和不敏感细胞系DU145中均能够抑制WNT信号通路的激活,负向调控DU145细胞系p-STAT3相关蛋白,轻微抑制C4-2细胞系AR、PSA水平的表达,因此,我们推测其对前列腺癌细胞系生物学行为的抑制作用并非完全依赖于这些信号通路。结论:1.我们研发一种口服生物利用度高的氯硝柳胺衍生物（DK419）,其在去势抵抗性前列腺癌治疗作用优于氯硝柳胺,且安全有效。2.联合应用恩杂鲁胺及氯硝柳胺/其衍生物（DK419）体内并未增强对CRPC治疗作用。3.氯硝柳胺及其衍生物（DK419）对前列腺癌细胞杀伤作用与其抑制肿瘤细胞线粒体代谢功能作用相关3.联合应用糖酵解抑制剂2-DG及氯硝柳胺/其衍生物（DK419）可显着增强对高度恶性和侵袭性的前列腺癌细胞系杀伤作用。
张成[8]（2017）在《LncRNA LOC440040在前列腺癌中的表达及对前列腺癌细胞功能影响的研究》文中研究指明目的:长链非编码RNA（lncRNAs）在前列腺癌（prostate cancer,PCa）的发生和发展中起着重要的作用。本研究旨在通过高通量测序技术筛出差异表达的lncRNA,并探索其在前列腺癌中的表达、生物学功能以及其与临床的相关性分析。材料和方法:通过基因芯片和生物学信息分析筛选出候选的lncRNA。采用逆转录聚合酶链反应技术验证前列腺癌组织和对应癌旁正常组织以及前列腺癌细胞株和前列腺正常细胞株中lncRNALOC440040的表达水平。采用t检验或卡方检验分析LOC440040表达水平与临床病理特征之间的关系。采用Kaplan-Meier方法评估LOC440040表达水平与患者预后的关系。采用CCK8细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成实验评估lncRNA LOC440040对前列腺癌细胞株PC-3和22RV1细胞功能的影响。结果:芯片结果和qRT-PCR结果显示,与癌旁组织相比,lncRNA LOC440040在前列腺癌组织中的表达水平明显上调（P<0.05）;与人前列腺正常肌成纤维基质细胞（WPMY-1）相比,lncRNA LOC440040在前列腺癌细胞系PC3和22RVl中显着高表达（P<0.05）。临床病理分析表明,与lncRNALOC440040低表达的前列腺癌患者相比,lncRNALOC440040高表达的前列腺癌患者呈现出进展性的临床特点和更短的总体生存率。多元回归分析结果显示,lncRNALOC440040表达水平是前列腺癌患者一个独立的预后因素。敲低lncRNA LOC440040表达水平可以抑制前列腺癌细胞系PC3和22RVl的细胞增殖、迁移和侵袭。结论:LncRNA LOC440040可能在前列腺癌的发生和发展中起致癌作用。LncRNA LOC440040可能作为前列腺癌新的lncRNA分子预后生物标记物和新的潜在治疗靶点。
俞旭君[9]（2016）在《芪蓝胶囊基于VEGF抑制前列腺癌VM形成的机制研究》文中研究说明研究背景和目的：前列腺恶性肿瘤逐年高发,发病率在欧美国家成年男性中已排第一位。国内由于老龄化社会的到来和健康体检的推广,该病的发病率也已连年上升。长期以来,肿瘤血管生成是被认为其获得血液供应的唯一途径,但血管生成可能不是所有肿瘤获得微循环血液供应的唯一机制,某些高度恶性的肿瘤细胞可以模拟内皮依赖性血管（Edothelium dependent vessel, EDV）的形态结构形成一种新的血液供应模式,称之为“血管生成拟态”（Vasculogenic mimicry, VM）。肝癌、PCa、卵巢癌等恶性肿瘤中已报道有VM存在的证据。VM在前列腺癌的发生、发展中发挥着重要作用。VEGF在前列腺癌组织中表达增高,增加血管通透性和刺激新生血管形成,从而给肿瘤细胞供应足够的营养,使其生长、转移等过程能够顺利进行。近来研究发现,VEGF可通过HIF-1α→VEGFα→EphA2→MMPs→Laminin-5γ2→VM路径诱导前列腺肿瘤细胞形成VM,尤其在生殖系肿瘤当中,只有高表达VEGF的细胞才有形成VM的潜能。因此,我们遴选VEGF参与介导形成VM的通路,探讨芪蓝胶囊基于VEGF抑制前列腺癌VM形成的作用机制。本研究拟分析芪蓝胶囊对VM形成的影响,探讨芪蓝胶囊干预VM形成的作用规律及“量-效”关系。同时我们在3D培养体系中,采用RNAi干扰技术分别沉默VEGF通路上各位点的表达,运用RT-qPCR和Western-blotting技术检测VEGF通路上各点的基因表达及表达产物变化,目的在于探寻芪蓝胶囊在抑制VEGF介导形成前列腺癌VM的通路中的作用位点及其作用机制。研究方法：1.将PC-3细胞冻存管从液氮罐中取出,迅速融化,转移到离心管,加入2mlDMEM/F-12培养液,吹打混匀,离心后弃去上清,加入1ml DMEM/F-12,吹打使细胞混匀,形成单细胞悬液。将制成的悬液转移至25ml细胞培养瓶,加入DMEM/F-12培养基（含10%FBS） 5ml进行细胞传代培养,细胞计数直至获得足够数量的细胞用于实验。培养好的细胞再次通过BeaverNanoTM 3D细胞培养方法进行3D培养,将3D培养的细胞随机分为：空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组设3个复孔。芪蓝胶囊含药血清按10%,5%,2.5%（培养体系体积比）设置高、中、低剂量组给药,不足10%的组别用胎牛血清补足；空白组采用10%大鼠空白血清给药,作用时间48h。