一、我国灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的新寄主植物（论文文献综述）
陈虎臣[1]（2021）在《人参灰葡萄孢BcSpd1基因的功能研究》文中研究说明人参（Panax ginseng）为五加科植物,被誉为"百草之王",是我国传统的名贵药材,具有极高的药用价值和经济价值。人参灰霉病是近年人参生产过程中经常遇到的一种真菌病害。人参灰葡萄孢能侵染人参的根部、茎部、叶、花和果实,具有发病迅速发病严重等特点,一旦发病往往造成较大的经济损失。在人参灰霉病的防治上微生物药剂通常受限于复杂的环境因素达不到理想中的效果,而化学药剂的使用往往伴随着环境污染、病菌抗药性增强及农药残留问题,现代农业生产上迫切需要新的病害防治策略防治人参灰霉病。锌簇蛋白做为真菌特有的一类蛋白,在调节真菌代谢、参与细胞逆境反应和抗药性等方面发挥着重要作用。BcSpd1（Botrytis cinerea suppression of plant defense gene 1）属于锌指蛋白家族,具有典型的锌簇特征,其在灰葡萄孢菌与寄主植物互作过程中上调表达,推测其可能参与灰葡萄孢与寄主植物互作过程。本文通过对BcSpd1基因分子遗传学研究,初步得到以下结果:1、对BcSpd1基因进行了克隆和生物信息学分析,发现BcSpd1基因全长1504 bp,含有三个外显子和两个内含子,其开放阅读框长1398 bp,编码465个氨基酸,具有锌指结构域,进化上具有保守性。2、在致病性上,ΔBcSpd1敲除突变体对人参、拟南芥、菜豆和番茄致病性均呈明显降低。3、在生长发育方面,与野生型B05.10相比ΔBcSpd1敲除突变体在PDA培养基上生长速率减缓,菌核无法形成。4、在形成侵染结构方面,相比较于野生型,敲除突变体孢子液与菌丝在疏水界面上侵染垫形成受阻,相同时间在侵染垫形成数量和发育上明显低于野生型。5、在形成次级代谢物的能力上,与野生型B05.10相比ΔBcSpd1敲除突变体黑色素形成增多,草酸形成降低。6、模拟逆境胁迫,敲除突变体对SDS、H2O2、CR和Na Cl的耐受性与野生型和回补体基本一致,表明BcSpd1基因基本不参与对氧化胁迫、渗透胁迫和控制细胞壁完整性三者的逆境响应。7、通过大肠杆菌表达获得BcSpd1蛋白并对其体外结合能力进行了分析。本研究结果表明,BcSpd1在进化上保守,与人参灰葡萄孢菌的生长、发育,侵染结构以及次级代谢产物形成密切相关,参与人参灰葡萄孢菌的致病性。
杨蕊[2]（2021）在《灰葡萄孢自然群体交配型鉴定及有性生殖引起的遗传变异分析》文中认为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）作为重要病原菌,寄主植物达1400多种,引起作物采前采后灰霉病,造成重大经济损失。灰葡萄孢属于异宗配合真菌,含有两种交配型,有性阶段形成子囊盘和子囊孢子。但是,在自然条件下,灰葡萄孢以无性繁殖为主,而有性繁殖则不常见。了解病原菌的生活史和繁殖方式对控制植物病害流行和危害具有重要意义。有性生殖产生遗传多样性,限制有害突变积累,有利于物种生存。灰葡萄孢群体变异较大,存在大量个体单倍型和营养体亲合群（vegetative compatibility groups,VCGs）,暗示其可能通过有性繁殖发生遗传重组,但缺乏直接的试验证据。目前对灰葡萄孢变异研究集中在无性繁殖变异方面,包括突变、基因水平转移等。对灰葡萄孢交配型（Mating type）基因功能的认识多集中于对有性生殖转录调节的影响,是否有其它功能（如生长发育、致病性及杀菌剂敏感性等）目前还不知晓。保护地栽培的作物（如草莓和番茄）处于适温高湿的环境中,适合灰葡萄孢发生。目前,对于保护地草莓和番茄灰葡萄孢群体有性繁殖潜力还不清楚。针对上述问题,本论文对保护地草莓和番茄灰葡萄孢群体交配型进行鉴定,对交配型基因MAT1-1-1基因功能进行研究,并分析了有性生殖对灰葡萄孢遗传变异的影响。取得研究结果如下:1.明确了湖北省保护地草莓和番茄等作物上的灰葡萄孢群体的交配型构成采用多重PCR方法对706株分离自湖北省保护地草莓和番茄上的B.cinerea菌株的交配型进行了鉴定。研究结果发现,MAT1-1和MAT1-2两种交配型的菌株共同存在于保护地灰葡萄孢群体中。湖北省草莓和番茄B.cinerea群体总体两种交配型的分布偏离1:1比例（χ2=13.60,P=0.0002,df=1）,MAT1-2型占据优势地位（56.9%）。另外,对湖北B.cinerea群体进一步分析发现,草莓群体和番茄群体两种交配型的分布存在显着差异,草莓群体交配型分布符合1:1比例（χ2=0.01,P=0.9151,df=1）,而番茄群体分布则不符合1:1比例（χ2=26.03,P<0.0001,df=1）;不同地区间,两种交配型分布比例也存在显着差异,在源于湖北12个市（县）的12个灰葡萄孢亚群体中,7个亚群体交配型分布符合1:1比例,5个亚群体（荆门亚群体、荆州亚群体、仙桃亚群体、孝感亚群体和宜昌亚群体）交配型分布比例偏离1:1。这些结果表明,保护地草莓和番茄灰葡萄孢部分群体可能存在有性生殖。2.明确了交配型基因BcMAT1-1-1在子囊盘产生中的作用以灰葡萄孢野生型菌株B05.10为基础,采用同源重组技术,敲除交配型基因BcMAT1-1-1,获得BcMAT1-1-1缺失突变体菌株,并从有性发育、生物学特性、致病力以及药剂敏感性等方面对BcMAT1-1-1基因功能进行分析。结果表明:ΔBcMAT1-1-1突变体在菌落形态（菌丝、菌核、大型和小型分生孢子）、菌丝生长速度、大型分生孢子和菌核产生量、孢子萌发率以及致病力等方面与野生型菌株没有显着差异。但是,BcMAT1-1-1对于灰葡萄孢有性生殖非常重要。以ΔBcMAT1-1-1菌株为母本（♀）或父本（♂）,所测试交配组合均不能产生子囊盘柄和子囊盘。3.明确了灰葡萄孢有性生殖对其遗传变异的影响以黑色菌核（black sclerotia,简称B）菌株HBtom544（MAT1-2,♀）和黄色菌核（Yellow sclerotia,简称Y）菌株HBstr494（MAT1-1,♂）的交配组合（BY组合）以及B菌株HBtom544（♀）和B菌株B05.10（MAT1-1,♂）的交配组合（BB组合）,在实验室条件下诱导子囊盘及子囊孢子产生。从BY组合中获得了57个单子囊孢子杂交后代,从BB组合中获得了32个单子囊孢子杂交后代。采用菌落形态观察（菌丝、大型分生孢子、菌核）,交配型基因检测,菌丝亲合群（mycelial compatibility group,MCG）测定,菌丝生长速度测定,致病力,以及药剂敏感性测定等方法,评估子囊孢子后代的变异。（1）灰葡萄孢有性生殖子代菌株,在菌核产生、颜色和菌落形态上表现出多样性。BB后代菌株均产生黑色菌核,而BY后代菌株中出现黑色和黄色2种类型的菌核。这些子代菌株菌落形态类型可分为8种（3种菌丝型,5种菌核型）。BB后代发现4种菌核型（S2～S5）,以S3亚型为主（46.9%）。BY后代发现3种菌丝型（M1、M3和M4）,菌丝型中以M1亚型居多（38.6%）;菌核型存在5种（S1～S5）,以S2亚型为主（26.3%）。（2）MAT1-1和MAT1-2两种交配类型在有性生殖子代群体中普遍存在,且分布比例符合1:1。在BY后代群体中（n=57）,MAT1-1交配类型有30株,MAT1-2型有27株,符合1:1比例（χ2=0.16,P=0.6911,df=1）;在BB后代群体中（n=32）,MAT1-1交配类型有15株和MAT1-2交配类型有17株,符合1:1比例（χ2=0.13,P=0.7237,df=1）。（3）有性生殖子代菌株在菌丝亲和群（MCG）上出现多样性分化。大多数菌株在菌丝接触时出现明显的拮抗作用,菌落接触区域出现深色色素沉积线或菌丝稀疏透明地带,表现出菌丝不亲和性。BB组合32个子代菌株分为12个菌丝亲合群(MCG 1BB～12BB),其中,优势亲和群为MCG 4BB,含6个菌株,其他菌丝亲和群则含有1～5个菌株,91.9%的菌株是不亲和的;BY组合57个子代菌株分为7个其它菌丝融合群(MCG1BY～7BY),其中,MCG 1BY、MCG 2BY和MCG 4BY分别含有16、15、和13个菌株,其他菌丝亲和群则含有1～5个菌株,79.8%的菌株是不亲和的。香农指数（H）和辛普森指数（D）多样性指数分析表明,BB组合后代（H=2.6630,D=0.8945）的多样性水平高于BY组合后代（H=1.6709,D=0.7842）。（4）有性生殖子代菌株在生长速率、致病力和药剂敏感性上表现出多样性。亲本菌株均为中等致病力菌株,而有性生殖后代菌株中出现了强、弱致病力菌株的分化,尤其在BY组合后代这种分化现象更加明显,弱致病力菌株出现的频率达到53.4%。所有亲本和单子囊孢子后代菌株对杀菌剂氟啶胺和咯菌腈都表现敏感性,但是菌株间敏感程度存在差异。对BY亲本和子代菌株的咯菌腈靶标基因Bos1氨基酸序列分析发现:父本菌株HBstr494存在P1186L和A1259T 2个点突变位,母本菌株HBtom544存在I926T和A1259T 2个突变位点,但子代菌株则出现了更多的突变位点,其中A1259T在亲本和子代菌株中均有发现。这些结果表明有性生殖对灰葡萄孢遗传变异具有重要作用。上述研究结果为认识保护地番茄和草莓上的灰葡萄孢群体结构、繁殖方式以及变异机制提供了线索。
高知枭[3]（2020）在《SsNSRV-1基因功能及其与核盘菌互作机制研究》文中研究指明核盘菌是一种典型的死体营养型植物病原真菌,在世界范围都有广泛分布,可侵染包括油菜、大豆、向日葵等重要经济作物在内的729种植物,造成严重的经济损失。真菌病毒是感染真菌的病毒,在核盘菌中广泛存在,其中一些真菌病毒会导致核盘菌致病力衰退,甚至丧失致病力,具有控制作物菌核病的潜力。实验室前期从弱毒菌株AH98中分离鉴定出与核盘菌致病力衰退相关的单股负链RNA病毒Sclerotinia sclerotiorum negative-stranded RNA virus 1（Ss NSRV-1）,研究表明该病毒基因组上线性分布有6个非重叠的ORF（ORF I-VI）,分别编码P1、P2（N蛋白）、P3、P4、P5（L蛋白）和P6蛋白,这些ORF的具体功能及其对核盘菌的影响并不清楚;同时,发现菌株AH98可能被多种病毒复合侵染,但并不明确这些病毒的分子特性。本研究以菌株AH98及前期获得的Ss NSRV-1基因ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF VI的核盘菌1980菌株超表达转化子为研究材料,通过高通量测序明确了菌株AH98携带的病毒种类及分子特性;基于生物信息学分析预测了Ss NSRV-1各个ORF的结构和功能;结合转录组和代谢组分析,揭示了Ss NSRV-1各个ORF对核盘菌的影响,初步探究了Ss NSRV-1导致核盘菌出现弱毒特性的分子机理,揭示了Ss NSRV-1与核盘菌互作的分子网络。取得的具体研究结果如下:通过高通量测序明确了菌株AH98中携带6种真菌病毒,包括2种-ss RNA病毒,即Ss NSRV-1与Ss NSRV-5X;4种+ss RNA病毒,分别命名为Bc HV1/AH98、Ss MV30/AH98、Ss MV7-A/AH98和Ss DFV2/AH98。Ss NSRV-5X全长为9993 nt,5’端没有帽子结构,3’端也没有poly A序列,5’-UTR为420 nt,3’-UTR为168 nt。预测编码4个不重叠的ORF（ORF I-ORF VI）,在基因组上线性排列。其中,ORF III最大（nt 2672-8553）,编码的L蛋白含有1952个氨基酸（AA）,含有Mononegaviruses中非常保守的Mononeg＿m RNA＿pol及Mononeg＿m RNAcap结构域。序列分析和系统发育分析表明Ss NSRV-5X属于Mymonaviridae科病毒,但序列特征又与该科现有的病毒有所差异,其L蛋白与Ss NSRV-1的相比,一致性只有17.96%,属于真菌单股负义链RNA病毒科中的一个新的成员,它与另外一种还未报道的病毒（Bc NSRV-7）可能代表一个新的属。Bc HV1/AH98长度为10223 bp,编码的Rd Rp与Bc HV1（Nc＿037659.1）的Rd Rp序列（QBA69887.1）Query Cover达到100%,一致性高达98.82%。系统发育分析表明Bc HV1/AH98应当归类为Hypoviridae科Betahypovirus属,与已报道的Bc HV1（NC＿037659.1）属于同一种病毒的不同株系。实验室前期研究中,发现ORF I、ORF II和ORF III超表达转化子转录的m RNA均发生了不同程度的剪切;而超表达ORF IV和ORF VI的转化子中,病毒基因正常表达,不被剪切。本研究采用宏转录组测序分析进一步确认了这种现象,并发现剪切的起始位点富含GT（GC）,终止位点富含AG,属于真核生物内含子剪切位点的特征序列。而且发现ORF III在禾谷镰孢菌和稻瘟菌中超表达,其转录产物也可以被被剪切;表明真菌可以特异性识别病毒的某些基因,而且这种识别和剪切在真菌中可能普遍存在,可能是一种抗病毒机制。另外,ORF II在AH98和超表达转化子中均具有两个符合正态分布的转录峰,但是与前期检测到N蛋白的两种形式（P41和P43）并不对应,表明ORF II可能还编码其他蛋白。利用生物信息学软件分析了Ss NSRV-1中5个ORF所编码蛋白的保守结构域、亚细胞定位、结构特征及其可能的互作位点;并利用转录组测序技术对病毒5个ORF超表达转化子的总RNA分别进行了宏转录组测序,初步分析了病毒各ORF对核盘菌的影响,并根据这些结果推测病毒基因在Ss NSRV-1与核盘菌互作过程中的功能,推定出Ss NSRV-1导致核盘菌出现弱毒特性的分子机理。发现病毒ORF I编码的蛋白P1具有负链病毒N蛋白的结构特征,与核蛋白同源的可能性高达82.52%,参与Ss NSRV-1病毒粒子的形成,起转录调控的作用。ORF I的超量表达影响了寄主部分与致病、转录、跨膜运输、蛋白质生物合成及修饰、代谢过程等相关基因的表达,导致转化子的生长速度和致病力降低。病毒ORF II编码Ss NSRV-1的N蛋白,主要影响了核糖体和细胞核相关基因的表达,调控了寄主与致病、转录、跨膜运输、代谢过程等相关基因的表达,可能使转化子的生长速度和致病力降低。病毒ORF III编码的P3蛋白在结构上与负链病毒糖蛋白具有一定的同源性,可能具有肽链内切酶的活性,主要影响了核盘菌核糖体、蛋白酶体及DNA复制和修复相关基因的表达,并调控了蛋白质的翻译和代谢过程。病毒ORF IV编码的P4蛋白在寄主体内起转录调控的作用,主要影响了核盘菌与转录调控、氧化还原、跨膜运输、代谢过程等相关基因的表达,通过调控线粒体、r RNA及核糖体相关基因严重影响了能量和代谢过程,可能通过这些方式使得ORF IV超表达转化子表现衰退特性。ORF VI编码的P6蛋白可能是核孔蛋白复合物,参与核质转运过程,同时还可能作为转录调控因子发挥重要的作用。ORF VI的超量表达主要影响了核盘菌与转录调控、跨膜运输、代谢过程等相关的基因的表达,可以部分调控核盘菌与r RNA相关及核糖体相关的基因,严重影响了碳水化合物和核苷酸代谢过程。本研究通过代谢组分析了Ss NSRV-1的ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF VI在核盘菌1980中超表达后核盘菌产生的差异代谢物,并初步鉴定了病毒各ORF导致核盘菌变化最显着的物质,分析了这些物质可能参与的途径。结果表明ORF I、ORF II和ORF III的表达（在核盘菌中超表达后被剪切）对核盘菌代谢影响较大,产生的差异代谢物有较大的相似性,超表达后核盘菌的标志代谢物为酮类物质（显着下调）和酰胺类物质（显着上调）;ORF IV和ORF VI对核盘菌代谢影响影响相对较少,ORF IV超表达后核盘菌的标志代谢物为酰胺类和磷脂类物质（显着下调）,ORF VI超表达后核盘菌的标志代谢物为磷脂类物质（显着上调）。病毒的ORF I、ORF II和ORF III超表达后核盘菌中共有差异代谢物有253个,主要参与苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、核黄素代谢、磷酸戊糖途径、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、类固醇生物合成和色氨酸代谢等途径。病毒的ORF IV超表达后有76个差异代谢物,参与甾醇类物质生物合成,半胱氨酸生物合成/同型半胱氨酸降解（反式硫化）等途径。病毒ORF VI超表达后核盘菌有50个差异代谢物,参与多巴胺降解、生物素羧基载体蛋白组装、脂肪酸生物合成起始、尿嘧啶降解和棕榈酸生物合成等通路。本研究发现菌株AH98中除感染Ss NSRV-1之外,还感染了5种病毒,其中Ss NSRV-5X可能代表真菌单股负链RNA病毒科一个新的属;发现在转病毒基因转化子中核盘菌利用内含子剪切机制对病毒基因的m RNA进行剪切,预示真菌中存在一种未知的抗病毒机制。同时,利用生物信息学分析预测了Ss NSRV-1各个ORF的结构和功能,并结合转录组和代谢组分析从整体水平解析了Ss NSRV-1导致核盘菌弱毒的机制。上述结果为研究负链RNA病毒多样性,单股负义链RNA病毒与寄主互作及菌核病控制提供了新的思路和材料。
