一、锯缘青蟹Sox基因的PCR扩增(英文)（论文文献综述）
何欣蓉[1]（2020）在《拟穴青蟹细丝蛋白C的分子克隆及抗原表位分析》文中研究说明蟹类水产品的消费量逐年递增,随之引发的过敏反应广受关注。细丝蛋白C（filamin C,FLN c）是拟穴青蟹（Scylla paramamosain）肌肉中的新型过敏原,有关该过敏原的基因序列、理化特性、抗原表位等尚不清楚。因此针对FLN c基因序列及抗原表位的研究有利于解决甲壳类动物FLN c交叉反应引起的过敏疾病诊断难题。本研究以拟穴青蟹FLN c为研究对象,利用巢式聚合酶链式反应及互补脱氧核糖核酸末端快速扩增技术获得FLN c的基因序列,该基因开放阅读框共2544个碱基,编码847个氨基酸残基,核苷酸序列登录号为MK747241.1,填补了甲壳类水产品FLN c基因序列的空白。生物信息学分析结果显示,FLN c含有9个结构域,其三级结构呈免疫球蛋白样折叠,具有典型的细丝蛋白家族特征;系统进化树分析结果表明,细丝蛋白家族在进化中呈现高度保守性。另外,基于三种生物信息学在线分析及软件预测得到FLN c的28个线性表位,并将本实验室前期经噬菌体淘选获得的模拟表位肽段与青蟹FLN c基因序列进行比对,共匹配得到22个表位肽段,比对分析最终明确了拟穴青蟹FLN c的11个线性表位。进一步对拟穴青蟹FLN c进行体外表达,获得纯化的重组FLN c（rFLN c）。与天然FLN c（nFLN c）比较发现,rFLN c三级结构发生明显改变;免疫球蛋白E（immunoglobulin E,IgE）结合能力分析显示,rFLN c比nFLN c更易被甲壳类过敏患者血清识别,结果提示rFLN c可以作为蟹类过敏组分诊断的候选过敏原。基于结构域组成及三级结构分析后,将拟穴青蟹FLN c进行分段表达,纯化得到带有麦芽糖结合蛋白标签的重组蛋白rFLN c1（氨基酸序列1-335区）、rFLN c2（氨基酸序列336-531区）、rFLN c3（氨基酸序列532-847区）。免疫结合活性分析FLN c抗原表位的分布情况显示,rFLN c2的免疫结合能力最强,确定的6个抗原表位分布于该区域,提示结构域5,6（氨基酸序列336-531区）可能为拟穴青蟹FLN c的抗原表位优势区域。甲壳类、软体类8种水产品中FLN c的特异性抗体及血清学分析结果显示,FLN c均存在于8种水产品中,且rFLN c可明显抑制8个水产品中FLN c与甲壳类过敏患者血清IgE的结合能力,结果表明不同物种FLN c具有相同或相似的抗原表位且存在免疫交叉反应。综上所述,本研究对拟穴青蟹FLN c进行分子克隆及重组表达,分段表达明确了FLN c抗原表位优势区域,分析8种水产品过敏原FLN c免疫交叉反应情况,这些结果对于完善甲壳类动物FLN c的基因序列信息,以及蟹类过敏疾病的诊断和治疗具有指导意义。
钱恒[2]（2019）在《拟穴青蟹MF合成通路基因的克隆及表达分析和保幼激素酸甲基转移酶的蛋白表达分析》文中认为拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国比较受欢迎的海产蟹类之一。所以,研究者对于青蟹的关注日益增加,尤其是对于人工养殖和育苗过程中面临的问题,主要是关于养殖规模小、膏蟹产量低、性早熟、溞状幼体到仔蟹培育时死亡率高、病害等。甲壳类内分泌学方面的研究对于这些问题的解决具有重要的指导意义。甲基法尼酯（Methyl farnesoate,MF）是调节拟穴青蟹生长发育和繁殖过程中重要的内分泌激素之一,由大颚器（Mandibular organ,MO）合成和分泌,在青蟹性成熟和幼体变态发育中起着至关重要的作用。本论文以拟穴青蟹内分泌激素MF为主线,借助RACE技术克隆获得拟穴青蟹MF合成过程中的几个关键调控基因,同时采用实时荧光定量PCR技术对其不同幼体发育时期、不同卵巢分期及不同组织的表达模式进行分析,探讨这些基因在个体发育过程中的作用,并对保幼激素酸甲基转移酶（juvenile hormone acid methyl transferase,JHAMT）的蛋白表达进行分析,为解决拟穴青蟹人工养殖和育苗中出现的问题提供参考理论基础。获得的主要研究成果如下:1.拟穴青蟹FPPS、FoD和FaD基因的克隆及表达分析。法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthases,FPPS）、法尼醇脱氢酶（Farnesol dehydrogenase,FoD）或法尼醛脱氢酶（Farnesal dehydrogenase,FaD）是甲壳动物MF合成过程中的关键调控酶。FPPS催化多步反应最终生成法尼焦磷酸（farnesyl diphosphate,FPP）,FoD催化法尼醇生成法尼醛,FaD催化法尼醛生成法尼酸（FA）。本文获得了这三个基因的序列,分别命名为Sp-FPPS、Sp-FoD和Sp-FaD。Sp-FPPS全长为1548 bp,其中ORF为1290 bp,编码429个氨基酸。序列分析发现含有焦磷酸合酶的结构域,其中有两个高度保守的天冬氨酸基序,可能与酶的功能位点有关。qPCR表达分析表明,Sp-FPPS在幼体发育的三个重要时期（溞状幼体3期、5期和大眼幼体期）变化极为显着,在成体组织中的表达量最高在大颚器中,肌肉中表达次之这提示基因FPPS的功能与个体发育特别是幼体发育的关系极为密切。在卵巢发育的四期表达量比较显着,此时青蟹合成的MF含量也比较高,这与Sp-FPPS与MF合成相关的观点相符。拟穴青蟹Sp-FoD基因的cDNA全长为2269 bp,ORF为1137 bp,编码378个氨基酸,5’UTR和3’UTR分别为152bp和980 bp。预测蛋白分子量为40kD,等电点为6.71。预测发现其不含信号肽,不是一个分泌类蛋白。在序列中含有醇脱氢酶活性位点和NAD结合域。该基因序列高度保守,与其他物种中的功能相似。幼体表达模式与Sp-FPPS的表达模式很相像,而在组织表达分析中表达量最高是在肌肉中,表皮中次之。与Sp-FPPS在不同卵巢发育时期的表达模式极为相似,推断两者的时间表达一致。拟穴青蟹FaD基因（Sp-FaD）的cDNA全长为1749 bp,开放阅读框为1506 bp,编码501个氨基酸。预测蛋白分子量为56kD,等电点为6.2。预测含有醛脱氢酶谷氨酸活性位点,序列相对保守。qPCR结果表达分析表明,FaD在幼体发育的溞状幼体2期、3期和5期变化极为显着,成体组织表达分析在大颚器中表达量最高,在卵巢的发育四期和六期表达尤为显着。2.拟穴青蟹保幼激素酸甲基转移酶的蛋白分析。保幼激素酸甲基转移酶（JHAMT）是JH合成途径中的关键酶,是存在于节肢动物体内的甲基转移酶家族成员。现在有猜测认为它有可能是甲壳动物中MF合成的关键酶。通过构建pET28a-SpJHAMT重组表达载体,转化表达菌株,获得的重组蛋白SpJHAMT,然后进行纯化、复性。从而获得比较纯净的重组蛋白。综上所述,本文对MF合成通路上的三个酶基因进行了初步研究,表明它们的表达可能与MF的合成相关;并对合成MF最后一步的关键酶基因JHAMT成功构建了载体获得了重组蛋白为它的功能验证做好准备,为了更深入的研究MF合成机制奠定了基础。
孙敬蒙[3]（2019）在《哈蟆油多不饱和脂肪酸累积途径及固体分散体制剂的制备工艺研究》文中提出目的:采集不同地点和不同时期的中国林蛙,确定中国林蛙哈蟆油中多不饱和脂肪酸的组成及含量变化规律;对哈蟆油进行转录组测序,得到哈蟆油多不饱和脂肪酸合成途径,并找到关键酶基因;对哈蟆油进行实时荧光定量测定,探讨哈蟆油不同时期的表达量,从而获得高质量的哈蟆油;进一步将获得的高质量哈蟆油采用固体分散体技术制备成剂型,并建立制剂质量标准,对制剂的稳定性和急性毒性进行研究,并进行剂型的免疫实验验证。方法:采集不同地点和不同时期的中国林蛙样品,取中国林蛙的输卵管,-80.0℃冰箱备存,提取哈蟆油中多不饱和脂肪酸并甲酯化,采用气相色谱法测定其多不饱和脂肪酸的含量,采用美国StatView软件分析多不饱和脂肪酸的组成及相对含量;并分析多不饱和脂肪酸的变化规律,探究哈蟆油质量最好的区域和最佳的采集时期。为了确定哈蟆油多不饱和脂肪酸累积途径,对哈蟆油进行转录组测序,生成数据库,并进行分析和统计,获得哈蟆油多不饱和脂肪酸合成途径及影响哈蟆油中多不饱和脂肪酸的关键酶基因。采用Trizol法提取哈蟆油中的RNA,使用Nanodrop 2000超微量紫外/可见光分光光度计对RNA浓度和质量进行检测,采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性;采用Takara公司的试剂盒将哈蟆油中的总RNA反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR检测脂肪酸脱氢酶基因在哈蟆油不同时期中的表达量,与测定各时期哈蟆油中多不饱和脂肪酸的含量相比较,获得高质量的哈蟆油,进一步将获得的高质量哈蟆油采用固体分散体技术制备成剂型,并建立最佳剂型的质量标准,进行稳定性、急性毒性研究,并采用小鼠动物实验进行哈蟆油最佳制剂的免疫实验验证。