一、导致宫颈癌的病毒可诱发口腔癌（论文文献综述）
李瑾[1]（2021）在《HIV感染者早期口腔唾液微生物组的变化研究》文中进行了进一步梳理人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）感染仍然是一个重大的全球公共卫生问题。口腔机会性感染是HIV感染最早期的症状之一,临床上常作为口腔医生发现可疑HIV感染者的指导依据。研究发现HIV感染机体后,机体免疫功能受到严重损伤,口腔唾液微生态亦发生明显紊乱,加重口腔感染。临床上可在治疗早期,通过血液免疫指标评估机体免疫状况,指导临床治疗方案,判断疾病预后和评估治疗效果。然而血液检测具有创伤性和危险性,不易被患者接受。因此,寻找更加简便、无创的生物学指标具有十分重要的意义。唾液作为体液的一种,包含了人体多种微生物,且取材方便、无创伤。因此,本课题组运用高通量测序的方法,研究口腔唾液微生物在HIV感染者与HIV未感染之间的差异（第一部分）,纵向观察HIV感染者抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral therapy,ART）前后唾液微生物的动态变化,并与血液中的免疫因子进行相关性分析（第二部分）,从而寻找可代替血液指示机体免疫状况、预测治疗效果的无创生物学指标,为HIV感染的诊断和免疫状态监测提供新的思路。第一部分HIV感染者和HIV未感染者口腔唾液微生物菌群的多样性比较差异分析目的:本部分实验目的是检测HIV感染者早期和HIV未感染者之间口腔唾液微生物组成和结构的差异,寻找区分HIV感染和HIV未感染的唾液微生物标记物。方法:纳入20例近一年内未行ART治疗的新发HIV感染者和20例性别年龄配对的HIV未感染者为研究对象,收集其口腔非刺激性唾液样本进行DNA提取,设计16S r RNA V3-V4区引物进行PCR扩增,采用Illumina Mi Seq平台对扩增产物进行高通量测序,在不同的分类学水平分析HIV感染者与HIV未感染者之间口腔唾液微生物菌群的差异。结果:1.数据经过质控和物种注释后共得到1845904条有效序列,27个门,47个纲,89个目,155个科,367个属,671个种。2.厚壁菌门,拟杆菌门,变形菌门,放线菌门,梭杆菌门,Sacccharibacteria和螺旋体门七个主要的门物种占据唾液细菌微生物总量的98%。3.HIV感染者和HIV未感染者之间Alpha多样性指数未见明显差异。4.组间物种差异分析显示:在门水平,HIV感染者唾液微生物螺旋体门显着增加（P=0.01829）,变形菌门显着降低（P=0.006218）;在属水平,HIV感染者中链球菌属丰度显着高于HIV未感染者（P=0.00114）,而奈瑟菌属丰度显着降低（P=0.001959）。5.线性判别分析效应大小（Linear discriminant analysis effect size,LEf Se）多级物种差异分析结果显示:在属水平,链球菌属,普雷沃菌属1,产线菌属,欧式菌属,无胆甾原体属,依赖杆菌属等菌属在HIV感染者中显着富集,而奈瑟菌属和博斯氏菌属在HIV未感染者中显着富集。结论:HIV感染者早期口腔唾液微生物失衡,唾液微生物链球菌属增加和奈瑟菌属降低。链球菌属和奈瑟菌属是区分HIV感染者和HIV未感染者的潜在唾液微生物标记物。第二部分HIV感染者ART治疗前后口腔唾液微生物菌群的动态变化与血液免疫因子间的相关性分析目的:本部分实验目的纵向观察HIV感染者ART治疗前后唾液微生物的动态变化,并与血液中的免疫指标进行相关性分析,寻找可代替血液、指示机体免疫状况、预测治疗效果的无创生物学指标。方法:随访HIV感染者ART治疗3个月和6个月,收集其口腔非刺激性唾液样本进行DNA提取和PCR扩增,采用Illumina Mi Seq平台对扩增产物进行高通量测序,从不同的分类学水平分析HIV感染者ART治疗前后唾液微生物的动态变化以及与HIV未感染者之间的差异,分析唾液微生物与血液免疫指标CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量（Viral Load,VL）之间的相关性。结果:1.数据经过质控和物种注释后共得到3440992条有效序列,31个门,56个纲,113个目,189个科,451个属,797个种。2.HIV感染者口腔唾液微生物Alpha多样性在ART治疗3个月后未见明显改变,但在ART治疗6个月后显着降低。3.组间物种差异分析显示:ART治疗3个月后唾液微生物未见明显改变;ART治疗6个月后,在门水平,与HIV感染者ART治疗前相比,变形菌门的相对丰度显着增加（P=0.045）,拟杆菌门的相对丰度显着降低（P=0.045）。在属水平上,HIV感染者ART治疗6个月后,nornankfCaulobacterace相对丰度显着增加（P=0.0006728）,放线菌属和拟普雷沃菌属相对丰度显着降低（P=0.03389,P=0.01079）。4.ART治疗后,HIV感染者口腔唾液中多数微生物物种发生动态变化趋向HIV未感染者,但不能完全恢复正常。5.ART治疗后,CD4+T淋巴细胞计数升高和VL降低;相关性分析发现,普雷沃菌属7,奈瑟菌属和嗜血杆菌属与CD4+T细胞计数呈现负相关（r=-0.4797,P=0.03233;r=-0.4572,P=0.04272;r=-0.4889,P=0.02877）;奈瑟菌属与VL呈现正相关（r=0.4511,P=0.04588）。结论:ART治疗后,HIV感染者口腔唾液多数微生物物种发生动态变化趋向HIV未感染者,但不能完全恢复正常。唾液微生物奈瑟菌属是一个潜在标记物替代血液指标来指示HIV感染者机体免疫状况和预测治疗效果。
朱俐[2]（2019）在《基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究》文中提出宫颈癌是全球女性中第四大常见的癌症,已有研究表明持续性感染高危型人乳头瘤状病毒（HPV）病毒是宫颈病变的必要条件。早期感染HPV不会产生任何症状,这是因为HPV L1蛋白是保护性抗原,可激发人自身的免疫系统而清除病毒,又因为HPV L1蛋白是晚期产生的蛋白,主要存在病毒复制期,所以检测HPV L1蛋白能反应患者的免疫状态和HPV DNA是否整合到宿主基因组,从而判断病情发展趋势以及是否能引起恶性病变。不同宫颈癌变的级别与HPV感染型别存在一定差异,人们常常根据患者携带病毒的量来辨别病情,预测宫颈恶性病变的风险,因此当已经确证持续感染HPV后,我们既要根据感染HPV的型别,又要根据患者携带病毒的量,来评判和预测与HPV病毒有关疾病的发展趋势,做到早预防早治疗,降低发病率和死亡率。综上HPV分型检测对早期宫颈癌的筛查起着重要作用,而检测HPV L1蛋白对宫颈疾病发展趋势的预测和HPV感染治疗的预后都具有很大的参考意义,二者结合起来对临床诊断更具实用价值。同时进行HPV分型和HPV L1蛋白检测可弥补彼此的缺点,临床上可极大降低漏诊误诊率,提高恶性病变诊断和预测的准确性,最大程度减少患者的损失。本论文基于纳米材料特性采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI TOF MS）建立高危HPV16、18分型检测方法及HPV16 L1蛋白检测方法,方法具有较高的灵敏度,并且分析速度快,经济高效,应用于临床样本的检测取得良好的结果。1.通过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）偶联反应成功将精胺（SP）修饰到纳米金刚石（NDs）上。通过比较修饰后100 nm和5 nm两种纳米金刚石,发现5 nm的纳米金刚石具有更大的比表面积,修饰效果较好。SP-NDs由于表面覆有大量精胺,精胺在酸性条件显现多胺的特性可带正电,可以通过静电有效地吸引带负电荷的DNA磷酸骨架,研究发现SP-NDs对寡核苷酸具有优异的吸附效果（184 mg/g）,研究还发现SP-NDs不仅可以在稀溶液中提取和富集寡核苷酸,而且可以从复杂基体中,如十二烷基苯磺酸钠和尿素溶液中提取寡核苷酸,是寡核苷酸的优异固体吸附剂。2.聚合酶链式反应（PCR）产物直接用MALDITOF MS检测受限于两个方面,一是寡核苷酸的分子量太大MALDI检测不到,二是PCR缓冲溶液中含有酶和盐,抑制寡核苷酸的电离,需要复杂的除盐纯化过程。