一、Echinococcus granulosus钙结合蛋白基因的克隆和序列分析（论文文献综述）
李丽竹,罗波,周必英[1]（2021）在《重要绦虫蛋白质组学研究进展》文中研究说明绦虫病是一类严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,其药物治疗和疫苗防治是当今研究的热点,而目前蛋白质组学成为了研制疫苗和了解致病机制的重要工具。寄生虫不同发育阶段间蛋白质模式的差异可能反映了其在不断变化的环境和生命周期中所使用的特定策略和适应机制,故本文对多种绦虫的蛋白质组学研究进展作一综述,旨在为绦虫病的防治提供参考依据。
李爽[2]（2021）在《沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的鉴定及功能研究》文中指出沙葱萤叶甲Galeruca daurica（Joannis）是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲钙结合蛋白（calcium-binding protein,Ca BP）基因,分析其在沙葱萤叶甲不同发育阶段及不同温度下的表达谱,应用RNAi技术明确其对沙葱萤叶甲3龄幼虫发育历期、体重及存活率的影响,为进一步探究其在沙葱萤叶甲生长发育过程中的作用奠定基础。1.沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的克隆及生物信息学分析。应用RT-PCR技术克隆得到4条沙葱萤叶甲Ca BP基因开放阅读框（open reading frame,ORF）全长序列,分别命名为Gd Ca M,Gd CAPSL,Gd Tn Cl和Gd CRT（Gen Bank登录号:MN695412-695415）,ORF全长分别为480,648,516和1 209 bp,分别编码149,215,171和402个氨基酸。同源序列比对和系统发育分析表明,Gd Ca M,Gd CAPSL,Gd Tn Cl和Gd CRT分别与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera的Ca M,CAPSL,Tn Cl及马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CRT的氨基酸序列一致性最高,分别为100.0,74.0,88.2和92.5%。2.沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的表达谱分析。q PCR分析表明,4个Ca BP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段及不同日龄成虫中的表达量均存在显着差异,且表达模式不同。Gd Ca M在卵和1龄幼虫期的表达量显着低于其他发育阶段的表达量;Gd CAPSL在卵期的表达量最高,其次为蛹期,而在幼虫期和成虫期的表达量最低;Gd Tn Cl特异性地高表达于成虫期,在其他发育阶段微量表达;Gd CRT在不同发育阶段呈现先降低后上升的趋势,蛹期表达量最高,其次为成虫、卵和1龄幼虫,再次为3龄幼虫,2龄幼虫期表达量最低。Gd Ca M在成虫滞育前（羽化后3 d）表达量较高,进入滞育后（羽化后7 d）表达量降低,在滞育期间（成虫羽化后7～60 d）表达量变化较小,而解除滞育后（成虫羽化后90 d）表达量进一步下调。Gd CAPSL在滞育初期（羽化后10 d）维持在最低水平,进入滞育中后期（羽化后40～60 d）开始回升,滞育解除后又突然下调至最低水平,而羽化后110 d急剧上升至最高水平。Gd Tn Cl在滞育初期（成虫羽化后15～20 d）高表达,进入滞育中后期后（羽化后30～60 d）急剧下降至最低水平,滞育解除后再次上调,但羽化后110 d突然下调至最低水平。Gd CRT在进入滞育后表达量开始逐渐下调,在滞育维持期间（成虫羽化后15～60 d）维持在低水平,滞育解除后又开始上升。温度对除Gd CRT外的其他3个Ca BP基因的表达有显着影响。低于20℃时,Gd Ca M的表达量随温度的降低而升高,但0℃时突然下降;高于20℃时,Gd Ca M的表达量随着温度的升高而上升。Gd CAPSL的表达量随着温度的升高而呈现上升的趋势,25℃时达到最高,然后下降。Gd Tn Cl随着温度的升高,表达量呈现下降的趋势。3.沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的RNA干扰效应。注射ds Ca M、ds CAPSL、ds Tn Cl和ds CRT后,处理组靶标基因Gd Ca M、Gd CAPSL、Gd Tn Cl和Gd CRT较对照组均有不同程度的降低。干扰Gd Ca M后3～4 d、干扰Gd CAPSL后2～6 d、干扰Gd Tn Cl后3～6 d及干扰Gd CRT后4 d,3龄幼虫体重较对照组显着降低;干扰Gd CAPSL和Gd Tn Cl后,蛹重（49.95±4.51 mg和52.8±5.01 mg）较对照组（59.32±4.92mg）显着降低;干扰Gd CAPSL后,3龄幼虫的发育历期（8.45±1.47 d）较对照组（9.95±1.28 d）显着缩短;干扰Gd Ca M、Gd Tn Cl和Gd CAPSL后,3龄幼虫的存活率（88.33±6.24%、45±4.08%和78.33±2.36%）较对照组（96.77±2.36%）显着降低。说明Gd Ca M、Gd Tn Cl和Gd CAPSL在沙葱萤叶甲幼虫生长发育过程中起着重要的调控作用,而Gd CRT作用不明显。
