一、Cloning and Characterization of Fiber-specific Genes Through High Throughput Analysis（论文文献综述）
李昕宇[1]（2021）在《小鼠Kupffer细胞的转分化研究》文中研究表明研究背景及目的:KCs是肝脏长期驻留的巨噬细胞,在慢性肝损伤期间KCs被激活并分泌促炎症和促纤维化细胞因子,作用于HSCs转分化形成肌成纤维细胞,最终产生胶原沉积,学术界广泛认可,HSCs是肝脏中胶原沉积的主要来源,也是肝纤维化病理过程的核心环节,而KCs除了能辅助HSCs参与纤维化以外,是否有其他途径产生胶原沉积尚未阐明。HSCs转分化成为肌成纤维细胞是肝纤维化的关键步骤,除了HSCs转分化以外,肝脏中还存在大量其他细胞转分化的现象,例如有实验研究证明了动物模型中肝细胞和胆管细胞相互转化。在肝外组织中的巨噬细胞,例如皮肤、心肌、肾脏等组织中巨噬细胞可更进一步转分化为纤维细胞并分泌胶原蛋白,和伤口损伤愈合修复密切相关。通过上述类比,提出KCs可以发生转分化的猜想,KCs转分化为类成纤维细胞后可能产生胶原沉积,甚至有可能参与肝组织损伤修复乃至肝纤维化形成。KCs的转分化理论提供了不同于传统纤维化理论着眼于HSCs的不同视角,把肝硬化的过程视为河流,HSCs的转分化可视作主干道,而KCs则可作为支流,提供了未来肝纤维化治疗的新思路和新靶点,同时给成纤维细胞提供了新的来源,完善了对肝纤维化的认识。材料和方法:首先本研究在两个不同的体外实验模型中进行平行实验:体外肝脏非实质细胞培养和精密肝切片培养。具体步骤如下:（1）构建特异性追踪KCs谱系的动物模型Emr1Cre+/-::Ribo Tag+/-的小鼠追踪KCs谱系。（2）分离KCs后进行体外培养。（3）使用精密肝切片培养技术进行精密肝片培养。（4）使用免疫荧光成像分析培养后的KCs表达的蛋白。（5）利用多聚体免疫共沉淀富集KCs,提取RNA,合成c DNA。（6）实时定量PCR（Fludigm）。其次在小鼠肝切片中进行胶原沉积研究,使用氯膦酸盐脂质体耗竭KCs,进行精密肝切片培养,对肝切片进行Masson三色染色和RT-PCR基因表达分析。最后使用IL1r敲除小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠,使用精密肝切片培养技,实时定量PCR分析基因表达,使用LDH检测套盒定量分析肝片中细胞死亡情况。结果:（1）随着体外培养时间的推移,体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均发生:KCs的特征基因以及调控其表达的转录因子表达下调。（2）随着体外培养时间的推移,体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均发生:KCs中纤维化相关的基因以及调控其表达的转录因子表达上调。上述效应在非实质细胞培养和肝组织切片培养之间是高度一致的。（3）清除KCs后肝切片中胶原沉积减少。（4）Il-1r敲除小鼠的肝片中细胞死亡相关基因表达与对照组没有显着差异。（5）Nlrp3敲除小鼠肝片中细胞死亡相关基因表达与对照组没有显着差异。结论:KCs转分化在体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均有发生。KCs的转分化在体外培养中相对保守反应,转分化为类似成纤维细胞样的细胞,可以分泌胶原沉积相关蛋白。
刘雪华[2]（2021）在《基于RNA探针的拟干酪乳杆菌启动子库构建及高质量乳酸生产菌株研究》文中提出乳酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、生物、化工等行业。近年来,随着环保意识的不断增强,推动了聚乳酸行业的快速发展,也进一步加大了对高品质乳酸单体的需求,如何高效生产高质量乳酸是目前亟待解决的难题。适应性进化及代谢工程可对菌株进行定向改造,而在代谢工程中,无论是表达系统构建还是产物的优化表达都离不开启动子的调控。乳酸菌中具有不同调控活性启动子的缺乏,是进行细胞代谢精准调控的一大阻碍。本研究通过构建和应用RNA探针对启动子进行高通量筛选,建立适用于拟干酪乳杆菌的具有不同调控活性的启动子库;此外,通过适应性进化及CRISPR-Cas9基因编辑技术对菌株进行改造,以满足工业乳酸生产对菌株性能的需求。首先,利用RNA探针Pepper构建了乳酸菌中RNA水平启动子探针。通过对比eGFP（enhance green fluorescent protein）和Pepper表征的启动子强度及相关性分析,证明了 Pepper作为报告基因在乳酸菌中应用的可行性和可靠性,并基于此构建了 RNA水平启动子探针。同时,结果表明可先在大肠杆菌中对启动子强度进行初步检测,然后再转化到拟干酪乳杆菌进行调控活性的验证。