针对第一个问题,我们采用巢式PCR扩增嵌入内切酶位点,通过限制性内切酶酶切成短的寡核苷酸片段,每种HPV型别可酶切出六种不同小分子量的DNA片段,这不但能让MALDI检测到而且对检测结果的分析判断增加了可靠性。针对第二个问题,我们采用第一章合成的纳米材料SP-NDs提取酶切的HPV六种小分子量DNA片段,我们研究发现,SP-NDs不仅可以直接从PCR酶切产物中提取寡核苷酸,还可以从聚合酶链式反应-限制性片段质量多态性（PCR-RFMP）的酶消化产物中选择性地提取HPV特异性DNA片段,提取后的基因片段用MALDI TOF MS检测可区别HPV的型别,该方法成功地应用于临床样品分析并取得了良好的结果。SP-NDs作为固相吸附剂,用于MALDI分析前提取纯化寡核苷酸,替代电泳或液相色谱的纯化方法,避免了传统的纯化步骤,简化了分析过程且提高了灵敏度。基于PCR-RFMP方法,用SP-NDs富集、提取和分离寡核苷酸后,MALDI MS还能够分析DNA甲基化、单核苷酸多态性和其他病毒分型。3.基于金纳米颗粒（AuNPs）上的HPV16 L1核酸适配体（APTHPV16 L1）和质量标签（三聚氰胺）之间的非共价竞争吸附,建立了激光解吸电离质谱（LDI MS）检测HPV16 L1蛋白的新方法。在我们的设计中,APTHPV16 L1与三聚氰胺竞争占据AuNPs表面的非共价作用位点,当APTHPV16 L1存在时,会优先占据AuNPs表面的非共价作用位点,检测不到AuNPs表面存在三聚氰胺。随着HPV16 L1蛋白的加入,HPV16 L1蛋白与APTHPV16 L1之间存在特异性更强的相互作用,导致APTHPV16 L1从AuNPs的表面脱落,暴露出的反应位点被三聚氰胺所占据,经离心洗涤后采用LDI-TOF MS直接检测三聚氰胺信号,AuNPs表面三聚氰胺的质谱信号强弱反映了HPV16 L1蛋白含量的多少。采用内标法定量,HPV16 L1蛋白在2～80 ng/mL的范围内成线性关系,相关系数0.998,检出限（LOD=3SD空白/斜率）为58.8 pg/mL,该方法成功用于检测临床和疫苗样本中HPV16 L1蛋白,具有高灵敏度、高通量的优点,有望应用于宫颈癌的早期临床诊断和预后情况的判断。4.在高盐条件下氧化石墨烯（GO）吸附核酸适配体增强了 GO胶体溶液的稳定性,当溶液中加入目标物HPV16 L1蛋白后,核酸适配体与目标物特异性结合并从GO表面脱离,暴露的GO在高盐下聚集,导致230 nm处溶液吸光度发生变化。我们发现,吸光度与HPV16 L1蛋白浓度的对数成线性关系,以此建立了紫外吸光光度法定量检测HPV16 L1蛋白的方法。本方法耗时短,灵敏度高,试剂消耗少,具有较好特异性,方法回收率在87%～102%,检出限可达2 pg/mL,仅用简单的紫外分光光度计即可检测HPV16 L1蛋白浓度,其对临床样本的检测结果与用酶联免疫吸附测定（ELISA）以及第四章所述方法的检测结果完全一致。该研究的创新点是不用荧光标记的核酸适体,从而避免了荧光的漂白。我们根据GO本身的光学性质开发的灵敏、简单、快速、低成本的分析HPV16 L1蛋白方法,具有替代常规检测HPV16 L1蛋白方法的应用前景。
陈欣[3]（2019）在《淫羊藿素诱导人宫颈癌细胞凋亡及其机制的研究》文中认为宫颈癌主要是由人乳头瘤病毒持续感染引起的癌症,主要包括宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌。虽然早、中期患者通过手术治疗多数预后良好,但晚期和复发患者的治疗效果仍有限,因此急需开发新型治疗方法和药物。近年的研究发现,细胞在恶性转化过程中,产生了许多生化通路的改变,这些癌细胞高度依赖、而正常细胞依赖程度低的生化特征可能是癌细胞的脆弱点,因此可用于对其进行选择性攻击。临床实践及实验研究都证明,癌细胞比正常细胞对ROS更敏感,进一步升高癌细胞的ROS或削弱其抗氧化能力被认为是有效的抗癌方式。淫羊藿是药用价值极高的传统中药,其主要活性成分是淫羊藿苷（Icariin）和淫羊藿素（Icaritin）等。大量研究证明淫羊藿素能诱导多种癌细胞发生凋亡,其机理被认为与JAK/STAT、MAPK或PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制有关。但以上信号通路的抑制与癌细胞凋亡同时发生,其原因-后果关系有待确定。一些研究观察到淫羊藿素处理的癌细胞中ROS水平显着升高并伴随细胞凋亡,但ROS与细胞凋亡之间的因果关系或ROS如何激活凋亡等尚不清楚。为此,本研究对淫羊藿素抑制宫颈腺癌细胞株HeLa和鳞状上皮细胞癌细胞株SiHa的效果以及ROS在其抗癌活性中的作用进行了探讨。首先,MTT实验显示淫羊藿素处理48小时后,HeLa和SiHa两种癌细胞的生长均受到显着抑制(IC50分别为12.5和17μM),而非恶性的CCD?1095Sk成纤维细胞和HEK293人胚肾上皮细胞则只受到轻微影响,说明淫羊藿素对癌细胞有选择性毒性。其次,淫羊藿素处理HeLa和SiHa细胞3小时后,细胞内ROS水平即已显着升高,而用N-乙酰半胱氨酸（NAC）阻断ROS升高后,淫羊藿素的抑制作用即基本消失,说明淫羊藿素引起的ROS升高是其对HeLa和SiHa细胞选择性毒性的基础。接下来的碱性彗星电泳实验表明淫羊藿素处理12小时后,HeLa和SiHa细胞内DNA断裂数量显着上升,加入OGG1 DNA糖苷酶后DNA断裂数进一步升高,而NAC处理阻止了淫羊藿素所致DNA断裂的上升,说明淫羊藿素处理所致ROS升高引起了显着的DNA氧化损伤,由此导致了大量DNA链断裂。免疫荧光染色发现淫羊藿素处理6小时后γH2AX和53BP1阳性细胞数均显着增多,用NAC处理后显着减少,进一步证明淫羊藿素处理引起了大量DNA损伤并激发了DNA损伤反应（DDR）。Western blot检测发现CDC25C-pS216随淫羊藿素处理浓度的加大而升高,而CDK1-pT14水平下降。流式细胞术检测发现淫羊藿素处理HeLa和SiHa细胞24小时后,发生了G2/M期细胞周期阻滞,NAC处理阻断了CDC25C和CDK1蛋白的变化以及G2/M期周期阻滞,显示DNA损伤反应激活了G2/M细胞周期检验点且与淫羊藿素所致ROS有关。Western blot检测同时显示活化的caspase 3和caspase 9以及Bax蛋白随淫羊藿素处理浓度的加大而升高,而Bcl-2和XIAP蛋白下降;流式细胞术和线粒体膜电位检测发现淫羊藿素处理HeLa和SiHa细胞后,凋亡细胞比例呈时间依赖性增加,而NAC处理降低了凋亡蛋白的变化以及凋亡细胞数的上升,显示ROS所致DNA损伤反应同时激活了细胞凋亡。此外,qRT-PCR和Western blot检测结果表明淫羊藿素处理前后HPV E6和E7基因的转录和蛋白水平均无明显改变,提示淫羊藿素对HeLa和SiHa的细胞毒性与HPV病毒基因的表达无关。为了系统地分析淫羊藿素对宫颈癌细胞的作用机理,药物刺激前后HeLa细胞蛋白质组学的变化以同位素二甲基标记和串联质谱技术进行测定。通过对蛋白质提取,分离及质谱鉴定,共同定量到716种蛋白质,药物刺激后,14种蛋白质显着上调,62种蛋白质显着下调。利用生物信息学方法对差异蛋白质进行系统整理与分析。发现差异表达蛋白主要涉及12种分子功能;参与细胞过程调节及刺激应答相关蛋白质数目较多;差异表达蛋白多集中于细胞质、细胞核和外泌体;参与癌症通路等,检测到细胞凋亡相关蛋白基因数6个。印证了淫羊藿素最终诱发宫颈癌细胞内源凋亡途径。为支持淫羊藿素的开发,以计算机辅助的虚拟筛选技术对淫羊藿素的成药性和毒理学性质进行了分析。结果预测淫羊藿素具有很好的水溶性和肠道吸收性;其血浆蛋白结合率小于90%,具有很高的血脑屏障通透性;毒理学性质分析预测淫羊藿素的致突变性和致癌性低,且有良好的ADMET性质。通过本研究,进一步揭示了淫羊藿素的抗癌机理,预测了其具有良好的成药性,为淫羊藿素开发提供了重要数据和参考信息。