穆凡[4]（2020）在《澳大利亚核盘菌病毒多样性及低毒菌株SX276中RNA病毒分子特性研究》文中研究说明核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种世界性的死体营养型植物病原真菌,可侵染700多种植物,每年造成严重的经济损失。真菌病毒是一类在真菌中复制和增殖的病毒,在核盘菌中普遍存在。部分真菌病毒侵染可以引致核盘菌致病力衰退,具有绿色防控菌核病的潜力。探究核盘菌群体及单个菌株中真菌病毒多样性,发现、鉴定新病毒,不仅为菌核病防控提供生防资源,也为丰富病毒圈进化的证据提供生物材料。本论文分析了来自澳大利亚的核盘菌中真菌病毒种类及多样性,并对低毒菌株SX276中携带的9种真菌病毒进行分子特性及其对核盘菌影响进行了探究。主要研究结果如下:以来自于澳大利亚16种作物上的84株核盘菌菌株为材料,首次对澳大利亚的核盘菌中病毒多样性进行了分析。生物学特性分析发现84株菌株间在菌落形态和致病力等方面均呈现出明显的分化,其中11株菌株表现出低毒特性。采用宏病毒组测序技术分析核盘菌菌株中的病毒种类。在84株核盘菌中,共测序获得285条与病毒相关contig,代表57种不同真菌病毒的基因组部分序列。基于基因组核酸类型划分,75%为正单链RNA（+ss RNA）病毒,14%为双链RNA（ds RNA）病毒,9%为单股负义链RNA（-ss RNA）病毒,及一个DNA病毒。在+ss RNA真菌病毒中,共发现了25种线粒体病毒,占58%。57种病毒隶属于13个不同的病毒科或属中,包括双分病毒科（4%）、减病毒科（5%）、内源病毒科（11%）、线粒体病毒科（44%）、灰葡萄孢欧尔密病毒科（4%）、芜菁花叶病毒科（7%）、丁型线性病毒科（2%）真菌单股负义链RNA病毒科（14%）、全病毒科（2%）、番茄丛矮病毒科（4%）、真菌多聚病毒科（2%）、葡萄孢双节段病毒属（2%）及真菌DNA病毒科（2%）。基于多重比对及遗传进化分析,57种真菌病毒中有60%（34/57）的新病毒。该发现丰富了现有的病毒资源库,增加了我们对病毒多样性,生态学和进化的整体认知。核盘菌菌株SX276是被9种真菌病毒复合侵染的低毒力菌株。菌株SX276菌落形态异常,产生少而小的菌核,菌丝尖端明显弯曲且分枝增多,对油菜致病力弱,是一株典型的低毒菌株。宏转录组测序的技术及数据组装分析,确定菌株SX276携带有9种不同的真菌病毒,包括7种+ss RNA病毒,1种-ss RNA病毒和1种ds RNA病毒。采用RACE等策略,获得了9种真菌病毒的全长基因组序列。基于基因组序列分析,8种真菌病毒隶属于6个病毒科（减病毒科、内源RNA病毒科、芜菁花叶病毒科、丁型线性病毒科、灰葡萄孢欧尔密病毒科、弹状病毒科）、1个病毒属（灰葡萄孢双节段病毒属）及1种分类地位未确定的病毒,表明菌株SX276中真菌病毒种类复杂。核盘菌丁型线性病毒3（Sclerotinia sclerotiorum deltaflexivirus 3,Ss DFV3）为丁型线性病毒科的一个新成员,但与已发现的芜菁花叶病毒目病毒在基因组结构上显着不同,Ss DFV3基因组有三个RNA组分,编码两个隶属于同一超家族的解旋酶基因,且位于Ss DFV3不同RNA组分上,是首次发现的多节段丁型线性病毒。核盘菌真菌阿尔法病毒1（Sclerotinia sclerotiorum mycoalphavirus virus 1,Ss MAV1）是一个未分类的+ss RNA病毒,其基因组仅有一条RNA片段;虽然在真菌中发现了与Ss MAV1亲缘关系较近的真菌病毒,但显着区别于已知病毒,Ss MAV1基因组编码两个解旋酶结构域,推测该病毒在进化过程中发生了解旋酶基因加倍事件。通过病毒粒子和核酸转染方法分析菌株SX276中欧尔密病毒、灰葡萄孢双节段病毒及减病毒对核盘菌的影响。SX276中两种核盘菌欧尔密病毒的ds RNA或/和ss RNA具有侵染能力,但不影响核盘菌基本生物学表型,灰葡萄孢双节段病毒是潜伏侵染,而减病毒与核盘菌低毒相关。真菌中首次发现弹状病毒。核盘菌弹状病毒1（Sclerotinia sclerotiorum rhabdovirus 1,Ss Rh V1）基因组全长含11356 nt,其5?末端与3?末端反向互补。Ss Rh V1基因组（3?-5?）有5个开放阅读框（ORFⅠ-Ⅴ）,推定编码5个蛋白。通过与已知弹状病毒多重比对分析,推定ORFⅠ、ORFⅣ和ORFⅤ分别编码核衣壳蛋白（N）、糖蛋白（G）和复制酶相关蛋白（L）,ORFⅡ与ORFⅢ在NCBI数据库中未比对到任何保守的信息,编码未知功能的假定蛋白。Ss Rh V1基因组中有保守的转录起始信号及转录终止信号,但是未发现保守的转录间隔区。Ss Rh V1的L蛋白与水泡病毒属中皮理病毒（Piry virus）有35%的一致性,N和G蛋白也与其他弹状病毒有较低同源性（最高一致性为29%和25%）。系统进化分析表明Ss Rh V1与已知的20个弹状病毒属未聚在一起,而是单独成一个进化分支,表明Ss Rh V1为弹状病毒科的一个新的成员。Ss Rh V1寄主是真菌,且其与已知弹状病毒同源性低,以及基因组结构等特性,建议以Ss Rh V1为模式种,成立一个新的属:核盘菌弹状病毒属（Sclerorhabdovirus）。Ss Rh V1会削弱核盘菌的生长速度,但不影响核盘菌的致病力。核盘菌内源RNA病毒3（Sclerotinia sclerotiorum endornavirus 3,Ss EV3）与核盘菌低毒力相关,是菌株SX276的低毒因子。Ss EV3基因组全长为12631 nt,编码一个多聚蛋白,包含甲基转移酶（Mtr）、解旋酶（Hel）、依赖RNA的RNA聚合酶（Rd Rp）及S7保守结构域。系统发育分析表明Ss EV3与乙型内源RNA病毒属的成员聚为一进化簇,为该属的一个新成员。通过原生质体脱除真菌病毒以及真菌病毒水平传播研究,发现Ss EV3与核盘菌低毒紧密相关,是菌株SX276的主要低毒因子。Ss EV3的侵染引起核盘菌生长速度减慢,菌落形态异常,产菌核能力下降且致病力降低,呈现低毒特性;也能导致菌株抵抗不良非生物环境,包括高盐、高糖及高渗的能力变弱;产酸性物质能力下降,且不能降解酸性物质,在植物表面不能形成侵染垫。本研究对分离自澳大利亚的核盘菌群体及单个低毒菌株的病毒多样性进行研究,发现、鉴定了41种新的真菌病毒,首次在真菌中发现弹状病毒和多节段丁型线性病毒,并明确了内源RNA病毒是菌株SX276的主要的低毒因子,不仅丰富了真菌病毒的种类,为植物病害的生物防治提供了潜在的真菌病毒资源,也为研究病毒进化、生态学提供丰富的生物材料。
薛龙海[5]（2020）在《多花黑麦草种带真菌及病害多样性的研究》文中研究表明多花黑麦草（Lolium multiflorum）是一种高产优质牧草,在我国西南地区广泛种植。病害是限制多花黑麦草生产和利用的主要因素之一,而我国对其病害尚缺乏系统性研究。本研究于2015年2019年,通过对四川省多花黑麦草不同生育期的病害调查和36个品种的种带真菌及其致病性的研究,获得以下主要结果:1.系统研究了多花黑麦草的真菌病害。发现新病害5个,分别为:链格孢叶斑病（Alternaria alternata）、灰霉病（Botrytis cinerea）、诺博核腔菌叶斑病（Pyrenophora nobleae）、稻梨孢叶斑病（Pyricularia oryzae）和菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）。2.明确了多花黑麦草灰霉病的发病规律、发病条件及品种抗性。灰霉病发病高峰期为1月至2月;低温（15-20℃）高湿条件下,灰霉病扩散迅速,对多花黑麦草具有潜在的威胁。发现灰葡萄孢的最适生长温度为20–25℃,最适培养基为PDA,最佳C源为D-半乳糖,最佳N源为D-亮氨酸;黑暗条件下显着促进菌丝的生长（P<0.05）;10min水浴条件下的菌丝致死温度为47℃。发现阿伯德和冬青两个品种对灰霉病抗性较强。3.明确了多花黑麦草核腔菌叶斑病的发病规律。发病高峰期一般为4月至5月,个别年份发病率高达100%。典型病症呈棕色叶斑,带一圈黄色光晕,或棕色至暗棕色、网斑状病斑。明确了核腔菌叶斑病的主要致病菌为网斑核腔菌（P.dictyoides）,其次为诺博核腔菌。4.明确了多花黑麦草的种带真菌区系。从36个多花黑麦草品种的种子上共计获得921株真菌;其中曲霉属（Aspergillis）真菌534株,占所有分离菌株的58%,是最常见的种带真菌,其次分别为毛壳属（Chaetomium）及形态相似属真菌（12.7%）和核腔菌属（Pyrenophora）真菌（12.3%）。根据相关多基因序列特征和形态学特征,鉴定出种带真菌14属33种,其中25种为首次发现,分别为:疣孢漆斑菌（Albifimbria verrucaria）、鸭茅链格孢（Alternaria dactylidicola）、Aspergillis hiratsukae、赭曲霉（As.ochraceus）、As.Protuberus、假灰绿曲霉（As.pseudoglaucus）、赤曲霉（As.ruber）、聚多曲霉（As.sydowii）、金色毛壳（Arcopilus aureus）、螺卷毛壳（Chaetomium cochliodes）、高大毛壳（Ch.elatum）、Ch.rectangulare、近缘毛壳（Ch.subaffine）、旋丝毛壳（Collariella bostrychodes）、Co.carteri、直立毛壳（Dichotomopilus erectus）、印度毛壳（Di.indicus）、Di.pratensis、Di.variostiolatus、Fusarium torulosum、盾壳霉（Paraphaeosphaeria minitans）、燕麦生核腔菌（Pyrenophora avenicola）、三隔核腔菌（P.triseptata）、P.tritici-repentis和篮状菌（Talaromyces ucrainicus）。5.明确了种带真菌对种子萌发和幼苗生长的影响。发现疣孢漆斑菌、麦根腐平脐蠕孢（Bipolaris sorokiniana）、灰葡萄孢、Ch.rectangulare、Fusarium torulosum、燕麦生核腔菌、燕麦核腔菌、网斑核腔菌、黑麦草核腔菌、圆核腔菌和三隔核腔菌对种子的萌发有抑制作用,为种带致病真菌;与对照相比,种子的发芽率分别降低了100%、14%、9%、12.8%、20.2%、8.6%、8.6%、15.8%、23.3%、18.3%、和8.9%,发芽指数分别降低了100%、14.3%、13.1%、20%、29.8%、20.2%、11.8%、22.8%、22.5%、19.1%、和12.4%。
王明阳[6]（2020）在《人参灰霉病菌BcGP基因的功能研究》文中指出人参（Panax ginseng C.A.Meyer）是我国传统的名贵中草药,为五加科多年生草本药用植物,具有非常高的药用价值和经济价值。东北是人参的重要产区,灰葡萄孢可以侵染人参叶片、叶柄、花和果实,严重时还会侵染人参的茎和根。目前,人参灰霉病已经成为影响人参产业持续健康发展的主要危害之一。BcGP基因编码谷氨酰胺转移酶,谷氨酰胺转移酶在自然界分布广泛,目前该酶主要来源是微生物,主要应用在食品工业用于改善食品蛋白质结构,也有报道该酶与人类疾病相关（包括肿瘤、自身免疫疾病、皮肤病、神经退行疾病等）,但目前未见有关该酶在灰葡萄孢致病过程中的作用的报道。本论文通过对BcGP基因研究,得到了如下结果:1、对BcGP基因进行了克隆和生物信息学分析,发现BcGP基因全长781 bp,含有三个外显子和两个内含子,其开放阅读框长681bp,编码226个氨基酸,有5个结构域,在进化上具有保守性。2、通过农杆菌介导的遗传转化的方法得到了BcGP基因的敲除突变体ΔBcGP和回补转化子ΔBcGP/GP,并通过相应的抗性筛选、PCR验证和qRT-PCR检测验证了敲除子和互补子。3、ΔBcGP的菌落生长速度略快于灰葡萄孢野生型B05.10的生长速度,对盐胁迫敏感,对刚果红和十二烷基硫酸钠不敏感,对H2O2的耐受性更强。4、与B05.10相比,ΔBcGP对人参、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和菜豆（Phaseolus vulgaris）等植物叶片的致病力增强,表明BcGP基因对B05.10的致病性具有负调控作用。
张洪祥[7]（2020）在《SsHADV-1介导的核盘菌内生特性及应用研究》文中研究说明核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种寄主范围十分广泛的病原真菌,由其引起的菌核病是包括油菜在内的许多重要作物上的毁灭性的病害。核盘菌在侵染初期分泌小分子蛋白、草酸、细胞壁降解酶类杀死寄主细胞、抑制寄主的抗性,并从死亡的细胞中吸取营养,是典型的死体营养型真菌。目前尚未在油菜中发现高效的抗病品种,油菜菌核病始于子囊孢子在花瓣上侵染,并随罹病花瓣飘落至枝条和主茎,感染和杀死枝条或整个植株。由于田间油菜植株密、冠层厚,药剂难以抵达病菌为害部位,防治非常困难。核盘菌低毒相关DNA病毒1（Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1,Ss HADV-1）是首例在真菌中发现的DNA病毒,该病毒侵染性强,病毒粒子可直接侵染核盘菌,也可以在不同的营养体亲和型菌株间进行传播,而且发现有昆虫传播介体,是极具生物防治潜力的真菌病毒。前期研究发现在盛花期喷施携带Ss HADV-1的核盘菌菌丝片段可以高效控制菌核病并显着提高油菜产量,但是携带Ss HADV-1的核盘菌能否在油菜上生长并不清楚;同时,携带低毒相关病毒的菌株能否在植物上长期存活是利用真菌病毒控制病害的关键。因此,本文主要研究携带Ss HADV-1的核盘菌在油菜上的生存和生长及其机制、研究携带病毒的核盘菌对油菜生长发育的影响及其机制,以及基于本研究的新发现建立的应用Ss HADV-1控制油菜菌核病的新技术。取得的主要结果如下。1.携带Ss HADV-1的核盘菌菌株DT-8可以在油菜上内生性生长,并在核盘菌群体中传播病毒。在油菜抽薹期喷施DT-8的菌丝片段,7周之后,在油菜成熟期的果荚上可以检测到病毒的DNA。为了确认携带核盘菌的菌株可以在油菜内或者表面生长,将菌株DT-8菌丝块接种到油菜叶片上,一周后未产生任何病斑,取距DT-8菌丝块约1cm位置的油菜叶片组织进行共聚焦荧光观察,发现菌株DT-8可以在油菜叶片表面蔓延生长,同时形成简易侵染垫的结构侵入油菜组织中吸取营养物质。表面消毒的油菜种子经菌株DT-8的菌丝悬浮液浸泡处理后,于MS平板上萌发,之后分别移至含有MS培养基的组织培养瓶和无菌培养土中,培养20 d和30 d。PCR检测证实在油菜的根、下胚轴和叶等部位均可检测到Ss HADV-1的DNA和核盘菌的DNA,表明菌株DT-8可以在油菜上生长。利用菌株DT-8RFP（m Cherry荧光蛋白标记的菌株DT-8）处理油菜,通过共聚焦荧光观察和电镜观察,进一步发现菌株DT-8可以在油菜根部细胞间穿梭和通过根部细胞间隙在组织中蔓延;同时,在下胚轴维管束中可观察到DT-8菌丝随维管束方向蔓延。