一、CMV-Pf-CP基因表达载体的构建及转化西番莲(Passiflora edulis)的研究（论文文献综述）
陆珍,黄诚梅,魏源文,邓智年,曹辉庆,吴凯朝,罗海斌,蒋胜理,徐林[1]（2019）在《西番莲脱分化再生体系研究》文中提出以大果黄果西番莲为材料,通过无菌播种获得无菌苗,采用无菌苗的子叶及下胚轴为外植体,对诱导分化不定芽、不定芽继代增殖、生根诱导等斱面进行研究,为西番莲组织培养和遗传转化研究提供基础。结果表明:以未完全展开的子叶为外植体,诱导不定芽分化的效果最好,最适宜的分化培养基为MS+2.0mg/L6-BA+0.1 mg/L IAA,其诱导分化率可达100.0%;最适宜的增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,其芽苗增殖系数最高,为3.19,且芽苗长势好;最适宜的生根培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA,其生根率达100.0%,根粗壮、长、多,且幼苗长势好。
焦楠[2]（2019）在《西番莲快繁体系建立及脱毒技术研究》文中指出西番莲（Passiflora caerulea L.）属西番莲科（Passiflora ceae）西番莲属（Passiflora L.）,是亚热带地区的一种多年生常绿攀援植物。其果实富含丰富的营养物质,果汁气味馥郁,故有“百香果”的美名,在世界饮品市场占据重要席位。近年来随着西番莲的大量引种种植,病毒病害侵染情况愈发严重,使西番莲果实产量和品质大幅下降,严重阻碍了我国乃至世界西番莲产业的发展。因此,对西番莲进行优质种苗快速繁育以及病毒苗木的脱毒工作尤为重要。本研究建立并优化了西番莲离体再生体系,将获得的无菌苗进行炼苗及移栽管理;针对侵染西番莲的两种病毒建立了TeMV和CMV双重RT-PCR病毒检测体系,进一步对反应条件进行了优化,同时建立了微量直接RT-PCR检测方法;通过构建CP-GFP的表达载体对TeMV外壳蛋白展开亚细胞定位研究,进一步对感病西番莲体内的TeMV表达特性进行定量分析;以感病西番莲茎尖为材料,通过建立的小滴玻璃化法进行超低温脱毒处理,探究了影响脱毒效果的主要因素,并对脱毒过程进行优化。主要研究结果如下:1西番莲快繁体系的建立及优化以西番莲带腋芽的茎段为外植体材料,对不同消毒剂种类和消毒时间进行筛选,优化外植体灭菌体系。结果表明:西番莲外植体的最佳灭菌方法为使用75%乙醇浸没处理30s,随后转入0.1%HgCl2溶液中消毒12min,可以显着降低外植体的污染率和褐化率,接种后可获得较高的存活率。以腋芽发育得到的无菌苗为材料,采用正交法研究6-BA和NAA两种外源激素对西番莲增殖效果的作用。结果显示,两种激素存在显着的交互效应,将2.0mg/L6-BA和0.1mg/LNAA加入增殖培养基时,西番莲的增殖系数最高,为5.09。对四周苗龄的西番莲试管苗进行生根诱导时,探究了IBA和NAA两种激素对植株生根的影响。由试验结果得知,1.5mg/LIBA和0.5mg/LNAA组合为最佳诱导生根培养基,平均可诱导生根数为5.53。对根系生长健壮且达到34条主根的无菌苗进行移栽管理,根据移栽苗的成活率及生长势可以判断最适移栽基质为草炭土和珍珠岩混合比为4:1的营养基质,移植后植株成活率达93%,生长势也明显优于其他试验组。2西番莲相关病毒的检测技术研究以感染病毒病的西番莲叶片为试验材料,对四种西番莲常见病毒进行分子生物学检测,结果表明:在采集的西番莲样叶中,可检测到黄瓜花叶病毒（CMV）、夜来香花叶病毒（TeMV）、东亚西番莲病毒（EAPV）和西番莲木质化病毒（PWV）四种病毒侵染的情况。在此基础上针对复合感染TeMV和CMV的西番莲建立了双重RT-PCR检测体系,并且对反应参数中的引物浓度、退火温度及循环次数进行优化。改良后的双重RT-PCR检测系统反应参数为:最佳引物浓度比为TeMV:CMV=1:4,即TeMV反应终浓度为2.0mmol/L,CMV终浓度为8.0mmol/L;最佳退火温度为57℃;最佳循环次数为35次。针对优化后的双重RT-PCR检测体系进行灵敏度检验,结果显示,当样叶cDNA稀释到原液的10-5时,仍能够扩增出特异性条带,检测灵敏度等同于10-5mg组织量。将优化后的双重RT-PCR体系应用于36份西番莲样叶进行检测,结果表明,来自不同产区的样品中,有8份样品复合感染TeMV及CMV,18份样品单感TeMV或CMV。本研究还建立了西番莲微量直接RT-PCR检测体系,针对不同取样部位和不同尺寸的针头进行试验。由检测结果可知,选择尺寸为23G（0.6×25TW LB）的注射器针头,以健壮的茎段或叶片为检测部位可以对PWV病毒达到较好的检测效果,此研究可为西番莲的田间检测提供便利。3 TeMVCP基因克隆、亚细胞定位及表达特性分析以感染TeMV的西番莲植株为试验材料,对TeMV外壳蛋白进行克隆验证。通过构建CP-GFP融合载体并转化至烟草植株进行亚细胞定位试验,定位结果表明:TeMVCP蛋白定位于叶绿体中,与网站预测结果一致,由此推测TeMV感染西番莲后作用位点位于叶片的叶绿体处。为研究TeMV在西番莲寄主体内的表达特点,对不同西番莲品种以及不同组织部位进行RNA提取和反转录操作,以eIF-5A作为内参基因,进行定量表达分析。定量结果显示:TeMV在感病西番莲不同部位的表达量差异显着,在叶片部位表达量最高,花药处表达量最低,具有明显的组织表达特异性。对“福建百香果一号”和“福建百香果三号”两个感病品种进行定量表达分析后发现,前者较后者具有显着高表达的情况,表达量约为后者的三倍,推测“福建百香果三号”具备较强的抗病性。4西番莲茎尖超低温脱毒技术研究及脱毒苗遗传稳定性检测以携带TeMV病毒的西番莲组培苗茎尖为材料,运用小滴玻璃化法对西番莲茎尖采取超低温处理。针对影响小滴玻璃化法的预培养时间和脱水时间两个因素进行优化试验,优化后的小滴玻璃化法操作程序为:剥取1mm的西番莲茎尖投入液体预培养基中预培养24h,随后转入PVS2脱水剂中50min进行脱水处理,在1×4cm大小的铝箔纸上制作PVS2小滴并转入脱水后的茎尖,将铝箔纸转移至液氮冻存1h,冻存结束后进行卸载处理并转移茎尖至再生培养基上恢复培养。根据优化后的小滴玻璃化法对西番莲茎尖进行超低温脱毒研究,设置不同的茎尖大小研究不同尺寸的茎尖对超低温脱毒效果的影响。设置不同的茎尖大小研究不同尺寸的茎尖对超低温脱毒效果的影响。试验结果证明,当剥取的茎尖尺寸在0.81.0mm时,经超低温脱毒后茎尖存活率和再生率最高,分别为83.3%和60%,脱毒率达100%。对超低温脱毒后的组培苗进行ISSR扩增,结果显示:试验共扩增得到2550条条带,每组引物可扩增出49条条带,与母株对照组相比,试验组脱毒苗无特异性条带产生,超低温脱毒后的再生苗未发生遗传变异。
冀树娴[3]（2019）在《西瓜花叶病毒遗传多样性及长距离移动决定因子研究》文中进行了进一步梳理西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）,主要通过蚜虫以非持久性方式传播。WMV寄主范围广泛,是危害葫芦科、藜科、豆科等多种作物的重要病毒。受WMV危害后,作物的产量和品质严重下降。本研究制备了WMV CP特异性抗血清,明确了WMV臭椿分离物CN:AIL-TA:17和西葫芦分离物CN:ZUC-JN:17在生物学和血清学上的差异,分析了2个WMV分离物遗传进化关系,构建了CN:ZUC-JN:17全长侵染性cDNA克隆,鉴定了81种葫芦科作物品种对WMV的抗性,验证了WMV P1基因在决定寄主范围中的作用。具体结果如下:（1）制备了效价高、特异性强的WMV CP抗血清。利用原核表达的WMV CP免疫新西兰大白兔获得WMV CP抗血清。该抗血清能特异性识别WMV CP,与同属的番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）和烟草花叶病毒属的黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）均无反应。ELISA检测表明制备的WMV CP抗血清效价为1:8192。（2）分析了WMV西葫芦分离物CN:ZUC-JN:17和臭椿分离物CN:AIL-TA:17生物学特性。