郑雨虹[4]（2019）在《miR-218对HPV联合MNNG致Het-1A细胞恶性转化的作用研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:食管癌的发生是机体内因和外因多因素综合作用的结果。环境危险因素相关研究显示,亚硝胺类化合物暴露和人类乳头瘤病毒（HPV）感染与食管癌发生密切相关。在食管癌的多种致癌机制研究中,微小RNA（microRNA,miRNA）作为一种表观遗传调控方式近年来成为研究热点。本课题组在淮安食管癌高发区的前期研究结果显示,食管癌患者癌组织和癌旁组织中存在一组表达紊乱的miRNA,其中miR-218表达显着下调。本研究应用课题组构建的HPV联合MNNG致食管细胞恶性转化模型,观察miR-218对恶转细胞生物学行为的影响,并对恶转细胞进行转录组学分析,探索miR-218的靶基因及其参与的信号转导通路,初步分析miR-218在HPV联合MNNG致食管癌发生过程中可能发挥的作用。方法与结果:一、miR-218对食管癌细胞及食管恶转细胞生物学行为的影响采用RT-qPCR法检测食管癌细胞（EC109/EC9706/KYSE510）、永生化食管上皮细胞（Het-1A）以及恶转过程中四组细胞不同代数miR-218表达水平;以EC109和恶转细胞为靶细胞,分别转染miR-218 mimic,并进行相应的生物学行为检测;CCK-8法和细胞平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;Transwell迁移和侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力;流式细胞术检测细胞的周期和凋亡情况。本研究中应用课题组已构建的HPV联合MNNG致食管细胞恶性转化模型（恶转细胞）,细胞培养至35代,经裸鼠成瘤实验证实已发生恶性转化。根据处理方式的不同分为以下四组:HPV18转染组（HPV组）、空载体质粒转染组（对照组）、HPV与MNNG联合作用组（HPV+MNNG组）、MNNG染毒组（MNNG组）。1.miR-218对食管癌细胞EC109生物学行为的影响1.1 miR-218在三种食管癌细胞（EC109/EC9706/KYSE510）中的表达均低于永生化食管上皮细胞（Het-1A）（P<0.05）。1.2 CCK-8结果显示,转染miR-218 mimic（miR-218组）的EC109细胞增殖活性低于阴性对照组（miR-NC组）（P<0.05）。细胞平板克隆形成实验结果显示,miR-NC组和miR-218组细胞克隆率分别为（20.57±0.59）%、（9.57±0.95）%（P<0.05）。1.3 Transwell迁移实验结果显示,miR-NC组和miR-218组穿透微孔膜的细胞数分别为156.67±7.64、77.67±6.81（P<0.05）;Transwell侵袭实验结果显示,miR-NC组和miR-218组穿过的细胞数分别为268.33±7.64、79.00±7.94（P<0.05）。1.4 AnnexinV-PI双染检测结果显示,miR-218组的凋亡率（12.06±0.46）%高于miR-NC组（10.40±0.97）%（P<0.05）。2.miR-218对食管恶转细胞生物学行为的影响2.1恶转过程中miR-218表达情况如下:25代之前,四组细胞中miR-218表达水平与0代相比,基本保持不变;25代之后,HPV+MNNG组和MNNG组细胞中miR-218表达水平迅速上升;40代之后,miR-218在四组细胞中的表达均呈下降趋势。2.2 CCK-8结果显示,miR-218 mimic转染24h时,miR-NC组和miR-218组恶转细胞活性分别为1.45±0.02、1.42±0.14,差异无统计学意义（P>0.05）;转染48h时,miR-218组细胞活性（1.99±0.18）低于miR-NC组（2.33±0.05）（P<0.05）。2.3 Transwell迁移实验结果显示,miR-NC组和miR-218组穿透微孔膜的细胞数分别为85.33±5.03、54.33±5.13（P<0.05）;Transwell侵袭实验结果显示,miR-NC组和miR-218组穿过的细胞数分别为207.67±7.77、151.67±7.64（P<0.05）。2.4细胞周期分析结果显示,miR-218组和miR-NC组S期细胞所占比例分别为（34.15±1.09）%、（24.57±1.07）%（P<0.05）,G2期分别为（27.01±1.51）%、（36.24±2.17）%（P<0.05）。2.5 AnnexinV-PI双染检测结果显示,miR-NC组和miR-218凋亡率分别为（15.23±0.41）%、（14.29±0.58）%,差异无统计学意义（P>0.05）。二、miR-218在食管细胞恶性转化中的作用机制采用Illumina测序技术对恶转细胞进行转录组学测序,对差异表达基因进行GO功能注释和Pathway分析,使用STRING数据库分析差异表达基因之间的互作关系,互作网络由Cytoscape软件实现可视化。应用miRNAs靶基因预测软件（TargetScan/Pictar/miRDB）对miR-218功能靶基因进行预测,采用RT-qPCR、Western Blot和双荧光素酶报告基因实验对miR-218靶基因进行验证。1.恶转细胞的转录组学分析1.1 DEGs分析结果显示,与对照组相比,HPV+MNNG组差异表达基因604个,MNNG组2462个,HPV组247个。1.2 GO分析结果显示,与对照组相比,HPV+MNNG组差异基因主要富集到对病毒的防御反应、细胞趋化性等,MNNG组差异基因主要富集在血管形态发生、血管再生等肿瘤形成过程,HPV组差异基因富集在炎症反应过程,如中性粒细胞趋化性、对I型干扰素的反应、细胞因子活性。1.3 KEGG信号通路分析显示,与对照组相比,HPV+MNNG组差异基因主要富集在TNF signaling pathway、Influenza A、NF-kappa B signaling pathway,MNNG组差异基因主要富集与在肿瘤发生直接相关的信号通路,如Pathways in cancer,HPV组差异基因富集在IL-17 signaling pathway。1.4差异基因的蛋白互作网络图中基因的节点大小与其产物作用能力大小呈正相关。与对照组相比,HPV+MNNG组差异基因中EGR1、JUN、FOS、IL8、TNF的节点较大,MNNG组中基因JUN、FOS、FYN、SMAD3的节点较大,HPV组中基因EGR1、JUN的节点较大,提示以上基因产物的作用能力较大。2.miR-218靶基因筛选及验证2.1采用miRNA靶基因预测软件（TargetScanHuman7.2/miRDB/Pictar）对miR-218靶基因进行在线预测,取这三个软件预测结果的交集,得到134个靶基因。2.2 HPV+MNNG组差异表达基因604个,与上述134个靶基因再次取交集,最终获得7个基因（ELMO1,NPAS2,ITM2C,GAB2,CNTNAP2,MDGA1,SOCS3）。2.3采用生物信息数据库GeneAnalytics对以上7个基因进行GO功能注释和Pathway分析,发现其中4个基因（ELMO1,NPAS2,GAB2,SOCS3）参与肿瘤发生发展的多个环节,进一步查阅肿瘤相关文献,最终确定两个与肿瘤关系最为密切的基因,即GAB2和SOCS3。2.4 RT-qPCR和Western Blot结果显示,转染miR-218 mimic可降低GAB2、SOCS3在mRNA和蛋白水平上的表达。双荧光素酶报告基因实验结果显示,GAB2-WT+miR-218 mimic转染组荧光素酶活性与GAB2-WT+miR-NC转染组和GAB2-MUT+miR-218 mimic转染组相比,分别减少了52.44%和48.68%,从而表明在恶转细胞中GAB2是miR-218的直接靶基因。3.miR-218通过靶向GAB2调控SHP2/ERK和Akt/mTOR通路3.1 CCK-8结果显示,恶转细胞转染si-GAB2（si-GAB2组）72h和96h后细胞增殖活性低于阴性对照组（P<0.05）。3.2 Transwell迁移实验结果显示,si-NC组和si-GAB2组穿透微孔膜的细胞数分别为47.33±1.53、16.67±1.52（P<0.05）;Transwell侵袭实验结果显示,si-NC组和si-GAB2组穿过的细胞数分别为38.00±1.00、16.00±1.00（P<0.05）。3.3采用Western Blot法检测SHP2/ERK和Akt/mTOR通路中关键蛋白的表达水平。结果显示,恶转细胞转染si-GAB2后,SHP2/ERK通路中SHP2、ERK、p-ERK蛋白表达量减少,Akt/mTOR通路中的Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平下降。