在叶面上接种菌株DT-8RFP也可以观察到标记的菌丝。这些结果表明,菌株DT-8可以在油菜植株中内生生长。经在MS组织培养瓶中培养6个月后,部分油菜植株开始死亡（8/32和6/23）,同时在其上可以观察到菌丝的生长。挑取菌丝进行培养,发现菌株为核盘菌,分别在8和6个培养物中有3和4个菌落携带病毒。但在健康的植株上及穴盆栽培的植株上均未分离出核盘菌。在经过菌株DT-8处理的油菜上接种核盘菌菌株1980-hyg,14天后自病斑上重新分离获得13株分离物中5株分离物中携带Ss HADV-1,且表现出生长速度减弱、致病力降低、菌落形态异常等弱毒相关特性。在田间不同时期喷施菌株DT-8菌丝悬液后,采集和分离的菌株中,有15%携带有DNA病毒。2.Ss HADV-1显着改变核盘菌致病相关基因的表达。为了解析菌株DT-8在感染Ss HADV-1的情况下由死体营养型病原真菌转变为内生真菌的机理,通过转录组测序技术,对菌株DT-8在PDA培养基上和接种在油菜叶片上与DT-8VF菌株的基因表达差异进行了分析。对显着差异基因（DEGs）进行KEGG富集和Fungi Fun功能富集分析,发现两种培养方式的菌株DT-8中上调表达的DEGs均主要富集在DNA的错配修复和重组相关通路中,这些通路相关基因的变化与病毒的复制有关;下调表达的DEGs均集中在代谢相关的通路中。对接种在油菜叶片上的菌株DT-8相比于DT-8VF菌株三个时期（12hpi、18hpi和24hpi）的DEGs进行详细分析,发现细胞壁降解酶类和小分泌蛋白等致病相关基因显着下调表达,同时侵染垫的形成和草酸合成等侵入相关基因正常表达。这表明Ss HADV-1对核盘菌的侵染能力没有显着的影响,但削弱了其对寄主植物的危害,可能是菌株DT-8成功入侵到油菜植株中营内生生长的原因。3.菌株DT-8促进油菜生长并显着提高油菜的抗病力。将表面消毒的油菜种经菌株DT-8的菌丝悬浮液浸泡处理后,MS平板上萌发,移植到培养土中培养36 d,地上部分鲜重为17.15±2.0 g/株,显着高于未处理的对照植株（14.55±1.1 g/株）;同时,在无菌组培瓶中MS培养基上培养的油菜植株,也获得了相似的促生结果。表明,菌株DT-8内生生长可以促进油菜植株的生长。在培养土中培养36 d的油菜叶片上,活体接种核盘菌1980菌丝块,菌株DT-8处理油菜植株上,病斑直径（1.22±0.08 cm）显着低于未接种的对照植株（1.51±0.12 cm）;同时,对油菜叶片上活体接种灰葡萄孢菌株B0510,菌株DT-8接种的油菜植株上的病斑（1.54±0.24 cm）显着小于未接种的对照植株（1.99±0.10 cm）。这表明菌株DT-8内生生长可以促进油菜生长,并且可以提高由此植株对核盘菌和灰葡萄孢的抗性。4.菌株DT-8改变油菜抗病及生长相关途径基因的表达。为了探究菌株DT-8内生影响油菜生长发育和抗病性的分子机理,取菌株DT-8处理的油菜植株茎尖生长点部位进行转录组分析,发现菌株DT-8对油菜植株基因表达的影响幅度较小,与对照植株相比,显着差异表达的基因总共只有348个,约占已知总基因数（101041）的3.4‰,其中显着上调表达的基因有258个,显着下调表达的基因有90个。上调表达的基因大部分与抗病相关,包括植物病原信号和抗性信号传导相关基因（CDPK、CML、WRKY33和MKK9）、茉莉酸和乙烯合成及其调控的抗性相关基因（AOC、ACS和ERF等）。下调表达的基因主要是以CCA1和LHK为主效基因的节律调节相关基因,该途径节律调节相关基因的下调表达可能与油菜植株生物产量的提高有关。表明油菜植株抗性的提高是可能通过菌株DT-8诱导抗性相关表达实现的,而生物产量的提高可能是通过抑制节律调节相关基因的下调表达实现的。5.田间喷施菌株DT-8可以显着提高油菜产量。根据菌株DT-8可以在油菜中内生并且可以在油菜表面长期生长的这一特性,将菌株DT-8的菌丝液喷施到油菜植株上进行油菜菌核病的田间防治试验。2013年-2015年,我们在湖北省武汉、鄂州、随州和襄阳等地分别进行DT-8菌丝液防治油菜菌核病的小区试验和大田试验。在小区试验中分别在苗期、抽薹期、盛花期、角果期,采取两种浓度（～1×105 cfu/m L和～1×104cfu/m L）的菌丝液进行喷施;大田试验油菜盛花期进行DT-8菌丝液的喷施（～1×104 cfu/m L）。连续3年各地在小区试验和大田试验中,DT-8菌丝液处理显着降低油菜菌核病的病情指数防控率高达50%左右,产量提高10%-20%,使油菜籽的含油量显着上升高达3.8%。6.灰葡萄孢中发现的新型DNA真菌病毒BcHADV-1,与灰葡萄孢的弱毒相关。Bc HADV-1具有一个34 nm等轴对称的病毒粒子,其基因组有四个1700 nt左右的单链环状的DNA组成。这四个基因组分共有有一个300 nt的共同区域（common region）、特殊的茎环结构和独特的nonanucleotide序列"TAAAATTTT"。进化分析显示在葡萄孢属真菌进行种间分化之前,Bc HADV-1-like病毒便于与葡萄孢属菌株之间存在基因水平转移。Bc HADV-1的Rep与Fg GMTV1具有一定的亲缘关系,而Bc HADV-1的CP基因与其他病毒的CP均没有亲缘关系。因此,Bc HADV-1可能代表着与Genomoviridae亲缘关系比较近的新的CRESS DNA病毒。同时,Bc HADV-1与灰葡萄孢的弱毒相关。本研究首次发现核盘菌可以在油菜植株中内生的生物现象,证明菌株DT-8的内生可以促进油菜植株的生长、增强油菜植株的抗病性。田间试验表明,感染低毒相关病毒的病原真菌可以作为植物疫苗保护植物,显着提高植物产量。本研究揭示了感染真菌病毒后,病原真菌的生活方式发生改变的现象,为利用真菌病毒控制作物病害研究提供新思路。同时,菌株DT-8的内生对Ss HADV-1传播的促进作用,揭示了Ss HADV-1传播的新途径,并为真菌弱毒相关病毒传播方式的探索提供了新的方向。为真菌病毒、病原真菌和寄主植株三者之间相互作用关系的研究提供了研究模型。同时,灰葡萄孢中DNA病毒Bc HADV-1的发现预示着这种新型生物防治模式在灰霉病的防治中可能同样适用。Genomoviridae中可能具有丰富的真菌弱毒相关病毒资源,等待人们去开发用于真菌植物病害的生物防治。
刘红斌[8]（2020）在《细胞自噬在松材线虫侵染寄主过程中的作用》文中提出松树萎蔫病（Pine Wilt Disease,PWD）又称松材线虫病,是一种毁灭性森林病害,在东亚和欧洲部分地区发生为害严重。近年该病在我国的疫情不断扩展蔓延,已经造成了巨大的经济损失和生态威胁,其病原松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）被我国评定为一级危险性林业有害生物。由于松材线虫病的发生发展过程复杂,其致病机理仍未明确,防治十分困难。阐明松材线虫如何克服环境变化和松树防御反应而成功侵染定殖于树体的分子机制对有效防控松材线虫病具有十分重要的意义。细胞自噬是真核生物为应对环境应激而进化出的一种由一系列自噬基因调控的保护性机制,其通过降解胞内组分以维持生理平衡和内环境稳态,在生物体的生长发育、免疫防御等生理和病理过程中都具有重要的作用。然而目前关于病原松材线虫细胞自噬的研究甚少。为此本文对细胞自噬在松材线虫侵染寄主和适应环境变化过程中的作用进行了探讨,以期促进对松材线虫致病机制和生态适应机理的阐明。主要研究结果如下:1.通过蛋白质免疫印迹分析比较自噬标志蛋白BxATG8-II与BxATG8-I表达量的变化,建立了定量检测松材线虫细胞自噬活性的方法。检测自噬活性是研究自噬的基础。本研究首先通过同源重组构建松材线虫自噬标志蛋白BxATG8的原核表达载体pET-28a（+）-BxATG8,将其转入表达感受态细胞异源表达该蛋白,大量诱导表达后通过Ni-NTA agarose纯化得到重组蛋白BxATG8;使用该蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,纯化浓缩后得到BxATG8多克隆抗体,通过间接ELISA检测其效价高达1:512,000,Western blot分析证明该抗体能够同时识别松材线虫自噬标志蛋白BxATG8两种形式的蛋白:BxATG8-I和BxATG8-II。使用自噬抑制剂3-Methyladenine（3-Ma）处理松材线虫后,检测线虫的自噬活性即蛋白表达量比值BxATG8-II/BxATG8-I的大小,发现自噬抑制剂3-Ma确实显着降低了松材线虫的自噬活性,表明定量检测松材线虫自噬活性的方法成功建立,为进一步的研究提供了科学手段与技术支持。2.通过PCR克隆得到松材线虫中3个新的自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16,对其编码蛋白的系统进化与结构进行了生物信息学分析。研究发现,松材线虫这3个自噬蛋白与已知的其他物种中的这3个蛋白有一定的相似度,但亲缘关系都较远;这3个蛋白均偏酸性,且都是亲水性蛋白,其中BxATG5和BxATG16无信号肽,BxATG9存在信号肽且含有5个跨膜区,属于典型的跨膜蛋白;对这3个蛋白的三级结构模型进行了预测,结果显示其中的BxATG16蛋白不存在空间折叠,推测可能与其特定的功能相关。3.通过RNA干扰对松材线虫自噬基因BxATG9和BxATG16的功能进行了验证分析。研究发现,自噬基因BxATG16正向调控BxATG5的转录表达;高效沉默BxATG9和BxATG16后,对松材线虫的细胞自噬活性、虫体形态、运动能力、取食速度和繁殖量进行了测定,结果显示这两个自噬基因的沉默都能导致松材线虫的自噬活性明显降低;并且都显着抑制了松材线虫在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）上的取食速度和繁殖量,但不影响线虫的形态和运动能力。表明这两个基因在松材线虫的自噬过程中具有重要作用,并参与调控了线虫的取食繁殖过程。4.通过qRT-PCR检测了松材线虫在受到松树主要防御物质之一的α-蒎烯的胁迫和侵染寄主松树的过程中自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16的表达模式。结果显示,这3个自噬基因的相对表达水平都在松材线虫遭受α-蒎烯胁迫4 h时以及松材线虫侵染松树后其病程的整个发展过程中（发病前期、初期、后期和病树死亡）显着增强,表明自噬很可能在松材线虫的防御与致病过程中起着关键的作用。5.同源克隆得到黑松（Pinus thunbergii）中两个调控活性氧（Reactive oxygen species,ROS）合成的关键基因呼吸爆发氧化酶基因PtRBOH1和PtRBOH2的保守结构域,通过qRT-PCR分析了黑松中这两个基因在松材线虫侵染早期（0.5、1、2、3和4 d）的表达模式,并测定了接种点附近的松树茎干中ROS主要产物H2O2含量的变化。结果发现黑松ROS在基因和代谢水平都响应了松材线虫的侵染。同时对松材线虫侵染早期3个自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16的表达模式进行了检测,结果显示这3个基因上调表达的时间与受侵染松树中H2O2含量达到峰值的时间相同,且它们的表达水平随H2O2含量的显着下降而明显降低,表明侵染早期松材线虫自噬基因的表达与松树ROS代谢相关。接着通过qRT-PCR、透射电子显微镜的观察和Western blot定量分析,发现H2O2引起的氧化胁迫使松材线虫自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16的表达明显提高,使松材线虫细胞中自噬前体、自噬体、自噬溶酶体这些典型的自噬结构的数量增加,使松材线虫的自噬活性显着增强,表明氧化胁迫诱发了松材线虫的细胞自噬。6.通过自噬抑制剂3-Ma的应用和自噬基因BxATG9和BxATG16的沉默,双重验证了自噬在松材线虫抗氧化过程中的重要性。结果表明,在氧化胁迫下自噬不影响松材线虫的形态和运动能力,但对线虫的取食、繁殖、卵孵化和存活至关重要,自噬是松材线虫抗氧化过程中不可或缺的一个环节。同样通过上述两种方法,双重验证了自噬在松材线虫侵染寄主过程中的重要性。结果显示,抑制线虫的自噬显着降低了线虫在树体中的繁殖量,明显推迟了寄主松树的发病时间和死亡时间,严重阻碍了松材线虫病的发展。表明自噬影响着松材线虫的毒力,在线虫的致病过程中具有关键的作用。结合前面的结果,可以认为:当松材线虫的自噬被阻塞时,松树中ROS代谢产生的氧化胁迫环境会大幅度减少线虫的取食速度和繁殖量,并严重抑制其卵孵化和存活,从而导致树体内线虫数量显着降低,进而明显延缓了松树的萎蔫进程。7.使用自噬抑制剂3-Ma和沉默自噬基因BxATG9和BxATG16抑制了松材线虫的自噬后,对侵染黑松早期（1、2和3 d）线虫中过氧化物酶基因BxPrx与过氧化氢酶基因Bxy-ctl-1和Bxy-ctl-2的表达模式进行了检测,发现这3个抗氧化基因的表达水平都显着上调,尤其在第3 d,表明松材线虫在侵染早期很可能通过提高过氧化物酶和过氧化氢酶这两条抗氧化通路的水平来减少自噬受抑引起的氧化损伤。8.温度是影响松材线虫病发生发展主要的环境因子,探讨了温度对松材线虫的取食繁殖和运动能力的影响及线虫对温度变化的适应机制。研究发现松材线虫在灰葡萄孢上的取食速度、繁殖量和运动能力在15°C的低温条件下被严重抑制,而在35°C的高温条件下被显着提高。同时通过定量Western blot和qRT-PCR测定了线虫的自噬活性和自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16的相对表达水平,结果显示15°C低温诱发了松材线虫的细胞自噬,35°C高温下线虫的自噬水平较低。通过自噬抑制剂3-Ma抑制了松材线虫的自噬活性后,对15°C低温条件下线虫在灰葡萄孢上的取食繁殖和运动能力进行了测定,发现自噬的抑制显着降低了低温下松材线虫的取食速度、繁殖量和运动能力,表明自噬参与调控松材线虫在低温下的取食繁殖和运动过程,自噬在线虫抵御低温胁迫时至关重要。本文证实细胞自噬在松材线虫侵染寄主和响应温度变化的过程中具有重要的作用,自噬通过抵御寄主活性氧代谢产生的氧化胁迫促进了松材线虫的侵染,并且有助于线虫在低温下的取食、繁殖和运动。该研究有助于阐明松材线虫的防御与致病机理及适应环境变化的分子机制,并为松材线虫病的防控提供了可能的靶标和理论依据。
刘琨[9]（2020）在《人参灰霉病菌遗传多样性分析及抗药性研究》文中研究表明人参（Panax ginseng C.A.Meyer）为五加科人参属多年生草本植物,是我国传统名贵中药材。近年,灰霉病在东北人参产区为害逐年加重,已成为影响人参产业健康发展的重要因素之一。鉴于人参灰霉病普遍发生的严峻形势,本研究在对辽宁、吉林、黑龙江人参产区灰霉病菌分离鉴定基础上,开展了室内抗药性和致病力测定;结合ISSR分子标记技术,分析了不同地理来源人参灰葡萄孢的遗传差异。本研究基本摸清了我国人参产区灰葡萄孢对4种杀菌剂的抗药性情况,相对清晰地阐述了不同地域来源人参灰葡萄孢致病力差异及遗传分化,为人参灰霉病科学防控提供了参考依据。研究结果汇总如下:（1）从我国辽宁、吉林和黑龙江采集的人参灰霉病样品中共计分离到102株灰霉病菌;经菌落形态学及分子生物学鉴定,均为灰葡萄孢Botrytis cinerea。（2）灰葡萄孢群体的遗传多样性（Ht）均值为0.3395,地理分布种群内遗传多样性（Hs）均值为0.2937,地理分布种群间遗传多样性（Dst）均值为0.0458,地理分布种群间的差异不如地理分布种群内的差异明显;各群体间遗传分化系数（Gst）均值为0.1348,基因流（Nm）均值为3.2084,说明东北人参产区灰葡萄孢种群间遗传分化不明显,遗传变异主要来自种群内。聚类分析结果表明,供试灰葡萄孢遗传相似系数为0.38～0.99,阈值0.52时可将全部菌株分为4组;阈值0.65时可将供试菌株划分为13组（组A—组M）,除了 A组、D组、E组、F组和J组外,其余组仅含1个菌株。结果表明,灰葡萄孢的遗传聚类与地理来源无关。（3）根据人参叶片上病斑大小,将人参灰葡萄孢分为弱致病力、中等致病力和强致病力3个等级。其中,中等致病力菌株最多（77.45%）;其次是弱致病力菌株（16.67%）;强致病力菌株最少（5.88%）。致病力检测结果表明,人参灰葡萄孢存在明显的致病力分化。（4）采用最小浓度抑制法,选取人参生产上常用的4种灰霉病杀菌剂,对分离的102株人参灰葡萄孢进行抗药性检测。结果表明,灰葡萄孢对多菌灵（C）、嘧霉胺（P）、异菌脲（I）、咯菌腈（F）的抗药性频率分别为100%、86.27%、73.53%和30.39%,辽宁、吉林省的人参灰葡萄孢对嘧霉胺、异菌脲的抗药性高于三省平均水平。根据抗药性检测结果,最终将人参灰葡萄孢分为7种抗性类型,即CRPRIRFR、CRPRIRFs、CRPRISFR、CRPRISFS、CRPsIRFs、CRPSISFR 和 CRPsIsFs,其所占比例分别为 26.47%、39.22%、4.90%、14.71%、5.88%、0.98%和 7.84%,未发现对供试 4 种杀菌剂均表现敏感的人参灰葡萄孢。
