一、用ELISA检测猪旋毛虫病的高效抗原（论文文献综述）
赵亚[1]（2021）在《小鼠感染旋毛虫的四种检测方法比较分析》文中认为旋毛虫病是一种危害十分严重的食源性人兽共患寄生虫病,不但给畜牧业生产造成巨大的经济损失,而且对人类健康也构成了巨大威胁,被世界各国列为屠宰动物强制性检验病种。目前我国对旋毛虫病的诊断主要通过对畜禽生产的下游即对屠宰动物进行检验,而检验方法仍为较为落后的镜检及集样消化法。由于我国集约化养殖率低、患畜率高以及屠宰量大,从而导致检验压力大且漏检率高。本实验针对旋毛虫生活史具有不同发育时期的特点,重点研究适宜于养殖现场的旋毛虫病活体早期快速诊断技术,为旋毛虫病的活体早期快速诊断提供理论依据和基础数据。本研究通过对我国9个地理株的旋毛虫线粒体COX1基因和NAD5基因进行扩增后的序列对比分析发现,猪旋毛虫的哈尔滨地理株、山东地理株、西安地理株、云南地理株、天津地理株、河南地理株和西藏地理株等7个地理株均属于旋毛形线虫（Trichinella spiralis,T1）;犬旋毛虫的哈尔滨地理株属于本地旋毛形线虫（T.nativa,T2）;浣熊旋毛虫的挪威地理株属于伪旋毛虫（T.pseudospiralis,T4）。结果表明这2个基因具有较稳定的保守性,能有效应用于旋毛虫种属分子分类鉴定。本研究建立了旋毛虫实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法。对经分子分类鉴定的9个旋毛虫地理株及猪蛔虫、隐匿管状线虫、鼠膜壳绦虫和肝片吸虫进行该方法的特异性实验,结果显示旋毛虫各地理株均有扩增曲线,而猪蛔虫、隐匿管状线虫、鼠膜壳绦虫和肝片吸虫等寄生虫和水对照均无荧光信号,表明其特异性强,可对毛形属内的T1、T2和T4旋毛虫种属进行检测。扩增的核糖体大亚基RNA基因（Ls-r RNA）经载体连接和转化后将菌液送去序列测定,回收质粒后建立了标准曲线,扩增方程Y=（31.90-X）/3.830,相关系数R2=0.998,呈现了良好的线性关系;提取25条旋毛虫基因组DNA后按10的倍数进行稀释,编号Ln（n=1～5）,之后进行该方法灵敏度测定,结果检测出10-4条旋毛虫,表明灵敏性较高。对同一样品进行10次重复检测,变异系数CV%=1.28%,无显着差异;将L1～L5样品-20℃保存60 d后再次检测,经比较假设检验（P>0.05）,无显着差异,组内和组间重复性实验结果说明该方法具有良好的重复性。本研究以本教研室已表达的旋毛虫鸟氨酸脱羧酶重组蛋白（Ts ODC）作为包被抗原,建立了检测旋毛虫抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法。分别对抗原最佳包被量、血清最佳稀释度、抗原最佳包被条件、封闭液的选择与封闭时间、酶标二抗的稀释度与孵育时间和TMB作用时间等条件进行了优化筛选。研究结果显示其最佳抗原包被量为100 ng,最佳血清稀释度为1:640,最佳抗原包被条件为4℃过夜包被,最佳封闭液为5%脱脂乳,最适封闭时间为37℃封闭120 min,酶标二抗的最适稀释度为1:8000,最适孵育时间为37℃封闭60 min,TMB作用时间为15 min。间接ELISA方法阴阳性临界值判定标准为0.814。重复性实验结果显示批内与批间变异系数CV%均小于6%,重复性好;旋毛虫阳性血清稀释1280倍后,测得P/N值大于2.1,表明其阳性且灵敏性良好;对猪蛔虫、华支睾吸虫和血吸虫阳性血清进行检测后,发现并无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。45只小鼠经口感染10条旋毛虫肌幼虫后,在不同的时间点取小肠、膈肌、血液和粪便等样本,应用qPCR方法、间接ELISA方法、压片法和人工胃液消化法四种检测方法对所需的不同样本进行检测。qPCR诊断方法结果显示,小鼠小肠核酸提取液最早于感染后1 d就可检出旋毛虫核酸,此后随着时间延长检出率呈波浪形上升;血清于感染后3 d检出旋毛虫核酸,随着时间的增加检出率上下波动;而膈肌核酸提取液于感染后4 d首次检测出旋毛虫核酸;粪便于感染后3 h检出旋毛虫核酸,之后出现波动,在感染后21 d时检出率升至最高。间接ELISA诊断方法结果显示,小鼠血清最早于感染后14 d可检出旋毛虫抗体此后检出率随着时间的延长而升高;小鼠小肠研磨液和小鼠膈肌研磨液均最早于感染后28 d检出旋毛虫抗体,此后检出率随着时间延长呈波浪形上升。压片法检测结果显示,最早于感染后21 d检出旋毛虫。人工胃液消化法最早于感染后28 d检出旋毛虫。由上述四种诊断方法结果比较可得出,根据旋毛虫的成虫、新生幼虫、肌幼虫不同发育时期,其可在小肠、粪便、血液、骨骼肌存在的特点,qPCR检测方法依据旋毛虫生活史综合采集以上部位进行检测,可对旋毛虫病做出活体早期快速诊断。终上所述,本研究通过对旋毛虫线粒体COX1基因和NAD5基因对9个旋毛虫地理株分子分类、qPCR检测方法建立、旋毛虫Ts ODC重组蛋白间接ELISA方法建立以及四种检查方法的比较研究,可以确定qPCR检测方法针对旋毛虫具有不同发育时期的特点,对各采样部位进行全方位检测可作为旋毛虫病活体早期快速诊断技术,这为旋毛虫病的活体早期快速诊断提供理论依据,且具有实际应用价值。
李健[2]（2021）在《应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究》文中研究指明旋毛虫（Trichinella spiralis,T.spiralis）是一种人兽共患食源性寄生虫,生食或半生食含有旋毛虫的猪肉及其产品是人类感染旋毛虫的主要方式,因感染旋毛虫而引起的疾病被称为旋毛虫病（Trichinellosis）,该病呈世界性分布且严重威胁人类健康和公共安全,因此,猪旋毛虫检测被列为屠宰必检项目。目前使用的旋毛虫检测方法存在技术短板,无法满足对日常养殖和现代化屠宰加工过程中,猪体内旋毛虫的监测。因此,针对现代化大型养殖和屠宰场研发一种快速、灵敏的旋毛虫现场检测方法,对于旋毛虫病防控具有重要意义。本研究基于表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS）和上转换发光免疫层析法（Upconversion phosphor immunochromatography assay,UCP-ICA）建立旋毛虫快速检测体系,为研发适用于现代化大型养殖和屠宰场的旋毛虫检测方法奠定基础,具体研究内容和结果如下:1.基于SERS建立旋毛虫检测方法。利用盐酸羟胺还原硝酸银,制备银纳米溶胶,测试其拉曼光谱增强性能及其对实验样品的影响。20只Wistar大鼠口服感染旋毛虫肌幼虫（Muscle larvae,ML）（3500条/只）,并设平行空白对照组（20只Wistar大鼠）。收集血清,采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪采集未感染的血清及感染后28天血清的SERS,对SERS进行去荧光背景及面积归一化处理。比较SERS变化以及通过多元统计分析,如主成分分析（Principal component analysis,PCA）和线性判别分析（Linear discriminant analysis,LDA）,分析SERS并建模。结果表明,所制备的银纳米溶胶颗粒直径约为25 nm,大小均匀,纯度高,且具有良好的拉曼光谱增强效果。感染组和对照组在未感染旋毛虫时的血清拉曼光谱无显着差异;第28天,两组的血清拉曼光谱出现显着差异。通过PCA结合LDA构建诊断算法,发现该方法灵敏度为87.5%,特异度为94.7%,正确度为91.4%。基于以上结果,将银纳米胶体的SERS与PCA和LDA相结合,有望实现大规模、现场、快速、无标记、高准确检测,在旋毛虫病防控方面具有巨大的应用潜力。2.基于UCP-ICA建立旋毛虫免疫层析检测法。将旋毛虫排泄分泌抗原（Excretorysecretory antigens,ES）、山羊抗兔Ig G与上转换发光纳米颗粒（Upconversion nanoparticles,UCNPs）共价偶联,以山羊抗猪Ig G（800 ng/条）与兔抗山羊Ig G（200 ng/条）喷于硝酸纤维素薄膜（Nitrate cellulose sheet,NC sheet）上,分别作为检查带（T线）与质控带（C线）,并且命名该方法为旋毛虫上转换发光免疫层析法（T.spiralis upconversion phosphor immunochromatography assay,Ts-UCP-ICA）。Ts-UCP-ICA优化后的最佳血清稀释倍数为1:150、最佳样品处理液为100 m M HEPES p H 7.5,270 m M Na Cl,0.5%v/v Tween-20,1%v/v BSA。通过检测169份阴性猪血清,确定Ts-UCP-ICA的低特异度cut-off值为0.1906（T/C ratio）,高特异度cut-off值为0.3233。检测猪囊尾蚴、亚洲带绦虫幼虫以及弓形虫感染后的猪血清样本,结果显示,Ts-UCP-ICA特异性良好,均未发生交叉反应。检测感染100、1000、10000 ML猪血清,发现三个剂量分别在第35、30、25天可检出阳性。Ts-UCP-ICA单盲测试（Single-blinded assay）55份猪血清,使用低特异度cut-off值时,检测特异度和灵敏度均100%,使用高特异度cut-off值时,检测特异度为100%和灵敏度为80%。该方法与人工消化法的检测总符合率为87.27%,一致性系数（Kappa值）为0.7454,稳定性为4℃保存6个月有效。本论文建立的两种旋毛虫检测方法,构成“旋毛虫快速检测体系”。基于SERS建立的旋毛虫检测法具有检测速度快,高通量的特点,适合大规模样本筛查;而基于UCP-ICA建立的旋毛虫检测方法可用于可疑血清进一步确定。该检测体系可提高检测效率和检测效果,进一步提升旋毛虫流行病学调查、畜牧养殖及屠宰即时检测水平,为旋毛虫病防控提供技术保障。
伊娜娜[3]（2020）在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究》文中研究表明旋毛虫是一种食源性寄生虫。在旋毛虫寄生期间,宿主需要尽可能的排出病原生物,而寄生虫需要在宿主体内成功繁殖和生存,因此在寄生过程中逐渐进化出一种复杂的宿主-寄生虫相互作用关系,而旋毛虫serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsSPI）在这一过程中可能发挥重要作用。TsSPI在旋毛虫ML、AW、NBL中都有表达,其中在ML期表达水平最高。本研究旨在通过RNAi研究TsSPI在旋毛虫入侵以及调节宿主免疫方面的功能,同时探讨重组蛋白TsSPI在体外对巨噬细胞极化的影响。本研究利用RNA干扰技术来探索TsSPI基因在旋毛虫生命周期中的功能。设计合成三条特异性siRNA（siRNA-153、siRNA-479、siRNA-986）,同时体外合成特异性dsRNA-TsSPI,利用脂质体辅助浸泡的方法将特异性siRNA和dsRNA传递到旋毛虫肌幼虫体内,结果发现RNAi可以有效地传递到旋毛虫肌幼虫体内;利用qPCR和Western-blot检测TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,结果发现siRNA和dsRNA-TsSPI的沉默效果为剂量依赖性,且2μM siRNA或60ng/μl dsRNA为最佳的作用浓度;三组特异性siRNA和dsRNA-TsSPI均可有效的降低TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,其中siRNA-986和dsRNA-TsSPI效果最佳,考虑到成本,后续实验均利用60ng/μl dsRNA-TsSPI进行;利用dsRNA-TsSPI浸泡处理旋毛虫2 d后开始有很好的沉默效果,3 d后沉默效果最佳,而且持续到7 d依旧有显着的沉默效果,可见在后续感染实验中,整个肠期感染阶段（感染后3-7 d）内经过dsRNA-TsSPI浸泡处理的旋毛虫都处于TsSPI基因沉默状态;利用检测dsRNA-TsSPI处理后的旋毛虫中Ts Ka SPI的基因转录水平及蛋白水平的方法验证dsRNA-TsSPI干扰的特异性,结果显示dsRNA-TsSPI特异性良好。