三、人群HPV感染及miR-218表达水平分析采用ELISA方法对血浆中HPV感染状况进行定性检测,miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒提取血浆总RNA,RT-qPCR对血浆中miR-218和GAB2的表达水平进行检测。1.ELISA检测结果显示,50例病例中有3例HPV为阳性,阳性率为6%,50例对照HPV均为阴性（P>0.05）。2.RT-qPCR结果显示,与对照相比,食管癌患者血浆中miR-218的表达水平呈下降趋势（P>0.05）,而GAB2相对表达水平较高,其表达量相当于对照组的2.86倍（P<0.05）。结论:1.miR-218在食管癌细胞中低表达;过表达miR-218可抑制食管癌细胞EC109的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。2.过表达miR-218可抑制食管恶转细胞的增殖、迁移和侵袭,阻滞细胞在S期。3.HPV+MNNG组差异基因主要富集在TNF signaling pathway、Influenza A、NF-kappa B signaling pathway,MNNG组富集在Pathways in cancer、Basal cell carcinoma等与肿瘤发生直接相关的信号通路,HPV组富集在IL-17信号通路。4.食管恶转细胞中GAB2是miR-218的直接靶基因之一。5.HPV联合MNNG致食管上皮细胞恶性转化中,miR-218可能是通过靶向调控GAB2的表达,进而激活GAB2下游相关信号转导通路SHP2/ERK和Akt/mTOR,参与调控细胞恶性转化过程。
庄琢琛[5]（2019）在《甲基亚硝胺吡啶基丁酮与HPV18 E6E7的协同致癌作用研究》文中指出甲基亚硝胺吡啶基丁酮（NNK）是一种重要的烟草特异亚硝胺（TSNA）,能够诱发实验动物肺、食管和口腔等部位的恶性肿瘤,NNK进入体内后在细胞色素P450的作用下代谢活化并进一步导致DNA损伤是其导致癌症的关键步骤。感染人乳头瘤病毒（HPV）是食管癌和宫颈癌发病的重要诱因,高风险型HPV18 E6/E7基因编码的E6/E7蛋白在HPV致癌过程中起关键作用。流行病学证据已表明HPV能与烟草烟雾产生协同致癌作用,这提示癌症的发生不是单一因素,明确不同致癌因子之间的协同致癌作用对揭示导致癌症的机制有重要意义。本研究对NNK与HPV18 E6E7的协同致癌作用进行了研究,进而为深入阐明食管癌、宫颈癌等吸烟和HPV感染相关癌症的防治提供新策略。本研究首先构建了含HPV18 E6E7基因的重组质粒p LVX-Puro E6E7,通过慢病毒包装方法转染人永生化食管上皮细胞SHEE,经嘌呤霉素抗性筛选得到稳定转染HPV18 E6E7的SHEE-E6E7细胞。同时使用p LVX-Puro空载体同样进行慢病毒转染SHEE细胞,得到SHEE-V细胞,作为后续实验的对照组。随后经RT-q PCR测定两细胞中的E6E7 m RNA含量,结果显示SHEE-E6E7细胞中的E6E7 m RNA水平显着上调,SHEE-V细胞几乎不表达E6E7,说明转染成功,为深入探究HPV18 E6E7基因与NNK的协同致癌作用奠定了基础。通过细胞克隆形成实验、Transwell细胞侵袭和迁移实验以及细胞划痕愈合实验对暴露于NNK的SHEE-E6E7细胞及SHEE-V细胞进行了研究,分析了NNK处理后两种细胞表型的变化。结果表明,NNK暴露可显着促进细胞迁移能力和增殖能力（p<0.01）,且SHEE-E6E7细胞的迁移、侵袭和克隆形成能力均显着高于SHEE-V细胞（p<0.01）,并在0-0.01 m M浓度范围内呈现出剂量依赖关系。这表明NNK能促进人食管上皮细胞的恶化,且与HPV18 E6E7呈现出明显协同作用。为进一步明确该协同机制,通过探究NNK导致细胞DNA损伤后形成4-羟基-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（HPB）的含量水平来研究NNK对细胞DNA损伤的影响。首先建立了HPB的高效液相色谱-电喷雾串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）定量检测的方法,采用选择反应扫描模式（SRM）检测HPB的m/z 166→106、m/z 166→134和m/z 166→79离子通道以及和[D4]HPB内标的m/z 170→106、m/z 170→136和m/z 170→79离子通道。通过方法学研究,表明该方法有良好的灵敏度（检出限为5 fmol、定量限为15 fmol）、稳定性（日内和日间RSD均小于5%）和准确性（加标回收率70.6%-80.7%）。然后,基于以上定量方法对NNK导致细胞DNA损伤后释放的HPB进行了定量分析。采用不同浓度NNK（0.001、0.01、0.1、1和2 m M）处理SHEE-E6E7和SHEE-V细胞后,经DNA提取、酸性水解、固相萃取纯化和浓缩收集后,再定量测定样品中的HPB。该结果显示,用不同浓度NNK处理后的SHEE-E6E7细胞中HPB水平均显着高于相应浓度NNK处理的SHEE-V细胞（p<0.01）。由此可见,HPV18 E6E7可促进SHEE细胞中NNK的代谢,使DNA损伤累积增加,为前述细胞实验的结果提供了合理依据。本研究构建了含HPV18 E6E7基因的SHEE-E6E7细胞及对照组SHEE-V细胞,通过细胞表型实验比较了暴露NNK对两细胞恶性变化的影响,并利用HPLC-ESI-MS/MS法对NNK造成两细胞DNA的损伤后而形成的HPB进行了定量测定,证明了NNK与HPV能够具备协同致癌作用,并确证了二者能够协同促进DNA损伤的累积。为阐明NNK与HPV的协同致癌作用机理提供了直接实验证据,而且对相关癌症的防治存在着重要意义。
马苗苗[6]（2019）在《中晚期宫颈鳞癌的临床特征与HPV特异性免疫反应的相关性研究》文中研究表明目的:1)分析中晚期宫颈鳞癌患者临床和病理特点,比较有无HPV感染患者临床和病理的差异,探讨HPV感染与患者淋巴结转移规律及预后特征。2)分析HPV16感染患者E1、E2蛋白抗原多肽特异性CTL免疫应答频率、强度与临床特征及预后的相关性,为宫颈癌治疗性疫苗研究提供参考依据。3)比较HPV16感染患者外周血和癌组织中CD4+、CD8+T细胞上CTLA-4、PD-1、Tim-3表达水平的差异及临床特征的相关性,分析PD-1、Tim-3共表达情况,探讨放射治疗过程中患者外周血中CTLA-4、PD-1、Tim-3表达水平的变化,为晚期宫颈癌患者联合免疫检查点抑制剂治疗提供理论基础。方法:1)收集2014年1月至2017年12月在新疆医科大学附属肿瘤医院住院治疗的中晚期宫颈鳞癌初治患者194例,记录患者基本临床病理特征、HPV感染状态及CT显示转移淋巴结情况,并对患者进行随访。2)选取第一部分研究中感染HPV16型的中晚期宫颈鳞癌患者66例和体检的60例HPV16阴性健康对照女性。使用EDTA抗凝管抽取治疗前患者和体检的健康女性外周肘静脉血15mL,分离出外周血中PBMC,采用ELISPOT试验检测患者和健康对照人群外周血T细胞对HPV16 E1、E2蛋白抗原多肽的特异性CTL免疫反应水平。3)选取HPV16型感染的中晚期宫颈鳞癌患者进行研究,共纳入63例。使用EDTA抗凝管采集患者治疗前、治疗中及治疗结束时外周肘静脉血15mL,使用活检钳采集患者入院治疗前的宫颈癌组织,分离外周血中PBMC和组织中的TIL。采用多色流式细胞技术检测外周血和癌组织中CD4+、CD8+T细胞上CTLA-4、PD-1和Tim-3的表达情况。结果:1)194例中晚期宫颈鳞癌患者中有155例检测到HPV阳性,39例患者检测HPV阴性,有淋巴结转移患者85例,无淋巴结转移患者109例。HPV阳性与阴性患者在SCC-Ag、有无淋巴结转移分组间比较,差异有统计学意义（P<0.05）;SCC-Ag在HPV阳性分组中表达量高于HVP阴性组,HPV阳性组中淋巴结直径高于HPV阴性组;淋巴结分站中一站HPV阳性率87.71%,二站HPV阳性率78.57%,三站HPV阳性率100%,第三站中HPV阳性率最高;HPV阳性患者的PFS、OS与阴性患者比较,差异有统计学意义（P<0.05）;HPV阳性并发生淋巴转移的患者与未发生淋巴结转移患者的PFS、OS比较,差异有统计学意义（P<0.05）。