结果:采用气相色谱法测定中国林蛙不同地点和不同时期中哈蟆油多不饱和脂肪酸含量,结果发现中国吉林省靖宇县三道湖镇浆源中国林蛙养殖厂基地的哈蟆油中多不饱和脂肪酸含量最高,并且发现哈蟆油中的多不饱和脂肪酸含量在散居冬眠期（1112月）时达到最高。通过对哈蟆油转录组测序结果分析,找到哈蟆油多不饱和脂肪酸的合成途径及影响哈蟆油中多不饱和脂肪酸含量的脂肪酸脱氢酶基因。采用实时荧光定量PCR测定哈蟆油不同时期的表达量,发现在散居冬眠期（1112月）时表达量最高。采用固体分散体技术将获得的高质量哈蟆油制备成滴丸剂,基质为聚乙二醇4000,药物与聚乙二醇4000的比例为1:3,冷凝液为甲基硅油（100mm2/s）:轻质液状石蜡（1:1）,药物与基质熔融温度为70℃。建立哈蟆油滴丸质量标准,符合2015版《中国药典》标准,稳定性试验符合要求。证明哈蟆油滴丸属实际无毒级。经口给予小鼠不同剂量的哈蟆油滴丸30天,能增强小鼠迟发型变态反应,说明哈蟆油滴丸能增强细胞免疫功能;并且试验结果表明能提高小鼠单核–巨噬细胞的碳廓清能力,说明哈蟆油滴丸能增强单核-巨噬细胞功能。结论:哈蟆油中的多不饱和脂肪酸含量在中国林蛙散居冬眠期（1112月）时最高,与实时荧光定量PCR测定哈蟆油不同时期的表达量结果相符,并确定哈蟆油多不饱和脂肪酸生物合成的途径,找到关键酶基因;将获得的高质量哈蟆油采用固体分散体技术制备成滴丸剂,质量标准符合2015版《中国药典》规定,免疫试验证明哈蟆油滴丸能提高免疫力。
王正光[4]（2018）在《红壳色中华绒螯蟹遗传多样性的研究》文中指出本实验采用微卫星分子标记方法,研究了红壳色及不同育种家系中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）仔蟹遗传特征,并结合近3代“光合1号”新品种群体遗传多样性参数,对长期人工选育产生的遗传效应进行了分析;通过对比相同养殖环境中不同育种群体,以及不同养殖环境中同一育种群体的生长参数,探讨了不同群体的生长潜力与聚类情况,分析了养殖环境对中华绒螯蟹生长的影响。主要结果如下:1.本研究选用11对微卫星引物,借助Cervus与PopGen 32软件,对红壳色（HK）、红壳色群体中正常壳色（QK）及“光合1号”（GH1）3个群体,共120只蟹,各基因位点的遗传多态性和群体间的遗传分化情况进行分析。结果表明,11对引物中的10对多态信息含量（PIC）>0.5,符合群体遗传评估的要求。GH1、QK与HK群体的有效等位基因数（Ne）分别为3.694 8、3.011 5和2.403 9,观测杂合度（Ho）分别为0.606 5、0.569 2和0.659 9,期望杂合度（He）分别为0.684 8、0.647 8和0.547 8,香农信息指数（I）分别为1.318 5、1.189 5和0.9244。其中HK群体的He与I显着低于GH1群体（P<0.05）。HK群体的固定指数（Fis）多为负值,GH1群体与QK群体的固定指数多为正值,存在群体内近交现象。3个群体的Hardy-Weinberg平衡偏离指数（D）在-0.110 9与0.712 7之间,在NE5、NE16、ES34基因位点上均为负值。GH1群体的D多为负值,其中有9个微卫星位点可能存在杂合子缺失现象。HK与GH1群体之间遗传距离与遗传分化系数（Fst）最大（0.479 9/0.113 3）,遗传相似系数最小（0.618 9）,QK与GH1群体之间遗传距离与Fst最小（0.277 8/0.061 7）,遗传相似系数最大（0.757 5）。UPGMA系统树分析显示GH1与QK群体聚为一支,HK群体单独聚为一支。红壳色中华绒螯蟹受限于“始祖效应”表现为遗传多样性水平较低。因此,建议通过扩大育种群体数量,应用杂交技术继续进行人工选育,以利于这一稀有种质资源的保存。2.选取了2012年、2014年与2016年3代“光合1号”中华绒螯蟹群体,利用7对微卫星引物进行标记分析,检测了育种群体遗传多样性的变化情况。结果表明,7对引物（PIC）>0.5,符合群体遗传评估要求。2012、2014与2016年3个中华绒螯蟹群体的遗传多样性指数均逐年降低,平均等位基因数（Na）从8.5714下降至6.00 0,降低约30%,且2012年与2016年群体之间差异显着（P<0.05）;平均Ne从6.001 5下降至4.493 6,降低约25%,且2012年与2016年群体之间差异显着（P<0.05）;平均I从1.992 4下降至1.558 9,降低约22%,且2012年与2016年群体之间差异显着（P<0.05）;平均He从0.845 9降低至0.764 9,下降约9.6%,且2012年与2016年群体之间差异显着（P<0.05）。其中,平均Ho从0.9716下降至0.6535,降低约32.7%,且2012年与2016年群体之间差异显着（P<0.05）。Hardy-Weinberg平衡检测（HW）显示,2012年群体中,仅ESC20与ESB882个基因位点偏离HW平衡;2014年群体中,仅NE271个基因位点偏离HW平衡;2016年群体中,ES38与NE492个基因位点偏离HW平衡。3.采用室内和稻田围隔2种养殖方式,比较了红壳色（A）、红壳色家系中正常壳色（B）和“光合1号”（C）仔蟹群体之间形态特征差异,并构建聚类图谱。群体间生长差异结果表明:室内环境中A群体的生长速度最快,远大于C与B群体。室外稻田环境中,A、C群体生长速度要优于B群体;室内养殖的NA群体的头胸甲宽、甲长与体质量变异系数（CV）均远远低于NB与NC群体,A群体整齐度最高,稻田条件下的整齐度与室内养殖情况相反,其整齐度最低。环境对同一群体影响的结果表明,60d时,A群体生长参数SGR在室内与稻田环境中均无显着差别,环境对A群体仔蟹的生长影响不明显;B群体室内生长参数SGR显着低于稻田群体,说明B群体对环境变化敏感;C群体在稻田饲养条件下的头胸甲宽与甲长SGR均稍稍大于室内群体,但两者体质量SGR差异不大,说明C群体仔蟹的生长过程易受环境影响。以头胸甲宽、甲长和体质量SGR与CV共6个生长参数作为变量因子做聚类分析,并将其与分子标记聚类图作比较,结果显示:室内条件下3个群体的聚类情况为QK群体仔蟹与GH1群体仔蟹聚为一支后再与HK群体仔蟹汇聚在一起,结果与分子标记聚类分析一致。而在稻田养殖条件下,3个群体的聚类较为混乱,表明环境对生长参数的影响最终导致了聚类的差异。
徐苗苗[5]（2015）在《两种海洋病原微生物快速检测技术的研究》文中进行了进一步梳理副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,简称VP）,是一种革兰氏阴性人鱼共患致病菌。副溶血性弧菌食物中毒与进食含有该菌的食物有关,生食或食入未煮熟的海产品或腌制食品是其主要传播途径。随着海产品消费水平的提高,副溶血性弧菌引起的食物中毒事件呈逐年上升的趋势,由该菌引发的疾病现已跃居食源性疾病之首。锯缘青蟹呼长孤病毒是近年来发现的一种青蟹类病毒,其致死率较高并难以控制,严重影响了青蟹养殖业经济的发展。由于该病毒发现较晚,国内对其进行的研究相对较少。目前,针对副溶血性弧菌的检测技术众多,包括各种分子生物学和免疫学方法。对青蟹呼长孤病毒的检测主要有肉眼症状观察法、传统的组织切片及超薄切片技术,PCR以及其衍生技术。但迄今为止,现有的各种检测技术虽然可以实现高特异性和高灵敏度,但是一般对仪器设备的要求比较高,且需要有熟练的专业技术人员操作,很难应用于基层单位及在病害发生现场进行快速检测。因此,针对上述两种具有严重危害的海洋病原微生物,迫切需要建立一种简便快速、特异性强、灵敏度高且成本低的检测技术,以适用于基层单位和现场的日常监测。交叉引物恒温扩增（CPA）是近几年建立的一种新的恒温扩增技术,该方法在恒温条件下就可以实现对目的片段的大量扩增。将该扩增技术与免疫胶体金技术相结合可实现快速、直观的检测效果,且对设备的要求比较低,操作相对简单。免疫胶体金技术是以胶体金为示踪物,利用抗原抗体特异性结合的原理,实现对抗原或抗体的快速检测。该方法灵敏度高,且对仪器的依赖程度低,操作简单。本研究结合分子生物学和免疫胶体金技术,分别建立了针对副溶血性弧菌和青蟹呼长孤病毒的新型检测技术,主要研究结果如下:（1）CPA-核酸试纸条法快速检测副溶血性弧菌方法的建立:以副溶血性弧菌种特异性溶血基因tlh为靶基因,设计两对扩增引物和一对检测探针。通过对CPA反应体系中的各个影响因子进行优化,最终确定最佳反应体系为:上下游外围引物各0.1μmol/mL,上下游交叉引物各0.6μmol/mL,两条检测探针各0.3μmol/mL,Mg2+浓度为4.0 mmol/mL,甜菜碱浓度0.8 mol/L,dNTPs浓度0.4 mmol/mL,2μl 10×ThermoPol缓冲液,反应温度63℃,反应时间1 h。