PCR熔解曲线检测乙型肝炎病毒变异体

一、PCR熔解曲线法检测乙型肝炎病毒变异株（论文文献综述）

贾双荣^[1]（2014）在《MLPA结合RT-PCR快速检测乙型肝炎病毒拉米夫定及阿德福韦耐药》文中研究指明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）耐药的产生成为长期治疗慢性乙型肝炎成功与否的主要障碍。目前检测HBV耐药的方法多种多样，但都因存在一些缺陷，其临床应用受到限制，例如灵敏度低、耗时长、成本高等缺点。在本论文中，我们建立了一种可以同时检测HBV拉米夫定（lamivudine, LAM）及阿德福韦（adefovir, ADV）耐药突变株（rtM204V, rtM204I, rtA181T, rtA181V, rtN236T）的多重连接探针-实时荧光PCR（multiplex ligation-dependent probe real-time PCR, MLP-RT-PCR）方法。该方法结合了多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技术的灵敏、特异、高通量和实时PCR方便快捷、实时检测的特点。通过检测临床116例慢性乙肝患者DNA样本对MLP-RT-PCR方法进行了方法性能评价，其中检测出LAM耐药突变41例（35.3%），ADV耐药突变17例（14.7%）及两者共同耐药突变5例（4.3%）。检测结果与金标准直接测序方法比较，MLP-RT-PCR检测rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T的符合率分别为95.7%（111/116）、98.3%（114/116）、99.1%（115/116）、98.3%（114/116）和99.1%（115/116）。MLP-RT-PCR方法检测低比例突变株的灵敏度比直接测序方法更高，能够检测0.1%以上的rtM204V、rtM204I、rtA181T和rtN236T突变株，1%以上的rtA181V突变株。MLP-RT-PCR发现了4例低比例临床突变株，并进一步被TA克隆测序方法确证。MLP-RT-PCR能够快速、灵敏检测HBV多重耐药突变位点，为临床提供了一种成本低廉、检测快速的乙型肝炎耐药检测方法。

张为民,唐曙明,谢亚琴,毛维玉,龚文波^[2]（2013）在《慢性乙型肝炎患者YMDD自然变异的临床观察》文中进行了进一步梳理目的观察发生YMDD自然变异的慢性乙型肝炎（CHB）患者的临床特征,探讨HBV YMDD自然变异发生的可能机理,为CHB抗病毒治疗提供新思路。方法选择144例HBV DNA阳性、未经抗病毒治疗的CHB患者作为观察对象,采用PCR熔解曲线法检测其YMDD基因序列突变;同时对其进行HBV DNA定量、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和乙肝两对半等相关指标检测,并对患者性别、年龄及上述检测结果进行统计学分析。结果144例未经抗病毒治疗的CHB患者中,有30例出现YMDD自然变异,变异检出率为20.8%,其中YIDD阳性19例（占63.3%）,YVDD阳性8例（占26.7%）,YIDD+YVDD同时阳性3例（占10%）。YMDD自然变异组CHB患者年龄明显小于未变异组;HBV DNA定量值在105 copies/ml以上的CHB患者易发生YMDD自然变异,而HBV DNA定量低于105 copies/ml的CHB患者不易发生YMDD自然变异。CHB患者的性别、HBeAg和抗-HBe状态及肝功能损害程度与YMDD自然变异无关。结论 CHB患者中存在HBV YMDD自然变异,低龄和HBV DNA高值的患者易发生YMDD自然变异;自然变异与患者性别、HBeAg和抗-HBe状态及肝功能损害程度无关。