任维超[10]（2019）在《灰葡萄孢细胞自噬的生物学功能及其调控咯菌腈敏感性的机制研究》文中提出由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是世界上发生和危害最严重的病害之一。该病原菌寄主范围广泛,可以侵染包括多种水果、蔬菜、花卉在内的500余种植物,给农业生产造成巨大的经济损失。目前,由于缺乏有效的抗病品种,灰霉病的田间防控主要以化学防治为主。然而,随着杀菌剂的长期大量使用,以及灰霉病菌自身所具有的寄主范围广、繁殖速度快、遗传变异频繁的特点,导致灰霉病的抗药性问题日益突出。咯菌腈（fludioxonil）属于苯基吡咯类化合物,是一种高效、低毒、广谱的新型杀菌剂,对灰霉病的防治有特效。咯菌腈的作用机制独特,与现有杀菌剂无交互抗性,国际上杀菌剂抗性行动委员会（FRAC）认为咯菌腈的作用机制是干扰渗透压调节信号途径相关的组氨酸激酶的活性,导致菌体自身的渗透压失衡,从而达到杀菌的效果,但是具体的作用机制还不清楚。目前,国外田间已经有病原菌对咯菌腈低等水平的抗药性报道。在我国,咯菌腈的使用尚处于早期阶段,然而,在2016年田间已经发现了灰霉病菌对咯菌腈高等水平的抗性菌株,尽管这些抗性菌株的生物适合度普遍都很低。细胞自噬（autophagy）是真核生物中进化保守的对细胞内的物质进行代谢循环的重要过程。该过程中一些老化的蛋白质或损坏的细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后,运送到溶酶体（动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。近年来的研究表明,细胞自噬不仅是细胞在饥饿状态下获取能量的一种应激反应,而且参与许多重要的生理生化过程,在生物体应对外界胁迫的过程中起重要的作用。细胞自噬在部分真菌中已经有所报道,但其生物学功能会根据寄生营养型的不同而有所差异。因此,研究细胞自噬在灰葡萄孢中的生物学功能,将为科学防治灰霉病和新型杀菌剂的开发提供理论基础。本文主要研究了细胞自噬调控灰葡萄孢对咯菌腈敏感性的机制,同时,报道了细胞自噬在灰葡萄孢生长发育和致病性中的生物学作用。主要获得的研究结果如下:（1）细胞自噬在灰葡萄孢对杀菌剂敏感性中的作用。通过靶向基因敲除技术,我们构建了灰葡萄孢细胞自噬途径关键基因的缺失突变体。显微观察和生理生化实验证明,灰葡萄孢细胞自噬途径关键基因的缺失导致其细胞自噬过程被阻断。药敏性实验测定了灰葡萄孢细胞自噬基因缺失突变体对防治灰霉病常规杀菌剂的敏感性,包括苯基吡咯类杀菌剂咯菌腈、二甲酰亚胺类杀菌剂异菌脲和腐霉利、琥珀酸脱氢酶抑制剂啶酰菌胺和吡啶胺类杀菌剂氟啶胺。结果发现,细胞自噬途径阻断导致灰葡萄孢菌体对咯菌腈、异菌脲和腐霉利的敏感性显着上升,但是对啶酰菌胺和氟啶胺的敏感性保持不变。以上结果表明,细胞自噬途径参与调控灰葡萄孢对咯菌腈、异菌脲和腐霉利的敏感性。（2）灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG1的生物学和药理学功能研究。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中,ATG1编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Atg1,当细胞处于饥饿状态时,Atg1与Atg13结合形成复合体从而诱导细胞自噬过程的发生,当细胞处于营养充足的状态时,Atg13通过磷酸化降低与Atg1的结合力从而抑制细胞自噬过程。同源比对鉴定到BcATG1为灰葡萄孢中ATG1的同源基因。BcATG1可以回补酿酒酵母同源基因缺失突变体对氮饥饿的耐受性,并且响应菌体对碳和氮饥饿的诱导。基因敲除BcATG1导致菌体的细胞自噬过程阻断。药敏性实验测定发现,BcATG1缺失突变体对咯菌腈、异菌脲和腐霉利的敏感性上升。在生物学表型方面,BcATG1缺失突变体的气生菌丝减少,菌丝分支异常,色素含量升高,在营养匮乏的培养基上生长速率减慢,并且产孢量下降,孢子形态畸形,丧失了在PDA平板上形成菌核的能力。致病性实验表明,BcATG1的缺失影响了分生孢子萌发后侵染结构的形成,使菌体的表皮穿透能力下降,进而导致在不同寄主上的致病力严重减弱。另外,BcATG1缺失突变体的孢子中脂滴含量下降,菌体甘油含量升高。通过目的基因回复,BcATG1缺失突变体的表型缺陷都能得到恢复。以上结果表明,BcATG1在灰葡萄孢对咯菌腈的敏感性、发育和致病过程中发挥重要的作用。（3）灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG8和BcATG4的生物学和药理学功能研究。在酿酒酵母中（S.cerevisiae）中,ATG8编码类泛素蛋白Atg8,ATG4编码半胱氨酸蛋白酶Atg4。在细胞自噬的自噬泡形成过程中,Atg8首先被Atg4在碳末端进行修饰,然后在Atg3和Atg7的共同修饰作用下与磷脂酰乙醇胺结合形成泛素样共轭系统。根据同源比对,在灰葡萄孢基因组数据库中鉴定到了BcATG8和BcATG4,这两个基因均能同源互补各自的同源基因酵母缺失突变体,而且彼此之间存在直接的物理相互作用。通过绿色荧光蛋白（GFP）与BcAtg8的氮末端融合蛋白GFP-BcAtg8,成功构建了灰葡萄孢细胞自噬过程的发生标记。分别基因敲除BcATG8和BcATG4都能导致灰葡萄孢的细胞自噬过程阻断,而且对咯菌腈、异菌脲和腐霉利的敏感性上升。生物学表型方面,BcATG8缺失突变体的气生菌丝减少,生长速率减慢,产孢量下降,在饥饿条件下孢子萌发延迟,而且丧失了在PDA平板的菌核形成能力。BcATG4缺失突变体生长速率减慢,气生菌丝减少,产孢量下降,孢子畸形,在PDA平板上不能形成菌核。寄主侵染实验表明,BcATG8和BcATG4缺失突变体在不同寄主上的致病力均显着下降。此外,BcATG8和BcATG4的单基因缺失突变体脂滴含量下降,甘油含量升高。这些结果表明,BcATG8和BcATG4均参与灰葡萄孢发育、致病和对咯菌腈的敏感性调控过程。（4）细胞自噬基因BcATG3和BcATG7的生物学功能研究。在酿酒酵母（S.cerevisiae）中,ATG3和ATG7分别编码类泛素激活蛋白E2和类泛素激活蛋白E1,在细胞自噬发生过程中,E2和E1协同修饰类泛素蛋白Atg8以促进自噬泡的形成。通过同源基因比对,在灰葡萄孢基因组数据库中鉴定到了BcATG3和BcATG7。酵母双杂实验表明BcATG3和BcATG7所编码的蛋白之间存在直接的相互作用。基因敲除BcATG3或BcATG7都能导致灰葡萄孢细胞自噬过程的阻断。BcATG3和BcATG7缺失突变体表现出相似的生物学表型,包括气生菌丝减少,生长速率减慢,产孢量下降。值得注意的是,尽管BcATG3和BcATG7的缺失突变体都不能在PDA平板上形成菌核,但却可以在CM和MM培养基上产生少量的菌核。致病性实验表明,BcATG3和BcATG7的缺失突变体在不同寄主植物上的致病力均显着下降。以上结果表明,BcATG3和BcATG7是灰葡萄孢营养分化和致病力正常发生所必需的。
二、我国灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的新寄主植物（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、我国灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的新寄主植物（论文提纲范文）
（1）人参灰葡萄孢BcSpd1基因的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 灰葡萄孢菌与人参灰霉病研究概述 |
| 1.1.1 灰葡萄孢菌简介 |
| 1.1.2 灰葡萄孢菌侵染循环 |
| 1.1.3 灰葡萄孢菌致病机制 |
| 1.1.4 人参灰霉病研究现状 |
| 1.2 锌簇蛋白研究概述 |
| 1.2.1 锌指蛋白简述 |
| 1.2.2 锌簇蛋白研究现状 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 1.4 研究的技术路线 |
| 第2章 灰葡萄孢菌BcSpd1基因鉴定敲除与回补 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 供试载体 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.1.4 实验药品与试剂 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 人参灰葡萄孢菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 人参叶片基因组DNA的提取 |
| 2.2.4 灰葡萄孢菌Total RNA的提取、反转录与qPCR |
| 2.2.5 大肠杆菌DH5α(BL21)感受态的制备与转化 |
| 2.2.6 质粒提取 |
| 2.2.7 根癌农杆菌AGL-1感受态的制备与转化 |
| 2.2.8 灰葡萄孢菌BcSpd1基因的获得 |
| 2.2.9 灰葡萄孢菌BcSpd1基因的纯化 |
| 2.2.10 灰葡萄孢菌BcSpd1基因敲除与回补载体的构建 |
| 2.2.11 原核表达 |
| 2.2.12 Western Blot |
| 2.2.13 EMSA实验步骤 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 BcSpd1基因的生物信息学分析 |
| 2.3.2 BcSpd1基因敲除及回补 |
| 2.3.3 BcSpd1基因的表达与鉴定 |
| 2.3.4 BcSpd1体外结合DNA-motif分析 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 灰葡萄孢菌BcSpd1基因致病性及生物学功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.1.4 实验药品与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 生长速率、孢子形态及萌发分析 |
| 3.2.2 基因表达分析 |
| 3.2.3 侵染垫形成分析 |
| 3.2.4 灰葡萄孢菌菌核形成分析 |
| 3.2.5 黑色素形成分析 |
| 3.2.6 草酸形成分析 |
| 3.2.7 致病性测定 |
| 3.2.8 逆境胁迫 |
| 3.2.9 数据统计与分析 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 BcSpd1是影响灰葡萄孢菌致病的关键因子 |
| 3.3.2 BcSpd1基因缺失影响灰葡萄孢菌丝营养生长 |
| 3.3.3 BcSpd1影响灰葡萄孢菌菌核形成 |
| 3.3.4 BcSpd1影响灰葡萄孢菌侵染结构形成 |
| 3.3.5 BcSpd1影响灰葡萄孢菌草酸形成 |
| 3.3.6 BcSpd1影响灰葡萄孢菌黑色素形成 |
| 3.3.7 BcSpd1在灰葡萄孢菌逆境响应中的作用 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 结果与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 实验所需引物 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）灰葡萄孢自然群体交配型鉴定及有性生殖引起的遗传变异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究进展 |
| 1.1 灰葡萄孢研究现状 |
| 1.1.1 生物学特性 |
| 1.1.2 种群多样性 |
| 1.1.3 作物灰霉病防治现状 |
| 1.2 丝状子囊菌有性生殖 |
| 1.2.1 交配系统及演化 |
| 1.2.2 交配型位点结构 |
| 1.2.3 交配型基因功能 |
| 1.3 灰葡萄孢有性生殖 |
| 1.3.1 生活史 |
| 1.3.2 交配系统 |
| 1.3.3 交配型基因功能 |
| 1.3.4 有性生殖的意义 |
| 2 研究目的和意义 |
| 第二章 保护地草莓和番茄灰葡萄孢群体交配型构成分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 1.1.1 供试材料 |
| 1.1.2 培养基及试剂 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 菌株基因组DNA提取 |
| 1.2.2 DNA片段的回收、连接及转化 |
| 1.2.3 灰葡萄孢菌株交配型鉴定 |
| 1.2.4 同一生境灰葡萄孢群体交配型构成分析 |
| 1.2.5 其他Botrytis属菌株交配型鉴定 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 交配型鉴定 |
| 2.2 群体交配型构成分析 |
| 2.2.1 不同寄主灰葡萄孢群体交配型构成 |
| 2.2.2 灰葡萄孢菌株交配型地理分布 |
| 2.2.3 同一生境下交配型构成 |
| 2.3 其他Botrytis属菌株交配型 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 保护地草莓和番茄灰葡萄孢群体交配型构成分析 |
| 3.2 保护地灰葡萄孢群体有性生殖潜力分析 |
| 3.3 保护地灰葡萄孢群体有性生殖难于发生的原因分析 |
| 3.4 其他葡萄孢属交配型分子鉴定的可行性分析 |
| 第三章 灰葡萄孢BcMAT1-1-1的功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试剂和培养基 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 BcMAT1-1-1敲除同源重组片段的扩增 |
| 1.2.2 原生质体制备及转化 |
| 1.2.3 BcMAT1-1-1缺失突变体的PCR验证 |
| 1.2.4 BcMAT1-1-1缺失突变体有性交配能力测定 |
| 1.2.5 BcMAT1-1-1缺失突变体生物学特性测定 |
| 1.2.6 BcMAT1-1-1缺失突变体致病力测定 |
| 1.2.7 BcMAT1-1-1缺失突变体药剂敏感性测定 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BcMAT1-1-1基因缺失突变体的获得 |
| 2.2 BcMAT1-1-1缺失突变体有性交配能力 |
| 2.3 BcMAT1-1-1缺失突变体生物学特性分析 |
| 2.3.1 菌落及微观形态观察 |
| 2.3.2 菌核产量、大型分生孢子产孢量及萌发率 |
| 2.4 致病力 |
| 2.5 药剂敏感性 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 BcMAT1-1-1对菌株生物学特性的影响 |