在本研究中,dsRNA介导的TsSPI基因沉默不影响幼虫在体外的蜕皮和存活率,但降低旋毛虫体外入侵肠上皮细胞的能力。将各组旋毛虫肌幼虫感染小鼠,结果发现与对照感染组相比,TsSPI基因沉默组小鼠肠道成虫荷和肌肉中肌幼虫数量均显着降低,但两组之间相同数量的成虫产出的新生幼虫数量没有差异。dsRNA干扰遗传性分析结果显示,旋毛虫成虫的TsSPI基因依旧受到抑制,而P 1代肌幼虫中TsSPI基因已经基本恢复到正常水平。因此我们推测肌肉中P 1代肌幼虫数量降低可能是肠道成虫荷降低导致的。将dsRNA-TsSPI介导的TsSPI基因沉默的旋毛虫感染小鼠,小鼠感染后4 d、7 d取腹腔巨噬细胞,用ELISA检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫后,小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10含量均有不同程度的升高,而这种促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子形成的混合体内环境有利于旋毛虫的寄生;与感染后4 d相比,感染后7 d,促炎性细胞因子含量均有不同程度的降低,而抗炎性细胞因子含量没有显着变化。与感染未经过处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量均有不同程度的升高。可见TsSPI基因沉默后,旋毛虫引起的宿主炎性反应显着加剧,说明TsSPI可能通过影响宿主炎症因子之间的平衡缓解旋毛虫引起的宿主炎性反应。利用Western blot检测各组小鼠巨噬细胞P65磷酸化水平变化,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显着升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化显着降低,间接证明了随着感染时间的推移,旋毛虫引起的宿主免疫反应从Th1/Th2混合型反应转变为Th2型免疫反应为主。而与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显着升高,说明TsSPI可以缓解旋毛虫感染引起的巨噬细胞NF-κB的磷酸化,进而抑制宿主炎症反应。利用qPCR检测旋毛虫感染后腹腔巨噬细胞中效应因子CAM标志物i NOs和AAM标志物Arg-1的m RNA表达量,结果显示,与对照组,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞效应因子i NOs以及Arg-1的表达量均显着升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞i NOs表达量显着降低,而Arg-1表达量则显着升高,说明旋毛虫感染可以调节宿主巨噬细胞极化。与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞中效应因子i NOs的相对表达量显着升高,而效应因子Arg-1的相对表达量显着降低,说明TsSPI在旋毛虫调节宿主巨噬细胞极化过程中发挥重要作用。诱导表达重组蛋白TsSPI和mu TsSPI,其中mu TsSPI为丝氨酸蛋白酶抑制剂活性降低的突变体TsSPI。qPCR检测各CAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导巨噬细胞分泌CAM相关促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和效应因子i NOs的转录表达,同时利用Western blot检测巨噬细胞P65磷酸化水平和IRAK、IκB的蛋白表达情况,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导的IRAK、IκB降解以及P65磷酸化,并且如果改用突变体刺激,以上调节功能均明显减弱。可见TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,并进一步抑制促炎性细胞因子和效应因子i NOs的释放,阻止巨噬细胞向CAM极化。利用重组蛋白TsSPI和mu TsSPI直接刺激巨噬细胞。qPCR检测各AAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以有效的促进AAM相关抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和效应因子Arg-1的转录表达。同时利用Western blot检测巨噬细胞JAK2和STAT3磷酸化水平,结果显示,TsSPI可以刺激激活JAK2和STAT3发生磷酸化,改用突变体刺激并不影响这种调节功能。可见TsSPI可以刺激激活JAK2/STAT3信号通路,同时促进抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和AAM标志效应因子效应因子Arg-1的分泌,促进巨噬细胞向AAM极化。综上所述,dsRNA-TsSPI可以特异而有效的抑制TsSPI的基因转录水平及蛋白水平。TsSPI可能不直接参与寄生虫自身的生长和繁殖,但在一定程度上参与调节旋毛虫与宿主的相互作用。TsSPI基因沉默可以增强巨噬细胞NF-κB的磷酸化水平,促进巨噬细胞分泌炎性细胞因子,调节巨噬细胞极化。重组蛋白TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,同时刺激激活JAK2/STAT3信号通路,并调节相应细胞因子和效应因子的表达。TsSPI可能通过调节巨噬细胞极化,进而影响宿主炎症因子之间的平衡,从而调节宿主免疫反应,为旋毛虫在宿主中的定殖创造有利环境。
王洋[4]（2020）在《伪旋毛虫排泄—分泌（ES）产物蛋白质组学的初步分析》文中研究说明伪旋毛虫（Trichinella pseudospiralis）是可以感染哺乳类动物和鸟类的人兽共患寄生线虫。人类通常感染伪旋毛虫是因为食用生的或未煮熟的猪肉和其它含有伪旋毛虫感染性肌幼虫的动物。幼虫在宿主肌纤维中不能形成保护性胶原囊,由于可以感染鸟类,在自然界中呈全球性分布。伪旋毛虫无包囊这一形态上与旋毛虫的差异,导致它们在幼虫和成虫的大小、幼虫在肌纤维中运动模式、调节宿主免疫反应的能力、杆细胞颗粒的形态和分泌蛋白质含量均存在显着差异,特别是在免疫特异性的差异,值得进一步深入的研究。伪旋毛虫在入侵及寄生过程中,会排泄、分泌一些产物（ES）。由于ES产物直接暴露于宿主免疫系统,因此被认为是诱导宿主产生免疫反应的主要靶向抗原。目前研究发现ES产物在虫体穿透组织、幼虫的移行、参与免疫细胞调控、减缓凝血、消化、蜕皮、细胞外基质的降解等方面都发挥重要作用,在伪旋毛虫和宿主相互作用中扮演了重要角色。伪旋毛虫目前主要有三个代表性分离株（T4RUS、T4 AUS和T4 USA）,有研究表明对最适宿主（猪）的易感性存在很大差别,推测不同分离株ES产物对宿主免疫调控能力存在差异。因此,本实验首先利用流式细胞仪检测了猪感染伪旋毛虫不同分离株在不同感染时间点外周血中免疫细胞水平变化,以期观察伪旋毛虫不同发育时期对宿主免疫反应的调控作用。其次,利用差异蛋白质组学技术鉴定、对比分析伪旋毛虫肌幼虫和旋毛虫肌幼虫之间ES产物中显着差异表达蛋白,并对这些功能蛋白进行分析,阐述这些功能蛋白在参与寄生虫与宿主相互作用中可能扮演的角色,以期找到哪些ES蛋白参与调控宿主免疫反应,并导致伪旋毛虫抑制宿主炎症能力强于旋毛虫的可能原因。最后,采用免疫蛋白质组学技术筛选伪旋毛虫成虫和新生幼虫阶段期特异性蛋白,作为潜在的早期诊断抗原或疫苗的候选。为了观察伪旋毛虫对宿主免疫系统调控能力,我们采用了流式细胞术对感染伪旋毛虫（T4 RUS和T4 AUS）两个分离株猪外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞、Th17细胞、CD3+T细胞、CD21+B细胞和中性粒细胞在不同感染时间点变化及Th1和Th2型特异性细胞因子IL-2和IL-4进行检测,观察伪旋毛虫入侵对宿主体内免疫反应调控。结果显示,伪旋毛虫感染猪在早期（0-17天）主要诱导的Th2型免疫反应,特异性细胞因子IL-4显着升高。从感染第17天开始B细胞发挥了主要调节作用。Treg细胞从感染第11天开始增多,展现了对宿主免疫反应强的调节抑制作用。伪旋毛虫入侵宿主猪抑制了炎症细胞Th17水平,但在感染后期（45-60天）略有升高。T4 RUS和T4 AUS两个分离株相同剂量（10000条/头）感染猪,猪外周血中上述免疫细胞在不同感染时间水平变化趋势一致,引起相同的宿主免疫反应。T4 RUS不同感染剂量（1000条/头和10000条/头）,引起猪体内免疫细胞水平变化基本无差异。应用iTRAQ串联质谱技术,对伪旋毛虫三个分离株（T4 RUS、T4 AUS和T4 USA）以及旋毛虫（T1 ISS534）之间肌幼虫ES产物进行鉴定,共鉴定出2,591个蛋白,其中535个为可信蛋白。每两组对比分析（T4 RUS:T4 USA、T4 AUS:T4USA、T4 RUS:T4 AUS和T1:T4 USA）共有65（146）、72（98）、43（103）和28（147）显着上调（或下调）差异表达蛋白被鉴定出来,并对鉴定出来的差异表达蛋白进行生物信息学分析。在GO和KEGG Pathway富集分析中,我们发现差异蛋白参与主要的生物学过程富集在碳水化合物代谢过程、小分子代谢过程、前体代谢和能量生成和蛋白折叠。参与的主要KEGG通路富集在与糖代谢相关的糖酵解和糖异生、果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢和磷酸戊糖途径等通路;与氨基酸代谢相关包括色氨酸代谢、组氨酸代谢、缬氨酸、精氨酸和脯氨酸代谢和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢等通路;与脂肪代谢相关包括丙酸代谢、脂肪酸代谢和脂肪酸降解等通路。差异蛋白参与的这些生物学过程及通路都主要集中在能量的合成、代谢和蛋白质合成等,这些都为寄生虫的长期寄生提供支持。此外,我们发现T4 RUS:T4 USA和T4 AUS:T4 USA两组富集在溶酶体通路和过氧化物酶体通路的差异表达蛋白均下调。溶酶体在信号转导、细胞适应、质膜修复、免疫应答和许多其它基本细胞过程中发挥着重要作用。特别是溶酶体介导的降解作用有助于吞噬细胞快速清除凋亡细胞,调节宿主炎症反应。而过氧化物酶体与胞内活性氧自由基的清除相关。所有参与溶酶体和过氧化物酶体通路的差异蛋白在分离株T4 USA中表达明显高于其它两组。搜索STRING数据库我们绘制了差异蛋白互作网络图查找相互作用关系密切的蛋白,并发现F23B12.5、Hsp83、calr、T0111246、MDH1和Nom1等为互作网络图中重要节点与多个蛋白具有紧密的互作关系,协同行使功能。对鉴定出来的差异蛋白进行功能分类分析发现了一些参与抗氧化、抗压力、宿主免疫调节和信号传导相关的蛋白。如抗氧化的二硫键异构酶（PPI）和过氧化物酶、抗压力的热休克蛋白HSP70、HSP83、HSP beta-1和alpha-crystallin B chain（small HSP）、参与宿主免疫调节的DNaseⅡ和Ca2+信号传导、稳态的钙调蛋白、钙网蛋白和钙同线蛋白-1等。对比这些功能差异蛋白表达量,我们发现T4 USA分离株的蛋白表达量显着上调,高于其它三组。此外,我们发现伪旋毛虫分泌的RWD domain-containing protein 2B蛋白与能够参与宿主免疫调节激发宿主Th2型反应,抑制Th1型反应的53kDa糖蛋白（rTsP53）同源度较高（query cover为97%）,伪旋毛虫这个蛋白是否也行使相似的蛋白功能,在我们以后的研究中会进一步验证。最后,我们利用2DE-Western blot结合MALDI-TOF/TOF-MS/MS鉴定伪旋毛虫成虫和新生幼虫ES产物,通过肽指纹图谱PMF共识别出大约24个匹配的蛋白点,并确定为12种不同的蛋白。GO注释分析其主要的分子功能为DNase II活性和丝氨酸型肽链内切酶活性。对其蛋白功能分类分析发现与免疫调节相关的DNase II和丝氨酸蛋白酶、运输或储存金属离子的PCHTP蛋白、利于成虫对宿主免疫应答逃避的venom allergen 5蛋白和可以作为侵入宿主的毒力因子烯醇酶等。丝氨酸蛋白酶在马来丝虫微丝蚴ES产物中确认其具有抑制炎性细胞的聚集及炎性因子的释放,从而介导宿主的免疫抑制作用,本实验在成虫和新生幼虫ES产物中发现的多个丝氨酸蛋白酶推测可能也参与宿主免疫抑制作用,后续研究我们会继续验证。此外,筛选出的这些蛋白也可以作为潜在的早期诊断或疫苗的候选蛋白。综上所述,本研究鉴定了伪旋毛虫不同发育时期（ML、Ad和NBL）ES产物,并对其功能蛋白进行分析。对理解伪旋毛虫对宿主免疫抑制能力、寄生虫与宿主互作关系、早期潜在诊断蛋白筛选具有重要意义。