利用Western blotting分析发现西葫芦分离物CN:ZUC-JN:17和臭椿分离物CN:AIL-TA:17存在血清学上相关性。通过机械摩擦接种方法将CN:ZUC-JN:17和CN:AIL-TA:17分离物分别接种到本氏烟和西葫芦,结果发现,CN:AIL-TA:17能系统侵染本氏烟,但不侵染西葫芦;CN:ZUC-JN:17能够系统侵染西葫芦,但仅能侵染本氏烟的接种叶片,不能进行系统侵染。（3）分析2个WMV分离物在全基因组水平上的遗传多样性。通过RT-PCR和5’RACE技术获得西葫芦分离物CN:ZUC-JN:17和臭椿分离物CN:AIL-TA:17全基因组序列。序列分析发现CN:ZUC-JN:17和CN:AIL-TA:17基因组全长分别为10028和10045个核苷酸（Nucleotide,nt）,其中CN:ZUC-JN:17的开放阅读框为9645 nt,编码一个含3215氨基酸的多聚蛋白;CN:AIL-TA:17的开放阅读框为9657 nt,编码一个含3219氨基酸的多聚蛋白。与NCBI数据库中的其他WMV分离物比较发现,CN:ZUC-JN:17和CN:AIL-TA:17的全基因组序列分别与分离物CN:SQU-TA:16和CN:AIL-BJ核苷酸一致率最高,为93.9%和89.7%。系统进化分析发现本研究获得的CN:ZUC-JN:17分离物属于III组;CN:AIL-TA:17分离物与北京的臭椿分离物同属于VI组。基于全基因组序列的重组分析表明CN:ZUC-JN:17分离物中存在多个重组事件,是CN:WMV-WS:16、CN:WMV-CHN:05、FR:FBR04-37:04分离物的重组体;但未在CN:AIL-TA:17分离物中发现重组事件。同源性分析结果表明,分离物CN:AILTA:17与CN:ZUC-JN:17分离物在P1基因的同源性最低。（4）获得WMV侵染性克隆pCamWMV和含有GFP的pCamWMV-GFP。基于WMV西葫芦分离物成功构建了WMV侵染性cDNA克隆pCamWMV,将其通过农杆菌浸润方法接种西葫芦、甜瓜和西瓜等葫芦科植物,发病率均为100%。将GFP插入WMV NIb和CP蛋白酶识别位点之间,获得了能在紫外灯下观察病毒积累和分布的pCamWMV-GFP表达载体。（5）鉴定了81个山东省主要葫芦科品种对WMV的抗性。利用制备的WMV侵染性克隆pCamWMV-GFP,通过室内农杆菌浸润接种方法试验鉴定了81个山东省主要葫芦科品种对WMV的抗性。结果发现,在鉴定的14个西葫芦品种中,筛选到万盛丰宝和盛丰金珠2个中抗品种,其余品种为感病或高感品种;13个西瓜品种中,绿宝新秀和浪潮一号2个品种为中抗品种,其余品种为感病或高感品种;24个甜瓜品种中,只筛选到面皮黄瓜1个品种为抗病,其余品种为感病或高感品种;16个黄瓜品种中,星君贝贝为中抗品种,其余品种均为高抗;9个南瓜品种中,爱维80南瓜属于高抗,其余属于抗病或中抗;5个瓠瓜品种中,浙浦6号和瓠子瓜2个品种属于感病,其余3个品种均为高感。（6）分析了WMV P1在本氏烟中决定长距离移动。将侵染性克隆pCamWMVGFP在本氏烟中进行继代接种,在继代二次的本氏烟中获得了能够系统侵染本氏烟的自然突变体,与野生型侵染性克隆相比,其P1基因发生了变异。利用同源重组方法将CN:AIL-TA:17的P1基因替换到侵染性克隆pCamWMV-GFP中,获得异源P1的WMV嵌合突变体pCaZUC-JN-AIL-TA-P1。将WMV嵌合突变体通过农杆菌浸润方法接种本氏烟,8天后本氏烟系统叶片出现绿色荧光点,表明WMV嵌合突变体具有系统侵染本氏烟的能力,证明了WMV P1基因在决定长距离移动过程中具有重要作用。
严佳文,袁启凤,彭志军,王立娟,解璞,陈楠,马玉华[4]（2018）在《西番莲病毒病害研究进展》文中研究指明病毒病是危害西番莲产业的主要病害之一,严重影响西番莲的产量和品质。目前,国外对西番莲病毒病研究较多,并取得了一定进展。中国西番莲病毒相关研究仅涉及病原鉴定,在病毒流行病学、致病机理和抗病资源鉴选等方面鲜有报道。本文重点综述了国内外已经报道的西番莲病毒种类、侵染特性、检测技术以及主要防治策略,并对西番莲病毒病的主要研究方向进行了展望,以期为中国西番莲病毒病的研究和防治提供参考。
邹承武[5]（2014）在《中国淮山药病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究》文中认为淮山药病毒病是引起淮山药减产和品质下降的主要因素之一。本研究通过调查中国的广西、江西、河南、山东和江苏共五省的主要淮山药产地的病毒病发生情况,发现不同地区不同品种的淮山药的病毒病发病率差异较大。南方的广西和江西主栽种为参薯（Dioscorea alata Linn.）和日本薯蔬（Dioscorea japonica Thunb.）,病毒病的发病率在7%～40%之间;而北方的河南、山东和江苏等省份,主栽种为普通山药（Dioscorea opposita Thunb.）,病毒病的发病率在2%～59.3%之间。世界上已经报道的淮山药病毒分别属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus）、杆状DNA病毒属（Badnavirus）、马铃薯X病毒属（Potexvirus）和黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的多种病毒。本研究使用小RNA深度测序技术以及PCR或RT-PCR等技术对采自上述5个省区共365份的淮山药病毒病样本进行病原病毒鉴定,发现在中国侵染淮山药的病毒至少有2种DNA病毒和7种RNA病毒,其中有3种是本研究发现的新病毒,分别为马铃薯X病毒属（Potexvirus）的淮山药X病毒（YVX,暂命名）、香石竹潜隐病毒属（Caalarvirus）的淮山药潜隐病毒（YLV,暂命名）和菜豆金色花叶病毒属（Begorrmovirus）的淮山药黄斑花叶病毒（YYSMV,暂命名）。其它的6种病毒分别为:杆状DNA病毒属的薯蓣杆状病毒（DBV）、马铃薯Y病毒属的淮山药温和花叶病毒（YMMV）和日本淮山药花叶病毒（JYMV）、枳橙花叶病毒属（Macluravirus）的中国淮山药坏死花叶病毒（CYNMV）和淮山药褪绿坏死花叶病毒（YCNMV）,以及蚕豆病毒属（Fabavirus）的蚕豆萎蔫病毒-2（BBWV-2）。在参薯中检测出 DBV、YVX、YMMV、JYMV、CYNMV 和 YCNMV;在日本薯蓣中检测出DBV、YYSMV、YMMV、JYMV;在普通山药中检测出 DBV、YYSMV、YVX、YMMV、JYMV、BBWV-2、CYNMV 和 YLV。其中,在参薯中检出率较高的有DBV（71.1%）、YMMV（49.3%）和YVX（16.2%）,在日本薯蓣中的检出率较高的有DBV（66.7%）和JYMV（12.6%）;在普通山药中检出率较高的有JYMV（43.4%）、YLV（31.6%）、DBV（19.9%）、YMMV（17.6%）、BBWV-2（17.6%）和 YYSMV（12.5%）;其它病毒在上述三种淮山药中的检出率小于5%。病毒复合侵染现象普遍存在,在检测的365份样本中有138份样本为两种以上病毒复合侵染,其中在一个水山药的病毒病样本中同时检出5种病毒。应用RNA-Seq深度测序技术结合RACE和RT-PCR技术,成功克隆到侵染淮山药的 YMMV-NC1、JYMV-WX1、YVX-WX1、CYNMV-FX1、BBWV-2-SG、YLV-SG1和YYSMV-FX1病毒分离物的基因组全长序列。其中YVX-WX1具有 Potexvirus 的基因组结构特征,与白三叶草花叶病毒（Nhite clovermosaic virus,WClMV）日本分离物的核苷酸序列一致性最高,但仅为53.1%,是Potexvirus 一个新种;YLV-SG1具有Carlavirus的基因组结构特征,与酒花花叶病毒（Hop mosaicvirus HpMV）澳大利亚分离物的核苷酸序列一致性最高,为62.9%,是Carlavirus 一个新种;YYSMV-FX1具有Begomovirus的基因组结构特征,与百香果严重畸叶病毒（Passionfruit severe leaf distortion virus,PSLDV）巴西分离物的核苷酸序列一致性最高,但仅为54.2%,是Begomovirus一个新种。