王晓英^[3]（2013）在《慢乙肝患者HBVcccDNA与血清HBVDNA及其标志物相关性研究》文中指出目的探讨慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者肝组织HBVcccDNA与血清HBV DNA及其标志物等之间的相关性。方法采用实时定量荧光PCR检测法检测10例CHB患者肝组织HBVcccDNA，用PCR-荧光探针法检测血清HBV DNA含量，用电化学发光免疫分析法定量检测乙肝标志物，常规病理学染色分析病理学改变，对肝组织进行炎症活动度分级（G）及纤维化程度分期（S）。结果①10例CHB患者肝组织病理结果：G2S1：3例；G2S2：2例；G2S3：1例；G3S2：2例；G3S3：2例。②10例CHB患者肝组织均检测到HBVcccDNA，定量值为1.80x104拷贝/mL～8.50x109拷贝/mL。10例CHB患者血清HBVDNA:阳性8例，定量值为2.23xlO5拷贝/mL～3.08xlO8拷贝/mL；阴性2例（低于检测下限103拷贝/mL）。③肝组织HBVcccDNA定量值与肝组织炎症活动度（G）及纤维化程度（S）无相关性（Ｐ>0.05）。④肝组织HBVcccDNA定量值与血清HBV DNA定量值成高度正相关（ｒ=0.898，Ｐ<0.01）。⑤肝组织HBVcccDNA定量值与血清HBeAg滴度呈高度正相关性（r=0.821, Ｐ<0.01），与血清HBsAg滴度无相关性（r=-0.483, Ｐ>0.05）。⑥肝组织HBVcccDNA定量值与ALT、AST定量水平均无相关性。⑦血清HBV DNA与HBsAg、HBeAg、ALT及AST在统计学上，均无相关性（>0.05）。结论肝组织HBVcccDNA定量值与血清HBV DNA定量值和HBeAg滴度呈高度正相关，均能够直接反映CHB患者体内HBV的存在和复制状态；但其定量值的高低与肝组织病理结果、HBsAg滴度、ALT、AST水平均无相关。肝组织HBVcccDNA定量检测联合血清HBVDNA和HBeAg是判断抗病毒治疗疗效的可靠指标。目的探讨慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者血清HBVcccDNA与血清HBV DNA及其标志物等之间的相关性。方法采用实时定量荧光PCR检测法检测10例CHB患者血清HBVcccDNA，用PCR-荧光探针法检测血清HBV DNA含量，用电化学发光免疫分析法定量检测乙肝标志物。结果①10例CHB患者血清中检测到HBVcccDNA有6例，定量值为4.68x103拷贝/mL～1.08x107拷贝/mL，未检测到者4例（低于检测下限103拷贝/mL）。②10例CHB患者血清HBV DNA阳性10例，定量值为3.51xlO5拷贝/mL～6.29xlO8拷贝/mL。③CHB血清HBVcccDNA定量值与血清HBV DNA定量值、血清HBeAg滴度、血清HBsAg滴度均没有显着性的相关性（ｒ=0.049，Ｐ>0.05；r=0.302,>0.05；r=-0.248, Ｐ>0.05）。④血清HBVcccDNA定量值与ALT、AST水平均无相关性（Ｐ>0.05）。结论血清HBVcccDNA水平与血清HBVDNA水平、血清HBSAg和ＨＢeＡｇ的滴度以及ALT、AST均无相关。由此可见检测血清HBVcccDNA的定量并不能全面的反应血中HBV的复制和感染。所以不能成为血清HBVDNA及乙肝血清标志物的替代指标。目的探讨慢性乙型病毒性肝炎（CHB）在未进行抗病毒之前检测患者P-S区基因变异。方法采用实时定量荧光PCR检测法检测P-S区基因变异。结果10例CHB患者血清均未检测到P-S区基因变异。结论本研究没有检测到慢乙肝患者在接受抗病毒之前发生基因突变导致的原发性耐药，因此仍需要以后的研究实验进一步证实。

王晓英,佘会元^[4]（2012）在《拉米夫定抗乙型肝炎病毒治疗的耐药问题》文中认为抗病毒治疗是慢性乙型肝炎（CHB）的根本治疗方法。目前全世界公认有效的抗病毒药物主要是干扰素和以拉米夫定（lamivudine LAM）为代表的核苷（酸）类似物。LAM是首个被批准用于CHB抗病毒治疗的核苷类药物,自1999年在我国上市以来,已有上百万人服用此药,它解决了α-干扰素抗病毒治