此外,通过优化乳酸菌接种量和培养时间,建立了合适的Pepper荧光测定方法,发现初始接种量为5%时,培养4 h可获得最佳的荧光检测值。其次,建立了基于Pepper探针的拟干酪乳杆菌启动子库。通过易错PCR获得P32启动子突变片段,利用构建的RNA探针Pepper进行启动子强度的表征。首先在大肠杆菌中进行高通量筛选,共筛选了 950株突变菌,选择调控活性在P32荧光强度0.5-8倍范围内且强度呈梯度变化的10个转化子,转化到拟干酪乳杆菌后,其启动子强度与大肠杆菌启动子强度的相关性系数达到0.94,进而组成拟干酪乳杆菌功能性启动子库。最后,选育获得耐高温高质量L-乳酸高效生产菌。应用适应性进化策略,经过2160个小时的连续传代培养,获得一株能耐受45℃高温的拟干酪乳杆菌（high temperature,HT）,其发酵培养24 h后基本能够恢复出发菌株在37℃时发酵性能。将HT菌株在高初糖浓度（250 g/L）下进行开放式发酵,获得的L-乳酸浓度为221.0 g/L,产率为7.51 g/L/h,转化率为0.963 g/g,光学纯度和化学纯度均高于99.0%,其发酵性能较所查文献中报道的其它乳酸生产菌更优,有望成为潜在的工业高质量L-乳酸高效生产菌株。此外,为进一步提高L-乳酸光学纯度,满足聚乳酸对高品质乳酸单体的需求,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了靶向敲除D-2-羟基酸脱氢酶基因的质粒,可能受限于电转条件或CRISPR-Cas9表达元件的设计,暂未能筛选获得相应的敲除菌株。本研究为接下来进一步的高光学纯度乳酸生产菌株改造奠定了基础。
张晓然[3]（2021）在《戴瑞羊乳腺上皮细胞建系及Myostatin基因g.+6723位点HRM快速基因分型方法的建立》文中研究说明戴瑞羊（Dairy Meade sheep）是近年来我国从国外引进的新型乳肉兼用奶绵羊品种,具有优秀的泌乳性能和产肉性能。以戴瑞羊为育种材料,可培育适应内蒙古气候和养殖条件的乳用/乳肉兼用绵羊新品种,其泌乳和产肉性状相关遗传机制的解析,可为新品种培育提供重要的理论支撑。本研究首先建立了戴瑞羊乳腺上皮细胞系。采用组织块培养法结合差时消化法,分离培养了戴瑞羊乳腺上皮原代细胞,通过逆转录病毒介导SV40 LT基因转染原代乳腺上皮细胞获得了SV40 LT基因稳转的细胞株,并通过细胞形态学观察、生长曲线测定、免疫荧光检测、特异性基因表达检测和染色体数目分析等多种方法对戴瑞羊原代乳腺上皮细胞和SV40 LT基因稳转乳腺上皮细胞进行鉴定。结果表明,两种细胞皆成呈典型的“铺路石形”或“多角形”,细胞生长周期符合一般生物学规律且细胞染色体数目正常,细胞稳定表达CK7、CK8和β-casein基因,免疫荧光实验显示细胞表达CK7蛋白,且SV40 LT基因稳转细胞已传至20代,细胞状态良好。本研究还对比了MSTN基因g.+6723位点基因型为AA和GG的戴寒F1（戴瑞羊和小尾寒羊杂交一代）公羊的生长指标和屠宰性能,并利用HRM（高分辨率熔解曲线）技术建立了该位点快速基因分型的方法。结果显示,MSTN基因g.+6723位点AG基因型与GG基因型的戴寒F1公羊的生长指标无明显差异,但AG基因型公羊的屠宰率和净肉率显着高于GG基因型。通过对HRM反应体系中最佳引物对、Mg2+浓度（4.0 m M）、引物浓度（0.2μM）和模板浓度（0.25ng/μL）的不断优化,最终建立了适用于该位点快速基因分型的方法。本研究建立了戴瑞羊SV40 LT基因稳转乳腺上皮细胞系,为奶绵羊泌乳调控机制的研究提供了实验材料;基于HRM技术建立的MSTN基因g.+6723位点快速分型方法,为该位点在育种中的应用提供了技术支撑。
尚玉婷[4]（2021）在《沙门氏菌全基因组数据库构建及其分子靶标挖掘与应用研究》文中研究表明沙门氏菌是常见的食源性致病菌之一,血清型是该菌危害性判定和临床治疗的重要依据。根据抗原结构的差异,沙门氏菌可分为50多个血清群,2600多种血清型,复杂多样的血清型增加了传统检测和防控方法的难度。以核酸为基础的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点,逐渐成为可取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。而检测分子靶标的特异性和数量是建立沙门氏菌血清分型快速检测技术的瓶颈。本论文针对目前食品来源的沙门氏菌未有系统基因组学研究,各血清型基因组数据未充分发掘等问题,首先基于前期构建的全国食品微生物安全风险识别数据库和菌种资源库,利用二代测序技术和生物信息学方法,对食源性沙门氏菌基因组进行全面的分析,构建沙门氏菌全基因组数据库。