最后采用显微镜对培养孔中的细胞VM进行观察。2.PC-3细胞在培养瓶中处于对数生长期时,处理后加DMEM/F-12（含10%FBS）2ml,吹打形成单细胞悬液。按2.5x105细胞/孔的浓度接种,6孔板,混匀后置于37-C,5%CO2培养箱24小时。培养后进行siRNA的转染,转染后的混合物逐滴加入6孔板中混匀,温育6h。开始转染判定,转染率>80%时,进行后续步骤,荧光标记组停止后续步骤。将细胞分组,包括空白对照组、HIF-1α siRNA组、VEGF-α siRNA组、EphA2 siRNA组、芪蓝胶囊（中剂量）组、芪蓝胶囊+HIF-Iα siRNA组、芪蓝胶囊+VEGF-α siRNA组、芪蓝胶囊+EphA2 siRNA组。最后采用RT-qPCR和Western-blotting技术检测VEGF通路上各点的基因表达及表达产物变化。研究结果：1.空白组中细胞增殖明显,可见VM形成的各类表现,芪蓝胶囊低剂量组细胞增殖明显,可见直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹样的（没有完全封闭）、有分支的彩虹样的通道,但数量较空白组少；中、高剂量组细胞增殖受到抑制,仅见极少量直行通道形成。2.芪蓝胶囊可减少HIF-1α、VEGF-α、MMP-1的基因表达,但对EphA2的基因表达无显着性影响。转染HIF-1α siRNA后,HIF-1α、MMP-1勺基因表达受到明显抑制VEGF-α、EphA2的基因表达未受明显抑制。转染VEGF-α siRNA后,HIF-1α、 VEGF-α的基因表达未受明显抑制,MMP-1、EphA2的基因表达受到明显抑制,转染EphA2 siRNA后,HIF-1α、VEGF-α的基因表达无明显抑制,EphA2.MMP-1的基因表达受到明显抑制。加入芪蓝胶囊的4组均可明显抑制HIF-1α蛋白的表达,加入芪蓝胶囊4组与HIF-1α siRNA、VEGF-α siRNA、EphA2 siRNA组均可抑制VEGF-α蛋白的表达,芪蓝胶囊对EphA2蛋白表达无明显影响。研究结论：1.芪蓝胶囊含药血清可明显抑制体外前列腺癌PC-3细胞3D培养模型中VM的形成,以中、高剂量组的抑制作用更为明显；2.VEGF-α、EphA2、MMP-1之间存在明显的上下游关系,是VM形成的重要上游因子,证实在VM形成的过程中通路VEGF-α→EphA2-MMP-1→VM真实存在。而HIF-1α与VEGF-α、EphA2之间没有明显的抑制关系,可能与上游VEGF-α基因受到其他更多因子调节有关。MMP-1的表达在HIF-1α沉默后受到抑制,提示HIF-1α可能通过其他路径抑制了MMP-1的表达,从而影响VM的形成,还需要进一步深入研究。3.芪蓝胶囊通过抑制HIF-1α、VEGF-α、MMP-1基因以及蛋白的表达,从而使前列腺癌组织中VM形成受到抑制,影响了肿瘤组织自身血液供应系统的生长、发展过程,最终起到治疗前列腺癌的临床作用。
黄伟伟[10]（2012）在《雷公藤甲素药物活性和YY1表达调控及在细胞病理转化中的作用研究》文中研究说明雷公藤甲素是中药雷公藤的主要活性成分。近年来，由于雷公藤甲素表现出多种生物活性，如抗炎，免疫抑制，抗囊肿，尤其是抗癌活性，引起了极大地关注，并成为药物研究领域的研究热点。目前研究发现雷公藤甲素能够在体外或体内抑制多种肿瘤细胞的增殖，显示出良好的抗癌活性。然而对于雷公藤甲素的抗前列腺癌研究报道极少，其作用机制尚不完全清楚。因此本研究以前列腺癌为模型，研究雷公藤甲素的抗前列腺癌功效，与另一种雷公藤活性成分雷公藤红素的抗癌活性进行了比较，并进一步探索了雷公藤甲素抗前列腺癌的分子作用机制。此外，对雷公藤甲素的一个靶基因Yin Yang1（YY1）的表达调控和在肿瘤发生中的作用也进行了研究。主要取得以下结果：1、利用前列腺癌细胞，通过体外细胞试验，检测雷公藤甲素抗前列腺癌作用。结果表明雷公藤甲素具有良好的抗前列腺癌功效，在nM级就能够显着抑制前列腺癌细胞的增殖。雷公藤甲素还能够通过caspase途径诱导前列腺癌细胞凋亡。综合比较，雷公藤甲素抗前列腺癌功效要显着强于雷公藤红素。2、利用小鼠移植瘤模型，研究雷公藤甲素在体内的抗前列腺癌作用。结果表明雷公藤甲素能够显着抑制前列腺癌细胞PC-3移植瘤的生长，表现出良好的抗前列腺癌功效。3、通过实时定量PCR和Western blot等技术，分析雷公藤甲素抗前列腺癌的分子机制。结果发现雷公藤甲素能够显着抑制去SUMO化酶SENP1的表达，从而引起细胞内SUMO化水平升高。此外还发现雷公藤甲素能够抑制雄激素受体AR，转录因子c-Jun和YY1的表达，并抑制AR，c-Jun和YY1介导的转录调控。进一步发现通过siRNA沉默或高表达SENP1，AR和c-Jun，能够抑制雷公藤甲素抗前列腺癌功效。这些结果提示雷公藤甲素可能通过以上途径发挥抗抗前列腺癌作用。4、基于发现雷公藤甲素能够抑制YY1的表达。我们进一步对YY1的表达调控进行了研究。通过分析YY1的启动子和5’非编码区（5’UTR），结果发现可能存在G4四联体结构（G4-quadruplex，G4）。进一步通过圆二色谱（CD），足迹法和报告基因技术研究证实YY1启动子和5’UTR的确存在G4结构，并对YY1表达调控具有抑制作用。5、通过凝胶迁移，RANase I剪切，染色体免疫沉淀（ChIP）等试验发现G4解旋酶G4R1能够结合YY1启动子区的G4结构上并使之解旋，从而促进YY1的表达。此外，通过分析YY1和G4R1在乳腺癌中的表达水平，结果发现两者表达水平在乳腺癌中均升高，并且高度相关。6、研究了YY1在细胞病理转化中的作用。以乳腺癌为模型，通过检测乳腺癌细胞和病理组织，以及分析基因芯片检测结果，发现YY1在乳腺癌中高表达。进一步功能检测发现，高表达YY1能够增强乳腺细胞的增殖，迁移，侵润。相反，siRNA沉默YY1能够抑制乳腺癌细胞增殖，迁移，侵润和移植瘤模型中的肿瘤形成。表明YY1具有促进乳腺癌细胞恶性转化的作用。