张胜兰[5]（2020）在《旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的抗原性和对树突状细胞的免疫调节性研究》文中进行了进一步梳理旋毛虫（Trichinella spiralis）是一种典型的人兽共患寄生线虫,其引发的旋毛虫病是一种世界广泛分布的食源性寄生虫病。目前的诊断方法主要为集样消化法和ELISA检测方法。肌幼虫排泄分泌产物（ES）为应用最广泛的诊断抗原,但具有期特异性且成分复杂。旋毛虫相关蛋白可引发宿主Th2型免疫反应,造成宿主的免疫抑制,进而形成慢性感染导致长期寄生,现阶段该反应机理尚不清楚。旋毛虫ES成分复杂,包含多种蛋白酶:丝氨酸蛋白酶、谷胱甘肽转移酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等。因此,旋毛虫ES相关抗原分子的分离、鉴定及其抗原性和免疫调节性的研究对于旋毛虫病免疫学检测方法的建立及疫苗研制非常重要。本实验室前期构建了旋毛虫3日龄成虫的c DNA文库,经过免疫学方法筛选得到高丰度与强免疫反应性的丝氨酸蛋白酶基因Ts-Sp-7（Gen Bank登录号EU263332.1）。本研究基于该基因对Ts-Sp-7蛋白抗原性及免疫调节性进行研究。参照Gen Bank公布的Ts-Sp-7基因序列,设计特异性引物,收取感染3天的旋毛虫成虫阶段的总RNA,反转录获取目的序列,常规PCR扩增,并构建原核表达载体p ET28a-Ts-Sp-7,原核表达。SDS-PAGE结果显示,在47 k Da左右呈现一条蛋白条带,与理论值47.5 k Da一致,收获复性纯化后的Ts-Sp-7蛋白。Western-Blot结果显示,该蛋白能够与10000条/头感染剂量不同感染天数（15dpi、30 dpi、45 dpi、60 dpi、90 dpi、120 dpi）的猪阳性血清发生特异性反应。结果可知,纯化后的目的蛋白具备良好的反应原性。其次,采用变性纯化的Ts-Sp-7蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗Ts-Sp-7蛋白兔多克隆抗体。用间接ELISA测得该多抗效价是1:350000。由间接免疫荧光结果可以看出,相对于兔阴性血清对照组,Ts-Sp-7蛋白多抗作为一抗的肌幼虫表皮有很强烈的红色荧光信号。采用变性纯化Ts-Sp-7蛋白免疫BABL/c小鼠,复性纯化的重组Ts-Sp-7蛋白及ES进行筛选,收获稳定分泌抗Ts-Sp-7蛋白抗体的杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆,收获了5株杂交瘤细胞株,可以稳定地分泌抗Ts-Sp-7蛋白抗体。竞争ELISA结果显示,猪阳性血清能够抑制其中两株单抗与重组Ts-Sp-7的结合,命名为H4H7-2A4、H8D12-5B9。Western-Blot结果显示纯化后的两株单抗均能特异性地识别虫体蛋白。亚型鉴定显示,H4H7-2A4抗体为Ig G2a亚类,κ亚型;H8D12-5B9抗体Ig G2b亚类,λ亚型。以Ts-Sp-7基因序列为模板,设计3对引物,对Ts-Sp-7蛋白进行分段截短表达。Western-Blot结果表明,两株单抗都能够特异性地识别Ts-Sp-7-2蛋白。进而利用Pep Scan技术合成8个短肽,进行间接ELISA鉴定。确定H4H7-2A4所识别抗原表位位于W5肽段,氨基酸序列为222 GVDRSATCQGDSGGP236。H8D12-5B9所识别抗原表位位于W7肽段,氨基酸序列为252PPTCGDARHSVKFAKVP268。多克隆抗体和竞争性单克隆抗体的成功制备为建立基于Ts-Sp-7蛋白的旋毛虫感染诊断试剂奠定了基础。从小鼠骨髓源细胞里分离提取到树突状细胞（BMDCs）,体外对其诱导分化,形成未成熟状态的BMDCs,设立Ts-Sp-7蛋白单独作用组、LPS阳性对照组以及PBS阴性对照组,分别刺激BMDCs,利用流式细胞术分析目的蛋白对BMDCs成熟活化的影响。结果显示,Ts-Sp-7蛋白可诱导BMDCs表面分子CD86的表达,对MHCⅡ类分子的表达无显着影响,表明Ts-Sp-7蛋白可促进BMDCs的成熟。进而从OVA抗原特异性转基因小鼠（OT-II）脾脏内分离提取到Na?ve CD4+T细胞,和Ts-Sp-7蛋白预先刺激的BMDCs建立共培养体系,在OVA抗原刺激的前提下,检验Na?ve CD4+T细胞活化、增殖和分化的情况。结果表明Ts-Sp-7蛋白可促进Na?ve CD4+T细胞的明显增殖。可促进效应T细胞表面分子CD44和CD62L的表达,促进效应T细胞活化为可以参与淋巴细胞再循环的效应T细胞。Ts-Sp-7蛋白孵育的BMDCs可诱导Na?ve CD4+T细胞向Treg型分化,推测TsSp-7蛋白是具有免疫调节性的重组蛋白,可能参与宿主免疫调控。综合以上实验结果,Ts-Sp-7蛋白具备良好的抗原性及免疫调节性,可作为旋毛虫的诊断抗原及调控分子,在旋毛虫诊断方法的建立及宿主免疫反应的调节过程中发挥重要功能。
岳欣[6]（2020）在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶的分子特征及其诱导的保护性免疫》文中研究说明旋毛虫病是一种世界范围内广泛存在的人兽共患寄生虫病。人和动物主要通过食入含有旋毛虫幼虫的肉类与肉制品而感染,旋毛虫病给全球公共健康造成巨大威胁。旋毛虫的致病阶段主要是幼虫时期,肌幼虫被宿主食入后通过发育为肠道感染性幼虫（intestinal infective larvae,IIL）而侵入肠粘膜,经过4次蜕皮发育为成虫,雌雄虫交配产生的新生蚴随淋巴管和血液循环遍及全身,到达横纹肌的新生蚴又发育为肌幼虫。因此通过阻止旋毛虫幼虫侵入肠粘膜是研究的关键。目前的研究表明,旋毛虫侵入肠粘膜可能与其排泄分泌（ES）蛋白有关,本课题组前期从ES蛋白中鉴定出了一种旋毛虫丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis proteinase,Ts Serp）,该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族,而丝氨酸蛋白酶在寄生虫感染过程中具有降解宿主组织,协助寄生虫免疫逃避等功能。本研究克隆表达了Ts Serp（Gen Bank:AY028974.1）,对Ts Serp的生物学特性、抗原性及组织定位进行了鉴定,通过体外侵入实验、ADCC、抗rTsSerp血清抗体及细胞因子的测定,揭示了Ts Serp在旋毛虫侵入过程中的作用及Ts Serp所诱导的保护性免疫。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验用动物、佐剂、细胞类型该项研究所使用的旋毛虫虫种（ISS534）源于河南南阳家猪,由实验室传代保存。实验动物为来自河南省实验动物中心的雌性BALB/c小鼠以及昆明小鼠。佐剂为MONTANIDETM ISA 201 VG以及弗氏佐剂。实验用小鼠肠上皮细胞（IEC）为本实验室早期分离后传代保存的。2.旋毛虫丝氨酸蛋白酶的生物信息学分析、表达及定位使用NCBI,SWISS-MODEL,signal P server-5.0等生物信息学在线软件对Ts Serp的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域等信息进行了预测和分析。将去除信号肽区域的Ts Serp基因克隆至p ET-32a表达载体（带有一个TRX-tag标签）中,构建重组表达质粒p ET-32a/Ts Serp,通过原核表达得到rTsSerp,将纯化过的rTsSerp通过皮下注射免疫小鼠,经过4次免疫获得免疫血清。利用Western blot技术对rTsSerp进行抗原性分析;分别应用RT-PCR、Western blot、免疫荧光试验（immunofluorescent test,IFT）,观察旋毛虫Ts Serp在旋毛虫不同期虫体的转录与表达水平及其在虫体组织的定位。3.rTsSerp在体外旋毛虫侵入IEC与肠黏膜过程中的作用将100条旋毛虫肌幼虫（ML）与胆汁孵育2 h激活为IIL,然后与不同浓度的rTsSerp或抗rTsSerp血清混合后加至IEC单层（或注射入离体的小肠段）,37℃培养2 h后,镜下观察侵入IEC与肠黏膜的幼虫数,评价rTsSerp及其抗血清在旋毛虫侵入粘膜过程中的作用。4.抗rTsSerp抗体介导的细胞毒性对新生蚴的杀伤作用（ADCC）将旋毛虫新生蚴与小鼠腹腔渗出细胞混合后加入96孔板,按照不同的组别加入不同稀释度的血清（1:10、1:50、1:100、1:200）,每个组别设置3个复孔。在37℃、5%CO2条件下培养48 h,分别在0、12、24、48 h观察记录每孔新生幼虫存活情况。观察腹腔渗出细胞与旋毛虫新生幼虫的附着及新生幼虫的存活情况,判断抗rTsSerp血清介导的细胞毒性对新生幼虫的杀伤作用。5.rTsSerp免疫小鼠所诱导的体液与细胞免疫应答将200只小鼠分为4组（每组50只）,分别用rTsSerp、TRX-tag、ISA 201佐剂和PBS进行皮下注射免疫,共免疫4次,每次免疫间隔14天,收集每次免疫后不同组的小鼠血清,运用rTsSerp-ELISA检测各组小鼠血清中rTsSerp特异性Ig G、Ig G1、Ig G2a、Ig M及Ig E水平。同时,在末次免疫后2周收集小鼠脾脏及肠系膜淋巴结,经过研磨、洗涤、分离等方法收集脾细胞以及肠系膜淋巴结细胞,检测Th1（IFN-γ,IL-2）与Th2（IL-4）细胞因子的水平。6.rTsSerp免疫小鼠产生的免疫保护效果末次免疫后2周,应用300条旋毛虫肌幼虫对所有免疫小鼠经口攻击感染。感染后6 d与56 d分别剖杀10只小鼠,,观察肠道旋毛虫成虫数与肌幼虫虫荷,计算rTsSerp免疫组小鼠的的减虫率,评价rTsSerp的免疫保护效果。此外,观察不同免疫组小鼠感染后56 d咬肌的组织病理学变化。7.统计学处理使用分析软件SPSS 26.0对实验数据进行处理,数据的表述形式为平均数±标准差,主要运用卡方检验与方差分析,两组间的比较运用t检验,检验水准α<0.05。结果1.旋毛虫丝氨酸蛋白酶的生物信息学分析、表达水平及定位生物信息学软件分析结果显示,Ts Serp基因长度为1445 bp,编码421个氨基酸,p I为6.33。Ts Serp包含有一个胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶结构域,且氨基酸1-27号是该基因的信号肽区域。将扩增出来的Ts Serp基因克隆到p ET-32a表达载体中构建重组表达质粒p ET-32a/Ts Serp,并将其转染到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,将诱导出来的融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组菌表达的融合蛋白的分子量约为65.7 k Da。