商红艳^[5]（2011）在《PCR熔解曲线法检测HBV基因型及RT-ARMS-qPCR法定量检测HBV YMDD突变的建立》文中研究说明目的:1.建立一种新的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）基因分型方法,并应用此方法检测福建省乙肝患者的HBV基因型,了解福建省HBV基因型的分布情况,并探讨基因型与肝纤维化、HBeAg阳性率和HBV DNA水平的关系。2.构建HBV野生型YMDD以及突变型YVDD的标质粒标准品;建立高灵敏度的RT-ARMS-qPCR方法定量检测YMDD及YVDD,并对该方法进行评价,为HBV YMDD耐药突变定量检测奠定基础。方法:1. PCR熔解曲线法检测HBV基因型的建立:根据文献报道的中国HBV B、C型基因组全序列,分别设计B、C型特异性引物,以HBV B、C型的标准质粒为对照标准品,建立一种新的基于PCR的熔解曲线法,根据PCR产物的Tm值判断基因型并经测序验证;评价其灵敏度、特异性及重复性。2. PCR熔解曲线法检测HBV基因型检测效能的评价:分别采用PCR熔解曲线法和市售的HBV基因分型试剂盒对51例HBV感染者进行基因分型,比较两法的一致性,评价PCR熔解曲线法的检测效能。3. PCR熔解曲线法检测HBV基因型的初步临床应用:收集346份HBsAg阳性标本,利用所建立的PCR熔解曲线法检测其基因型,以了解福建省HBV基因型的分布情况,探讨基因型与肝纤维化、HBeAg阳性率以及HBV DNA水平的关系。4. RT-ARMS-qPCR法检测HBV YMDD耐药突变的建立:以pMD-18T为载体,构建拉米夫定耐药相关的YMDD野生株、YVDD突变株质粒标准品,建立RT-ARMS-qPCR的定量标准曲线,并评价检测系统的敏感性、特异性及重复性。结果:1.成功建立了PCR熔解曲线法检测HBV基因型成功建立了检测HBV基因型的PCR熔解曲线法,可以根据Tm值判断HBV基因型。B型Tm值为80.79±0.35,C型Tm值为85.75±0.33;可以对HBV DNA拷贝数≥103copies/ml的患者HBV进行分型;重复性好,高（108copies/ml）、中（106copies/ml）、低（104copies/ml）浓度血清Tm值的批内CV值分别为0.15%、0.09%、0.16%。2. PCR熔解曲线法检测HBV基因型检测效能的评价对随机选取的51例HBV感染者进行HBV基因分型,PCR熔解曲线法检测为B型的14份标本中,市售HBV基因分型试剂盒检出14份B型;21份C型标本用市售试剂盒检出全部为C型;16份B/C混合型的标本中,市售试剂盒的检测结果为1份B型,2份C型,13份B/C混合型。两种方法比较,B型结果符合率为100%,C型结果符合率为100%,B/C混合型结果符合率81.25%,总体符合率为94.12%（48/51,Kappa =0.909,P<0.05）。3. PCR熔解曲线法检测HBV基因型的初步临床应用3.1 HBV基因型分布346例HBV感染者中,检出B型190例,占54.91%,C型82例,占23.70%,B/C混合型74例,占21.39%,结果显示福建省乙肝患者中以B型HBV感染为主。3.2 HBV基因型与肝纤维化、HBeAg阳性率以及HBV DNA病毒载量关系346例HBsAg阳性的标本中91例被确诊为肝纤维化,142例标本进行了HBeAg和HBV DNA定量的检测,对其进行基因分型发现,91例肝纤维化标本中检出C型39例,占42.86%（39/91）,显着高于C基因型在全部研究对象（346例）中所占的比例23.7%（82/346）,而检出B型38例,占41.76%（38/91）,低于B基因型在全部研究对象中所占的比例54.91%（190/346）;对142例HBV DNA≥103copies/ml的患者血清,进行HBV基因分型,结果发现C基因型的病毒载量（HBV DNA）明显高于B型和B/C混合型,且C基因型的HBeAg阳性率87.18%（34/39）亦显着高于B型68.35%（54/79）和B/C混合型41.67%（10/24）,差异均有统计学意义（P<0.05）。以上结果证明C基因型与肝病的严重程度有关。4. RT-ARMS-qPCR法定量检测HBV YMDD耐药突变的建立:建立了RT-ARMS-qPCR法定量检测HBV YMDD耐药突变的体系。建立的定量检测YMDD野生株的标准曲线相关系数为0.998986,检测线性范围为102～108copies/μl,检测灵敏度为101 copies/μl,高、中、低浓度质粒标准品的批内CV值分别为1.06%、1.12%和1.71%,批间CV值为4.88%,;建立的定量检测YVDD突变株的标准曲线相关系数为0.998287,检测线性范围为101～107 copies/μl,检测灵敏度为101 copies/μl,高、中、低浓度质粒标准品的批内CV值分别为0.96%、1.11%和1.29%,批间CV值为2.63%。结论:1.成功建立了PCR熔解曲线法检测HBV B、C基因型,该法有较高的灵敏度、特异性和较好的重复性,分型结果与市售的基因分型试剂盒有较高的符合率,适合于临床基因扩增实验室进行HBV基因分型;2.福建省HBV感染者以B基因型为主;肝纤维化、HBeAg阳性率以及HBV DNA病毒载量与乙肝患者感染HBV的基因型相关,C基因型与重度肝病有关。3.在国内首次建立了RT-ARMS-qPCR法定量检测HBV YMDD耐药突变的检测体系,有较高的敏感度、特异性、重复性以及较宽的检测范围。提供了一种能更早地及时准确地检测出耐药突变及突变类型的检测技术。