二、强力霉素抑制前列腺癌PC-3细胞的体外侵袭作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、强力霉素抑制前列腺癌PC-3细胞的体外侵袭作用（论文提纲范文）
（1）ApoA-I和SLPI促进前列腺癌去势抵抗及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 ApoA-I通过调节肿瘤代谢促进前列腺癌进展 |
| 背景 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SLPI通过谱系可塑性促进前列腺癌神经内分泌分化 |
| 背景 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 神经内分泌前列腺癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 攻读博士期间发表论文(一) |
| 攻读博士期间发表论文(二) |
（2）下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词简表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 前列腺癌概述 |
| 1.2 肿瘤细胞能量代谢改变 |
| 1.3 脂代谢与肿瘤 |
| 1.4 ACACA的一般特点 |
| 1.5 ACACA的功能区划分 |
| 1.6 ACACA的生理功能 |
| 1.6.1 ACACA的生理功能 |
| 1.6.2 ACACB的生理功能 |
| 1.7 ACACA调控肿瘤的分子机制及相关信号通路 |
| 1.7.1 ACACA调控肿瘤的分子机制 |
| 1.7.2 肿瘤中ACACA相关信号通路 |
| 1.8 靶向ACACA基因在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.8.1 TOFA |
| 1.8.2 ND-630 |
| 1.8.3 ND-646 |
| 1.8.4 BAY ACC002 |
| 1.8.5 ACACA活性的新型调节剂 |
| 1.9 ACACA与脂代谢在肿瘤细胞中的调节 |
| 1.9.1 阻止脂肪酸合成 |
| 1.9.2 阻断脂肪酸合成基因的表达 |
| 1.9.3 增加脂肪酸降解 |
| 1.9.4 将脂肪酸转移到储存中或阻止脂肪酸从储存中释放 |
| 1.10 目前ACACA在肿瘤中的研究现状 |
| 1.10.1 ACACA在头颈细胞癌中的研究 |
| 1.10.2 ACACA在非小细胞肺癌中的研究 |
| 1.10.3 ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.4 ACACA与p-ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.5 ACACA在胃癌中的研究 |
| 1.10.6 ACACA在肝癌中的研究 |
| 1.10.7 ACACA在前列腺癌中的研究 |
| 1.11 本研究拟解决的问题 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 前列腺癌患者组织芯片 |
| 2.1.2 实验细胞株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂和耗材 |
| 2.1.5 实验主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组织化学实验及评分方法 |
| 2.2.2 细胞培养冻存和复苏 |
| 2.2.3 载体设计和细胞系构建 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.2.5 免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.6 细胞功能实验 |
| 2.2.7 液相色谱-质谱检测(LC-MS)细胞代谢组学检测 |
| 2.2.8 海马线粒体压力检测 |
| 2.2.9 海马XF-ATP效率实时检测 |
| 2.2.10 海马XF糖酵解速率检测 |
| 2.2.11 荧光显微镜及流式细胞术检测线粒体示踪 |
| 2.2.12 比色法检测NAD+/NADH水平 |
| 2.2.13 流式细胞术检测细胞内活性氧水平 |
| 2.2.14 动物实验构建裸鼠肿瘤模型 |
| 2.2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 ACACA在前列腺癌组织中上调其表达与TNM分期有关 |