rTsSerp蛋白的分子量等于c DNA克隆（44.7 k Da）+载体的TRX-tag编码的蛋白（21 k Da）之和,且rTsSerp可带抗his标签的一抗及感染旋毛虫的小鼠血清所识别。RT-PCR与Western blotting结果表明,Ts Serp m RNA与蛋白在旋毛虫4个不同发育期均有表达,且Ts Serp在肌幼虫与肠道感染性幼虫期的蛋白表达水平显着高于成虫与新生幼虫期（χ2=62.405,P<0.001）;间接免疫荧光试验结果显示,Ts Serp主要定位于虫体表皮、杆状体与雌虫胚胎,提示Ts Serp是一种幼虫侵入蛋白。2.rTsSerp在体外旋毛虫侵入IEC与肠黏膜过程中的作用将rTsSerp蛋白及TRX-tag标签蛋白与100条IIL孵育后,加入IECs单层,2小时后观察侵入情况并计数。结果表明rTsSerp对幼虫侵入IECs作用具有rTsSerp剂量依赖性（r=0.996）,,而标签蛋白的浓度改变未影响侵入率,在Ts Serp及TRX-tag蛋白浓度为15μg/m L时,Ts Serp组和TRX-tag组的幼虫侵入率分别为86.96%和61.18%（P<0.01）,表明rTsSerp对幼虫侵入IEC具有促进作用。将不同稀释度的抗rTsSerp血清、感染旋毛虫小鼠血清及正常小鼠血清分别与IIL混合,然后分别接种到IEC单层中体外孵育2 h,镜下观察不同血清对IIL侵入IEC的抑制作用。结果表明,当血清稀释度为1:100时,抗rTsSerp血清、感染旋毛虫小鼠血清及正常小鼠血清组的幼虫侵入率分别为36.47%,27.13%及68.96%（P<0.01）,且抗rTsSerp抗体对幼虫侵入的抑制作用具有抗体剂量依赖性（r=0.986）,随血清稀释度的增加而降低（P<0.01）,表明抗rTsSerp抗体阻止幼虫对IEC的侵入。此外,将rTsSerp、TRX-tag、抗rTsSerp血清、抗TRX-tag血清或PBS处理后肌幼虫注入离体小肠孵育2 h后,幼虫对肠黏膜的侵入率分别为71.33%、45.67%、55.34%、57.6%及56.00%。表明rTsSerp明显促进了幼虫侵入（χ2=6.000,P<0.0001）,而抗rTsSerp血清显着抑制了幼虫对肠黏膜的侵入（χ2=4.900,P<0.0001）。3.抗rTsSerp血清介导的细胞毒性对新生蚴的杀伤作用（ADCC）当抗rTsSerp血清浓度为1:10、1:50、1:100、1:200时,ADCC介导的新生幼虫的死亡率分别为24.35%、24.47%、22.02%及17.68%,明显高于免疫前血清组的新生幼虫死亡率(t1:10=3.959,P﹤0.05;:50=4.562,P﹤0.01;:100=8.981,P﹤0.01)。且对幼虫的杀伤作用随着血清浓度的升高而增强,具有抗体剂量依赖性（r=0.903,F=119.518,P﹤0.01）,这种杀伤作用也随着培养时间的延长而增加（r=0.921,F=18.356,P﹤0.01）。4.rTsSerp免疫引起的体液与细胞免疫应答BALB/c小鼠经过rTsSerp免疫4次后,血清特异性抗体（Ig G,Ig G1/Ig G2a,Ig E及Ig M）水平均随着免疫次数的增加而逐渐升高,而佐剂组与PBS组的抗体水平无明显变化。此外,Ig G1及Ig G2a抗体水平也明显增高,但Ig G1水平显着高于Ig G2a(t4w=14.246 t6w=22.291 t8w=14.244)。表明rTsSerp主要诱导的是Th 2型为主的免疫应答。rTsSerp组与佐剂组及PBS组相比,Ig E与Ig M水平也明显升高（F=404.328,P<0.01）。细胞因子检测结果表明,在rTsSerp免疫后8周与攻击感染后2周,IFN-γ、IL-2及IL-4水平显着高于TRX-tag,佐剂及PBS对照组（P<0.0001）。结果表明,rTsSerp皮下免疫小鼠诱导了全身与肠黏膜局部的Th1/Th2混合型的Th1/Th2免疫应答。5.rTsSerp免疫小鼠所引起的免疫保护效果与PBS组相比较,免疫小鼠攻击感染后6 d与56 d,肠道成虫与肌幼虫的减虫率分别为47.36%（F=120.677,P<0.01）和54.85%（F=131.244,P<0.01）。病理切片HE染色结果显示,标签组、佐剂组及PBS组小鼠幼虫囊包周围有较明显的病理学变化,即幼虫囊包周围有大量的炎症细胞如嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润,而rTsSerp免疫组肌幼虫囊包周围的炎症细胞浸润明显减少（r=0.993,P<0.01）,提示而rTsSerp免疫可减轻旋毛虫感染后的肌肉炎症反应。结论1.构建了pET-32a/TsSerp重组表达质粒并表达纯化了rTsSerp,Ts Serp在旋毛虫的所有发育期均有转录及表达,但在肌幼虫与肠道感染性幼虫期的表达水平高于其他虫期,主要定位于虫体的表皮、杆状体。2.rTsSerp对旋毛虫侵入IEC与肠黏膜具有促进作用,抗rTsSerp抗体介导了ADCC对新生蚴的杀伤作用。3.rTsSerp免疫小鼠可诱导显着的体液与细胞免疫应答及明显的免疫保护效果。4.Ts Serp是一种旋毛虫侵入宿主肠黏膜的主要蛋白,可作为一种抗旋毛虫疫苗的候选靶抗原。
王春[7]（2019）在《上转发光免疫层析试纸条快速检测猪旋毛虫方法建立》文中研究说明旋毛虫病是由旋毛虫引起的人兽共患疾病,呈世界性分布。猪是旋毛虫主要宿主之一,生食或半生食感染旋毛虫的猪肉及其产品是人类感染旋毛虫的主要方式,旋毛虫病严重威胁人类健康和公共安全。目前旋毛虫检测方法无法满足现场快速检测旋毛虫病的要求。因此,开发适用于现场的高效、灵敏的旋毛虫检测方法,能有效地缩短旋毛虫的检验时间,并为旋毛虫病的诊断和检测提供强有力的技术支持。本研究基于上转发光免疫层析（up-converting phosphor technology-based lateral flow assay,UPT-LF）技术快速检测猪旋毛虫。通过抗原和检测模式筛选、层析条件优化,确定间接法制备试纸条。将山羊抗猪IgG与示踪物上转发光颗粒（up-converting phosphor particle,UCP）共价偶联,以旋毛虫肌幼虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因（WM5）表达的蛋白WM5（2 mg/mL）与兔抗山羊IgG（0.5 mg/mL）喷点于分析膜上作为检测带（T）与质控带（C）,并命名该试纸条为Tsp-UPT-LF。通过进一步优化确定Tsp-UPT-LF最佳血清稀释倍数（5倍）、最优样品处理液（0.03 mol/L的PB内含有0.5%NP-40,0.1 mol/L NaCl,1%BSA）。通过对95份阴性血清的检测,确定Tsp-UPT-LF的Cutoff值为0.099。猪囊虫、华支睾吸虫感染后的猪血清测试结果显示Tsp-UPT-LF的特异性良好。对273份猪血清样本进行检测,Tsp-UPT-LF和ELISA的总符合率为92.31%,一致性系数Kappa（K）值为0.837,表明两种方法具有高度一致性。Tsp-UPT-LF检测感染五万条旋毛虫肌幼虫猪血清,结果显示感染第28 d为阳性（T/C值0.109）,第122 d阳性最强（T/C值为0.207）,至第425 d时阳性值有所下降,抗旋毛虫IgG阳性率为71.4%。本研究建立的基于UPT-LF技术检测猪旋毛虫的方法,通过对血清样本检测表明该方法操作简便并具有良好的特异性、耗时短（整个检测过程在20 min内完成）,为猪旋毛虫的即时检测（point-of-care testing,POCT）和保障食品安全提供了新的检测方法参考。
张妍[8]（2019）在《TsGAD基因沉默对旋毛虫抗酸影响及其间接ELISA方法建立》文中研究说明旋毛虫病是由旋毛形线虫（Trichinella spiralis）引起的一种危害严重的人兽共患线虫病,旋毛虫病对畜牧业及人类健康造成了严重危害,是目前世界范围内投入防控费用最高的食源性人兽共患寄生虫病之一。人和动物感染旋毛虫病主要是因为富含肌幼虫包囊的肉被其吞食导致。包囊在胃酸的作用下,释放出感染性肌幼虫,肌幼虫经数小时后钻入小肠,在小肠内产生新生幼虫继续其下一阶段生活史。旋毛虫的致病过程类似于大肠杆菌进入机体要经过胃部极酸性环境。近年来,关于致病性大肠杆菌抗酸系统的研究成果尤为显着。加强对旋毛虫病的检验与诊断,是控制该病的唯一有效途径。本研究利用siRNA干扰技术抑制旋毛虫TsGAD基因的表达,进而研究谷氨酸依赖型抗酸系统在旋毛虫抗酸机制中作用。同时,以旋毛虫的谷氨酸脱羧酶（TsGAD）、谷氨酰胺酶（TsGLS）为包被抗原成功建立两种间接ELISA方法。本研究根据NCBI已发表的TsGAD mRNA序列,设计3条靶向沉默TsGAD的干扰序列siRNAs:GAD-siRNA1、GAD-siRNA2和GAD-siRNA3及一条阴性对照:control siRNA。通过浸染法在Lipofectin 2000的作用下将siRNAs导入旋毛虫体内,利用免疫荧光技术确定转染时间为12 h。应用实时荧光定量PCR（qPCR）技术、Western blot（WB）技术检测RNA干扰技术对TsGAD基因表达量的影响。qPCR和WB的结果显示,三条siRNAs序列均能抑制TsGAD基因的表达,其中GAD-siRNA1序列对TsGAD基因的抑制效果最好,抑制率为51.70%56.70%。同时,通过qPCR和WB实验确立siRNA最适转染浓度为2μM。体外酸性环境培养TsGAD基因沉默的旋毛虫,从TsGAD基因的表达量、TsGAD酶活性、虫体存活率和培养基pH值变化等方面研究旋毛虫的抗酸机制。研究结果表明,酸性环境可以诱导TsGAD基因的表达,相同pH条件下,干扰组的酶活性比PBS组低;酸性条件下酶活性高。在同一pH值的培养液中,随着培养时间的增加,各组旋毛虫的存活率降低;在pH 6.6时各组旋毛虫的存活率最高;相同培养时间和相同pH下,GAD-siRNA1组旋毛虫的存活率明显低于PBS组。GAD-siRNA1组与PBS相比,培养基pH值升高不明显。用TsGAD基因沉默后的旋毛虫感染小鼠,从旋毛虫成虫的减虫率、RCI、LPG、肌幼虫减虫率和肌幼虫保姆细胞壁的厚度等方面研究TsGAD基因沉默后的旋毛虫感染小鼠的能力。研究结果显示,与PBS组相比,GAD-siRNA1组成虫减虫率为31.50%,RCI为62.51±7.32,LPG为1250.22±146.48;肌幼虫的减虫率为49.15%;F1代保姆细胞壁增厚,周围有大量炎性物质。以上研究结果揭示,TsGAD基因在旋毛虫抗酸过程中起到非常重要作用。将TsGAD基因沉默后旋毛虫的F1代肌幼虫酸性条件下培养,研究结果为F1代肌幼虫在pH 2.5的培养基中培养2 h后的存活率为57%,与F0代旋毛虫的存活率差异显着,说明siRNA的干扰效果不可以延续给下一代。本研究分别以旋毛虫TsGAD、TsGLS重组蛋白作为包被抗原,建立两种检测旋毛虫血清抗体的间接ELISA方法。分别对抗原包被量、血清稀释度、抗原包被条件、封闭液的选择与封闭时间、酶标二抗的稀释度与孵育时间和TMB作用时间等条件进行了优化。研究结果显示TsGAD重组抗原间接ELISA方法的最适抗原包被量为50 ng,最适血清稀释度为1:200,最适抗原包被条件为4℃过夜包被,最适封闭液为5%脱脂乳,最适封闭时间为37℃封闭2 h,酶标二抗的最适稀释度为1:5000,最适孵育时间为37℃封闭1 h,TMB作用时间为15 min;TsGLS重组抗原间接ELISA方法的最适抗原包被量为100 ng,最适血清稀释度为1:800,最适抗原包被条件为4℃过夜包被,最适封闭液为5%脱脂乳,最适封闭时间为37℃封闭2 h,酶标二抗的最适稀释度为1:5000,最适孵育时间为37℃封闭1 h,TMB作用时间为15 min。TsGAD重组抗原间接ELISA方法的阴阳性临界值判定标准为0.848,TsGLS重组抗原间接ELISA方法的阴阳性临界值判定标准为0.963。通过重复性实验、敏感性实验、特异性实验和对比实验检测了本研究建立的两种间接ELISA方法的准确性。