2)宫颈鳞癌患者HPV16 E1和E2抗原多肽的CTL免疫阳性反应频率高于健康对照人群,差异均有统计学意义（P<0.05）,患者HPV16 E1抗原多肽的CTL免疫阳性反应强度高于健康对照人群,差异均有统计学意义（P<0.05）;患者HPV16 E1特异性CTL反应频率在肿瘤分期、TSGF、淋巴结转移分组中比较,差异有统计学意义（P≤0.05）;单因素分析显示,年龄是患者PFS因素,HPV16 E1反应是影响患者PFS、OS因素;多因素分析显示,年龄、淋巴结转移是影响PFS的重要因素,HPV16E1反应是患者PFS、OS重要的影响因素;从生存曲线分析HPV16 E1阳性反应组患者PFS、OS好于HPV16 E1阴性组患者。3)感染HPV16型中晚期宫颈癌鳞患者外周血中以CD8+CTLA-4+T细胞免疫检查点分子表达量最高,宫颈癌组织中以CD8+PD-1+T细胞免疫检查点分子表达量最高;宫颈癌组织中CD4+、CD8+T细胞上PD-1、Tim-3的表达高于外周血,差异有统计学意义（P<0.05）;患者外周血中CD8+T细胞上CTLA-4的表达高于癌组织,差异有统计学意义（P<0.05）;相关性分析,外周血中CD4+、CD8+T细胞上PD-1和Tim-3的表达量随着组织中表达量的增高而增高,差异有统计学意义（P<0.05）;患者外周血中CD4+CTLA-4+T细胞在病理分级中分组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,外周血中CD4+Tim-3+T细胞在BMI、FIGO分期、有无淋巴结转移分组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;患者外周血中CD8+CTLA-4+T细胞在病理分级中比较,差异有统计学意义（P<0.05）,外周血中CD8+PD-1+T细胞表达量在肿瘤大小分组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,外周血中CD8+Tim-3+T细胞在病理分级、有无淋巴结分组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;癌组织中CD4+Tim-3+T细胞在BMI、FIGO分期分组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;癌组织中CD8+PD-1+T细胞表达量在肿瘤大小分组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;癌组织中CD8+Tim-3+T细胞在病理分级、肿瘤大小分组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。患者外周血和组织中CD4+、CD8+T细胞上,以PD-1+Tim-3-表达量最高,通过比较发现组织中PD-1+Tim-3+、PD-1+Tim-3-、PD-1-Tim-3+T细胞表量高于外周血,差异有统计学意义（P<0.05）;患者外周血中治疗前与治疗结束时CD4+T细胞上CTLA-4、PD-1、Tim-3免疫检查点分子表达量对比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1)存在HPV感染的中晚期宫颈鳞癌患者具有高SCC-Ag表达和易发生淋巴结转移的特点,宫颈鳞癌患者HPV感染与淋巴结转移规律相关,发生远处淋巴结转移的患者HPV阳性率更高,HPV阳性的患者PFS、OS差于HPV阴性患者,其中HPV阳性有淋巴结转移的患者预后更差,因此,有必要提高HPV感染宫颈癌患者抗肿瘤能力。2)中晚期宫颈鳞癌患者外周血中可以检测到HPV16 E1、E2特异性T细胞免疫反应,该免疫反应水平高于健康对照人群;HPV16 E1特异性T细胞免疫反应强度与肿瘤FIGO分期、TSGF、淋巴结转移相关,HPV16 E2特异性T细胞免疫反应强度只观察到与TSGF相关;HPV16 E1特异性T细胞免疫反应水平与患者的生存相关,HPV16 E1特异性T细胞阴性反应的患者PFS和OS更差,提示HPV16 E1蛋白可诱导宫颈鳞癌患者T细胞的免疫反应,可能是宫颈癌治疗的新的免疫靶点。3)宫颈鳞癌患者外周血和癌组织中均可检测到CD4+、CD8+T细胞表达CTLA-4、PD-1和Tim-3分子的表达;患者癌组织中CD4+、CD8+T细胞PD-1和Tim-3表达量高于外周血,外周血中CD4+、CD8+T细胞PD-1和Tim-3表达量随着癌组织中升高而升高;CD4+、CD8+T细胞表达的免疫检查点分子与BMI、病理分级、临床分期、肿瘤大小和淋巴结转移相关;患者外周血和癌组织中存在CD4+、CD8+T细胞PD-1和Tim-3共表达;放疗可引起患者机体免疫系统变化,放射治疗过程中CD4+T细胞表达的免疫检查点分子逐渐增加;为宫颈癌联合免疫检查点抑制剂治疗的使用提供指导意义。
马月,郑雨虹,赵超,刘冉,浦跃朴,尹立红[7]（2018）在《HPV联合MNNG对Het-1A细胞恶性转化的影响》文中进行了进一步梳理目的:探讨人乳头状瘤病毒（HPV）全长基因转染与N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）染毒联合作用对食管正常上皮Het-1A细胞恶性转化的影响,为食管癌的发病机制提供理论依据。方法:以Het-1A细胞为靶细胞,设4组,包括空载体转染对照组、转染HPV-18组（HPV）、MNNG染毒组（MNNG）、HPV与MNNG联合作用组（HPV+MNNG）,其中MNNG染毒剂量为2μmol/L,每代染毒1次,每次24h;选取第10代、20代及35代细胞进行形态学观察和功能学试验。采用CCK-8法检测各代各组细胞增殖活力,流式细胞术检测各代细胞周期分布,用增殖指数表示细胞的增殖状况。并采用AnnexinV-APC/PI双染法检测细胞凋亡,通过侵袭迁移能力以及软琼脂集落形成试验检测细胞恶性转化表型,最后通过裸鼠成瘤试验观察恶性转化细胞在体内的增殖状况。结果:随着染毒代数增加,HPV+MNNG组与MNNG组细胞形态发生了明显的改变,连接松散、细长、伴伪足。CCK-8检测结果与细胞周期检测结果一致,与对照组比较,HPV+MNNG组和MNNG组的细胞增殖活性出现了先升高再下降最后升高的趋势（P均<0.05）,且HPV+MNNG组细胞变化更明显。与MNNG单独作用组比较,HPV+MNNG联合作用组细胞的抗凋亡能力增强（P<0.05）。侵袭和迁移试验结果显示HPV+MNNG组穿膜细胞数均显着高于其他各组（P<0.05）,MNNG组次之;软琼脂集落形成试验中,HPV+MNNG组细胞集落形成率[（30.8±0.2）%]高于MNNG组[（27.1±0.3）%]（P<0.05）。HPV+MNNG组与MNNG组裸鼠成瘤率均为100%,瘤体大小无显着性差异。HPV单独作用组与对照组裸鼠未成瘤。结论:HPV与MNNG联合作用可致食管正常上皮细胞Het-1A恶性转化,使细胞增殖能力、抗凋亡能力、侵袭迁移能力及非锚定独立生长能力均显着增强,参与并促进恶性转化进程。
贾帅楠,李劲涛,赵丽娇,钟儒刚,曾毅[8]（2018）在《环境致癌物与病毒协同致癌作用的研究进展》文中研究表明癌症是威胁人类健康的重大疾病,其发病与环境、病原体、遗传和生活方式等多种因素有关。环境致癌物是诱发癌症的重要因素之一,如多环芳烃、亚硝胺和霉菌毒素等均为环境中广泛存在的典型致癌物,它们在体内经过代谢活化后导致DNA损伤最终诱发癌症。病毒感染也是人类癌症发病的重要原因,如乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）能够诱发肝癌;EB病毒（EBV）在鼻咽癌的发生过程中起关键作用;人乳头瘤病毒（HPV）与宫颈癌和食管癌有关。然而,由于癌症发病机制复杂,仅考虑单一因素往往难以进行合理的解释。因此,明确不同致癌因素之间的协同作用对于揭示致癌作用机制具有重要意义。本文综述了近年来有关环境致癌物与病毒协同致癌作用的研究,以期为深入阐明肿瘤发生和发展的作用机制找到新的突破口,进而为相关癌症的防治提供新策略。