| 3.2 ACACA基因低表达的前列腺癌细胞系(DU145和PC3)构建 |
| 3.3 敲低ACACA基因抑制前列腺癌细胞(DU145和PC3)功能 |
| 3.4 ACACA基因对前列腺癌细胞(DU145和PC3)凋亡的影响 |
| 3.5 抑制ACACA基因影响DU145和PC3细胞ATP水平 |
| 3.6 PC3细胞中敲低ACACA基因后降低L-棕桐酰肉碱和硬脂肉碱水平及代谢途径相关蛋白表达 |
| 3.7 敲低前列腺癌细胞系ACACA基因抑制线粒体-ATP水平和线粒体潜能 |
| 3.8 ACACA能影响线粒体MTDNA及染色情况 |
| 3.9 ACACA基因影响前列腺癌细胞系NAD+/NADH比值和ROS水平 |
| 3.10 敲低ACACA基因后将抑制裸鼠皮下移植瘤形成 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 本研究的不足之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 31种肿瘤简称 |
| 博士研究生期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）线粒体靶向的雷公藤甲素衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 雷公藤甲素与其抗肿瘤活性研究现状 |
| 1.1 雷公藤甲素的来源与结构 |
| 1.2 雷公藤甲素的抗肿瘤活性与作用机制 |
| 1.2.1 呼吸系统肿瘤 |
| 1.2.2 血液系统恶性肿瘤 |
| 1.2.3 消化系统恶性肿瘤 |
| 1.2.4 泌尿生殖系统肿瘤 |
| 1.2.5 其他肿瘤 |
| 1.3 雷公藤甲素毒性研究 |
| 1.3.1 心血管循环系统毒性 |
| 1.3.2 消化系统毒性 |
| 1.3.3 泌尿生殖系统毒性 |
| 1.3.4 免疫系统毒性 |
| 1.3.5 其他毒性 |
| 1.4 雷公藤甲素的结构改造与抗肿瘤活性 |
| 1.4.1 C-14β-OH的修饰 |
| 1.4.2 α,β-不饱和五元内酯环(D环)的修饰 |
| 1.4.3 C5,6-位的修饰 |
| 1.4.4 环氧基的修饰 |
| 1.4.5 其他修饰 |
| 第二章 线粒体靶向雷公藤甲素衍生物的设计与合成 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 目标产物与合成路线 |
| 2.3 雷公藤甲素衍生物的波谱数据 |
| 2.4 实验部分 |
| 2.4.1 实验试剂与实验设备 |
| 2.4.2 雷公藤甲素衍生物的合成方法 |
| 2.4.3 雷公藤甲素衍生物的纯度检查 |
| 第三章 线粒体靶向雷公藤甲素衍生物的抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞与动物 |
| 3.1.2 化合物 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.1.5 常用试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 MTT法测细胞活力 |
| 3.2.2 LDH法检测细胞毒性 |
| 3.2.3 RP-HPLC法检测化合物TP和Mito-TP-2在线粒体内的分布与聚集 |
| 3.2.4 DAPI染色法观察细胞凋亡 |
| 3.2.5 DCFH-DA染色检测胞内ROS水平 |
| 3.2.6 JC-1染色法检测线粒体膜电位 |
| 3.2.7 Annexin/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 3.2.8 PI染色法测细胞周期 |
| 3.2.9 化合物TP和Mito-TP-2抗肿瘤药效和毒性研究 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 雷公藤甲素衍生物的抗肿瘤活性评价 |
| 3.3.2 Mito-TP-2对LDH释放量的影响 |
| 3.3.3 Mito-TP-2在线粒体里的聚集与分布 |
| 3.3.4 Mito-TP-2对细胞内ROS的影响 |
| 3.3.5 Mito-TP-2对线粒体膜电位(ΔΨm)的影响 |
| 3.3.6 Mito-TP-2诱导细胞凋亡 |
| 3.3.7 Mito-TP-2对细胞周期的影响 |
| 3.3.8 化合物TP和Mito-TP-2抗肿瘤药效和毒性研究 |
| 总结与讨论 |
| 附录 化合物谱图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）Piperlongumine通过免疫原性死亡途径增强PD-1抑制剂在前列腺癌治疗中抗癌效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 PIPERLONGUMINE通过激活ROS--ER STRESS通路诱导前列腺癌细胞凋亡 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.2 实验步骤 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 细胞传代、培养、冻存及复苏。 |