研究结果显示,TsGAD重组抗原间接ELISA方法批内重复性实验的最大变异系数为5.647%,批间重复性实验最大变异系数6.049%,均小于10%,重复性好;当旋毛虫阳性血清稀释3200倍时,测得P/N值大于2.1,显示阳性,表明敏感性高;对猪蛔虫、华支睾吸虫、血吸虫和弓形虫阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有很好的稳定性和特异性。TsGLS重组抗原间接ELISA方法批内重复性实验的最大变异系数为7.318%,批间重复性实验最大变异系数8.536%,均小于10%,重复性好;当旋毛虫阳性血清稀释3200倍时,测得P/N值大于2.1,显示阳性,表明敏感性高;对猪蛔虫、华支睾吸虫、血吸虫和弓形虫阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有很好的稳定性和特异性。同时用膈肌压片法、两种间接ELISA方法和旋毛虫抗体快速检测卡分别对旋毛虫感染不同剂量和天数的小鼠进行检测,研究结果表明,旋毛虫感染剂量越多,旋毛虫病越早被检测出且检出率越高。无论旋毛虫感染剂量的多少,膈肌压片法最早可在旋毛虫感染后的第21天检测出旋毛虫病,这与旋毛虫的生活史有关;TsGAD重组抗原间接ELISA方法和TsGLS重组抗原间接ELISA方法最早在感染后的第7天检测出感染剂量为30条的旋毛虫病;旋毛虫快速检测卡最早可在感染后的第14天检测出感染剂量为30条的旋毛虫病。TsGAD重组抗原间接ELISA检测方法和TsGLS重组抗原间接ELISA检测方法对于心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等脏器研磨液的检测结果相似:在不同的旋毛虫感染剂量下均是最先从心脏研磨液中检测出;同一脏器研磨液的检出率随着感染剂量和感染天数的增加而升高。本研究利用RNA干扰技术成功的抑制了TsGAD基因的表达;实验结果证明旋毛虫谷氨酸脱羧酶在其耐受胃酸环境时发挥了重要作用,为后续研究提供了基础数据。同时,建立的两种间接ELISA方法为旋毛虫病的早期诊断和流行病学调查提供了必要的检测手段。
李婷婷[9]（2019）在《旋毛虫三种半胱氨酸蛋白酶抑制因子的功能研究及重组酶聚合酶扩增检测方法的建立》文中进行了进一步梳理由于旋毛虫的传播途径复杂,宿主地理分布广泛,旋毛虫病仍未得到有效控制。加强对该病的诊断和通过有效的疫苗阻断旋毛虫的传播是预防人类或者家养动物感染旋毛虫病的有效手段。寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine protease inhibitor,CPI或cystatin）不仅具有独特的半胱氨酸蛋白酶抑制活性,而且还可以调节宿主免疫反应,在寄生虫逃避宿主免疫应答,适应寄生生活中起着重要作用。本研究成功克隆了旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2基因,并且在原核表达系统中诱导表达,纯化后的重组蛋白具有蛋白酶抑制活性,可以在不同pH和温度下抑制人组织蛋白酶B的活性。TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2在旋毛虫的肌幼虫、成虫和新生幼虫时期均有转录,主要表达于肌幼虫的表皮和杆状体中。体外研究了重组TsCystatins对IFN-γ激活的巨噬细胞RAW264.7的影响。结果发现,重组TsCystatins和IFN-γ共同作用于RAW264.7细胞明显抑制了NO的产生,并且呈现剂量依赖性。重组TsCystatins能够抑制IFN-γ激活的RAW264.7细胞促炎性细胞因子（IL-6、IL-12和TNF-α）的分泌,而重组TsCystatins单独作用促进了抗炎性细胞因子（IL-10）的分泌。说明TsCystatins是旋毛虫感染宿主的免疫调节分子,通过抑制宿主巨噬细胞的炎症反应逃避宿主的免疫应答,来达到在宿主体内长期寄生的目的。攻击感染试验结果发现,重组的TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2能够刺激机体产生较高水平的抗体,但是不能有效的减少免疫鼠肌肉中旋毛虫的荷虫量。为了进一步确定TsCystatins对旋毛虫感染的免疫保护力,我们以弓形虫弱毒株RHΔGRA17为表达载体,使得TsCystatin2成功表达,且对该弱毒株的体外裂殖、宿主细胞的入侵及在宿主细胞内的增殖不产生影响。小鼠免疫RHΔGRA17::TsCystatin2产生较高水平的抗弓形虫特异性IgG;利用弓形虫裂解抗原刺激免疫之后的脾细胞能够产生较高水平的IL-12及IFN-γ。腹腔感染弓形虫强毒株试验的结果发现,小鼠免疫RHΔGRA17::TsCystatin2能抵抗弓形虫的再次感染。另外,免疫转基因RHΔGRA17::TsCystatin2虫株能够刺激小鼠产生抗旋毛虫特异性的体液免疫应答以及Th1为主的细胞免疫应答（较高水平的IgG2a、IL-12和IFN-γ）。但是,Th2型细胞因子（IL-4和IL-10）在免疫小鼠中并没有显着增加,而这种Th1主导的免疫反应并不能使免疫小鼠在随后的旋毛虫攻击感染中获得有效的免疫,即不能有效的减少免疫鼠肌肉中旋毛虫的荷虫量。以上研究结果说明TsCystatins可能不是理想的疫苗候选蛋白。此外,本研究以旋毛虫属（Trichinella spp.）线粒体小亚单位核糖体RNA（rrnS）基因为靶点,建立了重组酶聚合酶扩增技术和侧流层析试纸条（LF-RPA）联合检测旋毛虫感染的诊断方法。该方法可在25-45℃范围内进行,10-25 min内即可完成,且可检测到低至100 fg的旋毛虫DNA,具有简便、快速、准确、高特异性和敏感性的特点。
翟铖铖[10]（2018）在《旋毛虫不同发育时期抗原基因的克隆表达与诊断特性研究》文中研究指明旋毛虫病是一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病,呈世界性分布。从发现至今已近200年,但每年在世界各地仍有大量病例并引起多起暴发。由于旋毛虫病的临床症状不具有特异性,所以不易诊断,尤其是早期诊断,至今仍没有一种快速、准确、便捷的诊断方法。本研究旨在找到一种敏感性高、特异性好、又能大量制备的优质抗原,可用于研制旋毛虫病的免疫学诊断制剂。目的:本研究基于以往研究基础所获得的旋毛虫不同发育时期的4个强反应原性抗原基因,进行体外克隆表达,获得大量高纯度的基因重组蛋白,利用ELISA技术对人工感染不同剂量、不同时间的鼠血清中旋毛虫特异性抗体水平进行检测,并利用人体旋毛虫病人血清进行诊断效果的初步鉴定,筛选出可用于旋毛虫免疫学诊断的基因重组抗原,为进一步建立起有效的旋毛虫病免疫学诊断方法奠定研究基础。方法:根据NCBI-Gene注册的不同发育时期的4个基因序列,即感染后6h肠道幼虫期（inML6h）的类半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors-like,CPIL）基因Wn10、成虫Ad3期丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP1）基因Zh68、新生幼虫期（NBL）特异性丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP2）基因T668、肌幼虫期（ML）丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpin）基因Wm5,利用生物信息学方法预测4个基因编码蛋白的结构功能与抗原表位,并利用原核表达系统进行体外大量表达与纯化,获得纯度较高的基因重组蛋白,分别命名为P1、P2、P3和P4;进一步通过ELISA方法,利用基因重组蛋白对人工感染不同旋毛虫剂量、不同时间的鼠血清中旋毛虫特异性抗体水平进行检测;同时,利用旋毛虫病人血清分别对4个发育时期的ES抗原、基因重组抗原及市面上的旋毛虫诊断试剂盒进行诊断效果的比较;利用SPSS 22.0对所得数据进行统计学分析。结果:根据生物信息学的预测结果,4个基因所编码的蛋白都为亲水性蛋白,SP2有一个跨膜区,CPIL、SP1和SP2都含有信号肽,都具有众多抗原表位,且挑选出优势抗原表位。利用原核表达系统及蛋白纯化技术,成功获得了 4个纯度较高的基因重组蛋白。进一步利用ELISA方法结果表明:1)对鼠血清的检测结果显示,在IgM水平上,4个重组蛋白检测的抗体水平都较低或阴性;在IgG水平上,P1在低剂量和高剂量分别在第10天和第8天检测出阳性,在感染后第11-45天均为阳性且维持较高水平,感染早期低剂量组抗体水平明显高于高剂量组,P2、P3、P4最早分别在第10天、第14天、第16天可检测出阳性,在感染剂量上没有P1差别明显,且整体阳性检测水平低于P1。2)对病人血清诊断结果显示,在IgM抗体水平上,4种ES抗原、P2及P3都能诊断出全部旋毛虫病人的IgM抗体;在IgG抗体水平上,4种ES抗原、P4和IgG诊断试剂盒均能诊断出全部旋毛虫病病人的IgG抗体。结论:利用鼠血清的检测,4个重组蛋白对旋毛虫病IgG抗体都有较好的诊断效果,其中感染6小时肠道幼虫期的类半胱氨酸蛋白酶抑制因子（P1）可作为早期感染诊断的候选抗原,肌幼虫期的丝氨酸蛋白酶抑制因子（P4）可作为中晚期感染诊断的候选抗原,同时发现P1在感染低剂量明显高于高剂量的抗体水平,推测其可能参与旋毛虫感染引起的宿主免疫抑制功能,为研制旋毛虫病的阻断剂和保护剂提供重要的参考价值;利用旋毛虫病人血清对4个基因重组蛋白的诊断特性进行鉴定,P2和P3可作为旋毛虫病IgM抗体检测的候选诊断抗原,P4可作为旋毛虫病IgG抗体检测的候选诊断抗原;P1和P4的诊断特性及应用价值还需要进一步完善和深入研究。
二、用ELISA检测猪旋毛虫病的高效抗原（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用ELISA检测猪旋毛虫病的高效抗原（论文提纲范文）
（1）小鼠感染旋毛虫的四种检测方法比较分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫分类 |
| 1.2 旋毛虫诊断方法研究进展 |
| 1.3 旋毛虫病原学诊断 |
| 1.3.1 目检法 |
| 1.3.2 压片法 |
| 1.3.3 人工胃液消化法 |
| 1.4 旋毛虫免疫学诊断 |
| 1.4.1 皮肤实验 |
| 1.4.2 凝集实验 |
| 1.4.3 环幼沉淀法 |
| 1.4.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 1.4.5 胶体金法 |
| 1.5 旋毛虫分子生物学诊断 |
| 1.5.1 PCR |
| 1.5.2 液相基因芯片 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 试剂与实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 相关应用与数据分析 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 2.2.2 旋毛虫地理株的分类与鉴定 |
| 2.2.3 旋毛虫实验小鼠感染、样本收集及处理 |
| 2.2.4 旋毛虫探针及配套引物的合成 |
| 2.2.5 旋毛虫实时荧光定量PCR检测方法建立 |
| 2.2.6 旋毛虫TsODC重组蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.7 旋毛虫四种检测方法的比较研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同地区各旋毛虫地理株遗传进化分析 |
| 3.1.1 COX1 基因和NAD5 基因不同地理株的扩增结果 |
| 3.1.2 同源性与进化分析 |
| 3.2 旋毛虫实时荧光定量PCR的建立 |
| 3.2.1 特异性试验 |
| 3.2.2 灵敏性试验 |
| 3.2.3 重复性试验 |
| 3.3 旋毛虫ODC重组蛋白间接ELISA条件的优化 |