刘禄^[6]（2011）在《乙型肝炎病毒表型耐药分析方法建立的研究》文中进行了进一步梳理目前,全世界有大约3.5亿的慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染者,我国约有9300万的HBV感染者。HBV慢性感染可以引起慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭进而诱发为肝癌。临床上治疗HBV慢性感染的药物主要有:1.α-干扰素（IFN-α）;2.核苷（酸）类似物（NA）。α-干扰素主要是通过诱导细胞产生抗病毒蛋白和免疫调节来达到抗病毒的作用。与核苷（酸）类似物相比,α-干扰素治疗应答持续更久,但是α-干扰素治疗慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）有效率仍然较低,仅为30%～50% ,且具有副作用多,价格昂贵等缺点,并且有其他因素决定着α-干扰素抗病毒疗效。核苷（酸）类似物是近些年来临床治疗慢性乙型肝炎患者的重要药物,在体内核苷（酸）类似物可在磷酸激酶作用下形成三磷酸化合物,拮抗HBV所需的天然底物脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）。核苷（酸）类似物作用靶点是HBV逆转录酶,其可以在3个环节上抑制HBV逆转录酶的活性,依次是:碱基引导（base priming）、从mRNA前体反转录成负链DNA、HBV DNA正链合成。目前,在我国临床应用的核苷（酸）类似物药物有拉米夫定（LAM）、阿德福韦（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（L-dT）和替诺福韦（TDF）。HBV基因组易产生变异,原因在于HBV的多聚酶/逆转录酶（Reverse transcriptase,RT）缺乏必要的校对功能,其变异速度可达到10-7 bp/d,而远大于其他DNA病毒的平均变异水平。所以,临床长期应用核苷（酸）类似物治疗HBV感染者的过程中,在药物的压力选择下HBV准种中存在的极少量的耐药变异株成为优势株,从而出现病情的反复或加剧。HBV的耐药类型按照发生顺序可依次分为:1.基因型耐药（Genotypic Resistance）,表现为HBV基因组产生某些特定位点突变,并且这些突变的位点已证明与耐药相关;2.病毒学突破（Virological Breakthrough）,表现为患者血清病毒裁量出现>1 log10水平的反弹;3.生化学突破（Biochemical breakthrough）,表现为患者出现丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase,ALT）上升和（或）病理上出现肝脏组织学损伤加重。要确定某种HBV基因变异是否与耐药相关,需要用表型耐药（Phenotype Resistance）分析证实,基本策略是构建HBV DNA变异株与野生株基因组重组载体,转染肝癌细胞系后定量检测HBV DNA复制中间体,比较在不同药物浓度下病毒复制力的受抑制程度。由于HBV表型耐药分析技术方法比较复杂,用传统Southern Blotting杂交法结果重复性较差,国内仅有少数实验室初步建立了方法。目的建立实用的表型耐药分析方法,为鉴定定临床可能出现新型与复杂HBV耐药变异提供方法基础。具体包括:1.构建1.1倍HBV野生型和LAM耐药突变型的重组载体。2.将1.1倍HBV野生型和LAM耐药突变型的重组载体转染肝癌细胞系HepG2细胞,通过检测在不同药物浓度下的病毒复制力水平检测变异病毒的耐药表型。3.建立实时荧光PCR定量法检测病毒复制力,并与Southern杂交法比较。方法从临床上获得的LAM耐药慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,经基因工程技术获得具有HBV基因组耐药突变位点的质粒载体,在体外培养系统分析慢性乙型肝炎患者血清HBV分离株对拉米夫定（LAM）的敏感性。1.从临床检测确诊1例拉米夫定耐药患者（耐药位点为:rtL180M+rtM204V）血清内提取HBV DNA,运用巢式PCR扩增HBV DNA RT区,获得扩增RT区基因,命名为9077,将9077克隆至pGEM-Teasy载体,获得含有RT区耐药基因的质粒9077-p-m,将9077-p-m进行扩增,采用定点突变方法,把9077-p-m的RT区所含的耐药突变位点回复为野生型,野生型质粒命名为9077-p-w,并把9077-p-w克隆扩增。运用Nco I/Xho I双酶切质粒9077-p-m和9077-p-w回收RT区片段,将两条RT区片段替换至pTriEx-1.1-HBV载体,替换为可以表达野生型的载体,命名为:S9077-1;表达耐药突变型的载体,命名为:S9077-2。分别转染至HepG2细胞,ELISA法检测上清中HBsAg和HBeAg的水平。2.将构建成功的pTriEx-1.1-HBV野生型载体S9077-1和pTriEx-1.1-HBV拉米夫定耐药突变型载体S9077-2分别转染至HepG2细胞,加用拉米夫定,按0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的浓度梯度,每天换液一次,连续加用拉米夫定5天,提取HBV核心颗粒DNA,分别用荧光定量PCR和Southern杂交法检测HBV复制中间体水平,后者产生的图像用核酸定量软件进行灰度扫描定量。结果初步建立了体外HBV表型分析方法,该方法对监测HBV耐药性具有可行性,对指导临床医生制订更合理的抗病毒治疗方案及筛选新型抗病毒药物具有重要意义。具体如下:1.从拉米夫定耐药患者血清中提取HBV DNA RT区经克隆后测序,其耐药位点符合要求。将该HBV DNA RT区定点突变,克隆后测序,确证回复为野生型,重组到pTriEx-1.1-HBV载体上,转染至HepG2细胞检测上清抗原表达量检测符合要求。2. HBV DNA水平检测,加用不同浓度的LAM后,随药物浓度增加,野生株细胞内HBV复制中间体水平明显下降,IC50为0.04±0.01μmol/L;而rtL180M+M204V突变株转染细胞后,随药物浓度的增加,HBV复制中间体水平并没有明显下降, IC50 > 100μmol/L。与野生型毒株相比,rtL180M+M204V突变株的IC50增加了约2500倍。Southern Blotting检测结果与实时荧光PCR测定一致。结论1.本研究构建体外表达的1.1倍HBV野生型和LAM耐药突变型重组载体,将载体转染入HepG2细胞后,该载体能够在体外稳定地高表达HBsAg和HBeAg抗原水平,为HBV耐药体外研究提供了载体基础。2.本研究采用脂质体体外转染的技术手段,进行HBV DNA在体外细胞进行抗HBV药物作用的研究,建立了HBV表型耐药分析方法,对鉴定临床发现的病毒基因变异与HBV耐药性的关系提供了方法学基础。