| 2.2.3 MTT法检测PL对前列腺癌细胞系的抑制作用 |
| 2.2.4 克隆形成实验 |
| 2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 Caspase-3 Assay Kit检测活化的Caspase-3 |
| 2.2.7 ROS检测 |
| 2.2.8 Western blot检测细胞蛋白的表达 |
| 2.2.9 RT-PCR |
| 2.2.10 chop siRNA转染 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 PL抑制前列腺癌细胞的生长 |
| 3.2 PL可以诱导细胞凋亡 |
| 3.3 PL可以诱导前列腺癌细胞氧化应激 |
| 3.4 PL可通过内质网应激而诱导前列腺癌细胞凋亡 |
| 3.5 PL诱导内质网应激依赖于前列腺癌细胞产生活性氧 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 PL在前列腺癌中的抗癌作用 |
| 4.2 活性氧、内质网应激与PL诱导的癌细胞凋亡 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PL增强PD-1 抑制剂抗癌效果的机制研究 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 检测细胞表面钙网蛋白的表达 |
| 2.2.2 检测细胞外液中ATP含量 |
| 2.2.3 检测细胞外液中HMGB1 含量的测定 |
| 2.2.4 动物接受经PL处理的前列腺癌细胞疫苗免疫实验 |
| 2.2.5 PL动物体内治疗 |
| 2.2.6 PL联合PD-1 抗体动物体内治疗前列腺癌 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 PL可以诱导前列腺癌细胞表面钙网蛋白表达增加 |
| 3.2 前列腺癌细胞外液中三磷酸腺苷(ATP)随着PL的浓度增加而上升 |
| 3.3 前列腺癌细胞外液中HMGB1 随着PL的浓度增加而上升 |
| 3.4 PL主要通过ROS--ER STRESS通路诱导前列腺癌细胞发生ICD |
| 3.5 在体内实验中,PL可以通过免疫反应抑制肿瘤的再次攻击 |
| 3.6 在体内实验中PL主要通过提高细胞免疫反应治疗前列腺癌 |
| 3.7 PL联合PD-1 抗体在前列腺癌中的检测 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 PL所引起的免疫原性细胞死亡与DAMP的关系 |
| 4.2 ICD与凋亡、内质网应激的关系 |
| 4.3 ICD与肿瘤微环境的变化 |
| 4.4 PD-1 抑制剂的联合治疗的相关临床试验 |
| 4.5 ICD与 PD-1 抑制剂的联合治疗效果 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）RNA结合蛋白Musashi2稳定雄激素受体促进前列腺癌细胞增殖的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 绪论 |
| 第一部分 MSI2 在前列腺癌中的表达特点及与AR表达相关性的研究 |
| 1.实验材料与仪器 |
| 1.1 人前列腺癌组织 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 抗体 |
| 1.5 主要实验仪器和软件 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 组织标本石蜡包埋和切片 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 组织免疫荧光染色 |
| 2.5 Western blotting分析 |
| 2.6 RNA抽提 |
| 2.7 慢病毒sh RNA表达载体的构建 |
| 2.8 慢病毒制备 |
| 2.9 慢病毒感染建立低表达MSI2 的前列腺癌细胞稳转株 |
| 2.10 实时定量PCR |
| 2.11 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 生物信息学分析发现前列腺癌中MSI2 与AR表达高度相关 |
| 3.2 MSI2 在前列腺癌组织中高表达,且与GS评分高度相关 |
| 3.3 前列腺癌组织中AR的表达与MSI2 高度相关。 |
| 3.4 敲低前列腺癌细胞系中MSI2 的表达,AR的表达水平下降 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 MSI2 在前列腺癌中的生物学功能研究 |
| 1.实验材料与仪器 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 抗体 |
| 1.5 主要实验仪器和软件 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 平板克隆实验 |
| 2.3 CCK-8 实验 |