| 3.3.1 抗原包被板最佳包被条件的确定 |
| 3.3.2 抗原最佳血清稀释度和最佳包被浓度的筛选 |
| 3.3.3 封闭液和封闭时间的确定 |
| 3.3.4 酶标抗体稀释度和孵育时间的确定 |
| 3.3.5 显色时间的确定 |
| 3.3.6 间接ELISA临界值的确定 |
| 3.3.7 重复性试验 |
| 3.3.8 敏感性试验 |
| 3.3.9 特异性试验 |
| 3.4 旋毛虫四种诊断方法的应用 |
| 3.4.1 qPCR对旋毛虫不同感染时期的各组织部位的检测结果 |
| 3.4.2 间接ELISA方法对旋毛虫感染小鼠进行检测的结果 |
| 3.4.3 压片法对旋毛虫感染小鼠的检测结果及肌幼虫数的变化 |
| 3.4.4 消化法对旋毛虫感染小鼠的检测结果及LPG和 RCI的变化 |
| 3.5 旋毛虫四种诊断方法的比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 旋毛虫各地理株的分子分类 |
| 4.2 旋毛虫实时荧光定量PCR的建立 |
| 4.3 旋毛虫ODC重组蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 4.4 旋毛虫四种检测方法的比较研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（2）应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1 章 旋毛虫及旋毛虫病研究进展 |
| 1.1 旋毛虫及其生活史 |
| 1.2 旋毛虫病 |
| 1.3 旋毛虫检测方法的研究进展 |
| 第2 章 SERS在生物检测中的概况及应用 |
| 2.1 SERS概况 |
| 2.2 SERS在生物检测中的应用 |
| 第3章 UCP-ICA在生物检测中的概况及应用 |
| 3.1 UCP概况 |
| 3.2 UCP-ICA在生物检测中的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1 章 基于SERS建立旋毛虫病快速筛查模型及评价 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物和旋毛虫 |
| 1.1.2 主要试剂、耗材 |
| 1.1.3 主要实验仪器 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 旋毛虫ML收集 |
| 1.2.2 旋毛虫感染模型构建和血清样本制备 |
| 1.2.3 银纳米颗粒制备和表征 |
| 1.2.4 血清SERS光谱测量和收集 |
| 1.2.5 光谱数据处理和多元统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 旋毛虫ML收集后鉴定 |
| 1.3.2 银纳米颗粒表征结果 |
| 1.3.3 SERS测试结果 |
| 1.3.4 血清SERS多元统计分析 |
| 1.3.5 血清SERS官能团发掘 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 SERS光谱 |
| 1.4.2 统计分析 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 旋毛虫UCP-ICA制备及其优化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 旋毛虫虫种和实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂、耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫ML收集及其ES抗原制备 |
| 2.2.2 旋毛虫ML-ES抗原鉴定 |
| 2.2.3 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG制备与表征 |
| 2.2.4 旋毛虫UCP-ICA建立与优化 |
| 2.2.5 Ts-UCP-ICA的操作流程 |
| 2.2.6 阈值(cut-off)确立 |
| 2.2.7 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的效果评价 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 旋毛虫ML-ES抗原的鉴定结果 |
| 2.3.2 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG偶联表征 |
| 2.3.3 Ts-UCP-ICA建立与优化 |
| 2.3.4 Ts-UCP-ICA-cut-off值确定 |
| 2.3.5 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 Ts-UCP-ICA评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Ts-UCP-ICA制备 |
| 3.2.2 特异性分析 |
| 3.2.3 单盲测试分析 |
| 3.2.4 一致性评价 |
| 3.2.5 稳定性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 特异性分析结果 |
| 3.3.2 单盲测试结果 |
| 3.3.3 一致性评价 |
| 3.3.4 稳定性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫病与旋毛虫 |
| 1.1.1 旋毛虫病概述 |
| 1.1.2 旋毛虫生活史 |
| 1.1.3 旋毛虫入侵对宿主的影响 |
| 1.2 RNA干扰技术在寄生虫中的应用 |
| 1.2.1 常见的生物基因功能研究技术 |
| 1.2.2 RNA干扰技术的原理 |
| 1.2.3 RNA干扰在寄生虫中的作用方式和应用 |
| 1.3 旋毛虫与丝氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 1.3.1 丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.3.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂概述 |
| 1.3.3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类及结构特点 |
| 1.3.4 寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能 |
| 1.4 旋毛虫感染与免疫 |
| 1.4.1 寄生虫感染后宿主免疫策略 |
| 1.4.2 寄生虫感染与宿主T细胞 |
| 1.4.3 寄生虫感染与宿主巨噬细胞 |
| 1.4.4 寄生虫感染与宿主其他重要免疫细胞 |
| 1.4.5 寄生虫与免疫逃避 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫株与实验动物 |
| 2.1.2 主要菌株、细胞株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配置 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要应用软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 TsSPI基因siRNA设计与合成 |
| 2.2.2 TsSPI基因dsRNA设计与合成 |
| 2.2.3 旋毛虫肌幼虫的收集与体外培养 |
| 2.2.4 siRNA/dsRNA导入旋毛虫肌幼虫 |
| 2.2.5 qPCR检测TsSPI基因转染水平变化 |
| 2.2.6 Western blot检测TsSPI蛋白表达水平 |
| 2.2.7 qPCR检测dsRNA干扰效果的时间效应 |
| 2.2.8 检测dsRNA干扰的基因特异性 |
| 2.2.9 检测TsSPI基因沉默后肌幼虫体外存活率以及入侵IECs能力 |
| 2.2.10 检测TsSPI基因沉默后旋毛虫在小鼠体内发育、繁殖、减虫率情况 |
| 2.2.11 qPCR检测TsSPI基因沉默在旋毛虫中的遗传情况 |
| 2.2.12 检测旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞细胞相关因子表达水平变化 |
| 2.2.13 检测TsSPI基因沉默的旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB磷酸化情况 |
| 2.2.14 CCK8 检测小鼠巨噬细胞raw264.7 增值活力 |
| 2.2.15 qPCR检测CAM相关因子基因表达量 |
| 2.2.16 Western blot检测巨噬细胞IRAK通路相关蛋白含量 |
| 2.2.17 qPCR检测AAM相关基因表达量 |
| 2.2.18 Western blot检测巨噬细胞JAK2/STAT3磷酸化水平 |
| 2.2.19 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 利用RNAI沉默TSSPI基因 |
| 3.1.1 siRNA的设计与dsRNA的构建结果 |
| 3.1.2 siRNA导入旋毛虫体内情况分析 |
| 3.1.3 不同浓度RNAi对 TsSPI转录水平的影响 |
| 3.1.4 不同RNAi对 TsSPI转录水平的影响 |
| 3.1.5 dsRNA-TsSPI干扰的时间效应 |
| 3.1.6 dsRNA-TsSPI干扰的特异性 |
| 3.2 TSSPI基因沉默对ML体外存活率与入侵肠上皮细胞影响 |
| 3.2.1 TsSPI基因沉默对ML体外存活率的影响 |
| 3.2.2 TsSPI基因沉默对肌幼虫体外入侵肠上皮细胞的影响 |
| 3.3 TSSPI基因沉默对ML入侵宿主肠道并发育的影响 |
| 3.4 TSSPI基因沉默的遗传性分析 |
| 3.5 TSSPI基因沉默对ML入侵后宿主免疫相关因子的影响 |
| 3.5.1 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子含量影响 |
| 3.5.2 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞效应因子含量的影响 |
| 3.5.3 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB磷酸化水平的影响 |
| 3.6 重组蛋白TSSPI对小鼠巨噬细胞极化的影响 |
| 3.6.1 重组蛋白的表达纯化及复性 |
| 3.6.2 重组蛋白对小鼠巨噬细胞raw264.7增值活力的影响 |
| 3.6.3 重组蛋白对CAM相关因子基因表达水平影响 |
| 3.6.4 重组蛋白对巨噬细胞NF-κB通路相关蛋白的影响 |
| 3.6.5 重组蛋白对AAM相关因子基因表达水平影响 |
| 3.6.6 重组蛋白对巨噬细胞JAK2/STAT3 通路相关蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNA干扰对旋毛虫TsSPI基因表达的影响 |
| 4.2 旋毛虫TSSPI基因沉默在旋毛虫入侵宿主过程中的功能研究 |
| 4.3 旋毛虫TSSPI基因沉默在旋毛虫入侵过程中免疫调节功能的研究 |
| 4.4 重组蛋白TSSPI调节巨噬细胞极化的研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（4）伪旋毛虫排泄—分泌（ES）产物蛋白质组学的初步分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 伪旋毛虫及伪旋毛虫病研究进展 |