齐文静[3]（2018）在《细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位构建及其免疫特性鉴定》文中提出包虫病是由棘球绦虫的幼虫引起的人兽共患疾病,呈世界性分布。中国是包虫病高发区,25个省/自治区有病例报道,其中新疆、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古、青海、四川和西藏为包虫病高发区,严重影响我国农牧区的经济发展和群众健康。霍乱毒素B亚单位（CTB）是一种新型的免疫佐剂,通过构建细粒棘球绦虫成虫特异表达基因EgM123与霍乱毒素B亚基融合重组为CTB-EgM123融合蛋白,并在大肠杆菌中表达为亚单位疫苗,通过免疫接种小鼠确定其免疫原性。为了构建表达系统,通过PCR扩增细粒棘球绦虫的EgM 123基因,并将其连接到含有CTB片段的下游构建为CTB-EgM123融合原核表达质粒载体pET28a-CTB-EgM123。在通过IPTG诱导,并用吸附标签-His的亲和柱纯化,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量为35kDa。Western blotting结果显示重组蛋白被抗EgM123血清特异识别。纯化的EgM123和CTB-EgM123蛋白分别用于免疫接种小鼠。在三次接种后,通过ELISA测量针对EgM123的抗体,其滴度为（血清滴度>320,000）,ELISA也被用于测量免疫小鼠血清中的抗体IgG亚类,结果显示,免疫后1周后,IgG1,IgG2a和IgG2b为主要的抗体存在于血清中。然而,在免疫后第6周,IgG2a和IgG2b在小鼠血清中占优势;同时,在小肠组织中可以检测到IgG2a、IgG2b和IgG3抗体的表达。免疫接种后小鼠血浆中的细胞因子用流式细胞的方法测定,结果显示,CTB-EgM123免疫小鼠细胞因子IL-17A,TNF,IL-4,IL-6和IFN-γ表达上调,并且在免疫一周后,这些细胞因子在血浆中的含量高于正常对照小鼠（P<0.05）。仅接种CTB蛋白可以增加血浆中细胞因子IL-17A,IL-6和IFN-γ的水平,提示CTB作为佐剂可明显影响Th1/Th2免疫应答的平衡。然而,与正常对照小鼠中的这些细胞因子相比,EgM123蛋白仅上调细胞因子TNF和IL-6,并下调IL-4（P<0.05）,提示EgM123可在早期接种时诱导Th1应答。免疫6周后,接种CTB-EgM123的小鼠中细胞因子IL-17A和IL-6仍然高于正常对照小鼠血浆中的这些淋巴因子（P<0.05）。然而,接种EgM123的小鼠在免疫6周后诱导血浆中高水平的IL-17A,TNF,IL-6和IFN-γ,与对照组相比,差异显着（P<0.05）,表明EgM123可以诱导Th1和Th2免疫应答。本研究用流式细胞技术分析了免疫小鼠的淋巴细胞群。结果显示,免疫后第1周时,EgM123和CTB-EgM123均降低CD8+T细胞百分比,增加CD4+T细胞百分比（P<0.01）。然而,与正常对照小鼠中的细胞相比,免疫后第6周脾脏B细胞,CD4+T细胞和CD8+T细胞上调（P<0.05）,表明EgM123诱导很强的细胞免疫。本研究结果表明,重组蛋白EgM123和CTB-EgM123可以作为候选疫苗蛋白,CTB-EgM123诱导了很强的Th1和Th2免疫反应,为研发犬抗细粒棘球绦虫疫苗奠定了基础。
闫敏[4]（2017）在《细粒棘球绦虫LAP与TIM原核表达与ELISA诊断价值的初步评估》文中研究说明细粒棘球蚴病是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,Eg）的中绦期幼虫寄生于中间宿主（牛、羊等多种动物及人）的肝脏、肺及其它器官内引起的一种重大人兽共患寄生虫病。该病呈世界性分布,我国是高发国家之一。本研究扩增和原核表达了细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶（Eg leucine aminopeptidase,Eg-LAP）、磷酸丙糖异构酶（Egtriosephosphateisomerase,Eg-TIM）基因,并进行了免疫印迹与荧光免疫组化分析。同时,通过间接ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）的方法评价了上述2个细粒棘球蚴重组抗原对绵羊细粒棘球蚴病的诊断效果,为该病的监测与综合防控提供技术支持。一、细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶（Eg-LAP）基因的原核表达与特征分析亮氨酸氨基肽酶在调节合成和分解代谢的平衡以及水解以亮氨酸为氮末端的多肽过程中发挥重要作用。本研究克隆、原核表达了 Eg-LAP蛋白,通过生物信息学分析发现Eg-LAP蛋白序列包含亮氨酸氨基肽酶M17家族的标志性八肽（NTDAEGRL）,同时作为一种金属肽酶也包含5个金属离子结合位点。进化树分析结果显示Eg-LAP与绦虫的亲缘关系较近,其中与多房棘球绦虫亲缘关系最近。用大肠杆菌原核表达该蛋白后,免疫印迹结果显示其具有抗原性。荧光免疫定位试验显示,Eg-LAP分布于细粒棘球绦虫原头蚴体表以及顶突钩上,生发层有阳性荧光信号;成虫时期,在虫体表皮、薄壁层均有分布,虫卵内也有微量分布。