| 2.4 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.5 Transwell小室实验 |
| 2.6 Western blotting分析 |
| 2.7 RNA抽提 |
| 2.8 实时定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.9 siRNA的构建及转染 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 MSI2 促进前列腺癌细胞的增殖 |
| 3.2 MSI2 增强前列腺癌细胞皮下成瘤的能力 |
| 3.3 MSI2 促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分 MSI2 增强AR表达的作用机制研究 |
| 1.实验材料与仪器 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要实验仪器和软件 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 RNA抽提 |
| 2.3 实时定量PCR |
| 2.4 Western blotting分析 |
| 2.5 RNA-immunoprecipitation实验 |
| 2.6 RNA Decay实验 |
| 2.7 蛋白稳定性实验 |
| 2.8 RNA pulldown实验 |
| 2.9 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.10 免疫共沉淀实验 |
| 2.11 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 MSI2 增强AR mRNA的稳定性。 |
| 3.2 MSI2 结合至AR mRNA3’-UTR区域 |
| 3.3 MSI2 通过非直接结合方式增强AR的蛋白稳定性 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录:MSI2 在恶性肿瘤发生发展中的机制研究 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）NPRL2通过调控自噬参与去势抵抗前列腺癌对多西他赛耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 建立耐多西他赛去势抵抗前列腺癌细胞模型 |
| 引言 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 耐多西他赛去势抵抗前列腺癌细胞中NPRL2的表达及与自噬的相关性研究 |
| 引言 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 NPRL2参与去势抵抗前列腺癌多西他赛耐药的机制研究 |
| 引言 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:肿瘤微环境对肿瘤的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（7）氯硝柳胺及其衍生物在去势抵抗性前列腺癌中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂、材料和实验仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 相关抗体 |
| 2.1.3 主要材料 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 主要方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 体外研究氯硝柳胺及其衍生物(DK419)对前列腺癌细胞系的作用 |
| 3.2 体内动物实验研究氯硝柳胺及其衍生物(DK419)对前列腺癌细胞系的作用 |
| 3.3 氯硝柳胺及DK419对前列腺癌细胞系的作用可能与线粒体功能相关 |
| 3.3.1 氯硝柳胺及DK419抑制前列腺癌细胞系ATP的产生 |
| 3.3.2 前列腺癌细胞系线粒体DNA(mt DNA)拷贝数检测 |
| 3.3.3 检测不同前列腺癌细胞系线粒体功能情况 |
| 3.4 氯硝柳胺及其衍生物(NIC,DK419)在含糖及无糖培养基中对不同前列腺癌细胞系的杀伤作用 |
| 3.5 联合应用氯硝柳胺/DK419+2DG对不同前列腺癌细胞系及正常前列腺细胞系的影响 |
| 3.6 氯硝柳胺及其衍生物DK419对AR,WNT及 p-STAT3 信号通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）LncRNA LOC440040在前列腺癌中的表达及对前列腺癌细胞功能影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 统计学方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）芪蓝胶囊基于VEGF抑制前列腺癌VM形成的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 引言 |