王秋平,周小棉^[7]（2011）在《乙型肝炎病毒YMDD变异检测方法的新进展》文中研究表明乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致肝硬化和肝癌的重要因素,但长期接受拉米夫定治疗的患者会产生耐药变异,一般服用拉米夫定>6～9个月,部分患者可发生耐药变异,并随治疗时间延长而突变率逐渐增高。据文献报道,一般治疗

王涵^[8]（2010）在《HBV前C区A1896基因突变的检测方法及临床意义》文中研究说明慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）是世界上最常见的传染病之一,世界上有20亿人感染过HBV,其中HBV携带者就有4亿人之多,而我国占了1.5亿,并且本病每年造成的死亡人数约有100万,故可见,其危害极大。感染HBV患者的自然病程漫长,在临床上可表现为各种不同类型的疾病,包括无症状携带状态、急、慢性肝炎和肝硬化等,严重的可能发展为原发性肝癌,严重影响了人类的健康。HBV血清标志物的检测是目前诊断慢性乙型肝炎的最常用指标,它主要反映人体对HBV的免疫反应状态,但不能直接反应HBV在患者体内的复制与传染情况,所以临床上难以根据这些结果对患者体内HBV复制情况进行准确的判断,故临床上多联合乙肝前S1抗原及HBV-DNA的定量检测来判断HBV在体内的复制情况。目前临床上常指出HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者常出现病情反复,甚至有重症化趋势,经研究认为此现象与乙肝病毒变异有关。HBV前C区属病毒变异的高变区,而前C区的A1896基因也是易发生变异的重要位点之一,因此我们对HBeAg阴性并含有高滴度的HBV-DNA的慢性乙型肝炎患者做HBV前C区A1896位点的变异检测,为临床治疗、预后的判断等提供更有价值的信息。近10年来核苷类似物用于乙型肝炎（CHB）患者的治疗已取得了显着的效果。本研究将HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者血清做HBV-DNA含量的检测,然后筛选出病毒复制含量较高的患者做HBV前C区A1896位点变异的检测,根据检测结果分为变异与未变异两组,通过三种核苷类似物对两组的临床用药疗效进行比较,来探讨HBV前C区A1896基因突变的临床意义。

唐孝亮^[9]（2009）在《PCR熔解曲线法检测HBV YMDD自然变异》文中进行了进一步梳理目的了解未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎（CHB）患者乙肝病毒YMDD自然变异流行状况及特点。方法选择未接受过抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者119例,采用荧光标记杂交双探针PCR熔解曲线法（FH-PCR-MC）对其血浆标本进行YMDD基因序列突变检测。结果119例患者中,有23例存在YMDD自然变异毒株,变异检出率为19.3%,其中YVDD阳性者20例（87.0%）,YIDD阳性者2例（8.7%）,YVDD和YIDD同时阳性者1例（4.3%）。23例出现自然变异毒株的患者,其体内病毒均为变异株与野生株共生,且变异株为非优势株,变异株在总病毒量中所占的比例均在50%以下。变异毒株占总病毒量的40%～50%者4例,30%～40%者6例,20%～30%者6例,20%以下者7例。结论未经抗病毒治疗的CHB患者存在YMDD自然变异毒株,且变异株与野生株共生,为非优势株。