分别采用核酸试纸条和琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测,结果表明两种检测方法对CPA扩增产物的检测结果一致。通过比较普通PCR法与CPA-试纸条法对副溶血性弧菌纯培养物和基因组检测灵敏度发现,CPA-试纸条对纯培养物的检测限为5.8×102cfu/mL,对基因组的检测限为11.4 pg/mL,其灵敏度是普通PCR的10倍。该方法从扩增到检测完成仅需75 min,为副溶血性弧菌的快速检测提供了一种更高效的技术支持。（2）锯缘青蟹呼肠孤病毒外壳蛋白VP12原核表达体系的建立:以BL21/pET28a为表达载体构建重组表达质粒,通过对诱导表达条件的优化,表达后的重组蛋白量占总蛋白的83%,实现了重组蛋白VP12的高效表达。（3）锯缘青蟹呼肠孤病毒外壳蛋白VP12多克隆抗体的制备:以纯化的VP12重组蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经Western blotting分析该抗体能特异性的识别VP12蛋白,通过间接ELSIA测定该抗体的效价为1:51200。（4）锯缘青蟹呼肠孤病毒外壳蛋白VP12单克隆抗体的制备:以VP12重组蛋白为抗原进行单克隆抗体的制备,采用常规免疫技术,通过脾细胞与杂交瘤细胞的融合,成功制备了5株抗VP12细胞株。最后经Dot blotting分析,细胞株1M9和2N5产生的抗体亲和力较高,因此,选取McAb 1M9和McAb 2N5作为后续免疫胶体金制备的抗体材料。采用硫酸铵与protein G亲和层析法对单克隆抗体进行纯化,纯化后的抗体浓度分别为4.004mg/mL、4.078 mg/mL,且经SDS-PAGE电泳检测只有重链和轻链两条特异性条带。Western blotting实验结果表明抗体特异性较好,经间接ELISA测得两个抗体1M9和2N5的效价分别为1:102400和1:51200。（5）免疫胶体金试纸条的制备及其检测应用:采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20nm的胶体金颗粒,对制备的胶体金进行透射电镜和紫外可见光谱分析,证明制备的胶体金颗粒均一、分布均匀,质量较好,可以用其标记抗体。用1M9抗体作为金标单克隆抗体,同时分别将2N5单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线。通过一系列优化最终确定金标抗体的最低标记浓度为37.5μL每毫升胶体金溶液,单克隆抗体2N5和羊抗鼠IgG的包被浓度均分别为0.75 mg/mL和1.0 mg/mL。在此基础上将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按顺序依次组装成一次性免疫胶体金层析试纸条。用试纸条分别对稀释后的VP12重组抗原和呼肠孤病毒颗粒进行检测。检测结果表明,该试纸条对纯抗原的检测灵敏度为3.8μg/mL,对病毒颗粒的检测灵敏度为20.4μg/mL。取对虾白班综合症病毒和无菌水作为阴性对照检测其特异性,结果显示该试纸条只对锯缘青蟹呼肠孤病毒的检测结果呈阳性,具有较好的特异性。本研究建立的针对两种病原微生物的检测方法,具有快速、灵敏、高效、直观的检测特点,为两种病原微生物的早期预防、检验检疫、快速诊断、监测防控提供了较为实用的检测工具。
刘春云[6]（2015）在《拟穴青蟹VIH基因的克隆、重组表达和转录调控的初步研究》文中指出卵黄抑制激素（vitellogenesis-inhibiting hormone,VIH）是甲壳动物高血糖激素家族特有的成员之一,作为一种重要的神经肽激素,在调控甲壳动物卵黄蛋白原的生成过程中起到关键的作用。本研究是在课题组已有的部分VIH基因片段的基础上,通过Genome walker、Tail-PCR和常规PCR等技术克隆获得该基因的cDNA全长和基因组DNA序列以及5’调控区序列。并结合体外重组表达、细胞培养、瞬时转染和双荧光素酶报告基因检测等方法,在转录调控和翻译水平揭示VIH的结构特征和本身的转录调控机制。主要研究结果如下:1)采用Genome walker技术克隆出SpVIH基因的cDNA全长634 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）为375 bp,可编码125个氨基酸,包括信号肽（1-22aa）和成熟肽两部分。成熟肽包括CHH家族中6个位置较为保守的半胱氨酸（Cys）残基,同时在成熟肽第12位有CHH家族II型肽特有的Gly12。同源性比对和系统进化树分析均表明,SpVIH属于CHH家族II型肽。空间结构分析表明,其与南美白对虾（LvVIH）的空间结构高度相似,由5个α螺旋和多个无规则卷曲组成。2)采用常规PCR技术首次克隆出SpVIH基因的gDNA全长790 bp,由2个外显子和1个内含子组成,外显子和内含子均位于ORF内,内含子在SpVIH成熟肽Arg（AGG）和Arg（AGG）的密码子之间。其内含子和外显子之间并不遵循典型的“GT-AG”或“AT-AC”规则。3)通过原核表达技术对SpVIH的成熟肽部分进行体外重组表达,在29 kDa和31 kDa左右同时出现两条蛋白条带。经液相色谱质谱联用分析显示,上下两种蛋白测出的肽段序列与已知蛋白序列的覆盖率分别为57.8%和61.8%,均认为是目的条带。同时对29 kDa左右的蛋白进行镍柱纯化,并制备多克隆抗体。经western blot验证后,发现该抗体能特异地和这两个大小不一的蛋白结合。4)通过Genome walker和Tail-PCR联用技术克隆获得VIH基因的5’上游调控区序列,从翻译起始位点（ATG）起,共3070 bp,从预测的转录起始位点（A）起,共2398 bp。CpG岛预测软件分析其不含CpG岛。通过生物信息学预测软件和启动子活性分析表明,其核心启动子区位于-203 bp—+213 bp之间,包含在线软件预测的转录起始位点区域。在转录起始位点（A）上游-28 bp处存在TATA box。将pSpVIH-1（含核心启动子区）重组至转基因载体pEGFP-1上,在HEK293FT细胞中能驱动EGFP的表达。5)不同长度缺失片段启动子活性分析表明,在pSpVIH-4和pSpVIH-6之间可能同时存在正调控和负调控的转录因子。对该区域预测的Sox9结合位点进行位点突变和活性分析,发现突变该位点其活性发生显着性降低（p<0.05）,表明Sox9可能是正调控拟穴青蟹VIH基因表达的重要转录因子。
刘志强,陈洁,邱高峰[7]（2014）在《中华绒螯蟹EsSox21b-like基因干扰载体的构建及原核表达制备dsRNA》文中认为Sox（SRY-related HMG-box）基因是一类重要的转录因子,在动物的性别分化与决定、器官的发生等方面具有重要的调控作用。旨在利用RNA干扰技术证实该基因的功能,将EsSox21b-like基因617 bp的片段克隆至含有两个T7启动子的L4440载体上,构建了EsSox21b-like-L4440干扰载体,将该重组载体转化至RNaseⅢ缺陷型的HT115菌株中,经IPTG诱导菌株体内转录,获得了EsSox21b-like正义和反义单链RNA,经过变性、退火形成大量双链RNA（EsSox21b-like-dsRNA）,能满足以后应用RNA干扰试验对于EsSox21b-like基因功能的研究。
高洁[8]（2013）在《拟穴青蟹性腺差异的转录组学分析》文中进行了进一步梳理拟穴青蟹（Scylla paramamosain）在我国东南沿海分布较广泛,是主要的养殖蟹类之一,雌雄个体间存在显着不同的生物学特性和经济性状,因此关于青蟹性别决定和性腺发育的分子机制的研究一直是该领域的热点。随着下一代测序技术的广泛应用,本课题采用454 GS FLX技术对拟穴青蟹精巢和卵巢组织进行高通量转录组测序,在此基础上筛选并分析重要功能基因,以期为青蟹雌雄分化和性腺发育分子机制的进一步研究提供参考资料。通过Roche 454测序,两个文库共产生365116 reads（精巢171962,卵巢193154）,平均长度为285.4 bp。经过拼接组装,共生成21791 isotigs（精巢12439,卵巢9352）和22814singlets（精巢14241,卵巢8573）。通过与Nr蛋白数据库进行blastx比对,共有3471 unique转录子序列（精巢1718,卵巢1753）获得注释。Gene Ontology和KEGG分析表明共有224条unique转录子序列注释上224个酶分类学编号（EC number）,参与了174条代谢通路。生物信息学分析发现有4199条共有转录子在精巢和卵巢中的表达具有显着差异（Fisher P<0.05）,卵巢文库中共获得10522条特异表达转录子,精巢文库中共获得19013条特异表达转录子。