| 1.1 伪旋毛虫概述 |
| 1.2 伪旋毛虫的分类 |
| 1.3 伪旋毛虫和旋毛虫差异 |
| 1.4 伪旋毛虫的宿主和分布 |
| 1.5 伪旋毛虫病的流行病学 |
| 1.6 旋毛虫病的发生机制、临床表现、诊断与防治 |
| 第二章 寄生虫的蛋白质组学研究进展 |
| 2.1 蛋白质组学概论 |
| 2.2 蛋白质组学技术体系 |
| 2.3 蛋白质组学在寄生虫领域应用 |
| 第三章 寄生虫ES产物对宿主免疫反应调节研究进展 |
| 3.1 寄生虫排泄分泌抗原(ES)免疫调节作用 |
| 3.2 伪旋毛虫免疫调节特点 |
| 3.3 伪旋毛虫免疫诊断抗原研究 |
| 3.4 免疫细胞及其细胞因子参与免疫调节作用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 猪感染伪旋毛虫的免疫反应 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 伪旋毛虫肌幼虫ES产物的差异蛋白组学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 伪旋毛虫早期诊断抗原的免疫学筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
（5）旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的抗原性和对树突状细胞的免疫调节性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 旋毛虫流行病学调查 |
| 1.1 旋毛虫概述 |
| 1.2 旋毛虫流行途径分析 |
| 1.3 旋毛虫病分布 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 旋毛虫感染诊断抗原研究进展 |
| 2.1 排泄分泌抗原(ES) |
| 2.2 虫体抗原(粗抗原) |
| 2.3 表面抗原(SA抗原) |
| 2.4 重组抗原 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 旋毛虫及其虫源性分子免疫调控作用的研究 |
| 3.1 旋毛虫免疫调节 |
| 3.2 旋毛虫排泄分泌抗原(ES)免疫调节作用研究 |
| 3.3 旋毛虫重组抗原免疫调节作用研究 |
| 3.4 旋毛虫丝氨酸蛋白酶免疫调节作用研究 |
| 3.5 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白的表达与纯化 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物与旋毛虫虫种 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 常用试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 总RNA的提取及反转录 |
| 1.2.3 目的基因的扩增 |
| 1.2.4 重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.5 重组Ts-Sp-7 蛋白的诱导表达 |
| 1.2.6 重组Ts-Sp-7 蛋白的纯化 |
| 1.2.7 重组Ts-Sp-7 蛋白的Western-Blot分析 |
| 1.2.8 重组Ts-Sp-7 蛋白与猪阳性血清Westen-Blot分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 Ts-Sp-7 蛋白信号肽预测 |
| 1.3.2 目的基因的扩增 |
| 1.3.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 1.3.4 重组Ts-Sp-7 蛋白的可溶性分析 |
| 1.3.5 重组Ts-Sp-7 蛋白不同咪唑浓度纯化SDS-PAGE分析 |
| 1.3.6 重组Ts-Sp-7 蛋白Westen-Blot分析 |
| 1.3.7 重组Ts-Sp-7 蛋白与猪阳性血清Westen-Blot分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白多克隆抗体及单克隆抗体的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.2 单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.3.2 单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 旋毛虫Ts-Sp-7蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞抗原提呈功能的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 C57BL/6 小鼠树突状细胞的分离与培养 |
| 3.2.2 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白对骨髓源树突状细胞成熟的影响 |
| 3.2.3 OT-Ⅱ小鼠Na?ve CD4+T 细胞的制备 |
| 3.2.4 小鼠骨髓源树突状细胞与Na?ve CD4+T 细胞共培养体系的建立 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白对骨髓源树突状细胞成熟的影响 |
| 3.3.2 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白刺激后的BMDCs对 Na?ve CD4+T细胞增殖的影响 |
| 3.3.3 旋毛虫Ts-Sp-7 蛋白刺激后的BMDCs对 Na?ve CD4+T 细胞活化的影响 |
| 3.3.4 旋毛虫Ts-Sp-7蛋白刺激后的BMDCs对Treg细胞的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（6）旋毛虫丝氨酸蛋白酶的分子特征及其诱导的保护性免疫（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验相关仪器 |
| 2.3 试剂配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 TsSerp的生物信息学分析 |
| 3.2 TsSerp的克隆 |
| 3.3 表达载体(pET-32a)的连接、转化及验证 |
| 3.4 抗rTsSerp血清的制备 |
| 3.5 rTsSerp的抗原性分析 |
| 3.6 Ts Serp在旋毛虫不同发育时期的转录及表达 |
| 3.7 IFA检测Ts Serp在旋毛虫不同发育时期的定位 |
| 3.8 rTsSerp与正常小鼠肠上皮细胞的结合 |
| 3.9 旋毛虫肠道感染性幼虫体外侵入IEC实验 |
| 3.10 ADCC实验 |
| 3.11 rTsSerp免疫小鼠及相关免疫指标测定 |
| 3.12 rTsSerp诱导的免疫保护作用 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 TsSerp的生物信息学分析 |
| 4.2 TsSerp的克隆 |
| 4.3 TsSerp的体外表达及纯化 |
| 4.4 抗rTsSerp血清制备及效价测定 |
| 4.5 rTsSerp的抗原性分析 |
| 4.6 Ts Serp在旋毛虫不同发育时期的转录及表达 |
| 4.7 IFA检测Ts Serp在旋毛虫不同发育时期的定位 |
| 4.8 rTsSerp与正常小鼠肠上皮细胞的结合 |
| 4.9 旋毛虫肠道感染性幼虫体外侵入IEC实验 |
| 4.10 抗rTsSerp血清介导的ADCC对新生幼的杀伤作用 |
| 4.11 rTsSerp 免疫小鼠及血清抗体的测定 |
| 4.12 细胞因子测定 |
| 4.13 rTsSerp诱导的免疫保护作用 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 丝氨酸蛋白酶的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、硕士期间发表的学术论文情况 |
| 致谢 |
（7）上转发光免疫层析试纸条快速检测猪旋毛虫方法建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 旋毛虫病研究进展 |
| 1.1 旋毛虫病的危害 |
| 1.2 旋毛虫抗原研究进展 |
| 1.3 旋毛虫病诊断方法现状 |
| 第二章 上转发光免疫层析技术概况及应用 |
| 2.1 上转发光技术概况 |
| 2.2 上转发光免疫层析技术概况 |
| 2.3 UPT-LF结构 |
| 2.4 UPT-LF在免疫检测中的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫上转发光免疫层析试纸条(Tsp-UPT-LF)候选抗原的制备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 Tsp-UPT-LF检测方法的建立及优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Tsp-UPT-LF评价 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）TsGAD基因沉默对旋毛虫抗酸影响及其间接ELISA方法建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫简介 |
| 1.2 食源性致病菌抗酸机制的研究进程 |
| 1.2.1 大肠杆菌的抗酸机制 |
| 1.2.2 沙门氏菌的抗酸机制 |
| 1.2.3 志贺式杆菌的抗酸机制 |
| 1.2.4 乳酸乳球菌的抗酸机制 |
| 1.3 RNA干扰 |
| 1.3.1 siRNA干扰的原理 |
| 1.3.2 RNAi在寄生虫方面的研究 |
| 1.4 旋毛虫病的诊断方法 |
| 1.4.1 病原学诊断方法 |
| 1.4.2 血清学诊断方法 |
| 1.4.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂与实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 qPCR引物与siRNA片段序列 |
| 2.1.4 主要应用软件和数据分析 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 2.2.2 浸染法将siRNA导入肌幼虫体内 |
| 2.2.3 转染时间与效率的确定 |
| 2.2.4 siRNA片段的筛选 |
| 2.2.5 siRNA浓度的筛选 |
| 2.2.6 酸环境对TsGAD基因沉默虫体和培养液pH的影响 |
| 2.2.7 TsGAD基因沉默虫体对小鼠感染能力及保姆细胞壁厚度研究 |
| 2.2.8 旋毛虫TsGAD重组蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.9 旋毛虫TsGLS重组蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.10 对比试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转染时间与效率的确定 |
| 3.2 siRNA对TsGAD基因表达的影响 |
| 3.2.1 qPCR检测siRNA对TsGAD基因转录水平的影响 |
| 3.2.2 WB检测siRNA对TsGAD基因翻译水平的影响 |