以rEg-LAP蛋白为抗原建立绵羊细粒棘球蚴病间接ELISA诊断方法,结果显示rEg-LAP蛋白的诊断特异性和敏感性分别为79.09%（87/110）和95.8%（23/24）,与绵羊脑包虫和山羊细颈囊尾蚴存在交叉反应21.43%（3/14）;用囊液粗抗原对同样的血清作诊断时其特异性与敏感性分别是65.45%（72/110）和41.7%（10/24）。该重组蛋白的特异性与敏感性比囊液抗原分别高13.64%和54.1%,可以作为候选诊断抗原。二、细粒棘球绦虫磷酸丙糖异构酶（Eg-TIM）基因的原核表达与特征分析磷酸丙糖异构酶在糖酵解两个亚基之间的转化过程中发挥着不可取代的作用,同时也促使糖类发生糖酵解反应产生大量能量。本研究通过生物信息学分析发现Eg-TIM没有信号肽和跨膜区等结构,磷酸丙糖异构酶包含8个α螺旋与8个β折叠,他们依次相间排列,活性中心包含在]0个高度保守的氨基酸序列（AYEPVWAIGTG）中。进化树分析结果显示Eg-TIM与绦虫的亲缘关系较近,其中多房棘球绦虫亲缘关系最近。用大肠杆菌原核表达该蛋白后,免疫印迹结果呈现明显的单一条带,显示其具有抗原性。荧光免疫定位试验显示,Eg-TIM分布于细粒棘球绦虫原头蚴可外翻的颈节以及顶突钩上,生发层也有阳性荧光信号;在成虫时期,该蛋白分布于虫体薄壁层。以rEg-TIM蛋白为抗原建立绵羊细粒棘球蚴病间接ELISA诊断方法,结果显示rEg-TIM蛋白的诊断特异性和敏感性分别为53.6%（59/110）和87.5%（21/24）;与绵羊脑包虫和山羊细颈囊尾蚴存在交叉反应 42.86%（6/14）。
张耀刚[5]（2017）在《细粒棘球绦虫原头节和囊壁抗原筛选与烯醇酶和转酮醇酶生物信息学分析》文中提出目的利用蛋白质组学相关技术筛选出细粒棘球蚴原头节、囊壁蛋白中有望成为免疫学诊断抗原的分子,为早期诊断包虫病提供一定理论基础。方法提取细粒棘球蚴原头节、囊壁组织蛋白,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白,借助蛋白质印迹技术初步掌握细粒棘球绦虫原头节、囊壁蛋白表达谱及免疫原性;利用二维电泳技术分离原头节、囊壁蛋白,选取原头节40个蛋白点、囊壁8个蛋白点切胶,胰蛋白酶酶解,利用基质辅助激光电离解析飞行时间质谱分析技术获得各个蛋白点的肽指纹图谱数据,应用Mascot软件检索NCBInr、SWISS-PROT蛋白数据库进行蛋白质鉴定;通过查阅文献结合生物信息学技术初步分析,选取质谱分析鉴定结果中有望成为候选抗原分子的烯醇酶、转酮醇酶,利用生物信息学软件从理化性质、信号肽、B/T细胞表位、空间结构,亚细胞定位等分析烯醇酶、转酮醇酶成为特异性诊断抗原的可能性。构建烯醇酶、转酮醇酶原核表达载体,获得纯化蛋白为后期实验提供一定基础。结果1.原头节蛋白质在分子量72KD左右有大量浓集,囊壁的蛋白质浓集在72k D、26k D和17k D左右;2.原头节、囊壁中分别有36、6个蛋白点得到鉴定,大致可以分为:（1）细胞骨架蛋白（2）代谢相关酶类（3）细胞信号传导通路蛋白（4）物质转运相关蛋白（5）热休克蛋白（6）蛋白翻译有关蛋白等;3.烯醇酶基因全长1449bp,由3个外显子和2个内含子组成,CDS为1302bp,编码434个氨基酸;相对分子量、等电点、不稳定指数分别为46.56k D、6.48、32.97,半衰期较长,为稳定蛋白;烯醇酶亲水性、柔性区域、抗原性、表面可及性得分较高的氨基酸区域分别有9、12、19、8个;可能的B细胞线性表位有15个;CTL细胞表位和Th细胞表位各有10个;二级结构中主要以α螺旋、无规则卷曲为主;与人类烯醇酶氨基酸序列一致性为66.23%。转酮醇酶基因由7个外显子,6个内含子构成,CDS为1878 bp,编码625个氨基酸;相对分子量为67.76 k D;预测结果显示转酮醇酶可能为跨膜蛋白,位于细胞质,二级结构主要以α螺旋、无规则卷曲为主;有16个潜在的B细胞线性表位,11个CTL细胞表位,13个Th细胞表位;与人类转酮醇酶一致性仅为58.68%;4.成功构建pet28a-Eg EN、pet28-Eg TK原核表达载体,并获得重组蛋白,Eg En、Eg TK与CE病人血清反应阳性率均大于75%,CE与AE有部分交叉反应。结论初步鉴定了细粒棘球蚴原头节、囊壁组织中的部分蛋白点,这些蛋白主要参与代谢、细胞骨架、信号传导、物质转运、蛋白合成等,细粒棘球绦虫青海株原头节、囊壁蛋白表达数据库得以初步建立。初步认为烯醇酶、转酮醇酶可能成为早期诊断特异性抗原,但需进一步的实验证实。
何顺伟,张耀刚,李超群,彭源,魏晓星[6]（2016）在《青南高原多房棘球蚴myophilin基因的克隆和序列分析》文中研究表明目的克隆多房棘球绦虫（Em）的myophilin基因并对其序列进行分析与预测。方法提取Em原头节总RNA,采用RT-PCR技术扩增myophilin基因,将PCR产物连接入p GM-T载体,转化入DH 5α感受态细胞,挑选阳性克隆送测序。采用生物信息学软件对测序结果进行序列比对分析,同时预测编码蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、翻译后修饰位点、结构域和抗原表位。结果扩增出长度为576 bp的cDNA片段,包含完整开放阅读框（ORF）,编码190个氨基酸,与已知细粒棘球绦虫的序列同源性达99%。预测结果显示,编码蛋白分子式为C935H1519N255O285S11,理论分子质量为212 876,PI为8.66。α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲在二级结构中所占的比例分别为51.58%、10.00%和38.42%。含有10个翻译后修饰位点,各1个Calponin结构域和CH结构域,8个B细胞抗原表位和6个T细胞抗原表位。结论成功克隆出Em的myophilin基因并对其进行了有效分析和预测。