经过半定量PCR和实时定量PCR验证,我们确认了33条转录子在卵巢特异表达,13条转录子在精巢特异表达,17条转录子在精巢和卵巢中的表达具有显着差异。此外,我们鉴定了8610个潜在的SSR位点和23879个潜在的SNP位点。Sp-OTUB基因cDNA全长1261 bp,开放阅读框804 bp,编码267个氨基酸。该蛋白序列中包含一个OTU样的半胱氨酸蛋白酶催化结构域和一个由半胱氨酸（C）、天冬氨酸（D）和组氨酸（H）组成的催化三联体。实时定量PCR结果显示,Sp-OTUB在成熟拟穴青蟹各组织器官中均有表达,其中在血淋巴中的表达量最大,精巢中表达量最低。在卵巢发育过程中,Sp-OTUB的表达量在卵巢增殖期为最大,与其他各时期具有显着差异;在精巢发育各阶段,Sp-OTUB表达量在精子细胞期达到最大,显着高于精母细胞期和成熟精子期。同源系统进化分析Sp-OTUB与大多数物种的OTUB1聚为一支,与肩突硬蜱（Ixodes scapularis）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）亲缘关系最近。Sp-wds基因cDNA全长1433 bp,开放阅读框975 bp,编码325个氨基酸。该蛋白包含7个WD重复基序,形成一个高度对称的环状“螺旋桨”样结构。荧光定量PCR结果显示,Sp-wds基因在成熟青蟹各组织器官中均有表达,在卵巢的表达量显着高于其他各组织（P<0.5）,其次在精巢的表达水平也较高,与其他各组织具有显着差异。卵巢发育过程中,Sp-wds基因的表达呈现先上升后下降的趋势,在卵黄生成中期表达量最高并显着高于其他各时期（P<0.5）;在精巢发育各时期,Sp-wds的表达水平随着精巢的成熟表达水平渐渐降低,在成熟精子期降至最低,显着低于其余两个时期（P<0.5）。
岳磊磊[9]（2012）在《凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子和细胞黏附蛋白基因的克隆与序列分析》文中研究指明无脊椎动物没有真正的抗体和获得性免疫系统,主要依靠先天性免疫系统来抵御外来病原微生物的侵害。酚氧化酶原激活系统（Prophenoloxidase activating system, pro-PO）是无脊椎动物先天免疫机制中具有重要作用的免疫系统。酚氧化酶原激活因子（prophenoloxidase activating factor, PPAF）和细胞黏附蛋白（Peroxinectin, PX）基因是酚氧化酶原激活系统中的两个重要因子,这些免疫相关因子是如何抵御病原微生物入侵,如何参与机体的免疫活动一直以来受到广泛关注,因此本研究通过RACE方法首次克隆了PPAF的cDNA全长（GenBank登录号JQ684529）,及PX基因的部分序列,并对2个基因序列进行初步分析；通过半定量PCR分别对2个基因进行了不同组织的表达谱分析,研究结果如下：1.PPAF基因cDNA全长1986bp,其中含有一个1629bp开放阅读框（ORF）,两翼分别存在21bp（5’端）和336bp（3’端）的非翻译区。该基因的开放阅读框共编码542个氨基酸,以SMART软件分析该氨基酸序列,269-517a区域是其功能域,是胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶；494-502a区域有一个ALPHA-2巨球型免疫蛋白功能位点；316-321a区域有一个组氨酸酶活性位点。进化树分析表明凡纳滨对虾PPAF基因与斑节对虾的同源性最高,与果蝇、蚊的同源性最低。通过半定量PCR分析发现该基因在正常对虾的心脏、肝胰腺、肠、胃和肌肉中的表达量没有差别,血液中的表达量明显高于其他组织；在感染IHHNV病毒的对虾的组织中的表达量下降明显,但是血液中的表达量仍明显高于其他组织。2.PX基因部分cDNA序列长度为1529bp,分析发现该序列含有1个1308bp的开放阅读框（ORF）,3’端含有1个长度为221bp的非翻译区,开放阅读框共编码436个氨基酸。所获得的PX氨基酸序列理论等电点为4.64,分子量为48.86945KDa。经Signal P软件分析发现此氨基酸序列在72-86a区域有信号肽特征,82a是信号肽剪切位点的可能性最大。通过Motif Scan程序对其氨基酸序列进行分析,发现该氨基酸序列在其336-378a处有氧化物酶功能域；在172-179a处有一个八肽铜锚定位点；进化性分析表明PX序列与斑节对虾编码的氨基酸序列最高,与果蝇的相似度最低；半定量PCR分析发现该基因在正常对虾的血液中表达量最高,肝胰腺次之,在心脏、肠、胃和肌肉中的表达量没有差别,该基因在IHHNV病毒感染对虾的血液、心脏、肝胰腺、肠、胃和肌肉中的表达量下降明显,但在血液和肝胰腺中的表达量仍比其他组织要高。
臧云鹏[10]（2011）在《仿刺参微卫星DNA标记的筛选与应用及性别差异研究初探》文中研究说明1.利用FIASCO的方法构建了刺参（CA）n的微卫星DNA富集文库,检测结果证明该微卫星DNA文库的富集效率为56.3%。测序得到110条含有微卫星DNA的序列的克隆,共得到118个微卫星DNA位点,其中完美型的微卫星DNA共83个,占70.4%;非完美型的微卫星DNA共30个,占25.4%;复合型的微卫星DNA共5个,占4.2%。重复次数在59次之间的有88个,占73.5%,重复次数在10次以上的有29个,占24.8%。根据所分离的微卫星DNA序列,共设计了84对引物。结果表明FIASCO方法可以较好的应用于刺参微卫星DNA位点的分离。这些微卫星DNA标记的获得将为刺参群体遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、分子标记辅助育种等研究奠定良好的基础。2.利用设计的20对微卫星DNA标记引物对采自中国青岛、韩国木浦、韩国江陵、日本新泻以及俄罗斯海明崴5个地理群体的仿刺参以及美国沿海的八角参进行了微卫星DNA多态性筛选、遗传多样性水平以及遗传结构分析。结果表明,20个位点均表现出多态性,共检测出231个等位基因,各位点分别扩增得到320个等位基因,平均每个位点的等位基因数为11.6个。20个位点在6个群体中不同程度的偏离遗传平衡（p<0.05）,所有群体在整体上均表现为杂合子缺失（Fis>0）;5个仿刺参群体间的遗传相似系数在0.71以上,相似性较高,而仿刺参群体与八角参的相似性则较低。聚类分析结果表明,中国群体与韩国西海岸群体聚类成一支,而俄罗斯群体、韩国东海岸群体和日本群体聚类成另外一支,聚类的先后与它们在地理分布上的海域位置有一定的相关性。本研究所筛选的多态性微卫星DNA分子标记将为刺参群体遗传结构分析、刺参遗传连锁图谱构建和分子标记辅助育种研究提供基础。此外,不同群体刺参遗传结构的解析结果也为刺参良种选育相关研究提供基础数据。3.用攻毒的方法选出感病刺参和抗病刺参各15头,组成感病群体和抗病群体。用20对微卫星引物对两个群体刺参个体的基因组DNA进行扩增,卡方检验各等位基因在两个群体间出现频数的差异,得到与抗病正相关的特异性遗传标记3个,与抗病负相关的特异性遗传标记3个。用13对多态性引物对两个群体的遗传多样性水平及遗传结构进行了分析,结果发现,两个群体的遗传多样性水平均较高,抗病群体的遗传多样性水平要高于感病群体。两个群体间的遗传分化指数为0.0478,说明两个群体间存在轻度的遗传分化;两个群体间的遗传距离为0.1685,遗传相似性指数为0.8449。这些抗病相关的遗传标记将为刺参分子辅助育种提供数据支持。4.在刺参生殖季节采集刺参,采用组织学研究方法,以刺参体壁样品为对照,观察了雌雄刺参生殖孔及周围的肌肉组织,在雄参和雌参生殖孔及周围肌肉的横切及纵切切片中均发现了生殖管。雌雄刺参的生殖管在直径大小、横切形状及周围组织结构3方面均有不同。雄参的生殖管直径小,横切形状为圆形或心形,周围没有纤维状组织;刺参的生殖管直径大,横切形状为梭形,较大的生殖管周围有纤维状组织。本研究的发现为刺参性别鉴定技术提供了参考,为刺参生殖孔的形成以及性别分化机制等研究奠定了基础。5.利用AFLP技术,应用96对AFLP引物组合,对刺参雌雄基因组DNA进行检测,筛选与刺参性别相关的分子标记。实验中共扩增出2753个位点,未发现性别相关的特异性标记,发现了212个位点在雌性和雄性个体中出现的比例存在很大差异（大于50%）,用这212个位点绘制刺参个体聚类图,表明这212个多态位点与刺参性别之间存在很大的相关性。本研究所积累的大量AFLP分析结果和数据,可作为刺参遗传背景资料,为刺参性别以及其他方面的进一步研究提供参考。
二、锯缘青蟹Sox基因的PCR扩增(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、锯缘青蟹Sox基因的PCR扩增(英文)（论文提纲范文）