在此基础上,采用泛基因组分析和PCR验证相结合的方式,系统挖掘了沙门氏菌属、血清群和血清型的特异性检测新靶标,并建立多种新型快速检测体系;通过功能预测、基因敲除、功能验证和转录组学探讨了沙门氏菌属特异性靶标基因的生物学功能和代谢调控网络;利用生物学特性和全基因组分析,从环境土壤中筛选出了一株针对沙门氏菌不同血清型的新型噬菌体,并初步应用于食品中沙门氏菌的污染防控。主要研究内容和结果如下:（1）沙门氏菌全基因组数据库的构建获得我国食品样品中351株沙门氏菌全基因组序列,包括8个血清群和44种血清型。对其基因组特征全面解析,包括泛基因组分析、遗传进化分析、毒力和耐药基因携带情况等方面,从而了解其基因组特性。研究表明,沙门氏菌为闭合型泛基因组,其泛基因数量为29241个,其中核心基因1418个,不同血清型之间具有一定程度的聚类性;大部分菌株携带毒力岛1和毒力岛2相关基因,且不同血清群之间携带毒力基因相似度极高;血清群B和血清群E中London和Meleagridis血清型携带的耐药基因较多,血清群F、M、Q携带的耐药基因较少,且血清群内不同血清型携带的耐药基因比较相似。（2）沙门氏菌属靶标及环介导等温扩增技术（Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP）检测体系挖掘得到13个沙门氏菌属靶标（靶标mla B、group＿25736和group＿28248主要针对包含邦戈尔沙门氏菌在内的沙门氏菌,靶标ssa Q、yhh A、ssa H、ssa P、cit X＿2、ssa O、ssc B、ssa S、ssa G和ssa T主要针对肠道沙门氏菌）,并以ssa Q基因构建LAMP检测体系。该检测体系特异性良好,可准确识别多种沙门氏菌血清型,与非沙门氏菌之间不存在交叉反应,检测限为2.1×101CFU/m L,灵敏度较高,可实现对食品样品中沙门氏菌的快速鉴定。（3）沙门氏菌血清群靶标及多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction,m PCR）检测体系挖掘得到常见血清群B、C1、C2、D和E靶标各1个B-rfb J、C1-9679、C2-pim B、D-rfb J和E-28255。进一步与最常见血清型Enteritidis和Typhimurium靶标相结合,构建3个m PCR检测体系,可实现对食品样品中常见血清群和血清型沙门氏菌的同时检测,节省了检测时间和成本。（4）沙门氏菌血清型靶标及链置换LAMP量子点荧光微球免疫层析试纸条体系构建挖掘得到15种血清型新靶标64个,包括血清群B中的Typhimurium、Derby、Indiana和Agona,血清群D中的Enteritidis,血清群C1中Rissen、Braenderup、Infantis和Virchow,血清群C2中的Hadar和Albany,血清群E中的Weltevreden、London、Meleagridis和Senftenberg。靶标具有良好的特异性和较高的灵敏度,成功应用于食品样品检测过程中。以S.Typhimurium靶标构建链置换LAMP量子点荧光微球免疫层析试纸条,其检测的特异性良好,裸视LOD为103CFU/m L,比Au NPs标记的免疫层析试纸条灵敏度提高了10倍。在102～107CFU/m L之间具有良好的线性关系,R2为0.969,理论计算出的LOD为10-1CFU/m L。在饮用水、橙汁、生菜和鸡肉中的裸视LOD分别为103、104、104和105CFU/m L。样品添加回收,回收率在85%～110%的范围内,相对标准偏差低于7.8%。（5）沙门氏菌毒力岛2相关属靶标基因功能的探讨绝大部分新靶标基因功能预测为假定蛋白,其中7个属靶标为毒力岛2相关基因,构建毒力岛2基因ssa G、ssa H、ssa O、ssa P、ssa Q、ssa T和ssc B突变株,与野生株相比,各突变株在显色培养基上的显色、生长性能和总蛋白表达能力无变化,生物膜形成能力存在一定的差异,突变株的细胞黏附性（除△ssa Q）,入侵性,增殖性和毒性均减弱,转录组分析发现大部分差异表达基因被富集到菌体鞭毛,菌毛,核糖体合成等过程中,与细菌的运动性和趋化性密切相关。说明这7个基因直接或间接的影响细菌的运动性和趋化性,从而更好的发挥其毒性。（6）新型沙门氏菌噬菌体的分离和应用筛选出针对不同血清型的新型沙门氏菌噬菌体vB＿Sal P＿TR2,属于短尾噬菌体,可裂解Albany、Corvallis、Newport、Kottbus和Istanbul五种血清型;该噬菌体对一定范围的p H值和温度具有耐受性,潜伏期时间相对较短,不携带任何毒力或抗生素耐药基因;在体外纯培养物和食品基质中,能抑制一定数量沙门氏菌的增殖。综上,本论文构建了沙门氏菌全基因组数据库,并在此基础上,进行了分子检测靶标的系统性挖掘,毒力岛2相关基因功能的初步研究和新型噬菌体的分离与应用,为沙门氏菌的快速检测,致病机制的深入研究和生物学高效防控等领域的快速发展奠定基础。