赵香菊,王丽娜,王晶,刘芳馨,陈晓宁[7]（2014）在《旋毛虫亲肌肉抗原的基因克隆和序列分析》文中提出目的克隆一个新的旋毛虫基因即亲肌肉抗原（myophilin）并分析其序列同源性,为旋毛虫病疫苗的研制奠定基础。方法检索GenBank旋毛虫基因组数据库,获得旋毛虫亲肌肉抗原的cDNA序列,利用Primer5.0软件设计引物（上、下游引物分别含NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点）。收集云南株旋毛虫肌幼虫,提取总RNA,并以此为模板进行RTPCR。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,目的基因切胶回收后与克隆载体pMD-19T分别用NdeⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物以3︰1的比例与pMD-19T连接,然后转化到DH5a大肠埃希菌感受态细胞中,用Amp抗性培养基培养,阳性克隆提质粒后做PCR及双酶切鉴定,阳性菌液进行测序,测序结果与检索基因核苷酸序列通过DNAMAN软件比较,分析其同源性。结果 RT-PCR扩增出旋毛虫亲肌肉抗原全长基因序列,大小为579bp;亲肌肉抗原基因重组质粒经双酶切得到的片段大小分别为579、2 300和300bp,与预期值相符;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%。结论成功克隆出旋毛虫亲肌肉抗原基因,为旋毛虫病疫苗的研制奠定了基础。
王琦[8]（2012）在《八种重组抗原对肝细粒棘球蚴病诊断价值的初步鉴定》文中指出目的通过比较Zw1、Zw5、 Zw14、14-3、 Zw15、 Eg10、 P29、Hsp70八种重组抗原敏感性，探讨八种重组抗原中对肝细粒棘球蚴病有诊断价值的抗原。方法1收集样本：采集经手术确诊的53个肝细粒棘球蚴病人的血清以及60个正常人血清；2重组抗原浓度测定：通过应用BCA蛋白定量法测定八种待测重组抗原的浓度；3重组抗原纯度鉴定：应用SDS-PAGE在凝胶成像仪上显现的条带明确八种待测重组抗原分子量的大小，并通过对条带进行分析从而鉴定重组抗原纯度；4初步鉴定对肝细粒棘球蚴病有诊断价值的重组抗原：采用ELISA法鉴定八种待测重组抗原的敏感性，进而从中初步确定对肝细粒棘球蚴病有诊断价值的抗原。结果1八种重组抗原的分子量在18-90kDa之间，各种重组抗原条带清晰，纯度较高;2BCA蛋白定量测定重组抗原的浓度，明确了酶标板包被液浓度；3ELISA法结果初步判定八种重组抗原中Zw14、Eg10敏感性较高。结论八种重组抗原中Zw14、Eg10有较高的敏感性，有望成为具有肝细粒棘球蚴病诊断价值的抗原。
朱慧慧[9]（2011）在《细粒棘球蚴cDNA文库的构建及诊断靶抗原的筛选》文中进行了进一步梳理由细粒棘球蚴引起的细粒棘球蚴病（囊型包虫病）是一种人兽共患病,广泛流行于我国西部,导致严重公共卫生问题,不仅严重危害人民健康,而且造成重大经济损失,严重阻碍西部社会、经济发展。当前诊断囊型包虫病依赖的诊断方法——影像学方法不能进行早期诊断,从而影响药物治疗效果,而免疫学检测敏感特异,可用于早期诊断。目前检测囊型包虫病主要依赖检测患者血清中特异抗体,因此,检测效能极大依赖于所应用的抗原,而目前所应用的抗原或敏感度或特异度存在局限,因此,筛选更有诊断价值的新抗原就成为改善囊型包虫病免疫诊断效能的关键。本研究以采集于新疆额敏县细粒棘球蚴感染绵羊肝包囊的原头节为材料,抽提纯化mRNA构建细粒棘球蚴cDNA表达文库,用确诊的囊型包虫病患者混合血清免疫筛选cDNA表达文库,将其中筛选到的5个强阳性克隆L1、H3、H4、E1-1和K1亚克隆到pGEX-3X或pGEX-4T表达载体进行诱导表达,对表达的重组蛋白对囊型包虫病患者血清和其他寄生虫病患者血清及健康人血清的反应性进行了评价,并对筛选到的基因进行了同源蛋白搜索,对其预测编码蛋白进行了结构和功能分析。结果显示所构建的cDNA文库滴度为1.8×105pfu/ml,文库插入片段长度范围在1.0kb-4.0kb间,平均插入片段长度为2.64kb,插入效率为93.75%。进行亚克隆的5个基因预测编码蛋白均有较好的亲水性、表面可及性、可塑性及众多B细胞表位。同源性搜索显示L1、H3、H4、E1-1和K1编码蛋白分别与细粒棘球绦虫谷胱甘肽转移酶、曼氏血吸虫未命名蛋白、细粒棘球绦虫钙网织蛋白、细粒棘球绦虫苹果酸酶和三角涡虫热休克蛋白90有100%、28%、100%、99%和77%的相似性。其中H3和K1是新筛选到的细粒棘球蚴基因。以ELISA法评价这些基因表达的重组蛋白检测囊型包虫病的敏感度分别为64.20%、88.89%、54.32%、41.98%和53.09%,其中H3表达的重组蛋白检测的阳性率则最高（88.89%）,高于重组AgB8/2检测的敏感度（83.95%）,而L1、H3、H4、E1-1和K1检测的特异度分别为79.34%、76.09%、88.43%、89.26%和89.26%,它们之间没有统计学差异。本研究筛选到2个细粒棘球蚴新基因,其中H3表达重组蛋白检测囊型包虫病患者血清的敏感度高于目前认为最好的抗原AgB8/2,而两者检测的特异度相当。H3基因长度约4kb,且存在58个抗原表位,具有进行进一步改造提高检测敏感度和特异度的空间,因此,有希望成为最有诊断价值的囊型包虫病候选抗原。本研究还建立了细粒棘球蚴cDNA表达文库,为今后进一步筛选具诊断价值的候选抗原奠定了基础。