（1）拟穴青蟹细丝蛋白C的分子克隆及抗原表位分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 食物过敏与食物过敏原 |
| 1.1.1 食物过敏现状 |
| 1.1.2 食物过敏反应机制 |
| 1.1.3 食物过敏原与组分诊断 |
| 1.2 水产食物过敏原 |
| 1.2.1 鱼类过敏原 |
| 1.2.2 软体贝类过敏原 |
| 1.2.3 甲壳类过敏原 |
| 1.2.4 水产食物过敏原的免疫交叉反应 |
| 1.3 水产食物过敏原抗原表位 |
| 1.3.1 抗原表位的分类与研究方法 |
| 1.3.2 水产食物过敏原的抗原表位 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 原材料 |
| 2.1.2 甲壳类过敏患者血清 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 拟穴青蟹FLN c的纯化及鉴定 |
| 2.2.2 拟穴青蟹FLN c的多克隆抗体制备 |
| 2.2.3 拟穴青蟹FLN c的分子克隆 |
| 2.2.4 拟穴青蟹FLN c的生物信息学分析 |
| 2.2.5 拟穴青蟹FLN c的重组表达 |
| 2.2.6 拟穴青蟹nFLN c与 rFLN c的性质比较 |
| 2.2.7 甲壳类及软体类FLN c的免疫交叉反应分析 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 拟穴青蟹FLN c的纯化鉴定及抗体制备 |
| 3.1.1 FLN c的纯化及质谱鉴定 |
| 3.1.2 FLN c的 Native-PAGE及双向电泳分析 |
| 3.1.3 FLN c的 PAS染色分析 |
| 3.1.4 FLN c多克隆抗体制备及效价分析 |
| 3.2 拟穴青蟹FLN c的分子克隆及生物信息学分析 |
| 3.2.1 FLN c的分子克隆 |
| 3.2.2 FLN c的氨基酸序列分析 |
| 3.2.3 FLN c的二级结构及结构域分析 |
| 3.2.4 FLN c的三级结构分析 |
| 3.2.5 细丝蛋白家族系统进化树分析 |
| 3.2.6 FLN c的抗原表位分析 |
| 3.3 拟穴青蟹FLN c的重组表达 |
| 3.3.1 载体构建及重组表达 |
| 3.3.2 重组蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.4 拟穴青蟹n FLN c与 rFLN c的比较分析 |
| 3.4.1 理化特性的比较分析 |
| 3.4.2 二级结构及表面疏水性的比较分析 |
| 3.4.3 免疫结合活性的比较分析 |
| 3.5 拟穴青蟹FLN c的结构域重组蛋白表达及表位区域分析 |
| 3.5.1 FLN c不同结构域的载体构建及原核表达 |
| 3.5.2 FLN c不同结构域重组蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.5.3 FLN c不同结构域重组蛋白的免疫结合活性分析 |
| 3.6 甲壳类及软体类FLN c的免疫交叉反应分析 |
| 3.6.1 甲壳类及软体类FLN c的 IgG结合活性分析 |
| 3.6.2 甲壳类及软体类FLN c的 IgE结合活性分析 |
| 3.6.3 甲壳类及软体类FLN c的抑制性Western blot分析 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 拟穴青蟹FLN c的分子克隆及生物信息学分析 |
| 4.2 拟穴青蟹nFLN c与 rFLN c的性质比较 |
| 4.3 拟穴青蟹FLN c的抗原表位区域分析 |
| 4.4 甲壳类及软体类FLN c的免疫交叉反应分析 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间科研成果情况 |
（2）拟穴青蟹MF合成通路基因的克隆及表达分析和保幼激素酸甲基转移酶的蛋白表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 甲壳动物中甲基法尼酯的介绍 |
| 1.2 MF的合成过程 |
| 1.3 MF合成的调控 |
| 1.3.1 眼柄的调控 |
| 1.3.2 神经肽的调控 |
| 1.3.3 信号转导的调控 |
| 1.3.4 MF的作用机制 |
| 1.4 甲基法尼酯的降解过程 |
| 1.5 甲基法尼酯的功能 |
| 1.5.1 调控甲壳类的蜕皮生长 |
| 1.5.2 调控甲壳类的性腺发育 |
| 1.6 JHAMT的研究进展 |
| 1.7 甲基转移酶的简介 |
| 1.7.1 甲基转移酶的功能 |
| 1.7.2 甲基转移酶的分类 |
| 1.8 本研究的意义和目的 |
| 第二章 拟穴青蟹MF合成通路基因的克隆和表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 拟穴青蟹的FPPS基因的克隆及表达分析 |
| 2.2.2 Sp-FoD基因的克隆和表达分析 |
| 2.2.3 Sp-FaD基因的克隆和表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 拟穴青蟹JHAMT基因的蛋白表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Sp-JHAMT的生物学信息 |
| 3.2.2 Sp-JHAMT基因PCR扩增产物 |
| 3.2.3 pET28a载体双酶切 |
| 3.2.4 重组质粒菌落PCR验证和双酶切鉴定 |
| 3.2.5 重组蛋白表达分析 |
| 3.2.6 重组蛋白纯化 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 小结 |
| 4.1 研究总结 |
| 4.2 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件 |
| 致谢 |
（3）哈蟆油多不饱和脂肪酸累积途径及固体分散体制剂的制备工艺研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 实验研究 |
| 第一章 哈蟆油多不饱和脂肪酸测定 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 试验设备 |
| 3 研究气相色谱条件 |
| 4 哈蟆油多不饱和脂肪酸测定 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二章 哈蟆油多不饱和脂肪酸生物合成途径的研究及关键酶基因的筛选 |
| 1 动物 |
| 2 林蛙输卵管样本的转录物组测序分析 |
| 3 小结 |
| 第三章 哈蟆油表达量的测定 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 试验设备 |
| 3 试验动物 |
| 4 中国林蛙解剖 |
| 5 哈蟆油RNA的提取 |
| 6 哈蟆油总RNA反转录为cDNA |
| 7 内参基因的选择和引物设计 |
| 8 哈蟆油cDNA实时荧光定量测定 |
| 9 小结 |
| 第四章 基于固体分散体技术制备的成型工艺研究及质量标准的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 试验方法 |
| 3 哈蟆油滴丸的质量标准 |
| 4 小结 |
| 第五章 哈蟆油滴丸免疫实验验证 |
| 1 材料 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 1 哈蟆油多不饱和脂肪酸变化规律 |
| 2 哈蟆油的转录组测序 |
| 3 哈蟆油表达量变化 |
| 4 采用固定分散体技术制备哈蟆油滴丸 |
| 5 哈蟆油滴丸免疫实验验证 |
| 本文创新点 |
| 1 中国林蛙安全度过冬眠期机制 |
| 2 在美国Genbank上传基因序列 |
| 3 从哈蟆油多不饱和脂肪酸的组成及含量控制哈蟆油质量 |
| 4 采用固体分散体技术将哈蟆油制备成滴丸剂 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（4）红壳色中华绒螯蟹遗传多样性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 分子标记 |
| 1.1.1 分子标记的定义与特点 |
| 1.1.2 常用的分子标记技术 |
| 1.2 微卫星标记在虾蟹育种中的研究与应用 |
| 1.2.1 微卫星标记在虾蟹育种中的研究进展 |