田黎明[9]（2018）在《HPV与宫颈癌》文中研究表明本篇综述主要介绍了人乳头瘤病毒和宫颈癌基础和临床研究的历史和新进展。分为以下三个部分。在第一部分,主要介绍了 HPV病毒学方面的问题。从病毒的结构和物理性质入手,重点介绍了 HPV的8个病毒蛋白的性质、序列结构和功能。E1是有分解ATP活性的解旋酶,E2是调控病毒的复制和蛋白表达之间的平衡,E6和E7则是病毒最重要的致癌蛋白,诱导细胞的永生化。自组装的L1构成了病毒衣壳的主要成分,L2介导病毒DNA进入细胞后的向细胞核运输,二者在保护、运输病毒DNA和病毒的感染中发挥重要作用。在第二部分,主要介绍了 HPV和宫颈癌的临床问题。首先回顾了 HPV研究的历史,HPV是如何被确立为宫颈癌的主要致病因素。简单探讨了宫颈癌的疾病负担,其后介绍了 HPV的传播方式和感染演变过程。最后介绍了现有的HPV感染的诊断方法及其利弊和新进展。HPV感染一般会被机体自己清除,但总有一小部分患者无法自愈而变成持续性感染、潜伏感染。延长的感染时间为HPV转化上皮组织成为癌前病变提供了可能。此时整合型HPV会导致上皮细胞的永生化,而开发清除整合HPV基因的药物成为当前研究的热点。在第三部分,简要介绍了 HPV在其他癌症中的研究现状。HPV不仅是造成宫颈癌的元凶,在头颈部癌症、皮肤癌、肺癌、生殖器肛门癌中也有它的身影。全文尽力从基础研究到临床应用都广泛涉及,以求为妇科医生提供一个大致了解HPV致宫颈癌内在机制的窗口,同时也是我学习专业知识、提高文献搜集整理水平的途径。
何力[10]（2016）在《HPV16E7 siRNA抑制口腔鳞癌SCC-15细胞生长实验研究》文中认为目的:观察HPV16E7 siRNA对口腔鳞癌SCC-15细胞生长的影响。方法:用脂质体向口腔鳞癌SCC-15细胞中转染HPV16E7 siRNA,利用RT-PCR和Western blot技术来评价RNAi效果。采用MTT法和克隆形成法来说明SCC-15增殖变化。最后应用FCM检测RNA干扰后SCC-15的周期及其凋亡情况。结果:在SCC-15细胞中转染HPV16E7 si RNA后,可促使HPV16E7mRNA和蛋白的表达水平降低,SCC-15细胞生长受到抑制,并停留于G0/G1期,细胞凋亡增加。结论:HPV16E7 siRNA可明显抑制SCC-15细胞HPV16E7基因的表达,从而对细胞增殖起抑制作用,并促进细胞凋亡。
二、导致宫颈癌的病毒可诱发口腔癌（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、导致宫颈癌的病毒可诱发口腔癌（论文提纲范文）
（1）HIV感染者早期口腔唾液微生物组的变化研究（论文提纲范文）
| 缩略词、中英文词汇对照表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 文献综述 HIV感染者的人体微生物组 |
| 实验研究 |
| 第一部分 HIV感染者和HIV未感染者口腔唾液微生物菌群的多样性比较差异分析 |
| 第二部分 HIV感染者ART治疗前后口腔唾液微生物菌群的动态变化与血液免疫因子间的相关性分析 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人乳头瘤状病毒(HPV)概述 |
| 1.1.1 人乳头瘤状病毒（HPV)结构 |
| 1.1.2 人乳头瘤状病毒（HPV)基因组与功能 |
| 1.1.3 HPV病毒分型 |
| 1.1.4 HPV与肿瘤的关系 |
| 1.1.5 HPV的致病机理 |
| 1.1.6 HPV病毒载量与宫颈癌的关系 |
| 1.1.7 HPV分型检测的意义 |
| 1.1.8 HPV L1蛋白检测的意义 |
| 1.1.9 HPV分型联合HPV L1蛋白检测的意义 |
| 1.1.10 HPV检测方法 |
| 1.1.10.1 细胞学检查 |
| 1.1.10.2 杂交捕获二代分析（HC2) |
| 1.1.10.3 基于聚合酶链式反应(PCR)的检测方法 |
| 1.1.10.4 基因芯片技术 |
| 1.2 基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI TOF MS) |
| 1.2.1 MALDI TOF MS基本原理 |
| 1.2.2 MALDI电离机理 |
| 1.2.3 MALDI TOF MS的应用 |
| 1.2.3.1 多肽与蛋白质分析 |
| 1.2.3.2 多磷酸化肽分析检测 |
| 1.2.3.3 寡核苷酸分析检测 |
| 1.2.3.4 MALDI定量分析 |
| 1.2.3.5 MALDI TOF MS对HPV检测 |
| 1.3 本论文研究的目的、意义和主要内容 |
| 1.3.1 本论文研究目的和意义 |
| 1.3.2 本论文研究内容 |
| 第二章 高效富集寡核苷酸纳米材料的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 精胺修饰纳米金刚石的制备 |
| 2.2.3 红外光谱和红外成像的表征 |
| 2.2.4 SP-NDs对寡核苷酸的吸附效果 |
| 2.2.5 SP-NDs富集稀溶液及复杂基质中的寡核苷酸 |
| 2.2.6 MADLI TOF MS分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 SP-NDs的表征 |
| 2.3.2 SP-NDs对寡核苷酸的吸附 |
| 2.3.3 MALDI TOF MS分析稀溶液寡核苷酸 |
| 2.3.4 MALDI TOF MS分析复杂基体中的寡核苷酸 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于纳米材料高效富集质谱法对HPV病毒分型研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 HPV通用引物PCR扩增 |
| 3.2.3 巢式PCR-RFLP方法 |
| 3.2.4 临床样品DNA提取 |
| 3.2.5 MALDI TOF MS检测酶切产物 |
| 3.2.6 试剂盒检测临床样本 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 HPV限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFMP) |
| 3.3.2 MALDI TOF MS对HPV分型检测 |
| 3.3.3 临床样品验证结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于纳米金非共价键竞争吸附质谱法定量检测HPV16 L1蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 纳米金的合成 |
| 4.2.3 纳米金表征 |
| 4.2.4 纳米金聚集盐的浓度 |
| 4.2.5 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合 |
| 4.2.5.1 溶液配制 |
| 4.2.5.2 pH值的影响 |
| 4.2.5.3 盐的影响 |
| 4.2.5.4 吸附时间 |
| 4.2.5.5 AuNPs与核酸适配体比例 |
| 4.2.5.6 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物稳定性 |
| 4.2.5.7 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征 |
| 4.2.7 Mass Tag的筛选 |
| 4.2.7.1 确定Mass tag与AuNPs的亲和力 |
| 4.2.7.2 Mass Tag和HPV16 L1核酸适配体竞争吸附 |
| 4.2.8 HPV16 L1蛋白的检测 |
| 4.2.9 HPV16 L1蛋白的检测特异性 |
| 4.2.10 样本检测 |
| 4.2.10.1 标准曲线的建立 |
| 4.2.10.2 样本前处理和检测 |
| 4.2.11 方法学验证 |
| 4.2.11.1 方法重现性 |
| 4.2.11.2 方法回收率 |
| 4.2.12 酶联免疫(ELISA)试剂盒检测样本 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 纳米金的表征 |
| 4.3.2 纳米金聚集盐的浓度 |
| 4.3.3 AuNPs吸附Aptamer条件 |
| 4.3.3.1 pH的影响 |
| 4.3.3.2 盐的影响 |