将本研究获得的26个YMMV分离物与世界上其它淮山药种植区报道的19个YMMV分离物的核苷酸序列进行系统进化分析,发现这45个YMMV分离物共聚成5个组,呈现出与地理位置的密切相关性;来自中国南方和北方淮山药产区的26个YMMV分离物分别聚在2个组,彼此进化关系较远,由此推测YMMV遗传变异可能是由于地理隔离导致YMMV不同群体的单独进化以及不同YMMV分离物对不同淮山药品种的宿主适应性差异所致。本研究发现YMMV分离物存在重组现象,其中P1、HC-Pro、P3、6K1和CI区域有重组热点。本研究通过表面抗原表位抗体库（SEAL）技术成功制备了 JYMV的单克隆抗体,通过原核表达病毒外壳蛋白制备了 YMMV、YVX、CYNMV和YLV的多克隆抗体。JYMV的单克隆抗体在检测某些淮山药样本时有微弱的非特异性反应,其它病毒的多克隆抗体的特异性较好,且效价均大于1:256000,这些抗体对稀释103倍的病叶汁液仍表现出很强的免疫反应。基于所制备的病毒抗体,建立了相应的病毒ELISA检测方法和IC-RT-PCR检测方法,其中IC-RT-PCR方法的灵敏度是ELISA方法的1000倍以上。本研究还建立了可同时检测YMMV、JYMV、CYNMV和YLV的多重PCR检测技术。综上所述,本研究查明了中国五个省区的主要淮山药产地的病毒病发生情况并鉴定了淮山药的病原病毒,建立了灵敏可靠的检测方法,为将来淮山药生产的病毒病防控提供了重要保障。
王小明[6]（2010）在《CMV 2b蛋白与寄主互作研究中诱饵质粒的构建》文中认为黄瓜花叶病毒（Cucumber mosiac virus, CMV）是一种分布范围最广、发生最普遍的植物RNA病毒之一,能侵染100科1200多种单、双子叶植物。在分类上属于雀麦花叶病毒科（Bromoviridate）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）,其基因组由单链、正义RNA构成,包括RNA1、RNA2、RNA3和亚基因组RNA（RNA4）,有的还含有卫星RNA（Satellite RNA）,基因组结构简单,是研究RNA病毒致病机制的模式病毒之一。2b基因是近年来新发现的CMV基因组中与寄主植物相互作用的一个重要功能基因,其表达产物2b蛋白具有抑制转录后基因沉默的作用,其存在可能是CMV寄主范围广泛的重要原因之一。本论文就CMV的2b基因进行了以下方面的研究：1细菌双杂交诱饵质粒的构建与表达及自激活作用检测构建CMV 2b细菌双杂交诱饵质粒后,可通过从相应的文库中筛选与其相互作用的蛋白质,来对其功能进行分析。试验采用PCR法扩增2b基因编码区序列,将其克隆至带有λcI基因的pBT载体上,与λcI基因形成融合基因,获得pBT-CMV 2b重组质粒。DNA测序结果表明,重组质粒中CMV 2b编码区的碱基序列和阅读框均正确,pBT-CMV 2b重组质粒（即诱饵质粒）构建成功。将诱饵质粒pBT-CMV 2b转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞,在30℃培养条件下IPTG诱导重组融合蛋白表达。提取大肠杆菌的全细胞裂解产物,SDS-PAGE检测蛋白表达,无法判断CMV 2b融合蛋白是否表达,经Western blot免疫印迹进一步鉴定,结果显示有CMV 2b-λcⅠ融合蛋白的表达。重组质粒pBT-CMV 2b和空质粒pTRG共转化大肠杆菌XL1-BlueMRF’报告菌株,在no3-AT平板及3-AT平板上37℃培养,观察菌落生长情况,并与阴性对照比较。结果显示,重组质粒pBT-CMV 2b并无自主活化作用,可用于下一步的文库筛选实验。2λcI多克隆抗体的制备λcI抗体可用于Western blot鉴定大肠杆菌双杂交系统诱饵质粒的表达。试验采用PCR法扩增λcI编码区序列,经双酶切将其定向克隆至表达载体pET-32b上,获得pET-32b-λcⅠ重组表达质粒。DNA测序结果表明,重组质粒中λcI编码区的碱基序列和阅读框均正确；将重组质粒pET-32b-λcⅠ转化大肠杆菌DE3感受态细胞,在20℃培养条件下IPTG诱导表达出可溶性蛋白。经过Ni2+-NTA柱纯化λcI蛋白后与弗氏佐剂混合免疫家兔,经ID-ELISA验证,得到了效价为l：25000的λcI抗血清,Western blot免疫印迹证实该抗体可用于大肠杆菌双杂交系统诱饵质粒的表达鉴定。32b基因酵母双杂交诱饵质粒的构建与自激活作用检测由于酵母双杂与细菌双杂的特点不同,2b酵母双杂交诱饵质粒在相应的cDNA文库中筛选到的互作蛋白可能与细菌双杂不同,据此可对2b功能进行补充分析。试验利用GatewayTM技术的λ嗜菌体位点特异重组系统,通过入门克隆载体介导将CMV 2b基因引入载体pDESTTM32。通过BP重组反应将CMV 2b基因引入入门克隆载体pDONRTM207,得到了pDONRTM207-CMV 2b重组质粒。由于pDONRTM207与pDESTTM32具有相同的抗性筛选标记,无法按正常的将重组质粒pDONRTM207-CMV 2b与pDESTTM32经LR位点特异的重组反应,通过抗性标记来筛选重组质粒pDESTTM32-CMV 2b,因为很大部分未发生LR重组反应的pDONRTM207-CMV 2b转化的菌也可以在相应的抗性平板上生长,正常很难筛选到重组质粒pDESTTM32-CMV 2b。对pDONRTM207-CMV 2b序列进行酶切位点分析发现存在EcoRV和BglⅡ两个酶切位点,可通过切割使抗性标记失活,而且离LR重组位点较远不会影响到它和pDESTTM32的LR重组反应。对重组质粒pDONRTM207-CMV 2b用EcoRⅤ/BglⅡ进行双酶切后,再进行LR重组反应,在这种情况下的大部分重组子均含pDESTTM32-CMV 2b,并经过DNA序列测定证明插入序列完全正确,无读码框移位,成功构建了pDESTTM32-CMV 2b诱饵质粒。pDESTTM32-CMV 2b与pDESTTM22共转化酵母MaV203感受态细胞,并设置不同对照,结果表明pDESTTM32-CMV 2b具有弱的自激活作用,这种自激活可以被50-75 mM浓度的3-AT所抑制,故可以用于下一步的文库筛选试验。
范静苑[7]（2009）在《烟草黄瓜花叶病毒病抗性遗传分析及其分子标记》文中研究指明烟草是我国重要的经济作物之一。烟草黄瓜花叶病毒（CMV）是世界上分布最广的植物病毒之一,其株系繁多,严重的影响了烟草的产量和品质,每年都给烟叶生产造成重人的经济损火。CMV除了引起产量损失外,更严重的是影响烟叶的色泽和香气,商品价值大大降低。本文主要对CMV的抗性遗传分析及其分子标记进行了研究,主要包括以下三方面:（1）烟草黄花花叶病毒（CMV）的抗性鉴定及遗传分析;（2）利用正交试验设计构建适合于烟草的SSR反应体系;（3）利用分离群体分析法（BSA）对烟草CMV抗性基因进行SSR标记筛选,确定与抗性基因紧密连锁的SSR分子标记。主要结论如下:（1）台烟8号对CMV表现高抗,铁把子对CMV表现中抗,其构建的抗感组合的F1代均感CMV,表明供试材料对CMV的抗性表现为隐形遗传。F2代的抗感分离比均为3∶1,BC1代的抗感比例为1∶1,经实测值和理论值的适合性x2检验,F2代和BC1代病情的实测分离值和理论分离值无显着差异性。由此可以初步推断,铁把子和台烟8号对CMV的抗性可能是由一对隐形基因控制的。（2）建立了烟草SSR-PCR最佳反应体系,利用该体系对扩增程序中的退火温度和循环次数进行了筛选,获得了最佳的反应程序。（3）依据混合群体分组分析法（BSA）建立黄瓜花叶病毒病的抗病基因池和感病基因池,利用182对SSR引物进行分子标记和分析,得到标记SM1与来源于铁把子的CMV抗性基因间的遗传距离为8.64cM,标记SM2与来源于台烟8号的CMV抗性基因间的遗传距离为3.92cM。