| 1.3 中华绒螯蟹与数量性状研究 |
| 1.3.1 中华绒螯蟹介绍 |
| 1.3.2 数量性状的相关研究 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 红壳色中华绒螯蟹群体遗传特征微卫星分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 常用试剂的配置 |
| 2.1.5 中华绒螯蟹DNA的提取 |
| 2.1.6 DNA的检测 |
| 2.1.7 微卫星引物 |
| 2.1.8 PCR产物扩增 |
| 2.1.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 |
| 2.2 数据处理与分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 中华绒螯蟹基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 微卫星扩增结果检测 |
| 2.3.3 中华绒螯蟹3个群体的遗传多样性分析 |
| 2.3.4 中华绒螯蟹3个群体的遗传分化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 群体的遗传多样性 |
| 2.4.2 杂合子的缺失现象 |
| 2.4.3 红壳中华绒螯蟹群体的遗传结构 |
| 第三章 多代选育对中华绒螯蟹群体遗传多样性的影响研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样本收集 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 常用试剂的配置 |
| 3.1.5 中华绒螯蟹DNA提取 |
| 3.1.6 基因组DNA检测 |
| 3.1.7 微卫星引物 |
| 3.1.8 PCR产物扩增 |
| 3.1.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 |
| 3.2 数据处理 |
| 3.3 数据结果与分析 |
| 3.4 不同时期3个中华绒螯蟹群体遗传多样性差异分析 |
| 第四章 养殖环境对红壳中华绒螯蟹生长的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 指标计算与数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 相同环境下3个群体之间的生长差异 |
| 4.2.2 不同环境3个种群仔蟹生长比较 |
| 4.2.3 室内与稻田群体聚类图 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 群体差异对生长与变异的影响 |
| 4.3.2 环境差异对相同群体生长与变异的影响 |
| 4.3.3 环境差异对群体的聚类影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）两种海洋病原微生物快速检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 海洋中主要的病原微生物 |
| 1.1.1 海洋环境 |
| 1.1.2 海洋病原微生物的来源 |
| 1.1.3 海洋病原微生物的种类及危害 |
| 1.1.4 副溶血性弧菌研究进展 |
| 1.1.5 锯缘青蟹呼肠孤病毒研究进展 |
| 1.2 海洋病原微生物检测技术 |
| 1.2.1 免疫学方法 |
| 1.2.2 分子学方法 |
| 1.2.3 其他方法 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第2章 CPA-核酸试纸条法快速检测副溶血性弧菌方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器表 |
| 2.1.4 主要试剂及培养基的配制 |
| 2.1.5 引物及探针的设计 |
| 2.1.6 副溶血性弧菌tlh基因重组克隆质粒的构建 |
| 2.1.7 CPA扩增引物和探针的可行性验证 |
| 2.1.8 CPA扩增产物的检测 |
| 2.1.9 CPA反应体系及反应条件的优化 |
| 2.1.10 CPA法检测特异性和灵敏度的确定 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 副溶血性弧菌tlh基因片段阳性克隆质粒的构建及验证 |
| 2.2.2 副溶血性弧菌CPA法扩增体系的初步建立 |
| 2.2.3 反应体系的优化结果 |
| 2.2.4 CPA法检测副溶血性弧菌特异性分析 |
| 2.2.5 CPA法与传统PCR法检测灵敏度的比较 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 引物设计 |
| 3.1.3 重组克隆质粒构建 |
| 3.1.4 青蟹呼长孤病毒VP12蛋白序列生物信息学分析 |
| 3.1.5 重组表达质粒的构建 |
| 3.1.6 重组蛋白的诱导表达、纯化及免疫印迹分析 |
| 3.1.7 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12多克隆抗体的制备 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 重组克隆质粒的验证 |
| 3.2.2 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12结构特征 |
| 3.2.3 重组表达质粒的构建及验证 |
| 3.2.4 重组蛋白的诱导表达、纯化及免疫印迹分析 |
| 3.2.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12单克隆抗体的制备 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 小鼠免疫 |
| 4.1.3 细胞融合 |
| 4.1.4 阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆 |
| 4.1.5 杂交瘤细胞的冻存及复苏 |
| 4.1.6 腹水的制备 |
| 4.1.7 Dot blotting检测抗体灵敏度 |
| 4.1.8 腹水单克隆抗体的纯化 |
| 4.1.9 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 4.1.10 间接ELISA法测定单克隆抗体效价 |
| 4.1.11 单克隆抗体的Western blotting分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 骨髓瘤细胞的准备 |
| 4.2.2 融合细胞的鉴定 |
| 4.2.3 Dot blotting分析 |
| 4.2.4 单克隆抗体 1M9和 2N5纯化效果的SDS-PAGE电泳分析 |
| 4.2.5 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 4.2.6 抗体效价的测定 |
| 4.2.7 抗体的Western blotting分析 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 免疫胶体金试纸条检测方法的建立 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 胶体金颗粒的制备 |
| 5.1.3 胶体金与金标抗体最佳标记条件的确定 |
| 5.1.4 胶体金探针的制备及纯化 |
| 5.1.5 金标垫的预处理 |
| 5.1.6 金标垫、检测线、质控线上抗体最佳喷涂量的确定 |
| 5.1.7 封闭液的确定 |
| 5.1.8 试纸条的组装 |
| 5.1.9 试纸条的使用方法及结果判读 |
| 5.1.10 试纸条检测灵敏度确定 |
| 5.1.11 试纸条检测特异性验证 |
| 5.2 结果分析 |
| 5.2.1 胶体金质量的鉴定 |
| 5.2.2 单克隆抗体与胶体金标记的最佳pH |
| 5.2.3 单克隆抗体与胶体金标记最低标记量 |
| 5.2.4 金标垫处理液的选择 |
| 5.2.5 金标抗体稀释浓度 |
| 5.2.6 NC膜封闭液的优化 |
| 5.2.7 NC膜上最低抗体包被浓度的确定 |
| 5.2.8 试纸条灵敏度的验证 |
| 5.2.9 试纸条特异性的验证 |
| 5.3 分析与讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 本论文的主要结论 |