| 3.2 BcMAT1-1-1对菌株田间适合度的影响 |
| 3.3 BcMAT1-1-1对菌株有性生殖的影响 |
| 第四章 灰葡萄孢有性生殖对其遗传变异的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试剂和培养基 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 子囊盘诱导 |
| 1.2.2 子囊孢子的获得 |
| 1.2.3 有性子代菌株交配型构成分析 |
| 1.2.4 有性子代菌株菌落表型分析 |
| 1.2.5 有性子代菌株菌丝亲和性测定 |
| 1.2.6 有性子代菌株菌丝生长速率测定 |
| 1.2.7 有性子代菌株致病力测定 |
| 1.2.8 有性子代菌株药剂敏感性测定 |
| 1.2.9 咯菌腈靶标基因组氨酸激酶基因Bos1 序列分析 |
| 1.3 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 灰葡萄孢子囊盘诱导 |
| 2.2 有性子代菌株交配型构成 |
| 2.3 有性子代变异分析 |
| 2.3.1 菌株表型 |
| 2.3.2 菌丝亲合群 |
| 2.3.3 菌丝生长速度 |
| 2.4 致病力 |
| 2.5 药剂敏感性 |
| 2.6 组氨酸激酶Bos1序列分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 子囊盘诱导条件分析 |
| 3.2 有性子代群体交配型构成分析 |
| 3.3 有性子代菌株表型多样性分析 |
| 3.4 有性子代菌株菌丝亲和群多样性分析 |
| 3.5 有性子代菌株田间适合度变异分析 |
| 第五章 全文总结、创新点及展望 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 PCR扩增MAT基因序列及第三章PCR反应体系及程序 |
| 附录2 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）SsNSRV-1基因功能及其与核盘菌互作机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.核盘菌及油菜菌核病 |
| 1.1 核盘菌及其分类地位 |
| 1.2 油菜菌核病及其病害循环 |
| 1.3 核盘菌的致病机理 |
| 1.4 菌核病的防治 |
| 2.真菌病毒及其多样性 |
| 2.1 病毒与真菌病毒的发现 |
| 2.2 真菌病毒的分类 |
| 2.3 真菌病毒的广泛分布 |
| 2.4 真菌病毒的传播方式 |
| 2.5 真菌病毒的应用 |
| 3.真菌病毒与寄主互作研究 |
| 3.1 真菌病毒对寄主的影响 |
| 3.2 真菌对真菌病毒的影响 |
| 3.3 真菌病毒-寄主互作研究 |
| 4.转录组学与真菌病毒研究 |
| 4.1 转录组学及转录组测序(RNA-Seq)简介 |
| 4.2 转录组数据的分析流程 |
| 4.3 转录组学在真菌病毒研究中的应用 |
| 5.代谢组学及其应用 |
| 5.1 代谢组学的基本概念 |
| 5.2 代谢组的研究方法 |
| 5.3 代谢组数据分析 |
| 5.4 代谢组学在微生物研究中的应用 |
| 6.单股负义链RNA病毒与SsNSRV-1 |
| 6.1 单股负义链RNA病毒 |
| 6.2 Mymonaviridae的建立 |
| 6.3 核盘菌负链病毒SsNSRV-1 |
| 7.本研究的目的意义 |
| 第二章 利用高通量测序分析菌株AH98中的病毒 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.3.1 菌株的培养 |
| 1.3.2 RNA提取及cDNA合成 |
| 1.3.3 测序方案 |
| 1.3.4 数据分析流程 |
| 1.3.5 病毒序列的验证和分析 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 测序数据QC质量分析 |
| 2.2 测序获得的病毒验证 |
| 2.3 病毒SsNSRV-5X |
| 2.3.1 SsNSRV-5X的基因组结构 |
| 2.3.2 SsNSRV-5X基因功能预测 |
| 2.3.3 SsNSRV-5X的系统发育分析 |
| 2.4 BcHV1/AH98 的基因组结构和进化树分析 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 AH98被6种病毒复合侵染 |
| 3.2.2 AH98的弱毒特性由多种病毒共同导致 |
| 3.2.3 病毒BcHV1存在跨属传播的现象 |
| 3.2.4 SsNSRV-5X可能代表Mymonaviridae科病毒一个新的属 |
| 第三章 SsNSRV-1 基因超表达转化子的表达特性 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.4.1 菌株的培养和保存 |
| 1.4.2 真菌DNA提取 |
| 1.4.4 RNA提取及cDNA合成 |
| 1.4.5 农杆菌介导真菌的遗传转化 |
| 1.4.6 ORF超表达转化子PCR验证 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 核盘菌超表达转化子中病毒基因的表达特性 |
| 2.2 病毒基因剪切位点的序列特征 |
| 2.3 病毒ORF Ⅲ的剪切现象在禾谷镰孢菌和稻瘟菌中存在 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 病毒SsNSRV-1 基因被真菌内含子剪接系统编辑 |
| 3.2.2 病毒SsNSRV-1 可能存在防止内含子剪接的机制 |
| 3.2.3 病毒SsNSRV-1 N基因具有两个转录峰 |
| 第四章 结合转录组技术揭示SsNSRV-1 的基因功能及其与核盘菌互作机理 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.3.1 转录组测序样品制备 |
| 1.3.2 转录组数据分析方法 |
| 1.3.3 病毒SsNSRV-1 蛋白的定位、结构和功能预测 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 转录组测序样品质量检测 |
| 2.2 测序数据质量评估 |
| 2.3 测序数据比对基因组 |
| 2.4 基因ORFⅠ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.4.1 SsNSRV-1 P1 蛋白的结构和功能预测 |
| 2.4.2 核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.4.3 核盘菌ORF I超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.4.4 核盘菌ORF I超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.4.5 核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 2.4.6 核盘菌ORFⅠ超表达转化子中的分泌蛋白和致病相关蛋白 |
| 2.5 基因ORF Ⅱ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.5.1 SsNSRV-1N蛋白的结构和功能分析 |
| 2.5.2 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.5.3 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.5.4 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.5.5 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.6 基因ORF Ⅲ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.6.1 SsNSRV-1 P3 的蛋白结构和功能预测 |
| 2.6.2 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子与1980 差异表达基因概述 |
| 2.6.3 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.6.4 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.6.5 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.7 基因ORF Ⅳ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.7.1 SsNSRV-1 P4 蛋白的结构和功能预测 |
| 2.7.2 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.7.3 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.7.4 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.7.5 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.8 基因ORF Ⅵ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.8.1 SsNSRV-1 P6 蛋白的结构和功能预测 |
| 2.8.2 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.8.3 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.8.4 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.8.5 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.9 核盘菌病毒基因超表达转化子共有差异基因分析 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 病毒ORFⅠ可能参与病毒粒子的形成 |
| 3.2.2 病毒SsNSRV-1 导致核盘菌致病力衰退的机制 |
| 3.2.3 病毒SsNSRV-1 影响核盘菌的转录调控 |
| 3.2.4 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌的跨膜运输 |
| 3.2.5 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌生长发育 |
| 3.2.6 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌的信号传导途径 |
| 3.2.7 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌蛋白质合成和降解 |
| 3.2.8 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌自噬 |
| 第五章 真菌病毒SsNSRV-1 基因表达对寄主代谢的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.3.1 代谢组分析菌株的培养 |
| 1.3.2 代谢样品的提取 |
| 1.3.3 LC-MS分析条件 |
| 1.3.4 LC-MS数据处理 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 代谢数据预处理 |
| 2.2 病毒核盘菌ORFⅠ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.2.1 核盘菌ORFⅠ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.2.2 代谢组数据统计分析 |
| 2.2.3 核盘菌ORFⅠ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.3 病毒ORF Ⅱ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.3.1 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.3.2 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子代谢组数据统计分析 |
| 2.3.3 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.4 病毒ORF Ⅲ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.4.1 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.4.2 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子代谢组数据统计分析 |
| 2.4.3 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.5 病毒ORF Ⅳ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.5.1 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.5.2 代谢组数据统计分析 |
| 2.5.3 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.6 病毒ORF Ⅵ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.6.1 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.6.2 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子代谢组数据统计分析 |
| 2.6.3 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.7 核盘菌ORF Ⅰ、ORF Ⅱ和 ORF Ⅲ超表达转化子共有差异代谢物 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1.论文中使用的引物 |
| 附录2.附图 |
| 附图1.转录组测序样品质量评估 |
| 附图2.转录组测序样品平均错误率 |
| 附图3.转录组测序样品碱基含量分布 |
| 附图4.转录组测序样品比对基因组质量分析 |
| 附录3.附表 |
| 附表1.核盘菌中已研究的部分弱毒相关病毒 |
| 附表2.核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表3.核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表4.核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子与1980 显着差异表达基因 |