董伟清[8]（2008）在《农杆菌介导甘蔗ACC氧化酶基因的遗传转化研究》文中提出根据已报道的甘蔗ACO基因的序列,在读码框外设计特异引物,通过RT-PCR技术,克隆了甘蔗ACO基因编码区969bp的cDNA片段,分别正向和反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建了ACO基因的正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,该载体的抗性选择标记为NPTⅡ基因。利用冻融法分别将正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco导入根癌农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法,将ACO正、反义基因导入烟草K346。经PCR筛选,获得34株正义和28株反义转基因植株,转化率分别为24%和31%。取部分PCR阳性植株进行Dot-Southern杂交检测,证明外源基因已整合入烟草的基因组中。采用气相色谱法对转基因烟草进行内源乙烯释放量测定,结果显示,正义转基因烟草的乙烯释放比对照平均增加77.22%,面反义转基因烟草的乙烯释放量仅为对照的31.67%,达到极显着差异。说明甘蔗ACO正、反义基因可在异源真核系统中实现功能性表达。转基因烟草移栽后,反义转基因烟草表现出前期生长延缓、后期开花延迟特性,正义转基因烟草表现出前期生长快、后期开花早特性。通过农杆菌介导法将ACO反义基因遗传转化甘蔗ROC22,经过G418抗性筛选,获得19株抗性植株。对选择标记NPTⅡ基因进行PCR检测,有2株呈现阳性,该阳性转基因植株生长状况较野生型和PCR阴性的植株差,生长迟缓,矮化。
冷言峰[9]（2008）在《西番莲（Passiflora Linn.）种质资源遗传多样性研究》文中研究说明西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora Linn）植物,多为草质或木质藤本,稀为灌木或小乔木。西番莲科约有16个属,600余种。在我国有19种和2变种（包括引种栽培种）,西双版纳地区有9种1变种。当前,作为栽培品种主要有紫果种（Passif lora edulis Sims）、黄果种（P.edulis Sim.f,flavica rpa Deg.）、黄果与紫果杂交种等三大类。对西番莲种质资源的遗传多样性研究,有利于西番莲种质资源的收集、保存、鉴定、创新和合理利用。分子标记能直接从DNA水平反映种质之间的遗传差异,是研究植物遗传多样性的有效工具。ISSR标记具有简单、快速、重复性好、可靠性高、多态性高和引物通用的优点,被广泛地用于遗传多样性究。本研究采用了形态学标记和ISSR标记相结合,运用聚类分析、主坐标分析和因子分析,对62份西番莲种质材料的33个基因型遗传多样性进行了研究。主要结果如下:1.从14条1SSR引物中选山多态性好的6条引物对西番莲资源进行初步的ISSR分析,结果将62份资源分为33个不同的基因型。既避免了相同基因型个体的重复试验,同时也减少了工作量。2.14条ISSR引物在33份西番莲种质中共扩增出228条带,条带的大小在200bp-3000bp之间,其中227条带为多态性,多态位点百分率为99.56%。NTSYS-PC2.10a聚类分析表明,在Dice相似性系数0.73处可将所有供试材料分为5个类群。第一类群包含一个基因型G8（红花西番莲）;第二类群包含G12（巴西种）和G30（美花西番莲）两个基因型;第三类群包含G29（大果西番莲）和G31（百果洲2号）两个基因型;第四类群包含G32（百果洲3号）、G33（台农一号）两个基因型;第五类群包含余下的26种基因型。主坐标分析利聚类分析的结果非常相似,但比聚类分析更直观。3.对29份西番莲种质的24个形态学性状的基本统计分析,各性状在不同的种质材料中存在不同程度的差异,平均变异系数为20.69%,固酸比的变异系数最大,为61.41%,其次为有机酸含量、果肉香气及果肉颜色,果实横径的变异系数最小,为6.67%。29份材料的欧氏遗传距离分布在2.136-13.039之间,当欧氏距离在7.874时可将所有供试材料分为3个类群,第一类群包括只有两个基因型,G31（百果州2号）和G32（百果州3号）。第二类群包括3个基因型:G1（Purple Gold）、G23（XBGZ/Z1-1）和G33（台农1号）。第三类群包括剩下的24种基因型。对12个果实数量性状因子分析的结果表明,可以用5个主因子来概括12个形态性状。按因子方差贡献大小排列主因子的重要程度,依次为果重因子、酸度因子、果汁率因子、果实斑点直径因子和糖度因子。这5个主因子对变异的累计贡献率为85%以上,基本保持了12个性状的绝大部分信息。从主因子出发进行西番莲育种,可以加大目标性状的针对性和提高选择效率。4.综合两种标记系统的分析结果可知,西双版纳地区西番莲种质资源存在广泛的遗传变异,但是绝大多数的栽培种之间具有较高的遗传相似性。并且形态学性状聚类与ISSR聚类不太一致。
潘晓,何伯伟,陈敏智,毛碧增[10]（2006）在《芋艿病毒病及其防治对策》文中提出
二、CMV-Pf-CP基因表达载体的构建及转化西番莲(Passiflora edulis)的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CMV-Pf-CP基因表达载体的构建及转化西番莲(Passiflora edulis)的研究（论文提纲范文）
（1）西番莲脱分化再生体系研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 无菌苗的制备 |
| 1.2.2 诱导不定芽分化 |
| 1.2.3 增殖培养 |
| 1.2.4 生根培养 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同激素组合对子叶和下胚轴的诱导情况 |
| 2.2 不同培养基对西番莲不定芽增殖的影响 |
| 2.3 西番莲不定芽生根情况 |
| 3 讨论与结论 |
（2）西番莲快繁体系建立及脱毒技术研究（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 西番莲离体培养研究进展 |
| 1.1 外植体类型 |
| 1.2 培养基类型对西番莲离体培养的影响 |
| 1.3 激素对西番莲离体培养的影响 |
| 1.4 西番莲组培苗的生根与移栽 |
| 2 西番莲病毒病研究进展 |
| 2.1 西番莲病毒病的种类 |
| 2.2 西番莲病毒病的侵染特性及传播途径 |
| 3 植物病毒检测方法研究进展 |
| 3.1 指示植物法 |
| 3.2 电镜检测法 |
| 3.3 血清学检测法 |
| 3.4 分子生物学检测法 |
| 4 病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)功能及定位研究 |
| 4.1 CP的功能研究进展 |
| 4.2 CP的亚细胞定位研究进展 |
| 5 脱毒技术研究进展 |
| 5.1 热处理脱毒 |
| 5.2 化学疗法脱毒 |
| 5.3 组织培养脱毒 |
| 5.4 超低温脱毒 |
| 6 本研究的意义和内容 |
| 6.1 研究意义 |
| 6.2 研究内容 |
| 第二章 西番莲快繁体系的建立 |
| 第一节 西番莲外植体消毒体系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 培养条件 |
| 1.4 计算方法及数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 消毒剂种类对西番莲再生的影响 |
| 2.2 不同消毒时间对外植体的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二节 不同浓度激素组合对西番莲增殖的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 培养条件 |
| 1.4 计算方法及数据处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 不同浓度激素组合对西番莲组培苗生根的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 培养条件 |