| 6.2 本论文的主要创新点 |
| 6.3 本论文的研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表的学术论文 |
（6）拟穴青蟹VIH基因的克隆、重组表达和转录调控的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 拟穴青蟹生物学特性 |
| 1.2 甲壳动物眼柄神经内分泌系统 |
| 1.3 甲壳动物性腺抑制激素研究概述 |
| 1.4 启动子的研究概述 |
| 1.4.1 真核生物启动子的相关概念 |
| 1.4.2 真核生物启动子的研究方法 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 主要研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 主要技术路线 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验用菌株、质粒载体和细胞株 |
| 2.1.3 主要试剂和仪器 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取和cDNA第一条模板链的制备 |
| 2.2.2 基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 GenomeWalker |
| 2.2.4 Tail-PCR |
| 2.2.5 原核表达 |
| 2.2.6 Westernblot |
| 2.2.7 液相色谱质谱联用 |
| 2.2.8 启动子活性分析 |
| 2.2.9 生物信息学软件分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 SpVIH基因的cDNA序列分析 |
| 3.2 SpVIH基因组序列分析 |
| 3.3 氨基酸同源性分析 |
| 3.4 系统进化树分析 |
| 3.5 SpVIH空间结构的预测 |
| 3.6 原核表达 |
| 3.6.1 含酶切位点目的片段的获得 |
| 3.6.2 重组表达载体pET-32a-VIH的构建 |
| 3.6.3 重组表达载体pET-32a-VIH的诱导表达 |
| 3.6.4 多克隆抗体的制备、ELISA检测和Westernblot |
| 3.7 液相色谱质谱联用 |
| 3.8 SpVIH基因启动子的克隆和功能分析 |
| 3.8.1 SpVIH基因5’调控区的克隆和预测分析 |
| 3.8.2 不同长度缺失片段的扩增 |
| 3.8.3 不同长度缺失片段重组载体双酶切验证 |
| 3.8.4 转录起始位点的确定 |
| 3.8.5 转基因报告质粒pEGFP-SpVIH-1的表达情况 |
| 3.8.6 不同片段长度启动子活性分析 |
| 3.8.7 位点突变分析 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 SpVIH基因的克隆分析 |
| 4.2 SpVIH的蛋白表达 |
| 4.3 SpVIH的启动子活性分析 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表的学术论文 |
（7）中华绒螯蟹EsSox21b-like基因干扰载体的构建及原核表达制备dsRNA（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 卵巢RNA提取及c DNA第一链的合成 |
| 1.2.2 RNA干扰片段的选定与引物设计 |
| 1.2.3 重组体的构建 |
| 1.2.4 阳性克隆的筛选 |
| 1.2.5 ds RNA的合成 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组载体的构建 |
| 2.2 阳性菌落的筛选 |
| 2.3 原核表达制备Es Sox21b-like-ds RNA |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（8）拟穴青蟹性腺差异的转录组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 转录组测序的发展与应用 |
| 1.1.1 转录组与转录组学 |
| 1.1.2 测序技术的发展 |
| 1.1.3 转录组测序的应用 |
| 1.2 拟穴青蟹性腺发育相关基因研究进展 |
| 1.2.1 拟穴青蟹简介 |
| 1.2.2 性腺发育研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 1.4 本课题的研究内容与技术路线 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 主要技术路线 |
| 第2章 基于 454 GS FLX高通量测序的拟穴青蟹的性腺转录组分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 样品准备与高通量测序 |
| 2.1.4 数据处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 EST序列分析及拼接组装 |
| 2.2.2 Unigene序列功能注释 |
| 2.2.3 基于Gene Ontology和KEGG分析的功能分类 |
| 2.2.4 分子标记的鉴定 |
| 2.2.5 差异表达基因和特异表达基因的分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 拟穴青蟹转录组数据的生物信息学分析 |
| 2.3.2 性腺差异/特异表达基因的分析 |
| 2.3.3 与性腺发育相关的通路 |
| 第3章 性腺发育相关基因的克隆和表达分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 青蟹材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 总RNA的提取及基因组DNA的去除 |
| 3.2.2 SMART-RACE技术获取基因cDNA全长 |
| 3.2.3 割胶回收目的片段 |
| 3.2.4 与载体连接 |
| 3.2.5 转化 |
| 3.2.6 单克隆检测 |
| 3.2.7 生物信息学分析 |
| 3.2.8 实时荧光定量PCR（real-time PCR）反应体系及条件 |
| 3.2.9 石蜡切片 |
| 3.2.10 HE染色 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Sp-OTUB基因克隆与表达分析 |
| 3.3.2 Sp-wds基因克隆与表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 OTUB |
| 3.4.2 wds |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表的学术论文和研究成果 |
（9）凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子和细胞黏附蛋白基因的克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 凡纳滨对虾的免疫系统概述 |
| 1.2.1 物理屏障 |
| 1.2.2 细胞免疫系统 |
| 1.2.2.1 细胞吞噬 |
| 1.2.2.2 细胞粘连 |
| 1.2.2.3 包囊作用和结节形成 |
| 1.2.3 体液免疫 |
| 1.2.3.1 抗菌肽(anti-microbial peptides) |
| 1.2.3.2 凝集素 |
| 1.2.3.3 血淋巴凝结 |
| 1.2.3.4 溶菌酶 |
| 1.2.3.5 血蓝蛋白 |
| 1.2.3.6 酚氧化酶原系统 |
| 1.3 酚氧化酶原激活系统概述 |
| 1.3.1 酚氧化酶原和酚氧化酶 |
| 1.4 酚氧化酶原激活因子及其研究进展 |
| 1.5 Peroxinectin及其研究进展 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子全长cDNA克隆及序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.3.1 攻毒及样品采集 |
| 2.1.3.2 总RNA的提取与cDNA第一链合成 |
| 2.1.3.3 酚氧化酶原激活因子cDNA的克隆及测序 |
| 2.1.3.3.1 酚氧化酶原激活因子部分cDNA的克隆及测序 |