| 第一部分 芪蓝胶囊抑制血管生成拟态的效应研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 第二部分 芪蓝胶囊抑制血管生成拟态的作用机制研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 讨论 |
| 一、前列腺癌概况 |
| 二、前列腺癌的发病原因 |
| 三、前列腺癌的病理特点 |
| 四、前列腺癌的发病机制 |
| 五、前列腺癌的现代医学治疗进展 |
| 六、VM在肿瘤研究中的进展 |
| 七、前列腺癌血管生成拟态相关因子研究进展 |
| 八、三维培养技术(3DCC)的发展及其在肿瘤研究中的应用 |
| 九、中医药在前列腺癌治疗中的作用进展 |
| 十、“芪蓝胶囊”在前列腺癌治疗中的前期应用分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附：综述一 血管生成拟态的分子机制及其在前列腺癌中研究现状 |
| 参考文献 |
| 附：综述二 中医药治疗前列腺癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（10）雷公藤甲素药物活性和YY1表达调控及在细胞病理转化中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 雷公藤甲素与肿瘤 |
| 1.1.1 雷公藤 |
| 1.1.2 雷公藤甲素抗肿瘤活性及其作用机制 |
| 1.1.3 雷公藤红素抗肿瘤活性及其作用机制 |
| 1.2 转录因子 Yin Yang 1（YY1） |
| 1.2.1 YY1 基因序列及蛋白结构 |
| 1.2.2 YY1 蛋白功能 |
| 1.2.3 YY1 参与的细胞生理活动 |
| 1.2.4 YY1 与肿瘤发生 |
| 1.3 本研究目的与意义 |
| 第二章 雷公藤甲素抑制前列腺癌细胞增殖并诱发凋亡 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞生长曲线测定 |
| 2.2.3 细胞抑制率检测-MTT 法 |
| 2.2.4 细胞凋亡检测 |
| 2.2.5 Western Blot |
| 2.2.6 小鼠移植瘤试验 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 雷公藤甲素能够显着抑制 PCa 细胞增殖 |
| 2.3.2 雷公藤甲素能够显着诱导 PCa 细胞凋亡 |
| 2.3.3 雷公藤甲素能够引起 caspase 通路激活 |
| 2.3.4 雷公藤甲素显着抑制 PC-3 细胞移植瘤生长 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 雷公藤甲素抑制多个与 PCa 发生相关蛋白的表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 质粒构建 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 药物处理 |
| 3.2.4 细胞转染 |
| 3.2.5 细胞计数 |
| 3.2.6 实时定量 PCR |
| 3.2.7 Western Blot |
| 3.2.8 化学免疫荧光检测(Chemiluminescence Immumo-Assay，CLIA) |
| 3.2.9 统计分析 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 雷公藤甲素显着抑制 PCa 细胞 SENP1 表达 |
| 3.3.2 雷公藤甲素显着抑制 PCa 细胞 AR 表达 |
| 3.3.3 雷公藤甲素显着抑制 PCa 细胞 c-Jun 表达 |
| 3.3.4 雷公藤甲素显着抑制 PCa 细胞 YY1 表达 |
| 3.3.5 SENP1，c-Jun 和 AR 的表达对雷公藤甲素细胞毒性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 转录因子 YY1 启动子和 5’-UTR 区存在 G4 结构 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 质粒构建 |
| 4.2.2 细胞培养 |
| 4.2.3 圆二色谱（Circular Dichroism，CD）分析 |
| 4.2.4 5’-32P 标记 G4 寡核苷酸 |
| 4.2.5 硫酸二甲酯（Dimethyl sulphate，DMS）足迹法 |
| 4.2.6 YY1 启动子区体外 DNase I 足迹法 |
| 4.2.7 报告基因检测（Reporter assay） |
| 4.2.8 统计分析 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 YY1 启动子和 5’-UTR 富含 G/C 并含有 G4 形成序列 |
| 4.3.2 圆二色谱分析表明源自 YY1 启动子和 5’-UTR 的寡核苷酸能够在体外形成 G4 结构 |
| 4.3.3 YY1 G4 DNA 结构 DMS 足迹法鉴定 |