| 1.4 计算方法及数据处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四节 西番莲组培苗的炼苗与移栽 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 西番莲相关病毒检测技术研究 |
| 第一节 西番莲多种病毒的单重RT-PCR检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 西番莲Te MV和 CMV双重RT-PCR检测体系的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 部分感病西番莲样品表型 |
| 2.2 RT-PCR扩增结果 |
| 2.3 双重RT-PCR扩增 |
| 2.4 应用双重RT-PCR检测西番莲样品Te MV和 CMV感染情况 |
| 3 讨论 |
| 第三节 西番莲微量直接RT-PCR(Microtissue direct RT-PCR)检测体系的建立及优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同针头尺寸对微量直接RT-PCR检测的影响 |
| 2.2 不同部位对微量直接RT-PCR检测的影响 |
| 3 讨论 |
| 第四章 西番莲Te MV_CP基因克隆、亚细胞定位及表达分析 |
| 第一节 Te MV外壳蛋白基因克隆及生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 TeMV_CP基因克隆验证 |
| 2.2 TeMV_CP蛋白同源性分析及蛋白保守结构域预测 |
| 2.3 TeMV_CP蛋白理化性质分析 |
| 2.4 TeMV_CP蛋白跨膜结构与磷酸化位点预测 |
| 2.5 TeMV_CP蛋白二级结构及三级结构预测分析 |
| 2.6 TeMV_CP系统进化树构建与分析 |
| 2.7 TeMV_CP蛋白亚细胞定位预测 |
| 3 讨论 |
| 第二节 Te MV_CP蛋白亚细胞定位研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因酶切位点分析 |
| 2.2 目的片段及线性化载体的回收 |
| 2.3 重组载体的鉴定 |
| 2.4 TeMV_CP蛋白亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 第三节 Te MV病毒表达特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TeMV在西番莲不同组织部位的表达分析 |
| 2.2 TeMV在不同品种西番莲中的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 侵染西番莲的Te MV具有组织表达特异性 |
| 3.2 TeMV在西番莲上的表达具有品种差异性 |
| 第五章 西番莲茎尖超低温脱毒技术研究 |
| 第一节 茎尖超低温处理体系的建立及优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 试验设计及数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同预培养时间对超低温处理效果的影响 |
| 2.2 不同脱水处理时间对超低温脱毒效果的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二节 西番莲茎尖超低温脱毒效果检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 西番莲脱毒苗ISSR遗传稳定性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第七章 小结与展望 |
| 1 小结 |
| 1.1 西番莲离体快繁体系的建立与优化 |
| 1.2 西番莲主要病毒检测及双重RT-PCR检测体系的建立 |
| 1.3 侵染西番莲的Te MV_CP蛋白亚细胞定位研究及表达分析 |
| 1.4 西番莲茎尖超低温脱毒技术的研究 |
| 1.5 西番莲脱毒苗ISSR遗传稳定性检测 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（3）西瓜花叶病毒遗传多样性及长距离移动决定因子研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 西瓜花叶病毒(WMV)研究进展 |
| 1.1.1 分布与危害 |
| 1.1.2 寄主范围及传播途径 |
| 1.1.3 株系划分 |
| 1.1.4 基因组结构及蛋白功能 |
| 1.2 WMV的检测 |
| 1.2.1 生物学方法 |
| 1.2.2 分子生物学方法 |
| 1.2.3 电镜观察法 |
| 1.2.4 血清学方法 |
| 1.3 WMV防治现状 |
| 1.3.1 农业防治 |
| 1.3.2 化学防治 |
| 1.3.3 培育与种植抗病品种 |
| 1.4 病毒寄主范围特异性研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 毒原及植物材料 |
| 2.1.2 主要菌株、载体和试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 WMV CP抗血清的制备 |
| 2.2.2 WMV臭椿和西葫芦分离物的生物学分析 |
| 2.2.3 WMV臭椿和西葫芦分离物全基因组遗传多样性分析 |
| 2.2.4 WMV分离物CN:ZUC-JN:17 全长侵染性cDNA克隆的构建 |
| 2.2.5 P1 基因在WMV长距离移动中的作用分析 |
| 2.2.6 葫芦科作物品种对WMV的抗病性鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 WMV CP抗血清的制备及应用 |
| 3.1.1 WMV CP基因原核表达载体的构建 |
| 3.1.2 WMV CP的原核表达分析 |
| 3.1.3 WMV CP抗血清特异性分析 |
| 3.1.4 WMV CP抗血清灵敏度及效价分析 |
| 3.1.5 抗血清的应用 |
| 3.2 WMV臭椿和西葫芦分离物的生物学特性 |
| 3.3 WMV臭椿和西葫芦全基因组遗传多样性分析 |
| 3.3.1 基因组特征分析 |
| 3.3.2 WMV分离物的核苷酸和氨基酸一致率分析 |
| 3.3.3 WMV CN:AIL-TA:17和CN:ZUC-JN:17 多聚蛋白氨基酸序列比较 |
| 3.3.4 重组分析 |
| 3.3.5 系统发育关系分析 |
| 3.3.6 序列相似性分析 |
| 3.4 WMV西葫芦分离物侵染性cDNA克隆的构建 |
| 3.4.1 WMV全长cDNA克隆的构建 |
| 3.4.2 WMV全长cDNA克隆侵染性分析 |
| 3.5 葫芦科作物品种对WMV的抗性分析 |
| 3.6 P1在WMV侵染本氏烟过程中的作用分析 |
| 3.6.1 自然突变体的获得 |
| 3.6.2 异源P1的WMV嵌合体突变体的获得 |
| 3.6.3 嵌合体突变体pCaZUC-JN-AIL-TA-P1 在本氏烟上的侵染性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 高质量抗血清在病毒病监测预警过程中具有重要作用 |
| 4.2 中国西瓜花叶病毒分离物存在遗传多样性 |
| 4.3 侵染性cDNA克隆是研究植物RNA病毒的重要工具 |
| 4.4 培育和种植抗性品种是防治WMV的关键 |
| 4.5 WMV P1 基因在决定长距离移动过程中具有重要作用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）西番莲病毒病害研究进展（论文提纲范文）
| 1 西番莲病毒病种类及侵染特性 |
| 1.1 马铃薯Y病毒属 |
| 1.2 菜豆金色花叶病毒属 |
| 1.3 香石竹潜隐病毒属 |
| 1.4 黄瓜花叶病毒属 |
| 1.5 芜菁黄花叶病毒属 |
| 1.6 柑橘粗糙病毒属 |
| 1.7 烟草花叶病毒属 |