| 附表5.核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表6.核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表7.核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980显着差异代谢物 |
| 附表8.核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子与1980显着差异代谢物 |
| 附表9.核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子与1980 显着差异代谢物 |
| 附表10.核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子与1980差异代谢物 |
| 附表11.核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子与1980差异代谢物 |
| 附录4.已发表的论文及参与的会议 |
| 致谢 |
（4）澳大利亚核盘菌病毒多样性及低毒菌株SX276中RNA病毒分子特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 核盘菌的危害及菌核病防治 |
| 1.1 核盘菌及菌核病 |
| 1.1.1 核盘菌的生物学特性 |
| 1.1.2 核盘菌的危害及侵染循环 |
| 1.2 核盘菌的致病机理 |
| 1.2.1 水解酶类 |
| 1.2.2 草酸 |
| 1.2.3 侵染垫 |
| 1.2.4 分泌蛋白参与核盘菌侵染过程 |
| 1.2.5 其他致病相关基因 |
| 1.3 菌核病的防治方法 |
| 1.3.1 抗病育种 |
| 1.3.2 农业防治 |
| 1.3.3 化学防治 |
| 1.3.4 生物防治 |
| 2 真菌病毒的研究进展 |
| 2.1 真菌病毒的分类 |
| 2.2 真菌病毒的传播特性 |
| 2.2.1 水平传播 |
| 2.2.2 垂直传播 |
| 2.2.3 体外传播及介体传播 |
| 2.3 真菌病毒的生防潜力 |
| 2.4 宏病毒组学在真菌病毒多样性分析中的应用 |
| 2.5 真菌病毒的复合侵染及其相互作用 |
| 2.5.1 真菌病毒的复合侵染 |
| 2.5.2 真菌病毒复合侵染广泛存在的潜在原因 |
| 2.5.3 真菌病毒的相互作用 |
| 3 核盘菌病毒研究 |
| 3.1 核盘菌中病毒多样性 |
| 3.2 核盘菌与真菌病毒间的相互作用 |
| 3.3 本研究中涉及的主要病毒类群 |
| 3.3.1 弹状病毒科 |
| 3.3.2 内源RNA病毒科 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 澳大利亚核盘菌病毒多样性分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 核盘菌菌株的分离 |
| 2.3 核盘菌菌株生长速度的测定以及菌落形态的观察 |
| 2.4 核盘菌菌株致病力的测定 |
| 2.5 核盘菌菌株中dsRNA的提取及检测 |
| 2.6 核盘菌总RNA的提取 |
| 2.7 测序菌株混合样品质检 |
| 2.8 测序流程以及测序结果的分析 |
| 2.9 测序得到的病毒相关序列遗传进化分析 |
| 2.10 根据测序得到的序列设计特异性引物验证病毒的存在 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 核盘菌菌株生物学特性的观察 |
| 3.1.1 核盘菌菌株菌落形态的观察及生长速度的测定 |
| 3.1.2 核盘菌菌株致病力的测定 |
| 3.2 核盘菌菌株中含有丰富的dsRNA |
| 3.3 宏转录组测序结果的分析 |
| 3.3.1 与全病毒和双分病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.2 与灰葡萄孢双节段病毒及多聚真菌病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.3 与减病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.4 与内源RNA病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.5 与线粒体病毒及灰葡萄孢欧尔密病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.6 与芜菁花叶病毒及番茄丛矮病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.7 负链RNA病毒的病毒序列信息及及进化分析 |
| 3.3.8 与真菌双生病毒相关的病毒序列信息 |
| 4 结论与讨论 |
| 第三章 核盘菌低毒菌株SX276中病毒种类鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 核盘菌菌株SX276生物学特性观察 |
| 2.3 菌株SX276的dsRNA的提取 |
| 2.4 菌株SX276总RNA的提取及质检 |
| 2.5 测序流程以及测序结果的分析 |
| 2.6 病毒序列的验证 |
| 2.7 病毒全长序列的克隆 |
| 2.7.1 克隆末端所需要的引物 |
| 2.7.2 加接头连接反应 |
| 2.7.3 加完接头后的RNA处理 |
| 2.7.4 反转录 |
| 2.8 PCR产物连接载体测序 |
| 2.9 病毒的基因组结构分析及多重比对与进化分析 |
| 2.10 病毒粒子的提取 |
| 2.11 PEG介导的病毒粒子转染 |
| 2.12 原生质体再生脱除真菌病毒 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 核盘菌菌株SX276的生物学特性 |
| 3.2 菌株SX276被9种不同的真菌病毒复合侵染 |
| 3.3 SsHV1/SX276和SsBV3/SX276 的基因组结构及其对寄主的影响 |
| 3.4 欧尔密病毒SsOV4/SX276和SsOV5 的分子特性及其对寄主的影响 |
| 3.4.1 欧尔密病毒SsOV4/SX276和SsOV5 的分子特性 |
| 3.4.2 SsOV4/SX276及SsOV5 的水平传播特性 |
| 3.4.3 SsOV4/SX276及SsOV5 对寄主生物学表型的影响 |
| 3.5 隶属于芜菁花叶病毒目的SsMTV2、SsDFV3 的分子特性 |
| 3.6 新型RNA病毒SsMAV1 的分子特性 |
| 4 结论与讨论 |
| 第四章 弹状病毒SsRhV1的分子特性及生物学特性 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 核盘菌菌株生物学特性的观察 |
| 2.3 核盘菌菌株dsRNA的提取 |
| 2.4 核盘菌菌株总RNA的提取及病毒检测 |
| 2.5 病毒全长序列的克隆 |
| 2.6 病毒的基因组结构分析及多重比对与进化分析 |
| 2.7 病毒粒子的提取及观察 |
| 2.8 核盘菌原生质体再生 |
| 2.9 弹状病毒SsRhV1基因的表达模式 |
| 2.9.1 含有Poly(A)的mRNA分离与富集 |
| 2.9.2 基因的3?与5?RACE |
| 2.10 病毒的基因组结构分析及多重比对与进化分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 弹状病毒SsRhV1基因组特性 |
| 3.2 弹状病毒SsRhV1的转录调控信号及基因表达模式 |
| 3.3 弹状病毒SsRhV1的系统发育分析 |
| 3.4 SsRhV1与其他弹状病毒代表种基因组结构比较分析 |
| 3.5 弹状病毒SsRhV1的病毒粒子特性观察 |
| 3.6 弹状病毒SsRhV1对寄主生物学特性潜在的影响 |
| 4 结论与讨论 |
| 第五章 内源RNA病毒SsEV3 的分子特性及生物学特性 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 核盘菌生物学特性的分析 |
| 2.3 总RNA的提取及病毒检测 |
| 2.4 核盘菌内源RNA病毒SsEV3 全长c DNA序列的克隆 |
| 2.5 SsEV3基因组结构分析及遗传聚类分析 |
| 2.6 核盘菌原生质体制备及再生 |
| 2.7 对峙培养进行病毒水平传播能力测定 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 内源RNA病毒SsEV3 基因组特性分析 |
| 3.2 内源RNA病毒SsEV3 的遗传进化分析 |
| 3.3 仅含有SsEV3的核盘菌原生质体再生菌株的获得 |
| 3.4 SsEV3与核盘菌低毒特性相关 |
| 3.5 SsEV3导致寄主产菌核能力下降 |
| 3.6 SsEV3导致寄主降解酸性物质能力下降 |
| 3.7 SsEV3引起核盘菌抵抗非生物胁迫的能力下降 |
| 3.8 SsEV3导致寄主不能形成侵染垫 |
| 4 结论与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 全文结论与讨论 |
| 2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 文中附表 |
| 附录2 在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（5）多花黑麦草种带真菌及病害多样性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 多花黑麦草真菌病害的研究 |
| 1.2 牧草种带真菌区系的研究 |
| 1.3 真菌分类学的研究 |
| 1.3.1 灰葡萄孢属 |
| 1.3.2 核腔菌属 |
| 1.3.3 毛壳属及形态相似属 |
| 1.3.4 曲霉属 |
| 1.4 病害与种带真菌的相互关系 |
| 第二章 灰霉病及品种抗病性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 调查区概况及病害调查 |
| 2.2.2 病原菌的分离和形态学观察 |
| 2.2.3 生物学特性测定 |
| 2.2.4 DNA的提取、扩增、测序及系统发育学分析 |
| 2.2.5 致病性测定 |
| 2.2.6 抗性品种的筛选 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病症及田间发病动态 |
| 2.3.2 病原菌形态学和多基因序列鉴定 |
| 2.3.3 生物学特性 |
| 2.3.4 致病性测定 |
| 2.3.5 抗性品种的筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 核腔菌叶斑病 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 调查区概况 |
| 3.2.2 病害调查与标本采集 |
| 3.2.3 病原菌的分离和形态学观察 |
| 3.2.4 DNA的提取、扩增、测序及系统发育学分析 |
| 3.2.5 致病性测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 病症及田间发病动态 |
| 3.3.2 病原菌形态学和多基因序列鉴定 |
| 3.3.3 致病性测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 链格孢、稻梨孢和核盘菌病害 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 调查区概况及病害调查 |
| 4.2.2 病原菌的分离和形态学观察 |
| 4.2.3 DNA的提取、扩增、测序及系统发育学分析 |
| 4.2.4 致病性测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 病症及田间发病动态 |
| 4.3.2 病原菌形态学和多基因序列鉴定 |
| 4.3.3 致病性测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 种带真菌区系及核腔菌属真菌 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株的分离与纯化 |
| 5.2.2 形态学观察 |
| 5.2.3 DNA的提取、扩增、测序及系统发育学分析 |
| 5.2.4 致病性测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 种带真菌区系 |
| 5.3.2 核腔菌属真菌的形态学和多基因序列鉴定 |
| 5.3.3 致病性测定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 种带毛壳属及形态相似属真菌 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株的分离与纯化 |
| 6.2.2 形态学观察 |
| 6.2.3 DNA的提取、扩增、测序及系统发育学分析 |
| 6.2.4 致病性测定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 形态学和多基因序列鉴定 |
| 6.3.2 致病性测定 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 种带曲霉属及其它属真菌 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 菌株的分离与纯化 |
| 7.2.2 形态学观察 |
| 7.2.3 DNA的提取、扩增、测序 |
| 7.2.4 致病性测定 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 病原菌形态学和多基因序列鉴定 |
| 7.3.2 致病力测定 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 结论与创新点 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 后续工作 |
| 参考文献 |
| 项目资助 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）人参灰霉病菌BcGP基因的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 人参病害的研究现状 |
| 1.1.2 人参灰霉病的研究现状 |
| 1.1.3 灰葡萄孢的研究进展 |
| 1.1.4 活性氧类(ROS)在病原菌-宿主互作中的重要作用 |
| 1.1.5 谷氨酰胺转移酶研究进展 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.3 本研究技术路线 |
| 第二章 BcGP基因的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验质粒载体 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 核酸提取 |
| 2.2.3 目的基因的获得及PCR反应 |
| 2.2.4 RNA提取、反转录和qPCR |
| 2.2.5 敲除和互补载体的构建 |
| 2.2.6 感受态细胞制备与转化 |
| 2.2.7 根癌农杆菌AGL-1 热激感受态细胞制备与转化 |
| 2.2.8 农杆菌介导的遗传转化 |
| 2.2.9BcGP基因的生物学功能分析实验 |
| 2.2.10 致病性分析 |
| 2.2.11 DAB染色 |