余裕[5]（2021）在《黑色素瘤耐药性基因相互作用和机制研究》文中进行了进一步梳理背景尽管目前vemurafenib（维罗菲尼）仍被广泛用作BRAF V600E突变型黑色素瘤的主流用药,而且在vemurafenib治疗BRAF V600E突变型黑色素瘤患者的前期也确有效用的情况当中,由于复杂的细胞异质性及随时间变化增强的细胞适应性的作用影响,在vemurafenib对此型患者发生药物疗效的其后均会出现耐药性。为因vemurafenib治疗产生的复杂性耐药反应得到一定明晰的了解、取得比较准确而深入的认识、求得如vemurafenib类耐药性问题的解决方向和路径,需要系统性地分析涉及vemurafenib的耐药性与耐药基因之间的遗传相互作用。在本研究中,我们建立了基于CRISPR/Cas9的双敲筛选平台,并且通过使用双sgRNA文库系统地筛选了 BRAF V600E突变型黑色素瘤约3,500个的基因对组合。我们通过筛选及计算,找到了具有强耐药生长表型和强基因相互作用的基因组合,并且通过竞争生长实验和小分子抑制剂分别在基因和蛋白水平测定并验证了几个基因对的协同促敏以及耐药表型,并发现其中的cilengitide+linsitinib组合对难治型NF2功能缺失黑色素瘤细胞耐药有较好的抑制效果。我们进而通过RNA全转录组测序并结合TCGA临床数据库分析了NF2敲除的A375细胞系可能的vemurafenib的弱响应机制,解释了如何从各药物靶点中挑选出能有效针对NF2功能缺失的难治型A375细胞系的药物组合,并通过定量RT-PCR及western blot分析了 3对药物组合对黑色素瘤细胞在vemurafenib环境下协同促敏的机制,尤其发现cilengitide+linsitinib,cilengitide+JNK-IN-8组合能够影响作为MAPK抑制剂应激性反应的HDGF-LGR5耐药蛋白复合体形成。总之,本研究为了解黑色素瘤细胞中的vemurafenib耐药机制提供了全面的基因相互作用信息,由此将会促进发现更多更有效,更新颖的促敏药物组合,并挖掘出更多对vemurafenib耐药有更高参考价值的双基因诊断和预后指标。目的:1.建立高通量、定量性、基于CRISPR/Cas9基因的相互作用研究平台及流程,并使用该平台及流程寻找与vemurafenib耐药过程相关的重要基因相互作用。2.从双sgRNA筛选的基因相互作用中选择vemurafenib耐药表型和基因相互作用都比较强的基因组合,并研究抑制与基因靶点相对应蛋白所能产生的促敏表型程度及药物间互作强度。3.针对研究所发现的,有黑色素瘤细胞vemurafenib促敏效应的靶点,进一步分析其在黑色素瘤细胞中产生协同致敏效应的潜在机制。结果:1.我们构建了高覆盖度,高均一度的CRISPR/Cas9双sgRNA筛选文库,由45,504个双sgRNA载体组成,靶向约3,500个基因组合。2.进行了两次相互独立的双敲文库筛选,从而获取了两次独立筛选实验的sgRNA丰度测序数据。3.计算得到vemurafenib耐药性表型值和基因相互作用强度,然后比较两次独立筛选的生物学重复数据,滤除重复度较低的部分数据。4.建立了黑色素瘤vemurafenib耐药性表型和遗传相互作用两个基因网络,分别找到了在这个两个网络中显着影响vemurafenib耐药的中心节点。5.通过以上高通量数据,进一步验证并检测能够使黑色素瘤细胞对vemurafenib敏感或耐药的多个靶点组合,在基因水平发现:（1）EGFR+PLK1,ITGB3+IGF1R的双基因表达抑制能够协同促进A375细胞系对于vemurafenib敏感。（2）+CCNC的双基因表达抑制能够协同促进A375细胞系对于vemurafenib耐药。（3）ITGB3+IGF1R的双基因表达抑制能够协同促进NF2敲除的A375细胞系对于 vemurafenib 敏感。（4）在vemurafenib药物作用下,HDGF+LGR5的双基因表达抑制能够协同减弱A375细胞系的癌干细胞指标及癌干细胞成球能力。我们进一步研究了蛋白水平上lapatinib（拉帕替尼）+rigosertib,cilengitide（西伦吉太）+linsitinib（林昔替尼）组合,及 cilengitide（西伦吉太）+JNK-IN-8 的 vemurafenib促敏协调机制,发现:（5）Vemurafenib+lapatinib+rigosertib,vemurafenib+cilengitide+linsitinib 三药组合可以显着回补A375细胞中E-cadherin的mRNA丰度。（6）Vemurafenib+lapatinib+rigosertib,vemurafenib+cilengitide+linsitinib 三药组合可以使vimentin mRNA的丰度显着下调。