| 1.8 线虫传多面体病毒属 |
| 1.9 其它侵染西番莲的病毒 |
| 1.9.1 西番莲脉明病毒 (Passion fruit vein clearing virus, Pa VCV) |
| 1.9.2 紫果西番莲花叶病毒 (Purple granadilla mo-saic virus, PGMV) |
| 2 西番莲病毒检测技术 |
| 2.1 生物学检测 |
| 2.2 电子显微镜检测 |
| 2.3 血清学检测 |
| 2.4 分子生物学检测 |
| 3 西番莲病毒病防治 |
| 3.1 选育抗病品种 |
| 3.1.1 杂交育种 |
| 3.1.2 实生选种 |
| 3.1.3 分子育种 |
| 3.1.4 体细胞杂交 |
| 3.2 农艺防治 |
| 3.3 化学防治 |
| 4 问题与展望 |
（5）中国淮山药病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 淮山药研究概述 |
| 1.1.1 淮山药的主要品种和形态学特征 |
| 1.1.2 淮山药的起源 |
| 1.1.3 淮山药的生产和栽培 |
| 1.1.4 淮山药的用途 |
| 1.2 淮山药病毒性病害及其研究进展 |
| 1.2.1 马铃薯Y病毒科病毒 |
| 1.2.2 花椰菜花叶病毒科杆状DNA病毒属病毒 |
| 1.2.3 雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属病毒 |
| 1.2.4 未分类的淮山药病毒 |
| 1.3 病毒检测技术 |
| 1.3.1 生物学检测技术 |
| 1.3.2 电镜检测技术 |
| 1.3.3 免疫检测技术 |
| 1.3.4 基于核酸的检测技术 |
| 1.3.5 双链RNA分析技术 |
| 1.3.6 深度测序技术 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第二章 中国淮山药病毒病调查及病原病毒鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 田间调查 |
| 2.2.2 病毒样本的采集 |
| 2.2.3 生化及分子生物学试剂 |
| 2.2.4 病毒检测引物 |
| 2.2.5 淮山药总DNA的提取 |
| 2.2.6 淮山药总RNA的提取 |
| 2.2.7 cDNA的合成 |
| 2.2.8 常规PCR反应体系与条件 |
| 2.2.9 PCR产物电泳检测 |
| 2.2.10 克隆和测序 |
| 2.2.11 系统进化树分析 |
| 2.2.12 小RNA的深度测序 |
| 2.2.13 GAIIx上机 |
| 2.2.14 深度测序的生物信息学分析 |
| 2.2.15 淮山药病毒粒子的提取和形态观察 |
| 2.2.16 淮山药的细胞病理观察 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 淮山药病毒病田间症状 |
| 2.3.2 淮山药田间发病率 |
| 2.3.3 小RNA深度测序鉴定淮山药病原病毒 |
| 2.3.4 PCR或RT-PCR检测淮山药病原病毒 |
| 2.3.5 YYSMV的传播介体 |
| 2.3.6 YYSMV的部分田间寄主 |
| 2.3.7 侵染淮山药的YLV和BBWV-2病毒粒子的形态特征 |
| 2.3.8 受病毒侵染的铁棍山药叶片的细胞病理变化 |
| 2.3.9 受YMMV侵染的桂淮5号叶片的细胞病理变化 |
| 2.3.10 受YVX和YMMV复合侵染的紫山药叶片的细胞病理变化 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 中国淮山药病原病毒的分子生物学特性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 毒源 |
| 3.2.2 生化及分子生物学试剂 |
| 3.2.3 引物 |
| 3.2.4 核酸提取方法 |
| 3.2.5 RNA-Seq深度测序 |
| 3.2.6 逆转录反应 |
| 3.2.7 快速扩增cDNA末端 |
| 3.2.8 PCR反应扩增基因组全长 |
| 3.2.9 克隆及测序方法 |
| 3.2.10 重组分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RNA-Seq深度测序 |
| 3.3.2 YMMV南昌分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析 |
| 3.3.3 JYMV温县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析 |
| 3.3.4 CYNMV丰县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析 |
| 3.3.5 BBWV-2寿光分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析 |
| 3.3.6 YVX温县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析 |
| 3.3.7 YLV寿光分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析 |
| 3.3.8 侵染淮山药的DBV的遗传多样性分析 |
| 3.3.9 YYSMV丰县分离物的基因组全序列测定及其分子生物学特征分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 五种淮山药病毒抗体的制备及病毒检测方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 毒源 |
| 4.2.2 常用试剂及试剂盒 |
| 4.2.3 引物 |
| 4.2.4 病毒CP蛋白基因的扩增与测序 |
| 4.2.5 原核表达载体的构建 |
| 4.2.6 蛋白的诱导表达及表达条件优化 |
| 4.2.7 表达产物的可溶性分析 |
| 4.2.8 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.9 多克隆抗体的制备 |
| 4.2.10 单克隆抗体的制备 |
| 4.2.11 抗体效价及特异性检测 |
| 4.2.12 间接抗原包被免疫吸附测定(ACP-ELISA)方法检测病毒 |
| 4.2.13 蛋白质免疫印记(Western blot)方法检测病毒 |
| 4.2.14 免疫捕获反转录聚合酶链式反应 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 病毒蛋白基因的克隆 |
| 4.3.2 重组蛋白的原核表达及纯化 |
| 4.3.3 抗体效价测定 |
| 4.3.4 ACP-ELISA对淮山药病毒病样本的检出能力 |
| 4.3.5 IC-RT-PCR检测淮山药病毒 |
| 4.3.6 其它淮山药病毒抗体的制备 |
| 4.3.7 Western blot验证淮山药病毒抗体特异性 |
| 4.3.8 五种淮山药病毒的IC-PCR或IC-RT-PCR检测方法的建立 |
| 4.3.9 多重RT-PCR检测淮山药病毒 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 本研究的创新点 |
| 5.3 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 本论文所用术语缩写及全称对应表 |
| 附录2 本论文所用病毒缩写及全称对应表 |
| 附录3 本论文所用物种拉丁名与中文学名对应表 |
| 附录4 YYSMV-FX1的基因组序列 |
| 附录5 用于制备抗体的病毒外壳蛋白氨基酸序列 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）CMV 2b蛋白与寄主互作研究中诱饵质粒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 黄瓜花叶病毒的概述 |