王有广[10]（2011）在《细粒棘球蚴重组铁蛋白和重组mMDH的免疫保护性差异机制的研究》文中研究指明目的通过对具有免疫保护力的重组铁蛋白和不具有免疫保护力的重组mMDH蛋白的比较分析,从而找出小鼠被疫苗免疫后产生免疫保护和抗细粒棘球蚴的机制,为疫苗的广泛应用提供理论依据。方法（1）实验动物分组:选取雌性ICR小鼠随机分为3组:rEg.ferritin免疫组、rEg.mMDH免疫组和对照组;（2）动物免疫:rEg.ferritin和rEg.mMDH免疫组小鼠分别注射10μg重组抗原+佐剂+PBS,100μl,共三次,每次间隔两周,对照组注射100μl PBS;（3）动物攻击感染:第3次免疫后2周,各组均以1500个活的原头蚴/每只小鼠攻击感染;（4）免疫保护力观察:攻击感染20周后剖杀小鼠,统计小鼠腹腔内包囊数量和直径,计算免疫保护力。（5）脾细胞悬液的制备:剖杀小鼠,无菌取脾,分离脾细胞;（6）用分离得到的脾细胞,应用FCM检测CD4+和CD8+T细胞亚群的百分比变化。（7）用MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况。（8）获得数据后对具有免疫保护力和不具有免疫保护力的两组进行对照比较,分析其内在机制。结果（1）根据Dempster公式计算:rEg.ferritin抗原免疫ICR小鼠可获得86.37%的免疫保护力,而rEg.mMDH抗原免疫ICR小鼠未获得免疫保护力,提示rEg.ferritin具有疫苗的潜质,而rEg.mMDH则无。（2）免疫组与对照组经统计学检验比较:①r Eg.ferritin免疫组小鼠在剖杀前CD4+T细胞增加（P﹤0.01）,CD8+T细胞无明显变化（P﹥0.05）,而rEg.mMDH免疫组小鼠脾淋巴细胞亚群与对照组相比无明显变化,提示rEg.ferritin免疫小鼠的保护机制有CD4+T细胞的参与,CD8+T细胞的作用不是很大;②MTT法检测证实rEg.ferritin免疫的小鼠在rEg.ferritin刺激下脾淋巴细胞增殖水平明显高于对照组（P<0.01）,而rEg.mMDH无明显作用（P﹥0.05）,提示rEg.ferritin抗原免疫小鼠的保护机制可能与其刺激脾淋巴细胞增殖有关。结论rEg.ferritin抗原诱导小鼠产生细胞免疫的保护机制可能与激活CD4+T细胞,刺激脾淋巴细胞增殖有关,而rEg.mMDH抗原无免疫保护的机制可能与未激活CD4+T细胞,未刺激脾淋巴细胞增殖有关。
二、Echinococcus granulosus钙结合蛋白基因的克隆和序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Echinococcus granulosus钙结合蛋白基因的克隆和序列分析（论文提纲范文）
（2）沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 沙葱萤叶甲 |
| 1.2 钙结合蛋白 |
| 1.2.1 EF-hand结构 |
| 1.2.2 钙调蛋白 |
| 1.2.3 钙磷蛋白 |
| 1.2.4 肌钙蛋白C |
| 1.2.5 钙网蛋白 |
| 1.2.6 钙结合蛋白在昆虫生长发育中的作用 |
| 1.2.7 RNA干扰在农业害虫防治中的应用 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的鉴定和表达谱分析 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 RNA提取 |
| 2.1.4 RNA样品质量检测 |
| 2.1.5 cDNA第一链的合成 |
| 2.1.6 沙葱萤叶甲钙结合蛋白相关基因引物设计 |
| 2.1.7 沙葱萤叶甲钙结合蛋白相关基因的克隆与分析 |
| 2.1.8 PCR产物回收纯化 |
| 2.1.9 目的片段的连接、转化 |
| 2.1.10 阳性克隆检测 |
| 2.1.11 序列分析及系统发育树构建 |
| 2.1.12 钙结合蛋白基因表达的q PCR分析 |
| 2.1.13 数据分析 |
| 2.2 沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的RNA干扰效应 |
| 2.2.1 供试昆虫 |
| 2.2.2 主要仪器与试剂 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 PCR扩增,连接及转化 |
| 2.2.5 ds RNA的合成 |
| 2.2.6 ds RNA的注射 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的克隆与生物信息学分析 |
| 3.1.1 沙葱萤叶甲总RNA的检测 |
| 3.1.2 沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的同源比对 |
| 3.1.3 沙葱萤叶甲钙结合蛋白的序列特征 |
| 3.1.4 沙葱萤叶甲钙结合蛋白氨基酸序列预测分析 |
| 3.1.5 沙葱萤叶甲钙结合蛋白二级结构的预测分析 |