（7）在 A375 细胞系中,我们发现 lapatinib+vemurafenib 在 vemurafenib+lapatinib+rigosertib组合中对BIRC5的抑制发挥了上位作用,而在vemurafenib+lapatinib+rigosertib中对激活型caspase-3出现上调效果主要是由vemurafenib+rigosertib组合起到的上位效应产生的。（8）我们发现NF2敲除A375细胞系在vemurafenib药物干预下相比A375在vemurafenib 药物压力下,ROS1,Wnt10b,Integrin,IGF1R,SMAD,FGF等基因的表达水平显着激增,而PCDH7,DUSP6,Jun等基因的表达水平则显着下降。（9）在A375细胞系中,linstinib对vemurafenib+cilengitide+linsitinib组合中β-catenin蛋白表达的抑制起到了上位作用,但在NF2敲除的A375细胞系中却没有这样的作用,其中 vemurafenib+cilengitide+linsitinib 对 A375 细胞系和 NF2 敲除 A375 细胞系通过上调激活型caspase-3和下调磷酸化ERK表达水平来产生协同促敏效应。（10）在A375细胞系中,cilengitide+JNK-IN-8在磷酸化ERK的抑制和激活型caspase-3在活化方面表现出了协同作用。（11）HDGF和LGR5蛋白能够在BRAF抑制剂影响下应激性地形成蛋白复合体,并增强黑色素瘤细胞的癌干性,并且它们的蛋白复合体形成效率受到cilengitide+JNK-IN-8和cilengitide+linsitinib药物组合的正向及负向调节影响。结论:综上所述,我们建立了一个双sgRNA文库构建,筛选以及数据分析流程,系统性地研究了 vemurafenib耐药性相关的基因相互作用,我们构建了两个表征耐药性表型和基因相互作用强度的网络,并评估了其中的中心枢纽节点。根据高通量分析及低通量实验验证,我们确定了EGFR+PLK1、ITGB3+IGF1R、HDGF+LGR5、NF2+CCNC为致敏和耐药保护性基因靶点组合,这些基因靶点组合可能可以作为潜在有效的黑色素瘤vemurafenib耐药患者诊断和预后分子指标。此外,ITGB+IGF1R,ITGB3+JNK两个基因靶点组合被发现是克服NF2功能缺失型A375和SK-MEL-28 vemurafenib耐药细胞系的有效组合靶点。我们也发现了这些联合靶点对vemurafenib产生协同致敏的关键分子节点。特别是,我们观察到HDGF和LGR5可以在vemurafenib环境下适应性地形成一种蛋白复合物,通过促进癌细胞干性以增强癌细胞对MAPK抑制剂应激的反应能力,而 cilengitide+linsitinib,cilengitide+JNK-IN-8的药物组合可以对 HDGF-LGR5 复合物的形成产生负向或正向的影响。这些发现可能有助于从生物学意义上的基因相互作用的角度更好地理解肿瘤细胞对MAPK抑制剂的耐药性。
阎贝贝[6]（2021）在《尿素循环障碍的临床与遗传学研究及PBMC来源hiPSC和肝类器官的建立》文中研究说明研究背景尿素循环障碍（Urea Cycle Disorders,UCD）是由于参与尿素循环的六种酶中任意一种酶的基因发生突变而导致的出生缺陷,发病率据文献报道从1:8000到1:45,000不等。除鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷（Ornithine Transcarbamylase Deficiency,OTCD）为X连锁遗传外,其余五种均为常染色体隐性遗传。UCD根据发病时间分为早发型和晚发型,临床多表现为高氨血症的疾病过程。早发型UCD因酶严重缺乏或缺失而致临床症状极其严重,进展迅速,死亡率高达50%以上,存活者神经系统后遗症多严重;晚发型则可反复出现程度不一的高氨血症,亦合并神经系统损害,严重影响人类健康和生活质量。然而,由于UCD的罕见性和临床症状的不典型性,临床上面临识别难、诊断难、治疗难的困境,死亡率和致残率居高不下。因此,UCD患者的早期识别、早期诊断、早期干预,对挽留患者生命和改善患者预后都有着极为重要的意义。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）是由体细胞经重编程而获得的具有胚胎干细胞特性和功能的干细胞,其细胞来源广,诱导和培养技术成熟,建立后可长期培养,且病人来源的iPSC天然携带病人的致病基因,是建立疾病细胞模型的理想选择。将其诱导分化为目的细胞,可进行疾病模型的建立、治疗方法的对比、药物的筛选和毒理的研究并应用于再生医学领域的研究,应用前景广阔。鉴于上述研究背景,本论文围绕汇总UCD病人的临床资料和构建其外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）来源的iPSC与肝类器官这两方面展开研究,试图为UCD的诊疗提供循证医学依据,并期望将iPSC和肝类器官作为OTCD的体外细胞模型。