| 4.3.3.3 吸附时间的影响 |
| 4.3.3.4 AuNPs与核酸适配体比例 |
| 4.3.3.5 AuNPs-APT_(HPV16 L1)稳定性研究 |
| 4.3.4 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征 |
| 4.3.5 质量标签(Tag)的筛选 |
| 4.3.6 MALDI TOF MS条件 |
| 4.3.6.1 检测模式 |
| 4.3.6.2 基质的选择 |
| 4.3.7 HPV16 L1蛋白的检测 |
| 4.3.8 方法分析表现 |
| 4.3.9 实际样品的定量分析 |
| 4.3.10 ELISA实验验证 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 基于氧化石墨烯和核酸适配体竞争吸附检测HPV 16 L1蛋白 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 离心时间 |
| 5.2.3 氯化钠浓度 |
| 5.2.4 HPV16 L1核酸适配体浓度 |
| 5.2.5 HPV16 L1蛋白检测 |
| 5.2.6 临床样本检测 |
| 5.2.7 特异性实验 |
| 5.2.8 基于核酸适配体与GO检测体系Zeta电势和颗粒尺寸分布研究 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 离心时间的影响 |
| 5.3.2 氯化钠浓度的影响 |
| 5.3.3 HPV16 L1核酸适配体的浓度 |
| 5.3.4 HPV 16 L1蛋白检测 |
| 5.3.5 实际临床样本检测 |
| 5.3.6 回收率 |
| 5.3.7 特异性实验 |
| 5.3.8 GO/HPV 16 L1核酸适配体检测体系颗粒尺寸的分布研究 |
| 5.3.9 HPV 16 L1核酸适配体和GO检测体系Zeta电势分布 |
| 5.3.10 与第四章所建立的方法比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（3）淫羊藿素诱导人宫颈癌细胞凋亡及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 宫颈癌发病与治疗现状 |
| 1.1.1 宫颈癌的病因 |
| 1.1.2 宫颈癌的临床症状 |
| 1.1.3 宫颈癌的治疗 |
| 1.2 淫羊藿素研究进展 |
| 1.2.1 淫羊藿素简介 |
| 1.2.2 淫羊藿素的抗肿瘤作用 |
| 1.2.3 淫羊藿素的抗肿瘤机制 |
| 1.3 ROS |
| 1.3.1 ROS简介 |
| 1.3.2 ROS的来源 |
| 1.3.3 细胞内ROS的清除机制 |
| 1.3.4 ROS对肿瘤形成的促进作用 |
| 1.4 DNA损伤应答 |
| 1.4.1 DNA损伤应答 |
| 1.4.2 DDR机制 |
| 1.5 细胞凋亡 |
| 1.6 蛋白组学在宫颈癌研究领域的应用 |
| 1.7 药物的成药性 |
| 1.8 研究思路 |
| 第二章 淫羊藿素导致的活性氧水平升高诱发人宫颈癌细胞凋亡及其机制的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 MTT实验 |
| 2.2.5 集落形成实验 |
| 2.2.6 细胞ROS水平测定 |
| 2.2.7 免疫荧光染色 |
| 2.2.8 彗星实验 |
| 2.2.9 细胞周期检测 |
| 2.2.10 线粒体膜电位检测 |
| 2.2.11 细胞凋亡检测 |
| 2.2.12 Western Blot实验 |
| 2.2.13 细胞划痕实验 |
| 2.2.14 qPCR实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 淫羊藿素对宫颈癌细胞存活能力的影响 |
| 2.3.2 淫羊藿素对宫颈癌细胞迁移能力的抑制作用 |
| 2.3.3 淫羊藿素引起宫颈癌细胞内严重的DNA损伤 |
| 2.3.4 淫羊藿素引起宫颈癌细胞周期阻滞 |
| 2.3.5 淫羊藿素导致宫颈癌细胞凋亡 |
| 2.3.6 淫羊藿素未影响HeLa细胞中HPV E6/E7的表达水平 |
| 2.3.7 淫羊藿素引起宫颈癌细胞ROS水平升高 |
| 2.3.8 淫羊藿素引起的宫颈癌细胞活力和迁移能力抑制可被NAC恢复 |
| 2.3.9 淫羊藿素引起的宫颈癌细胞DNA损伤可被NAC阻断 |
| 2.3.10 淫羊藿素引起的宫颈癌细胞周期阻滞可被NAC阻断 |
| 2.3.11 淫羊藿素引起的宫颈癌细胞凋亡可被NAC阻断 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 淫羊藿素作用于宫颈癌细胞的蛋白质组学研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 蛋白质纯化和酶解 |
| 3.2.2 稳定同位素二甲基标记 |
| 3.2.3 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析 |
| 3.2.4 数据分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 定量结果 |
| 3.3.2 蛋白质功能注释 |
| 3.3.3 蛋白质分子功能富集 |
| 3.3.4 蛋白质参与的生理过程分析 |
| 3.3.5 蛋白质细胞定位分析 |
| 3.3.6 蛋白质相互作用通路分析 |
| 3.3.7 细胞内源凋亡途径蛋白检测 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 淫羊藿素药学性质的计算机模拟研究 |
| 4.1 ADMET预测淫羊藿素成药性 |
| 4.1.1 ADMET |
| 4.1.2 结果与讨论 |
| 4.2 淫羊藿素的毒理性质预测 |
| 4.2.1 实验方法 |
| 4.2.2 结果与讨论 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介及攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）miR-218对HPV联合MNNG致Het-1A细胞恶性转化的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 miR-218 对食管癌细胞及食管恶转细胞生物学行为的影响 |
| 第一节 miR-218 对食管癌细胞生物学行为的影响 |
| 第二节 miR-218 对食管恶转细胞生物学行为的影响 |
| 第二章 mi R-218 在食管细胞恶性转化中的作用机制研究 |
| 第一节 恶转细胞RNA-Seq测序数据分析 |
| 第二节 miR-218 靶基因的筛选及验证 |
| 第三节 miR-218 调控GAB2/SHP2/ERK和 GAB2/Akt/mTOR通路分析 |
| 第三章 人群HPV感染及miR-218 表达水平分析 |
| 第一节 血浆中HPV感染情况 |
| 第二节 血浆中miR-218和GAB2 的表达水平 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）甲基亚硝胺吡啶基丁酮与HPV18 E6E7的协同致癌作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 NNK的致癌作用 |
| 1.2.1 NNK的代谢活化机制 |
| 1.2.2 NNK导致DNA损伤 |
| 1.2.3 NNK致癌的生物标志物 |
| 1.3 HPV的致癌机理 |
| 1.3.1 HPV的结构特点和分类 |
| 1.3.2 HPV致癌的流行病学研究 |
| 1.3.3 HPV致癌作用的分子机制 |
| 1.3.4 HPV与环境致癌物的协同作用 |
| 1.4 本课题主要研究内容 |
| 第2章 构建转染HPV18 E6E7的SHEE细胞系 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器与试剂 |
| 2.2.2 人食管永生化上皮细胞SHEE的培养 |