| 3.1.6 沙葱萤叶甲钙结合蛋白三级结构的预测分析 |
| 3.1.7 沙葱萤叶甲及其他鞘翅目昆虫钙结合蛋白的系统发育关系 |
| 3.2 沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的表达谱分析 |
| 3.2.1 在不同发育阶段的表达分析 |
| 3.2.2 在不同日龄成虫中的表达分析 |
| 3.2.3 在不同温度胁迫下的表达分析 |
| 3.3 沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因功能的研究 |
| 3.3.1 ds RNA的合成 |
| 3.3.2 RNA干扰对钙结合蛋白基因表达水平的影响 |
| 3.3.3 RNA干扰钙结合蛋白基因对3 龄幼虫体重的影响 |
| 3.3.4 RNA干扰钙结合蛋白基因对蛹重的影响 |
| 3.3.5 RNA干扰钙结合蛋白基因对3 龄幼虫发育历期的影响 |
| 3.3.6 RNA干扰钙结合蛋白基因对3 龄幼虫存活率的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的鉴定和表达谱分析 |
| 4.2 沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的RNA干扰效应 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:核苷酸序列 |
| 附录2:氨基酸序列 |
| 作者简介 |
（3）细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位构建及其免疫特性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 包虫病的研究概况 |
| 1.2 包虫病的检测技术 |
| 1.3 包虫病的免疫机理 |
| 1.4 包虫病的疫苗进展 |
| 1.5 包虫病的治疗 |
| 1.6 霍乱毒素B亚单位的研究进展 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 第2章 细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位的构建表达纯化及小鼠抗血清的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 细粒棘球绦虫重组亚单位蛋白CTB-EgM123免疫的免疫原性研究——T淋巴细胞反应 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 细粒棘球绦虫重组亚单位蛋白CTB-EgM123免疫的免疫原性研究—系统免疫和组织免疫 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）细粒棘球绦虫LAP与TIM原核表达与ELISA诊断价值的初步评估（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 细粒棘球蚴病概述 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 诊断方法 |
| 1.4 展望 |
| 2 亮氨酸氨基肽酶与磷酸丙糖异构酶基因研究进展 |
| 2.1 亮氨酸氨基肽酶基因 |
| 2.2 磷酸丙糖异构酶基因 |
| 3 本试验的目的与意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 细粒棘球绦虫亮氨酸氨基肽酶的特征分析以及间接ELISA诊断方法的建立 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 虫体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 常用缓冲液和培养基的配制 |
| 1.6 主要生物信息数据库和计算机软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 细粒棘球绦虫总RNA的提取 |
| 2.2 第一链cDNA的合成 |
| 2.3 Eg-LAP基因的扩增 |
| 2.4 PCR产物的回收 |
| 2.5 Eg-LAP基因克隆、鉴定及转化 |
| 2.6 重组Eg-LAP在大肠杆菌中的表达 |
| 2.7 重组蛋白的纯化 |
| 2.8 重组蛋白抗原性分析 |
| 2.9 免疫荧光定位 |
| 2.10 间接ELISA方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-LAP基因的扩增与生物信息学分析 |
| 3.2 重组Eg-LAP的表达与抗原性分析 |
| 3.3 Eg-LAP在细粒棘球绦虫各阶段的定位 |
| 3.4 ELISA |
| 4 讨论 |
| 4.1 Eg-LAP的基本特征分析 |
| 4.2 Eg-LAP在虫体各个时期的定位分析 |
| 4.3 rEg-LAP的诊断 |
| 第二章 细粒棘球绦虫磷酸丙糖异构酶的特征分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 虫体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 常用缓冲溶液和培养基的配制 |