研究目的1.对7例UCD患儿的临床特征、疾病过程、实验室检查及基因检测结果进行汇总分析,总结疾病过程及特点,探索基因型与临床表型之间的关系。2.建立OTCD患儿PBMC来源的iPS细胞系,并通过3D培养技术诱导分化为肝类器官,以期将其作为研究OTCD的体外疾病模型。研究方法1.对2016年10月至2020年12月期间于山东大学齐鲁儿童医院就诊的16154名遗传代谢病高危儿进行血和尿串联质谱筛查,同时对临床出现意识障碍、惊厥等脑病表现的患儿进行血浆氨检测与遗传学检查,共确诊7例UCD的患儿,分析其临床表型、实验室检查及基因检测结果。2.分离不同基因变异OTCD患儿的PBMC,以非整合方法进行重编程,挑取具备干细胞形态的克隆进行纯化和培养。采用细胞免疫荧光技术对iPSC进行多能性分子标记物鉴定;利用qRT-PCR方法检测内源性多能基因的表达;并采用拟胚体自分化实验检测三个胚层的分子标记物表达情况,验证iPSC多向分化潜能;通过PCR技术证明外源基因的表达消失来验证非整合性重编程模式。利用染色体核型鉴定、qRT-PCR和Sanger测序技术确认所构建的iPS具有OTCD病人特异性。3.将OTCD患儿的iPSC与正常儿童iPSC同时诱导分化为定型内胚层细胞（definitive endodermal cells,DEC）,然后利用3D培养方式进行悬浮培养,使其分化成熟为肝脏类器官。分别应用qRT-PCR和免疫荧光的方式对不同阶段特异性基因和肝特征性蛋白的表达进行检测,从而证明肝类器官构建成功。在基因和蛋白水平对肝类器官中OTC的表达进行检测,初步探讨新发变异对OTC的影响。研究结果1.临床资料及实验室检查:7例UCD患儿中有6例早发型病例,1例晚发型病例,均表现为急性高氨血症的临床过程,且合并多脏器功能障碍,但以神经系统症状为突出表现。凝血功能障碍先于肝酶异常出现,且其中纤维蛋白原的降低与血浆氨的升高有明显相关性。早发型UCD患者均合并低钙血症,且血筛中均有血丙氨酸和脯氨酸水平的显着升高。2例患者在接受血液净化治疗以后,虽然血浆氨水平明显下降,但临床症状均未见明显好转。2.遗传学结果:7个病例发现6个新发变异,包括5个点变异和1个3-9号外显子缺失,均位于基因保守区域;导致早发型病例的基因变异均造成蛋白结构的改变。对比基因型和临床表型发现,2个无义变异和3-9号外显子缺失的患儿或病情进展更迅速,或临床症状更严重、治疗效果差。3.iPSC的建立和鉴定:重编程后,OTCD患儿来源的PBMC呈现出显着的胚胎干细胞形态。重编程所得的2株OTCD-iPSC不但可表达TRA-60、TRA-81、OCT4、SSEA4和NANOG等多能性标志物以及OCT4、SOX2、NANOG等内源性多能基因,还可自分化形成典型的拟胚体结构,并可以检测到内、中、外胚层的特异性标志物。构建的iPSC与患儿外周血样本染色体核型相同,且保留了细胞源原有的基因变异,未整合质粒基因。4.肝类器官的建立和鉴定:不同时期的细胞明场图证明iPS细胞经历不同的阶段最终呈现肝细胞形态,随着iPSC向肝细胞方向分化,定型内胚层的标记物在基因和蛋白两个层面的表达均下降,而肝细胞特征性标记物,如ALB、CYP3A4、AFP等的表达则逐渐升高。3-9号外显子缺失患儿PBMC来源的肝类器官不表达细胞源缺失的外显子,且OTC蛋白的表达量也显着下降。研究结论1.凝血功能障碍可能是UCD病人肝损伤更早期的表现,且需动态监测早发型UCD病人的血钙水平;血丙氨酸和脯氨酸水平可能对早发型近端UCD病人有辅助诊断价值。2.血液净化治疗可有效降低血浆氨浓度,但其临床症状的改善可能与血浆氨的降低不成比例;其临床表型和预后仍取决于基因变异对酶的结构和/或功能的影响程度;发生在基因保守区域、酶反应域、严重影响蛋白结构的变异以及大的片段缺失和无义变异可能对酶的影响更为明显,从而导致更为严重的临床表型。3.采用非整合重编程技术成功构建2株PBMC来源的OTCD病人特异性的iPS细胞系;将其向肝细胞方向诱导,成功建立了该病首个PBMC来源的肝脏类器官,可作为OTCD潜在的肝类器官模型进行相关研究。