| 4.3.4 YP-3 和 YU-4 形成二级结构对于一价金属阳离子的高度依赖性证实 G4 结构存在 |
| 4.3.5 YP-3 和 YU-4 形成的二级结构的热稳定性对阳离子的依赖证实 G4 结构存在 |
| 4.3.6 YY1 启动子区体外 DNase I 足迹法鉴定 |
| 4.3.7 YY1 启动子区和 5’-UTR 的 G4 形成序列能够调节报告基因的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 G4R1 通过结合并解旋 YY1 启动子上的 G4 结构调节 YY1 表达 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 报告基因检测（Reporter assay） |
| 5.2.3 Western Blot |
| 5.2.4 5’-32P 标记 G4 寡核苷酸 |
| 5.2.5 凝胶电泳迁移滞后试验（Electrophoretic Mobility Shift Assays，EMSAs） |
| 5.2.6 核酸外切酶剪切试验 |
| 5.2.7 染色体免疫共沉淀检测（Chromatin immunoprecipitation，ChIP） |
| 5.2.8 YY1 和 G4R1 表达谱基因芯片结果分析 |
| 5.2.9 统计分析 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 G4R1 能够增强 YY1 启动子驱动的报告基因表达而对 YY15’-UTR 功能无影响 |
| 5.3.2 G4R1 能够在体外结合 YY1 启动子上 G4 结构（YP-3） |
| 5.3.3 G4R1 能够解旋 YY1 启动子上的 G4 结构 |
| 5.3.4 G4R1 能够在细胞中与 YY1 启动子结合 |
| 5.3.5 改变细胞内 G4R1 的表达能够影响内源性 YY1 的蛋白水平 |
| 5.3.6 在乳腺癌样品中 G4R1 表达水平与 YY1 表达水平相关联 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 YY1 在乳腺癌中的表达检测及其作用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 质粒构建 |
| 6.2.2 细胞培养 |
| 6.2.3 病毒制备和细胞感染 |
| 6.2.4 组织微阵列（Tissue Microarray，TMA）检测 |
| 6.2.5 细胞伤口愈合试验（Wound healing） |
| 6.2.6 体外侵袭试验（Invasion assay） |
| 6.2.7 克隆形成能力检测（Clonogenic assay） |
| 6.2.8 乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型 |
| 6.2.9 Western Blot |
| 6.2.10 免疫组化染色（Immunohistochemistry，IHC） |
| 6.2.11 统计分析 |
| 6.3 结果分析 |
| 6.3.1 YY1 在乳腺癌中高表达 |
| 6.3.2 升高 YY1 表达能够促进乳腺细胞迁移，侵润和存活能力 |
| 6.3.3 沉默 YY1 表达能够抑制乳腺癌瘤细胞迁移，侵袭和存活能力 |
| 6.3.4 改变 YY1 表达能够引起乳腺细胞表型变化 |
| 6.3.5 沉默 YY1 表达能够抑制乳腺癌细胞转移瘤生长 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、强力霉素抑制前列腺癌PC-3细胞的体外侵袭作用（论文参考文献）
- [1]ApoA-I和SLPI促进前列腺癌去势抵抗及其机制研究[D]. 王晶. 山东大学, 2021(11)
- [2]下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展[D]. 张慧. 华南理工大学, 2020(05)
- [3]线粒体靶向的雷公藤甲素衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究[D]. 宋慧娜. 山东大学, 2020(04)
- [4]Piperlongumine通过免疫原性死亡途径增强PD-1抑制剂在前列腺癌治疗中抗癌效果的研究[D]. 张亿达. 南昌大学, 2020(08)
- [5]RNA结合蛋白Musashi2稳定雄激素受体促进前列腺癌细胞增殖的作用及机制研究[D]. 赵婧. 上海交通大学, 2020(01)
- [6]NPRL2通过调控自噬参与去势抵抗前列腺癌对多西他赛耐药的机制研究[D]. 罗生军. 重庆医科大学, 2020(01)
- [7]氯硝柳胺及其衍生物在去势抵抗性前列腺癌中的作用及机制研究[D]. 张清富. 中国医科大学, 2020(01)
- [8]LncRNA LOC440040在前列腺癌中的表达及对前列腺癌细胞功能影响的研究[D]. 张成. 南京医科大学, 2017(05)
- [9]芪蓝胶囊基于VEGF抑制前列腺癌VM形成的机制研究[D]. 俞旭君. 成都中医药大学, 2016(05)
- [10]雷公藤甲素药物活性和YY1表达调控及在细胞病理转化中的作用研究[D]. 黄伟伟. 西北农林科技大学, 2012(11)