| 1.6 主要生物信息数据库和计算机软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 细粒棘球绦虫总RNA的提取 |
| 2.2 第一链cDNA的合成 |
| 2.3 Eg-TIM基因的扩增 |
| 2.4 PCR产物的回收 |
| 2.5 Eg-TIM基因克隆、鉴定及转化与生物信息学分析 |
| 2.6 重组Eg-TIM在大肠杆菌中的表达 |
| 2.7 重组蛋白的纯化 |
| 2.8 重组蛋白抗原性分析 |
| 2.9 免疫荧光定位 |
| 2.10 间接ELISA方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-TIM基因的扩增与生物信息学分析 |
| 3.2 重组Eg-TIM的表达与抗原性分析 |
| 3.3 Eg-TIM在细粒棘球绦虫各阶段的定位 |
| 3.4 ELISA |
| 4 讨论 |
| 4.1 Eg-TIM的基本特征分析 |
| 4.2 内源性Eg-TIM的定位 |
| 4.3 rEg-TIM的诊断 |
| 第三部分 结论与创新点 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）细粒棘球绦虫原头节和囊壁抗原筛选与烯醇酶和转酮醇酶生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 技术路线 |
| 主要符号对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 细粒棘球蚴人体内蛋白质表达谱初步分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验标本 |
| 1.1.2 试剂及配制方法 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 原头节总蛋白的制备 |
| 1.2.2 囊壁总蛋白的制备 |
| 1.2.3 囊液总蛋白的制备 |
| 1.2.4 制胶 |
| 1.2.5 蛋白样品准备 |
| 1.2.6 Western-blot |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 样本质量 |
| 1.3.2 样本浓度 |
| 1.3.3 SDS-PAGE、Western-blot结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 细粒棘球蚴原头节及囊壁蛋白质筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验标本 |
| 2.1.2 二维电泳主要试剂及配制方法 |
| 2.1.3 主要仪器及材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 蛋白样品的制备 |
| 2.2.2 蛋白样品的纯化 |
| 2.2.3 蛋白浓度测定 |
| 2.2.4 IPG干胶条再水化与等电聚焦电泳（IEF） |
| 2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.6 质谱分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 二维电泳结果 |
| 2.3.2 质谱分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 烯醇酶与转酮醇酶生物信息学分析 |
| 3.1 序列获取 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 理化性质预测 |
| 3.2.2 亲水性、柔性区域、抗原性指数、表面可及性 |
| 3.2.3 亚细胞定位 |
| 3.2.4 B、T细胞表位预测 |
| 3.2.5 跨膜区、三级结构预测 |
| 3.2.6 同源性分析 |
| 3.3 烯醇酶生物信息学分析结果 |
| 3.3.1 烯醇酶序列基本信息 |
| 3.3.2 理化性质 |
| 3.3.3 信号肽 |
| 3.3.4 亲水性、柔性区域、抗原性指数及表面可及性分析 |
| 3.3.5 亚细胞定位 |
| 3.3.6 B细胞表位 |
| 3.3.7 T细胞表位 |
| 3.3.8 二级结构 |
| 3.3.9 跨膜区 |
| 3.3.10 三级结构 |
| 3.3.11 多序列比对 |
| 3.4 转酮醇酶生物信息学分析结果 |
| 3.4.1 转酮醇酶序列基本信息 |
| 3.4.2 理化性质 |
| 3.4.3 疏水性分析 |
| 3.4.4 信号肽分析 |
| 3.4.5 亲水性、柔性区域、抗原性指数及表面可及性预测 |
| 3.4.6 亚细胞定位 |
| 3.4.7 B细胞线性表位预测 |
| 3.4.8 T细胞表位 |
| 3.4.9 二级结构 |
| 3.4.10 跨膜区预测 |
| 3.4.11 三级结构 |
| 3.4.12 多序列比对 |
| 3.5 讨论 |
| 第四部分 烯醇酶、转酮醇酶基因克隆表达及免疫学分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验标本 |
| 4.1.2 主要试剂及材料 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 目的基因引物设计 |