| 2.2.12 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 BcGP基因的生物信息学分析 |
| 2.3.2 BcGP基因的敲除和互补 |
| 2.3.3 BcGP基因对灰葡萄孢营养生长的影响 |
| 2.3.4 BcGP敲除突变体对逆境的响应 |
| 2.3.5 BcGP基因调控灰葡萄孢对H2O2的应答 |
| 2.3.6 BcGP敲除突变体的致病性分析 |
| 2.3.7 灰葡萄孢侵染过程中寄主植物H2O2的检测 |
| 讨论与结论 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）SsHADV-1介导的核盘菌内生特性及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 核盘菌的危害及防治 |
| 1.1.1 核盘菌及作物菌核病 |
| 1.1.2 核盘菌的致病机理 |
| 1.1.3 植物针对核盘菌的防御机制 |
| 1.1.4 菌核病的防治 |
| 1.2 真菌病毒 |
| 1.2.1 真菌病毒的发现和分类 |
| 1.2.2 核盘菌中的病毒研究 |
| 1.2.3 真菌病毒的传播方式 |
| 1.2.4 真菌病毒与寄主的关系 |
| 1.2.5 真菌病毒应用及面临的问题 |
| 1.3 Genomoviridae病毒的研究进展和进化机制 |
| 1.4 内生真菌的研究进展 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 核盘菌菌株DT-8在油菜中内生 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株及培养 |
| 2.2.2 供试植物与培养方式 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 菌株DT-8对油菜植株的处理 |
| 2.2.5 .菌株DT-8 转化mcherry荧光蛋白 |
| 2.2.6 菌株DT-8在油菜植株中的内生观察 |
| 2.2.7 菌株DT-8自油菜植株中重分离 |
| 2.2.8 内生菌株DT-8的传毒 |
| 2.2.9 菌株DT-8的检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 菌株DT-8在油菜植株中内生性生长 |
| 2.3.2 菌株DT-8在油菜植株中的分布 |
| 2.3.3 菌株DT-8在衰弱油菜植株上的生长 |
| 2.3.4 菌株DT-8 通过内生传播SsHADV-1 |
| 2.3.5 田间喷施菌株DT-8对病毒的传播 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Ss HADV-1 对核盘菌基因表达的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 数据来源 |
| 3.2.2 显着差异表达基因的筛选 |
| 3.2.3 FunCat功能富集分析 |
| 3.2.4 KEGG功能富集分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Ss HADV-1 影响核盘菌基因的表达 |
| 3.3.2 菌株DT-8和DT-8VF的 DEGs的 FunCat富集分析 |
| 3.3.3 菌株DT-8和DT-8VF的 DEGs的 KEGG富集分析 |
| 3.3.4 核盘菌致病相关基因的表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 菌株DT-8内生促进油菜生长并提高抗病性能及其分子机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 油菜生物产量的测定 |
| 4.2.2 油菜植株抗病性的测定 |
| 4.2.3 油菜植株RNA的提取 |
| 4.2.4 转录组测序研究流程 |
| 4.2.5 数据分析方法 |
| 4.2.6 cDNA第一链合成和RT-PCR验证 |
| 4.2.7 实时荧光定量qPCR(Quantitative Real-time PCR) |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 菌株DT-8内生显着促进油菜生物产量 |
| 4.3.2 菌株DT-8提高油菜抗病力 |
| 4.3.3 菌株DT-8内生对油菜基因表达的影响 |
| 第五章 菌株DT-8田间防病增产应用研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 田间试验 |
| 5.2.2 病情指数调查 |
| 5.2.3 油菜籽含油量的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 菌株DT-8在油菜上长期存活 |
| 5.3.2 菌株DT-8处理减轻菌核病的危害 |
| 5.3.3 菌株DT-8处理提高油菜产量 |
| 5.3.4 菌株DT-8提高油菜籽的含油量 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 真菌中新型genomovirus-like病毒BcHADV-1 的发现 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株及培养 |
| 6.2.2 供试植物与培养方式 |
| 6.2.3 DNA病毒序列的克隆和测定 |
| 6.2.4 序列和系统进化分析 |
| 6.2.5 病毒粒子的提取 |
| 6.2.6 BcHADV-1 病毒粒体的负染观察 |
| 6.2.7 Southern blot杂交分析 |
| 6.2.8 病毒水平传播验证 |
| 6.2.9 病毒垂直传播验证 |
| 6.2.10 菌株生物学特性检测 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 灰葡萄孢中四节段DNA病毒的发现 |
| 6.3.2 BcHADV-1 编码的假定蛋白 |
| 6.3.3 Bc HADV-1 的系统进化分析 |
| 6.3.4 BcHADV-1 的传播 |
| 6.3.5 BcHADV-1 与灰葡萄孢的弱毒相关 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 论文发表情况和专利 |
| 致谢 |
（8）细胞自噬在松材线虫侵染寄主过程中的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 松材线虫病研究概况 |
| 1.1 松材线虫病的发生与分布 |
| 1.2 病原松材线虫的形态学特征和生活史 |
| 1.3 松材线虫致病机制研究 |
| 1.4 感病寄主的生理和病理变化 |
| 2 细胞自噬发生过程研究概述 |
| 2.1 细胞自噬的发现 |
| 2.2 细胞自噬的类型 |
| 2.3 自噬的形成过程及相关分子机制 |
| 2.3.1 自噬的起始阶段 |
| 2.3.2 自噬体的延伸阶段 |
| 2.3.3 自噬体的成熟降解阶段 |
| 3 细胞自噬作用的研究进展 |
| 3.1 自噬在模式动物秀丽隐杆线虫中的作用研究 |
| 3.1.1 自噬对秀丽隐杆线虫存活的影响 |
| 3.1.2 自噬对秀丽隐杆线虫生长发育的影响 |
| 3.2 自噬在植物病原真菌中的作用研究 |
| 3.3 自噬在植物中的作用研究 |
| 3.4 自噬在人类疾病中的作用研究 |
| 4 细胞自噬的研究方法 |
| 4.1 细胞自噬的检测方法 |
| 4.2 RNA干扰技术及其应用 |
| 4.3 实时定量PCR及其应用 |
| 5 本研究的意义 |
| 第二章 松材线虫细胞自噬活性定量检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料及其培养 |
| 1.2 松材线虫总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 1.3 松材线虫自噬标志蛋白BxATG8原核表达载体的构建 |
| 1.4 松材线虫自噬标志蛋白BxATG8的诱导表达与纯化 |
| 1.5 松材线虫自噬标志蛋白BxATG8抗体的制备 |
| 1.6 BxATG8 抗体的效价检测与Western blot验证 |
| 1.7 松材线虫细胞自噬活性的定量测定 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 松材线虫自噬标志蛋白BxATG8原核表达载体的构建 |
| 2.2 松材线虫自噬标志蛋白BxATG8的诱导表达与纯化 |
| 2.3 BxATG8多克隆抗体的制备与质量检测 |
| 2.4 松材线虫自噬活性的定量测定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 松材线虫自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的克隆与功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料及其培养 |
| 1.2 松材线虫总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 1.3 松材线虫自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 编码区的克隆 |
| 1.4 松材线虫自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的生物信息学分析 |
| 1.5 松材线虫自噬基因BxATG9和BxATG16 的双链RNA干扰 |
| 1.6 实时定量PCR检测基因干扰效率和其他自噬基因的表达 |
| 1.7 自噬基因沉默后松材线虫细胞自噬活性的测定 |
| 1.8 自噬基因沉默后松材线虫形态的观察与运动能力的测定 |
| 1.9 自噬基因沉默后松材线虫取食速度与繁殖量的测定 |
| 1.10 离体α-蒎烯胁迫和感染松树后的松材线虫自噬基因表达量测定 |
| 1.11 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 松材线虫自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的克隆与测序 |
| 2.2 松材线虫自噬蛋白BxATG5、BxATG9和BxATG16 的同源性、理化性质及三级结构分析 |
| 2.3 松材线虫自噬基因BxATG9和BxATG16 沉默的效率及对其他自噬基因表达的影响 |
| 2.4 自噬基因BxATG9和BxATG16 的沉默降低了松材线虫的自噬活性 |
| 2.5 自噬基因BxATG9和BxATG16 的沉默减少了松材线虫的取食和繁殖 |
| 2.6 α-蒎烯胁迫增加了松材线虫自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的表达水平 |
| 2.7 松材线虫与松树互作中自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的表达模式 |
| 3 讨论 |
| 第四章 细胞自噬在松材线虫侵染寄主过程中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料及其培养 |
| 1.2 松材线虫接种黑松与样品制备 |
| 1.3 黑松与松材线虫总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 1.4 黑松RBOH基因的克隆 |
| 1.5 qRT-PCR |
| 1.6 黑松茎段H_2O_2含量的测定 |
| 1.7 氧化胁迫下松材线虫自噬基因表达的测定 |
| 1.8 氧化胁迫下松材线虫细胞自噬的透射电镜观察 |
| 1.9 Western blot检测松材线虫的自噬活性 |
| 1.10 自噬抑制剂处理松材线虫与线虫自噬基因的干扰 |
| 1.11 松材线虫形态观察与运动能力的测定 |
| 1.12 松材线虫取食速度与繁殖量的测定 |
| 1.13 松材线虫卵孵化率和存活率的测定 |
| 1.14 松材线虫致病力及其在松树体内繁殖力测定 |
| 1.15 松材线虫接种黑松后早期抗氧化相关基因表达量的测定 |
| 1.16 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 侵染早期松材线虫自噬基因表达与松树ROS代谢相关 |
| 2.2 氧化胁迫诱发了松材线虫的细胞自噬 |
| 2.3 抑制自噬减少了松材线虫氧化胁迫下的取食、繁殖、卵孵化和存活 |
| 2.4 抑制自噬降低了松材线虫的毒力 |
| 2.5 自噬基因对松材线虫氧化胁迫下的取食、繁殖、卵孵化和存活是必要的 |
| 2.6 自噬基因对松材线虫的致病力有贡献 |
| 2.7 抑制自噬提高了侵染早期松材线虫抗氧化基因的表达 |
| 3 讨论 |
| 第五章 细胞自噬在松材线虫响应温度变化过程中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料及其培养 |
| 1.2 不同温度下松材线虫取食速度与繁殖量的测定 |
| 1.3 不同温度下松材线虫运动能力的测定 |
| 1.4 不同温度下松材线虫自噬活性的检测 |
| 1.5 松材线虫总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 1.6 不同温度下松材线虫自噬基因表达水平的测定 |
| 1.7 自噬抑制后的松材线虫取食速度、繁殖量与运动能力测定 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 温度变化改变了松材线虫的取食繁殖与运动能力 |
| 2.2 温度影响松材线虫的细胞自噬 |
| 2.3 自噬促进松材线虫在低温下的取食繁殖和运动能力 |
| 3 讨论 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 主要创新点 |
| 3 展望 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与获奖情况 |
| 参考文献 |
（9）人参灰霉病菌遗传多样性分析及抗药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 灰葡萄孢 |
| 1.1 灰葡萄孢菌 |
| 1.2 灰葡萄孢菌的致病机理 |
| 2. 人参灰霉病的研究进展 |
| 2.1 人参灰霉病的发生与危害 |
| 2.2 灰霉病的发病规律 |
| 2.3 灰霉病的防治 |
| 3. 灰葡萄孢遗传多样性及研究方法 |
| 3.1 遗传多样性 |
| 3.2 遗传多样性的研究方法 |
| 3.3 灰葡萄孢遗传多样性研究现状 |
| 4. 灰葡萄孢对杀菌剂抗性的研究现状 |
| 5. 研究目的与意义 |
| 第二章 人参灰葡萄孢的分离与鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 菌株分离与保存 |
| 1.4 灰葡萄孢形态特征观察及分类 |
| 1.5 灰葡萄孢分子鉴定 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 形态类型分析 |
| 2.2 分子鉴定结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 人参灰葡萄孢遗传多样性分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与仪器 |
| 1.2 引物合成 |
| 1.3 引物初筛 |
| 1.4 ISSR-PCR反应 |
| 1.5 数据分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 引物初筛结果 |