杨松^[10]（2009）在《慢性乙型肝炎患者阿德福韦酯耐药的检测与分析》文中研究说明研究背景和目的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）治疗的关键为抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）治疗。目前被我国国家食品药品监督管理局（State Foodand Drug Administration,SFDA）批准用于抗HBV治疗的药物主要包括两类:干扰素类与核苷（酸）类似物类,后者包括拉米夫定（lamivudine,LAM）、阿德福韦酯（adefovir dipivoxil,ADV）、替比夫定（telbivudine,LdT）与恩替卡韦（entecavir,ETV）。其中ADV自上市以来,在CHB患者,尤其是LAM耐药患者中被广泛应用。但随着ADV治疗时间延长,ADV耐药的问题逐渐凸显。目前关于ADV耐药相关的HBV反转录酶（reverse transcriptase,rt）区变异位点报道较多,如rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S、rtI233V与rtN238T/D等,但公认的ADV耐药相关的HBV变异为rtA181V/T与rtN236T。ADV治疗e抗原（HBeAg）阴性的核苷（酸）类似物初治CHB患者1～5年累积耐药发生率分别为0%、3%、11%、18%与29%。患者出现ADV耐药相关变异后,可以相继出现病毒学突破、生化学突破、肝炎发作与肝功能失代偿等。因此定期监测、早期发现ADV耐药并给予有效的挽救治疗对于有效地控制HBV感染具有重要意义。在ADV耐药的监测中,血清HBV DNA检测是重要的筛查指标。但是血清HBV DNA除受到ADV耐药影响外,还与患者依从性、患者应用药物的质量、药物代谢因素以及体内病毒的自然波动等相关,而特异性的ADV耐药检测则是确诊患者ADV基因型耐药的方法。现已报道的ADV基因型耐药（genotypic resistance）的检测方法包括:聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）产物直接测序法、克隆测序法、线性探针反向杂交法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法（restriciton fragmentlength polymorphism,RFLP）、实时荧光定量PCR法与限制性片段质谱多态性（restriciton fragment mass polymorphism,RFMP）等方法。在这些方法中,实时荧光定量PCR法目前尚未应用于临床检测;线性探针反向杂交法与RFMP法价格昂贵;克隆测序法操作非常繁琐而且价格昂贵。目前国内ADV耐药检测应用最广泛的是PCR产物直接测序法与PCR-RFLP法。PCR产物直接测序法目前多采用双脱氧测序法（di-deoxy sequencing）,其缺点为检测敏感度较低,只有当变异病毒占体内病毒群20%～30%以上时方可检出。PCR-RFLP法成本相对低廉,但仅针对已知变异,对每种变异均需设计特异性引物与酶切位点,且受到操作人员以及酶切体系影响较大。随着ADV耐药问题的逐渐凸显,临床上迫切需要有较高敏感度与特异度、操作简便、自动化程度高并且价格相对低廉的耐药检测方法。基因芯片技术用于疾病诊断具有高通量与高灵敏度的优点,它用于LAM耐药的检测已有报道,检测HBV DNA下限为2～3 log10拷贝/mL,可于病毒群中检出＞10%变异株。另外焦磷酸测序法作为一种新兴的测序方法,已有报道用于LAM耐药检测,同样肯有高通量与高灵敏度特点,并可于病毒群中检出＞10%变异病毒。目前尚无基因芯片法与焦磷酸测序法检测ADV耐药的报道。因此,我们收集ADV治疗出现病毒学突破或治疗48周未达到病毒学应答的CHB患者的血清样本与临床资料,采用PCR产物双脱氧测序法、焦磷酸测序法与基因芯片法进行ADV耐药检测,对三种方法检测结果进行分析。同时,我们进一步比较ADV治疗病毒学突破患者与48周无病毒学应答患者的耐药发生情况,分析耐药相关因素;并比较HBV基因型与ADV耐药的相关性。具体内容分述如下:第一部分:慢性乙型肝炎患者阿德福韦酯耐药的检测方法分析本部分实验,我们收集ADV治疗出现病毒学突破或48周未达到病毒学应答患者的血清,分别应用PCR产物双脱氧测序法、焦磷酸测序法与基因芯片法进行基因型耐药检测。对三种检测方法的耐药检测结果进行分析,探讨漏检耐药变异的原因,并对变异株在病毒群中所占比率（以下简称变异株比率）做初步探讨。材料和方法:1.收集ADV治疗（10mg/d）出现病毒学突破（病毒学突破组）或48周未达到病毒学应答患者（病毒学失败组）血清提取DNA模板,巢式PCR扩增后取阳性扩增的产物进行双脱氧法测序,采用NTI Vector 9与Chromas软件分析测序结果。2.取患者血清提取DNA模板,PCR扩增后取阳性扩增的产物采用基因科技（上海）HBV耐药突变焦磷酸测序法检测试剂盒进行检测。采用焦磷酸测序仪配套分析软件进行变异判断与变异株比率分析。3.取患者血清提取DNA模板,PCR扩增后取阳性扩增的产物采用晶芯乙型肝炎病毒耐药检测基因芯片试剂盒进行检测,检测结果采用晶芯乙型肝炎病毒耐药基因芯片分析软件进行分析。4.采用t检验、t′检验、Wilcoxon秩和检验、Pearson非校正法卡方检验或Yates校正法卡方检验进行统计分析。SPSS 11.5软件用于统计计算。结果:1.共检测病毒学突破组患者106例与病毒学失败组患者104例,两组患者性别比与平均年龄差别不存在统计学意义。2.ADV耐药检测结果:（1）.PCR产物双脱氧测序法耐药检测:210例患者PCR扩增均为阳性。病毒学突破组检出ADV耐药38例,病毒学失败组检出ADV耐药14例。（2）.PCR产物焦磷酸测序法检测:PCR扩增阴性患者10例（病毒学突破组5例,病毒学失败组5例）。