| 4.2.2 RNA提取 |
| 4.2.3 cDNA第一条链合成及目的基因扩增 |
| 4.2.4 目的基因鉴定及纯化 |
| 4.2.5 原核克隆载体构建及鉴定 |
| 4.2.6 原核表达载体构建及鉴定 |
| 4.2.7 小试培养选择最佳诱导条件 |
| 4.2.8 大量诱导表达 |
| 4.2.9 蛋白纯化 |
| 4.2.10 纯化蛋白鉴定 |
| 4.2.11 酶联免疫吸附试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 原头节总RNA提取结果 |
| 4.3.2 EgEn、EgTK基因PCR结果 |
| 4.3.3 克隆质粒PCR产物测序 |
| 4.3.4 表达载体双酶切 |
| 4.3.5 EgEn、EgTK蛋白诱导表达SDS-PAGE结果 |
| 4.3.6 EgEn、EgTK蛋白纯化SDS-PAGE结果 |
| 4.3.7 纯化蛋白浓度测定 |
| 4.3.8 纯化蛋白Western Blot分析结果 |
| 4.3.9 酶联免疫吸附试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 细粒棘球绦虫抗原基因的克隆与表达研究现状 |
| 综述参考文献 |
（6）青南高原多房棘球蚴myophilin基因的克隆和序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料选择 |
| 1.2 总RNA的提取与反转录 |
| 1.3 myophilin基因的扩增与测序 |
| 1.4 myophilin基因序列分析 |
| 1.5 myophilin蛋白预测 |
| 1.5.1 理化性质预测 |
| 1.5.2 二、三级结构预测 |
| 1.5.3 翻译后修饰位点和结构域预测 |
| 1.5.4 抗原表位预测 |
| 2 结果 |
| 2.1 myophilin基因的扩增与测序 |
| 2.2 基因序列分析 |
| 2.3 蛋白预测 |
| 2.3.1 理化性质 |
| 2.3.2 二、三级结构 |
| 2.3.3 翻译后修饰位点和结构域 |
| 2.3.4 抗原表位 |
| 3 讨论 |
（7）旋毛虫亲肌肉抗原的基因克隆和序列分析（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1材料 |
| 2方法 |
| 结果 |
| 1旋毛虫肌幼虫总RNA的提取与鉴定 |
| 2亲肌肉抗原基因的PCR扩增 |
| 3重组克隆质粒pMD-19T-myophilin的酶切鉴定 |
| 4亲肌肉抗原序列测定及其同源性 |
| 讨论 |
（8）八种重组抗原对肝细粒棘球蚴病诊断价值的初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
（9）细粒棘球蚴cDNA文库的构建及诊断靶抗原的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 专利 |
（10）细粒棘球蚴重组铁蛋白和重组mMDH的免疫保护性差异机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验内容 |
| （一） rEg.ferritin 和rEg.mMDH 抗原分别免疫小鼠后免疫保护力的观察 |
| （二） rEg.ferritin 和rEg.mMDH 抗原分别免疫小鼠后T 淋巴细胞亚群变化的研究 |
| （三） rEg.ferritin 和rEg.mMDH 抗原分别免疫小鼠后T 淋巴细胞增殖实验的研究 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 个人简历 |
四、Echinococcus granulosus钙结合蛋白基因的克隆和序列分析（论文参考文献）
- [1]重要绦虫蛋白质组学研究进展[J]. 李丽竹,罗波,周必英. 中华地方病学杂志, 2021(08)
- [2]沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的鉴定及功能研究[D]. 李爽. 内蒙古农业大学, 2021(02)
- [3]细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位构建及其免疫特性鉴定[D]. 齐文静. 新疆农业大学, 2018(05)
- [4]细粒棘球绦虫LAP与TIM原核表达与ELISA诊断价值的初步评估[D]. 闫敏. 四川农业大学, 2017(01)
- [5]细粒棘球绦虫原头节和囊壁抗原筛选与烯醇酶和转酮醇酶生物信息学分析[D]. 张耀刚. 青海大学, 2017(11)
- [6]青南高原多房棘球蚴myophilin基因的克隆和序列分析[J]. 何顺伟,张耀刚,李超群,彭源,魏晓星. 青海医学院学报, 2016(04)
- [7]旋毛虫亲肌肉抗原的基因克隆和序列分析[J]. 赵香菊,王丽娜,王晶,刘芳馨,陈晓宁. 中国病原生物学杂志, 2014(02)
- [8]八种重组抗原对肝细粒棘球蚴病诊断价值的初步鉴定[D]. 王琦. 宁夏医科大学, 2012(08)
- [9]细粒棘球蚴cDNA文库的构建及诊断靶抗原的筛选[D]. 朱慧慧. 中国疾病预防控制中心, 2011(04)
- [10]细粒棘球蚴重组铁蛋白和重组mMDH的免疫保护性差异机制的研究[D]. 王有广. 宁夏医科大学, 2011(05)