| 2.2 ISSR引物扩增结果 |
| 2.3 遗传多样性分析及聚类分析结果 |
| 3. 讨论 |
| 第四章 人参灰葡萄孢致病力分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 接种体制备 |
| 1.3 接种 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 人参叶片发病症状 |
| 2.2 病斑直径 |
| 2.3 灰葡萄孢致病力等级划分 |
| 2.4 灰葡萄孢致病力分析 |
| 2.5 致病力与形态类型的关系 |
| 3. 讨论 |
| 第五章 人参灰葡萄孢对4种杀菌剂的抗性 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 活化菌株 |
| 1.3 接种 |
| 1.4 统计抗药性频率 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 人参灰葡萄孢抗性频率 |
| 2.2 人参灰葡萄孢抗性类型 |
| 3. 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 溶液及培养基配制 |
| 附录二 ITS序列测序结果 |
| 作者简介 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（10）灰葡萄孢细胞自噬的生物学功能及其调控咯菌腈敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略说明表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 灰霉病研究进展 |
| 1.1 灰霉病概述 |
| 1.2 灰霉病菌的生物学特征 |
| 1.3 灰霉病的症状 |
| 1.4 灰霉病的病害循环及发病规律 |
| 1.5 灰霉病的防治现状 |
| 1.5.1 化学防治 |
| 1.5.2 农业防治 |
| 1.5.3 生物防治 |
| 2 细胞自噬研究进展 |
| 2.1 细胞自噬的类型 |
| 2.1.1 巨自噬 |
| 2.1.2 微自噬 |
| 2.1.3 Cytoplasm to vesicle transport (Cvt)途径 |
| 2.1.4 内质网自噬 |
| 2.1.5 线粒体自噬 |
| 2.1.6 过氧化物酶体自噬 |
| 2.2 巨自噬的基本过程 |
| 2.2.1 自噬的诱导 |
| 2.2.2 自噬体的形成 |
| 2.2.3 自噬体的融合 |
| 2.2.4 自噬小体的降解和再循环 |
| 2.3 细胞自噬的检测方法 |
| 2.3.1 Western blot检测Atg8的降解 |
| 2.3.2 显微镜观察 |
| 2.3.3 MDC染色 |
| 2.4 细胞自噬的功能 |
| 2.4.1 自噬在酵母中的功能 |
| 2.4.2 自噬在丝状真菌中的功能 |
| 2.4.3 自噬在植物中的功能 |
| 2.4.4 自噬在哺乳动物中的功能 |
| 参考文献 |
| 第二章 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG1的生物学和药理学功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 供试培养基 |
| 1.3 供试药剂 |
| 1.4 供试植物 |
| 1.5 灰葡萄孢DNA和RNA提取 |
| 1.6 PCR反应体系及程序 |
| 1.6.1 常规PCR |
| 1.6.2 反转录PCR(RT-PCR) |
| 1.6.3 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 1.7 DNA克隆技术 |
| 1.7.1 酶切反应体系: |
| 1.7.2 T4 DNA连接酶反应体系: |
| 1.7.3 大肠杆菌转化 |
| 1.8 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG1的鉴定及序列比对 |
| 1.9 灰葡萄孢BcATG1同源互补酵母突变体 |
| 1.9.1 载体构建 |
| 1.9.2 酵母转化 |
| 1.9.3 验证 |
| 1.10 灰葡萄孢BcATG1的表达响应碳源和氮源饥饿 |
| 1.11 灰葡萄孢BcATG1基因敲除和回复 |
| 1.11.1 基因敲除载体的构建 |
| 1.11.2 PEG介导的灰葡萄孢原生质体转化 |
| 1.11.3 基因敲除突变体的验证 |
| 1.11.4 基因回复载体的构建 |
| 1.12 灰葡萄孢BcATG1敲除突变体表型分析 |
| 1.12.1 灰葡萄孢细胞自噬过程发生的检测 |
| 1.12.2 灰葡萄孢菌丝生长测定 |
| 1.12.3 灰葡萄孢孢子产生测定 |
| 1.12.4 灰葡萄孢菌核形成测定 |
| 1.12.5 灰葡萄孢致病力分析 |
| 1.12.6 灰葡萄孢对杀菌剂敏感性测定 |
| 1.12.7 灰葡萄孢甘油含量测定 |
| 1.12.8 灰葡萄孢尼罗红(Nile red)染色 |
| 1.12.9 三酰基甘油(Triacylglycerol,TAG)含量测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 灰葡萄孢BcATG1的鉴定及序列分析 |
| 2.2 灰葡萄孢BcATG1同源互补酿酒酵母缺失突变体 |
| 2.3 灰葡萄孢BcATG1在饥饿胁迫条件下的表达 |
| 2.4 灰葡萄孢BcATG1基因敲除和回复 |
| 2.5 灰葡萄孢BcATG1基因敲除突变体和回复菌株的表型分析 |
| 2.5.1 BcATG1在灰葡萄孢细胞自噬发生过程中作用 |
| 2.5.2 BcATG1影响灰葡萄孢对咯菌腈的敏感性 |
| 2.5.3 BcATG1对灰葡萄孢菌丝生长的影响 |
| 2.5.4 BcATG1对灰葡萄孢产孢和菌核形成的影响 |
| 2.5.5 BcATG1对灰葡萄孢致病力的作用 |
| 2.5.6 BcATG1对灰葡萄孢侵染结构形成的影响 |
| 2.5.7 BcATG1对灰葡萄孢脂滴代谢的影响 |
| 2.5.8 BcATG1对灰葡萄孢菌体甘油含量的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG8的生物学和药理学功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 供试培养基 |
| 1.3 供试药剂 |
| 1.4 供试植物 |
| 1.5 灰葡萄孢DNA和RNA提取 |
| 1.6 灰葡萄孢总蛋白提取 |
| 1.7 PCR反应体系及程序 |
| 1.7.1 常规PCR |
| 1.7.2 反转录PCR(RT-PCR) |
| 1.7.3 荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 1.8 一步克隆法载体构建反应 |
| 1.9 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG8的鉴定及系统进化分析 |
| 1.10 酵母同源回补分析 |
| 1.11 酵母双杂 |
| 1.11.1 载体构建 |
| 1.11.2 酵母转化 |
| 1.12 灰葡萄孢BcATG8的基因敲除与回复 |
| 1.12.1 基因敲除载体的构建 |
| 1.12.2 PEG介导的灰葡萄孢原生质体转化 |
| 1.12.3 基因敲除突变体的验证 |
| 1.12.4 GFP融合蛋白回复载体的构建 |
| 1.13 BcATG8敲除突变体的表型分析 |
| 1.13.1 细胞自噬过程的发生 |
| 1.13.2 灰葡萄孢菌丝生长测定 |
| 1.13.3 灰葡萄孢产孢量分析 |
| 1.13.4 灰葡萄孢菌核形成测定 |
| 1.13.5 灰葡萄孢致病力分析 |
| 1.13.6 灰葡萄孢杀菌剂敏感性测定 |
| 1.13.7 灰葡萄孢尼罗红(Nile red)染色 |
| 1.13.8 灰葡萄孢脂滴代谢相关基因的表达量测定 |
| 1.13.9 灰葡萄孢甘油含量测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 灰葡萄孢BcATG8的鉴定及系统进化分析 |
| 2.2 灰葡萄孢BcATG8同源互补酿酒酵母缺失突变体 |
| 2.3 灰葡萄孢BcAtg8和BcAtg4酵母双杂 |
| 2.4 灰葡萄孢BcAtg8亚细胞定位 |
| 2.5 细胞自噬的标记GFP-BcAtg8分析细胞自噬过程 |
| 2.6 灰葡萄孢BcATG8的基因敲除与回复 |
| 2.7 BcATG8的生物学功能分析 |
| 2.7.1 BcATG8在细胞自噬过程中的作用 |
| 2.7.2 BcATG8影响灰葡萄孢对咯菌腈的敏感性 |
| 2.7.3 BcATG8影响灰葡萄孢在不同营养条件的菌丝生长 |
| 2.7.4 BcATG8对灰葡萄孢产孢、孢子萌发和菌核形成的影响 |
| 2.7.5 BcATG8对灰葡萄孢致病力的作用 |
| 2.7.6 BcATG8对灰葡萄孢脂滴代谢的影响 |
| 2.7.7 BcATG8对灰葡萄孢甘油含量的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG4的生物学和药理学功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 供试培养基 |
| 1.3 供试药剂 |
| 1.4 供试植物 |
| 1.5 灰葡萄孢DNA和RNA提取 |
| 1.6 灰葡萄孢总蛋白提取 |
| 1.7 PCR反应体系及程序 |
| 1.8 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG4的鉴定及系统进化分析 |
| 1.9 酵母同源互补分析 |
| 1.10 灰葡萄孢BcATG4的基因敲除与回复 |
| 1.10.1 基因敲除载体的构建 |
| 1.10.2 PEG介导的灰葡萄孢原生质体转化 |
| 1.10.3 基因敲除突变体的验证 |
| 1.10.4 GFP融合蛋白回复载体的构建 |
| 1.11 灰葡萄孢BcATG4敲除突变体的表型分析 |
| 1.11.1 细胞自噬过程的观察 |
| 1.11.2 灰葡萄孢菌丝生长测定 |
| 1.11.3 灰葡萄孢产分生孢子分析 |
| 1.11.4 灰葡萄孢菌核形成测定 |
| 1.11.5 灰葡萄孢致病力分析 |
| 1.11.6 灰葡萄孢对杀菌剂敏感性测定 |
| 1.11.7 灰葡萄孢甘油含量测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 灰葡萄孢BcATG4的鉴定及系统进化分析 |
| 2.2 灰葡萄孢BcATG4同源互补酿酒酵母缺失突变体 |
| 2.3 灰葡萄孢BcAtg4的亚细胞定位 |
| 2.4 灰葡萄孢BcATG4的基因敲除与回复 |
| 2.5 灰葡萄孢BcATG4的生物学功能分析 |
| 2.5.1 BcATG4在灰葡萄孢细胞自噬过程中的作用 |
| 2.5.2 BcATG4影响灰葡萄孢对咯菌腈的敏感性 |
| 2.5.3 BcATG4对灰葡萄孢菌体甘油含量的影响 |
| 2.5.4 BcATG4在灰葡萄孢菌丝生长中的作用 |
| 2.5.5 BcATG4对灰葡萄孢产孢、形态和萌发的影响 |
| 2.5.6 BcATG4对灰葡萄孢菌核形成的影响 |
| 2.5.7 BcATG4在灰葡萄孢致病力中的作用 |
| 2.5.8 BcATG4对灰葡萄孢侵染结构形成的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG3和BcATG7的生物学功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 供试培养基 |
| 1.3 供试植物 |
| 1.4 灰葡萄孢DNA和RNA提取 |
| 1.5 灰葡萄孢总蛋白提取 |
| 1.6 PCR反应 |
| 1.7 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG3和BcATG7的鉴定及序列分析 |
| 1.8 酵母双杂 |
| 1.8.1 载体构建 |
| 1.8.2 酵母转化 |
| 1.9 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7的基因敲除与回复 |
| 1.9.1 基因敲除载体的构建 |
| 1.9.2 PEG介导的灰葡萄孢原生质体转化 |
| 1.9.3 基因敲除突变体的验证 |
| 1.9.4 GFP融合蛋白回复载体的构建 |
| 1.10 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7敲除突变体的表型分析 |
| 1.10.1 灰葡萄孢细胞自噬过程的检测 |
| 1.10.2 灰葡萄孢菌丝生长测定 |
| 1.10.3 灰葡萄孢产孢量分析 |
| 1.10.4 灰葡萄孢菌核形成测定 |
| 1.10.5 灰葡萄孢致病力分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7的鉴定及序列分析 |
| 2.2 灰葡萄孢BcAtg3和BcAtg7酵母双杂分析 |
| 2.3 灰葡萄孢BcAtg3和BcAtg7亚细胞定位 |
| 2.4 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7的基因敲除与回复 |
| 2.5 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7的生物学功能分析 |
| 2.5.1 BcATG3和BcATG7在灰葡萄孢细胞自噬过程中的作用 |
| 2.5.2 BcATG3和BcATG7对灰葡萄孢菌丝生长的影响 |
| 2.5.3 BcATG3和BcATG7对灰葡萄孢产孢量的影响 |
| 2.5.4 BcATG3和BcATG7对灰葡萄孢菌核形成的影响 |
| 2.5.5 BcATG3和BcATG7对灰葡萄孢致病力的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 一、本文获得的主要结果: |
| 二、本文的主要创新点: |
| 三、本文尚待解决的问题: |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、我国灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的新寄主植物（论文参考文献）
- [1]人参灰葡萄孢BcSpd1基因的功能研究[D]. 陈虎臣. 吉林大学, 2021(01)
- [2]灰葡萄孢自然群体交配型鉴定及有性生殖引起的遗传变异分析[D]. 杨蕊. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]SsNSRV-1基因功能及其与核盘菌互作机制研究[D]. 高知枭. 华中农业大学, 2020
- [4]澳大利亚核盘菌病毒多样性及低毒菌株SX276中RNA病毒分子特性研究[D]. 穆凡. 华中农业大学, 2020
- [5]多花黑麦草种带真菌及病害多样性的研究[D]. 薛龙海. 兰州大学, 2020(01)
- [6]人参灰霉病菌BcGP基因的功能研究[D]. 王明阳. 吉林大学, 2020(08)
- [7]SsHADV-1介导的核盘菌内生特性及应用研究[D]. 张洪祥. 华中农业大学, 2020
- [8]细胞自噬在松材线虫侵染寄主过程中的作用[D]. 刘红斌. 南京林业大学, 2020
- [9]人参灰霉病菌遗传多样性分析及抗药性研究[D]. 刘琨. 北京协和医学院, 2020(05)
- [10]灰葡萄孢细胞自噬的生物学功能及其调控咯菌腈敏感性的机制研究[D]. 任维超. 南京农业大学, 2019(08)