病毒学突破组检出ADV耐药42例,病毒学失败组检出ADV耐药22例。（3）.基因芯片法检测:PCR扩增阴性患者21例（病毒学突破组12例,病毒学失败组9例）。病毒学突破组检出ADV耐药33例,病毒学失败组检出ADV耐药14例。（4）.由于双脱氧测序法与焦磷酸测序法为基于测序分析方法,其阳性结果可确认ADV耐药。此两种最终确定ADV耐药患者67例,其中病毒学突破组45例,病毒学失败组22例。共检出ADV耐药变异位点92个。基因芯片检测结果均得到双脱氧测序法和/或焦磷酸测序法的确认。3.三种检测方法比较:（1）.检测结果符合率:3种检测方法完全符合率为74.8%;双脱氧测序法与焦磷酸测序法结果符合率为83.8%;双脱氧测序法与基因芯片法结果符合率为83.3%;另外焦磷酸测序法与基因芯片法结果符合率为81.4%。（2）.就确认的67例ADV耐药患者对三种方法的耐药检出率比较:焦磷酸测序法耐药患者（P=0.002）以及耐药位点检出率（P=0.002）高于双脱氧测序法;焦磷酸测序法耐药患者（P＜0.001）以及耐药位点检出率（P＜0.001）高于基因芯片法。双脱氧测序法与基因芯片法耐药患者（P＞0.05）与耐药位点检出率（P＞0.05）差异无统计学意义。（3）.三种方法检测结果的阳性预测值:PCR产物双脱氧测序法与焦磷酸测序法可直接显示变异位点,其阳性预测值为100%。本研究中,基因芯片检测阳性结果均得到测序法的验证,其阳性预测值为100%。4.漏检变异分析:（1）.PCR产物双脱氧测序法漏检变异位点21个,漏检位点与患者血清HBVDNA水平与变异株在病毒群中所占比率相关。（2）.基因芯片法共漏检耐药变异位点29个,漏检位点主要与变异株的血清拷贝数相关,而与变异株在病毒群中所占比率无直接相关。（3）.焦磷酸测序法共漏检6个耐药变异位点。漏检位点原因尚不清。5.检出变异的变异株比率分析:（1）.rtA181T、rtA181V与rtN236T变异各自在检出时的平均变异株比率分别为38.96%、54.89%与54.01%。rtA181V平均变异株比率高于rtA181T（P=0.005）。rtA181V与rtN236T平均变异株比率差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）.在病毒学突破组,单一位点变异患者共24例,其中14例患者变异株比率＜50%。在病毒学失败组中,单一位点变异患者共20例,其中12例患者变异株比率＜50%。结论:1.初步研究表明,PCR产物焦磷酸测序法的ADV耐药检出率优于双脱氧测序法与基因芯片法。基因芯片法耐药检出率与双脱氧测序法无显着性差异。焦磷酸测序法与双脱氧测序法检测阳性结果可以确认耐药,基因芯片法同样具有较好的阳性预测值。2.PCR产物双脱氧测序法漏检变异位点与患者血清HBV DNA水平与变异株所占比率相关。基因芯片法漏检位点主要血清中变异株的拷贝数相关,而与变异株在病毒群中所占比率无直接相关。3.无论是ADV治疗出现病毒学突破还是治疗48周无病毒学应答患者,其检出的耐药变异株在体内均可能以非优势株存在,体内变异株比率与患者HBVDNA改变的关系还有待进一步研究。第二部分:CHB患者ADV耐药的相关因素分析由上部分可知,无论是ADV治疗病毒学突破组患者还是病毒学失败组患者均只有部分患者检出耐药。因此我们就第一部分中患者的ADV耐药检测结果进一步比较病毒学突破组与病毒学失败组患者的耐药情况,分析耐药发生的相关因素;并分析HBV基因型与ADV耐药的相关性。材料与方法1.患者HBV基因型检测,采用巢式PCR方法扩增HBV表面抗原（HBsAg）编码序列,扩增产物进行测序分析,将测序结果输入美国生物技术信息中心（NCBI）HBV分型软件进行分型。2.病毒学突破组与病毒学失败组患者ADV耐药检测参照论文第一部分。3.采用t检验、t′检验、Wilcoxon秩和检验、Pearson非校正法卡方检验或Yates校正法卡方检验进行统计分析。SPSS 11.5软件用于统计计算。结果:1.病毒学突破组中基因B型患者18例,基因C型患者88例。病毒学失败组中基因B型患者21例,基因C型患者83例。两组均未检出其它基因型患者。2.两种方法共检出ADV耐药患者67例,其中病毒学突破组45例,病毒学失败组22例。共检出耐药变异92个,其中rtA181V/T变异63个,rtN236T变异29个。病毒学突破组耐药患者检出率高于病毒学失败组（P＜0.001）。病毒学突破组联合变异检出率高于病毒学失败组（P=0.013）。病毒学突破组单一rtA181T变异患者比率低于病毒学失败组（P=0.017）。3.病毒学突破组中,单一位点变异患者HBV DNA突破水平（P＞0.05）与生化学突破率（P＞0.05）与联合变异患者差别无统计学意义。包含rtA181T变异患者HBV DNA突破水平低于不包含该变异的耐药患者（P=0.014）,但生化学突破率高于不包含该变异的耐药患者（P=0.023）。4.两组患者中,基因B型与C型患者耐药发生率差别无统计学意义（P＞0.05）。基因B型ADV耐药患者中单一rtN236T变异患者比率高于基因C型ADV耐药患者（P=0.011）。5.两组患者中LAM治疗失败患者ADV耐药检出率均高于ADV初治患者（病毒学突破组P=0.010;病毒学失败组P=0.020）。结论:1.ADV耐药变异中,rt181V/T变异较rtN236T变异常见,无论是ADV治疗病毒学突破患者还是治疗48周无病毒学应答患者均需进行耐药检测以指导抗病毒方案选择。2.rtA181T变异可降低ADV治疗出现病毒学突破患者的HBV DNA升高幅度,但可增加患者生化学突破率;分析可能的原因与rtA181T变异导致的HBsAg变异相关。3.基因B型ADV耐药患者中单一rtN236T变异所占比率高于基因C型ADV耐药患者,结果有待进一步确认。4.无论是在病毒学突破人群还是治疗48周无病毒学应答人群,ADV耐药均多发生于LAM经治患者。