| 1.1 寄主与症状表现 |
| 1.2 株系与传播方式 |
| 1.3 CMV基因组结构及其编码蛋白功能 |
| 1.4 抗植物病毒基因工程 |
| 2 CMV 2b蛋白的功能研究 |
| 2.1 转录后基因沉默(PTGS)抑制子 |
| 2.2 其他功能 |
| 3 酵母双杂交系统 |
| 3.1 酵母双杂交的原理 |
| 3.2 酵母双杂交系统的特点 |
| 4 大肠杆菌双杂交系统 |
| 4.1 基本原理 |
| 4.2 大肠杆菌双杂交系统的特点 |
| 5 本研究的立题依据 |
| 5.1 目的及意义 |
| 5.2 主要研究内容 |
| 5.3 研究技术路线 |
| 第二部分 酵母双杂交诱饵质粒的构建与自激活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 表达载体图 |
| 1.1.3 酶、抗体和化学试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定 |
| 2.1.1 寡核苷酸引物设计 |
| 2.1.2 CMV 2b编码区PCR扩增 |
| 2.1.3 attB-PCR产物的纯化 |
| 2.1.4 BP重组构建入门克隆 |
| 2.1.5 转化 |
| 2.1.6 菌落PCR鉴定重组质粒 |
| 2.1.7 质粒DNA提取 |
| 2.1.8 测序 |
| 2.1.9 pDONR~(TM)207-CMV 2b的双酶切 |
| 2.1.10 LR重组反应 |
| 2.1.11 转化 |
| 2.1.12 菌落PCR鉴定重组质粒 |
| 2.2 酵母双杂交诱饵质粒的自激活鉴定 |
| 2.2.1 酵母感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 转化MaV203感受态细胞 |
| 2.2.3 酵母菌株MaV203表型鉴定 |
| 2.2.4 pDES~(TM)32-CMV 2b的毒性及自激活作用检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 诱饵质粒pDEST~(TM)32-CMV 2b的构建与鉴定 |
| 3.1.1 CMV 2b编码区PCR扩增 |
| 3.1.2 诱饵质粒pDEST~(TM)32-CMV 2b构建及鉴定 |
| 3.2 pDEST~(TM)32-CMV 2b诱饵质粒自激活鉴定 |
| 3.2.1 酵母菌株MaV203表型鉴定 |
| 3.2.2 诱饵质粒的毒性检测 |
| 3.2.3 诱饵质粒的自激活作用检测 |
| 第三部分 大肠杆菌双杂交诱饵质粒的构建与自激活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒 |
| 1.1.2 表达载体图 |
| 1.1.3 酶、抗体和化学试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 大肠杆菌双杂交诱饵质粒的构建及鉴定 |
| 2.1.1 寡核苷酸引物的设计 |
| 2.1.2 CMV 2b编码区PCR扩增 |
| 2.1.3 PCR产物回收纯化 |
| 2.1.4 PCR产物及pBT载体酶切回收 |
| 2.1.5 连接反应 |
| 2.1.6 超级感受态制备 |
| 2.1.7 连接产物的转化 |
| 2.1.8 质粒DNA提取 |
| 2.1.9 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.10 重组质粒DNA序列测定 |
| 2.2 λcI多克隆抗体的制备 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 PCR扩增λcI基因 |
| 2.2.3 回收纯化λcI基因的PCR产物 |
| 2.2.4 PCR产物及pET-32载体酶切回收 |
| 2.2.5 连接反应 |
| 2.2.6 转化 |
| 2.2.7 质粒DNA提取 |
| 2.2.8 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 2.2.9 测序验证 |
| 2.2.10 重组质粒pET-32-λcI的表达 |
| 2.2.11 SDS-PAGE电泳及染色 |
| 2.2.12 表达蛋白纯化 |
| 2.2.13 纯化蛋白浓度的测定 |
| 2.2.14 免疫兔子制备抗体 |
| 2.2.15 ID-ELISA |
| 2.3 诱饵质粒的表达与自激活鉴定 |
| 2.3.1 诱饵质粒pBT-CMV 2b转化报告菌株 |
| 2.3.2 报告菌株表达细胞的制备 |
| 2.3.3 Western blot检测 |
| 2.3.4 大肠杆菌双杂交系统诱饵质粒的自激活鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pBT-CMW 2b诱饵质粒的构建与鉴定 |
| 3.1.1 CMV 2b编码区PCR扩增 |
| 3.1.2 重组质粒pBT-CMV 2b酶切鉴定 |
| 3.1.3 诱饵质粒pBT-CMV 2b的DNA序列分析 |
| 3.2 λcI多克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 λcI编码区PCR扩增 |
| 3.2.2 重组质粒pET-32-λcI双酶切和测序鉴定 |
| 3.2.3 重组表达质粒pET-32-λcI诱导表达 |
| 3.2.4 ID-ELISA验证效价 |
| 3.3 诱饵质粒的表达与自激活鉴定 |
| 3.3.1 pBT-CMV 2b的表达鉴定及λcI抗血清的应用 |
| 3.3.2 诱饵质粒pBT-CMV 2b自激活作用检测 |
| 第四部分 讨论与结论 |
| 1 讨论 |
| 1.1 2b蛋白的研究 |
| 1.2 pDEST~(TM)32-CMV 2b诱饵质粒的构建与自激活 |
| 1.2.1 pDEST~(TM)32-CMV 2b诱饵质粒的构建 |
| 1.2.2 诱饵质粒pDEST~(TM)32-CMV 2b自激活鉴定 |
| 1.3 pBT-CMV 2b诱饵质粒的构建与自激活鉴定 |
| 1.3.1 pBT-CMV 2b诱饵质粒的构建 |
| 1.3.2 诱饵质粒pBT-CMV 2b的表达鉴定 |
| 1.3.3 诱饵质粒pBT-CMV 2b的自激活检测 |
| 1.4 两种诱饵质粒构建的比较 |
| 1.5 cDNA文库的构建 |
| 2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 缩略词 |
| 附录B 常用试剂及缓冲液的配制 |
（7）烟草黄瓜花叶病毒病抗性遗传分析及其分子标记（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 黄瓜花叶病毒的研究进展 |
| 1.1.1 CMV 的病原学研究 |
| 1.1.2 CMV 的生物学特性 |
| 1.1.3 黄瓜花叶病毒的株系划分 |
| 1.1.4 烟草黄瓜花叶病毒的抗源的筛选及利用 |
| 1.2 分子生物学在烟草黄瓜花叶病毒病抗性研究中的应用 |
| 1.2.1 基因在烟草黄瓜花叶病毒病抗性中的应用 |
| 1.2.2 分子标记在烟草中的应用 |
| 1.3 本研究的目的意义及主要内容 |
| 1.3.1 目的和意义 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 第二章 烟草 CMV 的抗性鉴定及遗传分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验地点 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 供试材料 CMV 抗性鉴定结果 |
| 2.2.2 CMV 抗性遗传性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 抗病性鉴定方法和抗性标准 |
| 2.3.2 烟草对 CMV 的抗性遗传规律 |