郭晶鑫[7]（2021）在《单细胞技术在Lepr+骨髓基质细胞分析中的应用及单细胞ATAC-seq分析软件的开发》文中研究说明随着单细胞测序技术的蓬勃发展,单细胞测序数据分析已成为生物信息学的重要研究方向。在单细胞转录组测序（scRNA-seq）数据分析中,目前仍存在如何矫正样本批次效应,如何选取并整合不同分析软件解析数据等分析挑战。而单细胞表观基因组等组学数据的分析方法更是亟待开发。本文从怎样整合多种单细胞数据分析策略解析骨髓基质细胞的异质性和单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq）数据分析方法开发两方面对单细胞数据分析进行了深入研究。骨髓基质细胞可以通过分化成脂肪,成骨和软骨等细胞维持骨髓微环境的稳态,调控骨骼的发育和损伤修复。其中,表达瘦素受体（Lepr）基因的细胞是骨髓基质细胞中的主要细胞类型,它可以维持造血系统稳态,并参与骨折损伤修复。目前,Lepr+骨髓基质细胞的异质性尚不明确。本研究第一部分,我们借助scRNA-seq技术,对来自稳态、衰老、罗格列酮喂养,辐射和骨折损伤小鼠骨髓的Lepr+细胞的异质性进行了充分研究。通过整合批次效应矫正,细胞分群与识别,轨迹分析,差异表达分析,基因功能富集分析,转录因子调控网络分析,RNA速率分析等分析策略,我们描绘了稳态和不同压力刺激下的小鼠骨髓Lepr+细胞的单细胞转录组图谱,比较了不同压力刺激后成脂细胞谱系细胞的分化潜能,构建了成骨细胞发育轨迹,发现了两个在骨折损伤压力刺激后可调控Lepr+细胞成骨分化的新型转录调控因子Hoxb2和Npdc1,还首次解析了Lepr+骨外膜细胞的异质性,识别了不同骨外膜细胞亚群的分子特征,并发现了一群具有很强克隆能力但不具备软骨分化能力的Lepr-Cre+Sca-1+细胞亚群。基因的表达过程受到多种调控因子的共同作用,通过研究基因转录调控机制也可以解析细胞异质性。scATAC-seq技术是研究单细胞表观遗传修饰因子对基因转录调控作用的重要技术,但scATAC-seq数据由于高维稀疏且包含大量噪音的特点给单细胞数据分析提出了新的计算挑战。本研究第二部分,我们开发了可以有效降低数据噪音实现单细胞ATAC-seq数据准确分群和轨迹分析的单细胞数据分析软件scART。为了减少大量噪音对分析高维稀疏的scATAC-seq数据的影响,我们先采用KNN imputation算法填补了数据中的缺失值,并通过TF-IDF转化提取了每个细胞的特征。然后我们利用对噪音干扰更加稳定的余弦相似度算法评估细胞相似度。通过与6种已发表方法的比较,我们发现scART具有更加准确,稳定且灵敏的分群能力,尤其是对于识别低测序深度数据集中的细胞异质性。接下来,我们利用scART分析了一组包含七个不同胚胎时期的小鼠前脑scATAC-seq数据,通过分群和轨迹分析得到了小鼠胚胎前脑细胞的发育轨迹,刻画了大脑皮层中深层神经元向浅层神经元迁移和分化的动态变化轨迹。除了分群和轨迹分析,scART还可以对scATAC-seq数据进行motif富集分析,基因可及性分析等。
乐莉[8]（2021）在《基于共振能量转移检测食品中致病微生物的技术研究》文中认为由致病微生物引发的食源性疾病是世界首要的食品安全问题,食品生产是一个时间久,环节冗杂的过程,存在着许多被致病微生物污染的可能。常见的致病微生物有细菌、病毒以及真菌等。非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染猪后引发的一种急性出血性严重传染性疾病被称为非洲猪瘟（African swine fever,ASF）。ASF的持续传播不仅影响到居民的肉类供应,也影响到全球肉类供应的安全,然而,目前有关直接检测食品中ASFV的研究很少。在日常食品中检测ASFV可以追踪病毒来源,更广泛地监测病毒,进一步减少经济损失。金黄色葡萄球菌是最常见的食源性致病菌,是革兰氏阳性细菌的代表之一,可引起许多严重的感染性疾病。在奶、肉、蛋、鱼及其制品中比较常见,可引起化脓感染、肺炎甚至败血症等全身感染性疾病。因此,构建方便快速并实施有效的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）检测方法对于食品安全的有效监测与防控具有重要意义。本文基于简便、快速、灵敏的共振能量转移技术用于检测食品中的ASFV和金黄色葡萄球菌。课题一:本部分利用量子点（Quantum dots,QDs）和纳米金（Gold nanoparticles,Au NPs）开发了一种基于荧光共振能量转移（Forster resonance energy transfer,FRET）的DNA传感器,基于单链DNA互补配对原则用于ASFV特异性基因检测。生物素（biotin）修饰的ss-DNA与链霉亲和素（streptavidin）修饰的QDs根据链霉亲和素与生物素的特异性亲和力合成ss-DNA-QDs（探针1）,巯基修饰的ss’-DNA与Au NPs通过盐老化法合成ss’-DNA-Au NPs（探针2）。靶DNA缺失的情况下,ss-DNA-QDs（探针1）将与ss’-DNA-Au NPs（探针2）杂交,供体（QDs）与受体（Au NPs）距离变近,引发FRET效应,QDs的荧光被Au NPs淬灭。靶DNA存在的情况下,靶DNA与探针2竞争结合探针1,导致FRET被破坏,QDs的荧光发生恢复。该生物传感器可在1.25 h内快速检测ASFV靶DNA,检出限为0.72μM,在猪肉、火腿肠和猪肉饺子等食品中的回收率为82.00%～108.00%,变异系数为0.02～0.15%。