二、PCR熔解曲线法检测乙型肝炎病毒变异株（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、PCR熔解曲线法检测乙型肝炎病毒变异株（论文提纲范文）

（1）MLPA结合RT-PCR快速检测乙型肝炎病毒拉米夫定及阿德福韦耐药（论文提纲范文）

（3）慢乙肝患者HBVcccDNA与血清HBVDNA及其标志物相关性研究（论文提纲范文）

（5）PCR熔解曲线法检测HBV基因型及RT-ARMS-qPCR法定量检测HBV YMDD突变的建立（论文提纲范文）

（6）乙型肝炎病毒表型耐药分析方法建立的研究（论文提纲范文）

（7）乙型肝炎病毒YMDD变异检测方法的新进展（论文提纲范文）

（8）HBV前C区A1896基因突变的检测方法及临床意义（论文提纲范文）

（9）PCR熔解曲线法检测HBV YMDD自然变异（论文提纲范文）

（10）慢性乙型肝炎患者阿德福韦酯耐药的检测与分析（论文提纲范文）

四、PCR熔解曲线法检测乙型肝炎病毒变异株（论文参考文献）

• [1]MLPA结合RT-PCR快速检测乙型肝炎病毒拉米夫定及阿德福韦耐药[D]. 贾双荣. 第三军医大学, 2014(11)
• [2]慢性乙型肝炎患者YMDD自然变异的临床观察[J]. 张为民,唐曙明,谢亚琴,毛维玉,龚文波. 国际医药卫生导报, 2013(11)
• [3]慢乙肝患者HBVcccDNA与血清HBVDNA及其标志物相关性研究[D]. 王晓英. 宁夏医科大学, 2013(03)
• [4]拉米夫定抗乙型肝炎病毒治疗的耐药问题[J]. 王晓英,佘会元. 肝脏, 2012(04)
• [5]PCR熔解曲线法检测HBV基因型及RT-ARMS-qPCR法定量检测HBV YMDD突变的建立[D]. 商红艳. 福建医科大学, 2011(09)
• [6]乙型肝炎病毒表型耐药分析方法建立的研究[D]. 刘禄. 桂林医学院, 2011(05)
• [7]乙型肝炎病毒YMDD变异检测方法的新进展[J]. 王秋平,周小棉. 中华医院感染学杂志, 2011(01)
• [8]HBV前C区A1896基因突变的检测方法及临床意义[D]. 王涵. 吉林大学, 2010(09)
• [9]PCR熔解曲线法检测HBV YMDD自然变异[J]. 唐孝亮. 中国现代医学杂志, 2009(10)
• [10]慢性乙型肝炎患者阿德福韦酯耐药的检测与分析[D]. 杨松. 山东大学, 2009(04)

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