| 3.3 酸环境对TsGAD基因沉默虫体和培养液pH的影响 |
| 3.3.1 肌幼虫存活率 |
| 3.3.2 qPCR方法检测TsGAD基因的表达量 |
| 3.3.3 酶活性的改变 |
| 3.3.4 培养基pH值的变化 |
| 3.4 TsGAD基因沉默虫体对小鼠感染力的影响 |
| 3.4.1 TsGAD基因沉默肌幼虫对其产生的成虫的影响 |
| 3.4.2 TsGAD基因沉默对旋毛虫RCI、LPG和减虫率的影响 |
| 3.5 HE染色观察F1代旋毛虫保姆细胞 |
| 3.6 F1代旋毛虫的抗酸性 |
| 3.7 TsGAD与TsGLS重组蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.7.1 TsGAD和TsGLS重组蛋白的定量与SDS-PAGE分析 |
| 3.7.2 TsGAD重组蛋白间接ELISA条件的优化 |
| 3.7.3 TsGLS重组蛋白间接ELISA条件的优化 |
| 3.7.4 对比试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 旋毛虫体外培养酸环境pH值和培养时间的确定 |
| 4.2 siRNA干扰对旋毛虫TsGAD基因表达的影响 |
| 4.3 TsGAD基因沉默虫体的抗酸性 |
| 4.4 旋毛虫诊断方法的比较 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）旋毛虫三种半胱氨酸蛋白酶抑制因子的功能研究及重组酶聚合酶扩增检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 第一章 引言 |
| 1.1 旋毛虫及旋毛虫病概述 |
| 1.2 寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的研究进展 |
| 1.2.1 半胱氨酸蛋白酶抑制因子的类型及结构特征 |
| 1.2.2 寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子 |
| 1.2.3 寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的作用机制 |
| 1.2.4 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子 |
| 1.3 旋毛虫的诊断方法 |
| 1.4 总结与展望 |
| 1.5 研究目的与意义 第二章 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子蛋白功能研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 虫种、实验动物、质粒、菌株及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 旋毛虫各期虫体的收集 |
| 2.1.4 旋毛虫各期虫体总RNA的提取及反转录 |
| 2.1.5 qRT-PCR |
| 2.1.6 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.1.7 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.1.8 兔抗TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 重组蛋白高免血清的制备和鉴定 |
| 2.1.9 免疫定位 |
| 2.1.10 酶活抑制试验 |
| 2.1.11 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的准备 |
| 2.1.12 RAW264.7细胞的培养 |
| 2.1.13 CCK-8检测 |
| 2.1.14 总NO检测 |
| 2.1.15 ELISA检测细胞培养上清中的细胞因子 |
| 2.1.16 重组蛋白免疫保护性试验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2的PCR扩增结果 |
| 2.2.2 旋毛虫TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 的时期表达差异 |
| 2.2.3 原核表达重组质粒酶切鉴定结果 |
| 2.2.4 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.2.5 兔抗TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 重组蛋白高免血清的鉴定 |
| 2.2.6 TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2 在旋毛虫肌幼虫中的分布 |
| 2.2.7 rTsStefin、rTsCystatin1和rTsCystatin2 重组蛋白抑制活性分析 |
| 2.2.8 TsCystatins对IFN-γ激活的RAW264.7 细胞的增殖没有影响 |
| 2.2.9 TsCystatins抑制IFN-γ激活的RAW264.7 细胞产生NO |
| 2.2.10 TsCystatins对 RAW264.7 细胞产生细胞因子的影响 |
| 2.2.11 重组蛋白免疫保护性分析 |
| 2.3 讨论 第三章 表达异源半胱氨酸蛋白酶抑制因子弓形虫弱毒株的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验动物、质粒、虫株及细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液的配置 |
| 3.1.4 异源表达载体的构建 |
| 3.1.5 抗性及异源表达序列的扩增 |
| 3.1.6 CRISPR-Cas9质粒的提取 |
| 3.1.7 转基因弓形虫的构建 |
| 3.1.8 转基因弓形虫的PCR鉴定 |
| 3.1.9 转基因弓形虫的间接免疫荧光的鉴定 |
| 3.1.10 转基因弓形虫的Western blot的鉴定 |
| 3.1.11 其他弓形虫启动子表达旋毛虫的Stefin及 Cystatin |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 GRA1启动子和GRA2终止子的扩增 |
| 3.2.2 对Stefin、Cystatin1和Cystatin2 添加3×HA |
| 3.2.3 构建异源表达载体序列 |
| 3.2.4 构建异源表达载体筛选载体 |
| 3.2.5 异源表达及筛选序列的扩增 |
| 3.2.6 无内毒素CRISPR-Cas9质粒的大量提取 |
| 3.2.7 转基因弓形虫的单克隆筛选 |
| 3.2.8 转基因弓形虫PCR验证 |
| 3.2.9 转基因弓形虫的间接免疫荧光检测 |
| 3.2.10 转基因弓形虫的Western blot检测 |
| 3.2.11 其他弓形虫启动子表达旋毛虫Stefin及 Cystatin |
| 3.3 讨论 第四章 RHΔGRA17::TsCystatin2 的生物学特性及免疫保护性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验动物及虫株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要试剂的配置 |
| 4.1.4 弓形虫裂解抗原的制备 |
| 4.1.5 噬斑试验 |
| 4.1.6 入侵试验 |
| 4.1.7 复制试验 |
| 4.1.8 小鼠免疫试验 |
| 4.1.9 血清中IgG抗体及IgG1、IgG2a抗体亚类的检测 |
| 4.1.10 脾细胞制备 |
| 4.1.11 细胞因子的检测 |
| 4.2 结果和分析 |
| 4.2.1 噬斑试验 |
| 4.2.2 入侵试验 |
| 4.2.3 胞内增殖试验 |
| 4.2.4 转基因株的免疫原性 |
| 4.2.5 转基因株引起的抗旋毛虫免疫反应 |
| 4.2.6 旋毛虫减虫率 |
| 4.3 讨论 第五章 旋毛虫重组酶聚合酶扩增检测方法的建立 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 组织DNA提取 |
| 5.1.4 引物和探针的设计 |
| 5.1.5 RPA琼脂糖凝胶检测方法的建立 |
| 5.1.6 LF-RPA检测方法的建立 |
| 5.1.7 传统PCR检测方法的建立 |
| 5.1.8 LF-RPA反应条件的探索 |
| 5.1.9 LF-RPA特异性及灵敏度 |
| 5.1.10 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 5.1.11 LF-RPA检测人工感染样品 |
| 5.1.12 肌肉与虫体混合试验 |
| 5.1.13 抑制试验 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 LF-RPA的反应条件 |
| 5.2.2 特异性分析 |
| 5.2.3 灵敏度分析 |
| 5.2.4 抑制试验 |
| 5.2.5 人工感染样品的检测 |
| 5.3 讨论 第六章 全文结论 参考文献 致谢 作者简介 |
（10）旋毛虫不同发育时期抗原基因的克隆表达与诊断特性研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第一部分 旋毛虫四个抗原基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 不同发育时期抗原基因的克隆表达与蛋白纯化 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 基因重组蛋白对鼠血清中旋毛虫特异性抗体的动态观察 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 基因重组蛋白对人旋毛虫病诊断效果的鉴定 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 研究总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件 |
四、用ELISA检测猪旋毛虫病的高效抗原（论文参考文献）
- [1]小鼠感染旋毛虫的四种检测方法比较分析[D]. 赵亚. 东北农业大学, 2021
- [2]应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究[D]. 李健. 吉林大学, 2021
- [3]旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究[D]. 伊娜娜. 东北农业大学, 2020
- [4]伪旋毛虫排泄—分泌（ES）产物蛋白质组学的初步分析[D]. 王洋. 吉林大学, 2020(08)
- [5]旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的抗原性和对树突状细胞的免疫调节性研究[D]. 张胜兰. 吉林大学, 2020(08)
- [6]旋毛虫丝氨酸蛋白酶的分子特征及其诱导的保护性免疫[D]. 岳欣. 郑州大学, 2020(02)
- [7]上转发光免疫层析试纸条快速检测猪旋毛虫方法建立[D]. 王春. 吉林大学, 2019(11)
- [8]TsGAD基因沉默对旋毛虫抗酸影响及其间接ELISA方法建立[D]. 张妍. 东北农业大学, 2019(09)
- [9]旋毛虫三种半胱氨酸蛋白酶抑制因子的功能研究及重组酶聚合酶扩增检测方法的建立[D]. 李婷婷. 中国农业科学院, 2019
- [10]旋毛虫不同发育时期抗原基因的克隆表达与诊断特性研究[D]. 翟铖铖. 中国疾病预防控制中心, 2018