| 2.3.3 烟草 CMV 的抗源及其在育种上的应用 |
| 第三章 烟草 SSR 反应体系的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 烟草总 DNA 提取和浓度测定 |
| 3.1.3 PCR 反应因素水平的确定与正交试验的设计 |
| 3.1.4 PCR 扩增 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 正交试验结果与分析 |
| 3.2.2 各因素对 PCR 反应影响的差异分析 |
| 3.2.3 因素内各水平对 PCR 结果的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 反应体系的优化 |
| 3.3.2 循环条件及退火温度 |
| 3.3.3 正交设计优化体系的优缺点 |
| 第四章 烟草抗 CMV 的 SSR 分子标记 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验设计 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 基因组 DNA 的提取 |
| 4.2.2 烟草 CMV 抗性基因的 SSR 标记筛选 |
| 4.2.3 多态性片段的回收与测序 |
| 4.2.4 二次点样 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 DNA 的提取 |
| 4.3.2 与抗病基因相连锁的标记的筛选 |
| 4.3.3 分子标记辅助育种在烟草抗病育种中的应用 |
| 4.3.4 二次点样 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）农杆菌介导甘蔗ACC氧化酶基因的遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 ACC氧化酶与乙烯的生物合成 |
| 1.1.1 乙烯的生物合成途径 |
| 1.1.2 植物ACO基因及其分子生物学研究 |
| 1.2 乙烯对甘蔗生长发育的调控 |
| 1.2.1 乙烯利在甘蔗生产上的应用 |
| 1.2.2 乙烯对甘蔗生长发育的生理生化研究 |
| 1.3 甘蔗转基因技术 |
| 1.3.1 实现甘蔗遗传转化的方法 |
| 1.3.2 甘蔗遗传转化的国内外研究现状 |
| 1.3.3 影响遗传转化成功与否的因素 |
| 1.4 本研究的目的意义及内容 |
| 2 甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 质粒与菌种 |
| 2.1.3 酶与试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 甘蔗ACO基因编码区cDNA序列的克隆 |
| 2.2.2 甘蔗ACC氧化酶正、反义基因植物表达载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RNA的完整性 |
| 2.3.2 PCR产物的鉴定 |
| 2.3.3 甘蔗ACO cDNA的序列比较 |
| 2.3.4 甘蔗ACC氧化酶cDNA植物表达载体的鉴定和分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 农杆菌介导甘蔗ACC氧化酶正、反义基因遗传转化烟草研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 根癌农杆菌的转化与鉴定 |
| 3.2.2 烟草叶片组织对卡那霉素的敏感性 |
| 3.2.3 转基因烟草植株的获得及其性状表现 |
| 3.2.4 农杆菌介导烟草转化效率 |
| 3.2.5 转基因植株的PCR鉴定 |
| 3.2.6 转基因植株的Dot-Southern检测 |
| 3.2.7 转正、反义甘蔗ACO基因烟草叶片乙烯释放量的测定 |
| 3.3 讨论 |
| 4 农杆菌介导ACC氧化酶反义基因遗传转化甘蔗初步研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 甘蔗胚性愈伤组织的诱导 |
| 4.2.2 甘蔗对G418的敏感性 |
| 4.2.3 农杆菌介导法转化甘蔗的结果 |
| 4.2.4 抗性植株的PCR检测 |
| 4.3 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.2 后续研究 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
（9）西番莲（Passiflora Linn.）种质资源遗传多样性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 生物多样性 |
| 1.2 遗传多样性 |
| 1.3 遗传多样性的检测方法 |
| 1.4 西番莲种质资源的研究 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 西番莲种质资源的ISSR分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.3 数据统计与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 第4章 西番莲部分种质形态学性状分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 形态学和ISSR标记技术用于种质资源遗传多样性研究的可行性分析 |
| 5.2 西番莲种质资源遗传多样性评价方法的比较 |
| 5.3 分子标记和形态标记聚类结果的比较 |
| 5.4 产量和品质性状的相关性分析 |
| 5.5 因子分析 |
| 5.6 分组分析的可行性 |
| 5.7 西番莲种质资源保存建议 |
| 第6章 结论 |
| 6.1 西番莲种质资源的ISSR分析 |
| 6.2 西番莲种质资源的形态学分析 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的论文 |
（10）芋艿病毒病及其防治对策（论文提纲范文）
| 1 芋艿病毒病的主要种类及其特征 |
| 1.1 芋花叶病毒 |
| 1.2 芋脉褪绿病毒 |
| 1.3 芋杆状病毒和芋羽状斑驳病毒 |
| 2 芋艿病毒病的重要防治措施 |
| 2.1 建立病毒诊断或检定技术 |
| 2.2 抗病品种的培育和应用 |
| 2.3 建立健康种苗生产体系 |
| 2.4 其他防治措施 |
四、CMV-Pf-CP基因表达载体的构建及转化西番莲(Passiflora edulis)的研究（论文参考文献）
- [1]西番莲脱分化再生体系研究[J]. 陆珍,黄诚梅,魏源文,邓智年,曹辉庆,吴凯朝,罗海斌,蒋胜理,徐林. 中国果树, 2019(06)
- [2]西番莲快繁体系建立及脱毒技术研究[D]. 焦楠. 福建农林大学, 2019(04)
- [3]西瓜花叶病毒遗传多样性及长距离移动决定因子研究[D]. 冀树娴. 山东农业大学, 2019(01)
- [4]西番莲病毒病害研究进展[J]. 严佳文,袁启凤,彭志军,王立娟,解璞,陈楠,马玉华. 热带农业科学, 2018(04)
- [5]中国淮山药病毒病调查、诊断和病原病毒分子生物学的研究[D]. 邹承武. 广西大学, 2014(03)
- [6]CMV 2b蛋白与寄主互作研究中诱饵质粒的构建[D]. 王小明. 海南大学, 2010(01)
- [7]烟草黄瓜花叶病毒病抗性遗传分析及其分子标记[D]. 范静苑. 中国农业科学院, 2009(11)
- [8]农杆菌介导甘蔗ACC氧化酶基因的遗传转化研究[D]. 董伟清. 广西大学, 2008(01)
- [9]西番莲（Passiflora Linn.）种质资源遗传多样性研究[D]. 冷言峰. 西南大学, 2008(09)
- [10]芋艿病毒病及其防治对策[J]. 潘晓,何伯伟,陈敏智,毛碧增. 长江蔬菜, 2006(06)