| 2.1.3.3.2 酚氧化酶原激活因子RACE扩增、克隆与测序 |
| 2.1.3.4 序列的拼接与生物信息学分析 |
| 2.1.3.5 半定量RT-PCR |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 PPAF基因的分离鉴定与生物信息学分析 |
| 2.2.2.1 凡纳滨对虾PPAF基因cDNA的分离与鉴定 |
| 2.2.2.2 凡纳滨对虾PPAF基因RACE的分离与鉴定 |
| 2.2.2.3 凡纳滨对虾PPAF基因序列分析 |
| 2.2.2.4 PPAF氨基酸序列功能分析 |
| 2.2.2.5 凡纳滨对虾PPAF进化树的构建 |
| 2.2.3 半定量PCR分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 凡纳滨对虾细胞黏附蛋白基因克隆及序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.3.1 细胞黏附蛋白基因RACE扩增、克隆与测序 |
| 3.1.3.2 序列的拼接与生物信息学分析 |
| 3.1.3.3 半定量RT-PCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 凡纳滨对虾PX基因RACE的分离与鉴定 |
| 3.3.2 凡纳滨对虾PX基因序列分析 |
| 3.3.3 凡纳滨对虾PX氨基酸序列比对与功能位点预测 |
| 3.3.4 半定量PCR检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文情况 |
（10）仿刺参微卫星DNA标记的筛选与应用及性别差异研究初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 遗传标记及其应用 |
| 1.1 遗传标记的概念 |
| 1.2 遗传标记的分类 |
| 1.3 目前常用的分子标记 |
| 2 微卫星DNA 标记及其应用进展 |
| 2.1 微卫星DNA 的概念、分类 |
| 2.2 微卫星DNA 的形成机理和功能 |
| 2.3 微卫星DNA 技术的基本原理 |
| 2.4 微卫星DNA 位点获得的方法 |
| 2.5 微卫星DNA 标记在水产动物中的应用 |
| 3 水产动物性别鉴别进展 |
| 3.1 水产动物性别决定机制 |
| 3.2 水产动物性别鉴别方法 |
| 3.3 水产动物性别相关分子标记筛选研究进展 |
| 第二章 仿刺参基因组微卫星DNA 分子标记的筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 样本来源与DNA 提取 |
| 1.2 试剂配制 |
| 1.3 主要软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小片段基因组文库的构建 |
| 2.2 微卫星DNA 的杂交筛选 |
| 2.3 连接与转化 |
| 2.4 阳性克隆的培养 |
| 2.5 含微卫星DNA 序列的重组子的筛选 |
| 2.6 测序与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因组DNA 提取结果 |
| 3.2 基因组DNA 的酶切结果 |
| 3.3 连接产物的PCR 扩增 |
| 3.4 基因组微卫星DNA 杂交筛选后的PCR 扩增结果 |
| 第三章 不同自然地理群体海参遗传多样性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品采集及DNA 的提取 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 主要软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 微卫星DNA 引物的设计 |
| 2.2 微卫星DNA 引物的溶解 |
| 2.3 微卫星DNA 引物扩增条件的摸索 |
| 2.4 多态性检测及不同地理群体仿刺参的遗传多样性分析 |
| 2.5 数据统计及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 微卫星DNA 引物设计及扩增条件摸索结果 |
| 3.2 多态性检测及不同地理群体海参的遗传多样性分析结果 |
| 3.3 不同地理群体间的遗传结构分析 |
| 第四章 仿刺参抗病相关微卫星DNA 标记筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 样品采集及筛选 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 基因组DNA 提取 |
| 2.2 PCR 反应体系 |
| 2.3 PAGE 电泳 |
| 2.4 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR 扩增以及PAGE 电泳结果 |
| 3.2 两个群体的特异性位点 |
| 3.3 多态性检测以及遗传多样性分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 仿刺参性别差异的初步研究 |
| 第一节 仿刺参性别差异的组织学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 样本来源 |
| 1.2 试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 固定 |
| 2.2 脱水 |
| 2.3 透明 |
| 2.4 浸蜡 |
| 2.5 包埋 |
| 2.6 切片 |
| 2.7 展片 |
| 2.8 烤片 |
| 2.9 HE 染色 |
| 2.10 封片 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 刺参体壁肌肉 |
| 3.2 雄参生殖孔 |
| 3.3 雌参生殖孔 |
| 4 讨论 |
| 第二节 仿刺参性别相关分子标记的筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 样本来源 |
| 1.2 所用接头和引物 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 基因组DNA 提取 |
| 2.2 基因组DNA 的酶切 |
| 2.3 酶切产物与接头的连接 |
| 2.4 预扩增反应 |
| 2.5 选择性扩增反应 |
| 2.6 PAGE 电泳 |
| 2.7 AFLP 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 雌雄仿刺参基因组DNA 提取结果 |
| 3.2 仿刺参基因组DNA 酶切结果 |
| 3.3 预扩增结果 |
| 3.4 选择性扩增结果 |
| 3.5 AFLP 结果多态性分析及银染结果 |
| 3.6 雌雄个体差异 |
| 4. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、锯缘青蟹Sox基因的PCR扩增(英文)（论文参考文献）
- [1]拟穴青蟹细丝蛋白C的分子克隆及抗原表位分析[D]. 何欣蓉. 集美大学, 2020(08)
- [2]拟穴青蟹MF合成通路基因的克隆及表达分析和保幼激素酸甲基转移酶的蛋白表达分析[D]. 钱恒. 上海海洋大学, 2019(03)
- [3]哈蟆油多不饱和脂肪酸累积途径及固体分散体制剂的制备工艺研究[D]. 孙敬蒙. 长春中医药大学, 2019(03)
- [4]红壳色中华绒螯蟹遗传多样性的研究[D]. 王正光. 大连海洋大学, 2018(03)
- [5]两种海洋病原微生物快速检测技术的研究[D]. 徐苗苗. 集美大学, 2015(05)
- [6]拟穴青蟹VIH基因的克隆、重组表达和转录调控的初步研究[D]. 刘春云. 集美大学, 2015(03)
- [7]中华绒螯蟹EsSox21b-like基因干扰载体的构建及原核表达制备dsRNA[J]. 刘志强,陈洁,邱高峰. 生物技术通报, 2014(06)
- [8]拟穴青蟹性腺差异的转录组学分析[D]. 高洁. 集美大学, 2013(08)
- [9]凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子和细胞黏附蛋白基因的克隆与序列分析[D]. 岳磊磊. 广西大学, 2012(04)
- [10]仿刺参微卫星DNA标记的筛选与应用及性别差异研究初探[D]. 臧云鹏. 上海海洋大学, 2011(04)