| 2.2.3 p LVX-Puro E6E7 重组质粒的构建 |
| 2.2.4 慢病毒包装与细胞转染 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR检测HPV18 E6E7 表达 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 p LVX-Puro E6E7 重组质粒的构建 |
| 2.3.2 HPV18E6E7表达的鉴定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 NNK与 HPV18 E6E7 协同作用下的细胞恶性转化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 仪器与试剂 |
| 3.2.2 人永生化食管上皮细胞系SHEE的培养 |
| 3.2.3 细胞划痕愈合实验 |
| 3.2.4 Transwell细胞侵袭和迁移实验 |
| 3.2.5 细胞克隆形成实验 |
| 3.2.6 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 细胞划痕愈合实验 |
| 3.3.2 Transwell细胞迁移实验 |
| 3.3.3 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3.3.4 细胞克隆形成实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 NNK 与 HPV18 E6E7 协同作用导致 HPB 形成的HPLC-MS/MS 分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 仪器与试剂 |
| 4.2.2 溶液的配制 |
| 4.2.3 细胞培养和药物处理 |
| 4.2.4 DNA的提取和水解 |
| 4.2.5 DNA样品的纯化 |
| 4.2.6 HPB的 HPLC-MS/MS定量分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 方法学研究 |
| 4.3.2 标准曲线的绘制 |
| 4.3.3 DNA样品中HPB的测定 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间所发表的论文 |
| 致谢 |
（6）中晚期宫颈鳞癌的临床特征与HPV特异性免疫反应的相关性研究（论文提纲范文）
| 新疆医科大学博士研宄生学位论文导师评阅表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 HPV感染与中晚期宫颈鳞癌患者临床特征及淋巴结转移特点的分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 中晚期宫颈鳞癌患者HPV16 E1、E2 特异性CTL免疫反应与临床特征及预后的分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 中晚期宫颈鳞癌患者CD4+、CD8+T细胞CTLA-4、PD-1、TIM-3表达与临床特征的分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
（7）HPV联合MNNG对Het-1A细胞恶性转化的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞形态观察 |
| 1.2.3 CCK-8检测细胞增殖 |
| 1.2.4 细胞周期检测 |
| 1.2.5 Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 1.2.6 检测细胞侵袭能力 |
| 1.2.7检测细胞迁移能力 |
| 1.2.8 软琼脂集落形成试验 |
| 1.2.9 裸鼠成瘤试验 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞形态 |
| 2.2 CCK-8法检测细胞增殖活力 |
| 2.3 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.4 细胞凋亡 |
| 2.5 细胞侵袭与迁移 |
| 2.6 软琼脂集落形成试验 |
| 2.7 裸鼠成瘤实验及病理组织学检查 |
| 3 讨论 |
（8）环境致癌物与病毒协同致癌作用的研究进展（论文提纲范文）
| 1 多环芳烃与病毒的协同致癌作用 |
| 2 烟草特异亚硝胺与病毒的协同致癌作用 |
| 3 烟草烟气与病毒的协同致癌作用 |
| 4 黄曲霉毒素与病毒的协同致癌作用 |
| 5 其它环境致癌物与病毒的协同致癌作用 |
| 6 结论 |
（9）HPV与宫颈癌（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 HPV的进化、结构和分子生物学特征 |
| 第1节 病毒的结构 |
| 1.1.1 病毒成分和物理性质 |
| 1.1.2 HPV基因组和生命周期 |
| 第2节 病毒的分型 |
| 第3节 病毒蛋白的功能 |
| 1.3.1 E1 |
| 1.3.2 E2 |
| 1.3.3 E4 |
| 1.3.4 E5 |
| 1.3.5 E6 |
| 1.3.6 E7 |
| 1.3.7 主要衣壳蛋白L1 |
| 1.3.8 次要衣壳蛋白L2 |
| 第二章 HPV和宫颈癌 |
| 第1节 宫颈癌病因探究历史 |
| 第2节 宫颈癌的经济负担 |
| 第3节 HPV和宫颈癌的流行病学 |
| 第4节 HPV的传播方式 |
| 2.4.1 性传播 |
| 2.4.2 母婴传播 |
| 2.4.3 手传播 |
| 2.4.4 血液传播 |
| 2.4.5 手术传播 |
| 2.4.6 HPV的感染和进展情况 |
| 第5节 宫颈HPV感染临床诊断 |
| 2.5.1 常规细胞学 |
| 2.5.2 液基薄层细胞学 |
| 2.5.3 组织病理学 |
| 2.5.4 类型特异性PCR分析 |
| 2.5.5 通用引物PCR |
| 2.5.6 液体杂交捕获 |
| 2.5.7 HPV mRNA检测 |
| 2.5.8 HPV检测的新进展 |
| 第6节 持续HPV感染的治疗进展 |
| 第三章 HPV与其他癌症 |
| 第1节 生殖器肛门癌症 |
| 第2节 HPV与头颈癌 |
| 第3节 HPV与肺癌 |
| 第四章 其他 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
（10）HPV16E7 siRNA抑制口腔鳞癌SCC-15细胞生长实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
四、导致宫颈癌的病毒可诱发口腔癌（论文参考文献）
- [1]HIV感染者早期口腔唾液微生物组的变化研究[D]. 李瑾. 武汉大学, 2021(02)
- [2]基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究[D]. 朱俐. 北京化工大学, 2019(01)
- [3]淫羊藿素诱导人宫颈癌细胞凋亡及其机制的研究[D]. 陈欣. 吉林大学, 2019(10)
- [4]miR-218对HPV联合MNNG致Het-1A细胞恶性转化的作用研究[D]. 郑雨虹. 东南大学, 2019(05)
- [5]甲基亚硝胺吡啶基丁酮与HPV18 E6E7的协同致癌作用研究[D]. 庄琢琛. 北京工业大学, 2019(06)
- [6]中晚期宫颈鳞癌的临床特征与HPV特异性免疫反应的相关性研究[D]. 马苗苗. 新疆医科大学, 2019(08)
- [7]HPV联合MNNG对Het-1A细胞恶性转化的影响[J]. 马月,郑雨虹,赵超,刘冉,浦跃朴,尹立红. 癌变·畸变·突变, 2018(06)
- [8]环境致癌物与病毒协同致癌作用的研究进展[J]. 贾帅楠,李劲涛,赵丽娇,钟儒刚,曾毅. 病毒学报, 2018(04)
- [9]HPV与宫颈癌[D]. 田黎明. 厦门大学, 2018(01)
- [10]HPV16E7 siRNA抑制口腔鳞癌SCC-15细胞生长实验研究[D]. 何力. 重庆医科大学, 2016(02)