本研究提出了一种简单、快速的检测食品中ASFV基因片段的方法。课题二:在本工作中,成簇的规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR）与CRISPR关联蛋白系统（CRISPR-associated proteins system 13a,Cas13a）的技术（CRISPR/Cas 13a）具有特异剪切单链RNA的活性以及其操作简便等优势。化学发光共振能量转移（Chemiluminescence resonance energy transfer,CRET）由于无需要外部光源激发,无背景信号干扰,是一种高灵敏的检测技术。因此,本工作将CRISPR/Cas 13a与CRET结合灵敏简便地检测食品中的S.aureus。首先通过碱基互补配对原则合成aptamer-c RNA杂交双链体系,当S.aureus存在时,aptamer识别样本中S.aureus后释放出aptamer-c RNA杂交双链体系中的c RNA,CRISPR/Cas 13a识别目标c RNA反式剪切辣根过氧化酶（HRP）和单链RNA修饰的CRET探针（Au NPs-RNA1-HRP）（Au NPs与SH-RNA1-biotin通过冷冻法合成Au NP-RNA1,Au NP-RNA1与streptavidin-HRP通过链霉亲和素与生物素的特异性结合力合成Au NPs-RNA1-HRP）,从而导致CRET被破坏,加入底物后化学发光信号增强。上述传感策略实现了在1h内对S.aureus的定量检测。S.aureus浓度与相对化学发光强度在10-105cfu/m L浓度范围内呈现出良好的线性关系,该方法的检测限为7cfu/m L。将该策略用于检测真实样品饮用水和牛奶中的S.aureus时,回收率为90.07%～105.5%,变异系数为2.20～6.80%,说明本文提出的基于CRISPR/Cas 13a与CRET相结合可以快速灵敏地检测实际食品样品（饮用水、牛奶）中的S.aureus。在此原理基础上,设计了免疫层析试纸条以实现S.aureus的现场快速检测,可直接通过手机拍摄结果。该试纸条可以在10 min内检测到10 cfu/m L的S.aureus,并且在饮用水、牛奶中可检测到102 cfu/m L的S.aureus。本工作将CRISPR/Cas13a、CRET以及免疫层析技术三者结合,建立了S.aureus快速可视化检测方法,以期为病原微生物的快速实时监测领域的进一步研究提供参考。
李坤[9]（2021）在《基于多组学和生物信息学的淋巴细胞分化发育研究》文中研究说明淋巴细胞是具有重要免疫功能的白细胞,对于机体抵抗感染、清楚衰老细胞和防止肿瘤发生至关重要,因此对于淋巴细胞的研究一直是生命科学研究的热点。在淋巴细胞中NK细胞和T细胞分别在固有免疫和适应性免疫中发挥杀伤和免疫调节作用,同时基于NK细胞和T细胞的免疫疗法在疾病治疗中取得的良好效果,使得NK细胞和T细胞的研究愈发的重要。而对于NK细胞和T细胞分化发育的研究可以帮助我们正确理解NK细胞和T细胞的分化发育过程,对了解免疫系统的组成,免疫系统紊乱时疾病的发生以及疾病的治疗具有重要意义。此前技术的不完善严重阻碍了对NK细胞和T细胞分化发育的研究,随着多种组学测序技术的发展和完善我们可以更加全面地研究NK细胞和T细胞的分化发育。但是目前NK细胞和胸腺T细胞的分化发育过程并不是十分清楚,了解NK细胞和胸腺T细胞的分化发育过程可以为淋巴细胞的发育研究提供新的见解,并促进基于NK细胞和T细胞的免疫疗法的发展。整合多种组学技术对于增进我们对人类疾病和生物学的理解至关重要,因此本文希望利用Microarray,scRNA-seq,ATAC-seq,scATAC-seq 等多组学技术,整合转录组学和表观基因组学等多种生物信息学方法研究NK细胞和胸腺T细胞发育过程的转录调控网络,挖掘调控转录过程的重要的转录因子,并揭示发育过程中未曾揭示的重要的生物学过程。本论文内容主要分为两个部分。在第一部分工作中,我们首先在体外诱导NK细胞分化的不同阶段收集样品进行ATAC-seq建库测序,经过质量控制获得了高质量的ATAC-seq数据,并利用这些数据描述了 NK细胞分化过程中染色质可及性图谱。我们共发现6401个差异的染色质开放位点,对这些差异位点进行聚类分析发现NK细胞分化过程中表观调控元件的开放可以分为前后两个阶段,其中一些已知的调控NK细胞发育的基因也在相应的阶段富集,比如STAT5A在前期富集,在后期调控NK细胞发育的基因TBX21在后期富集。对这些差异性的调控元件进行功能富集分析发现,在前期开放的位点大多富集磷酸化等维持机体正常生命活动相关的功能,而在后期开放的位点则会参与免疫系统的构建等免疫反应相关的过程,说明在后期开放的这些调控元件伴随着基因的表达来调控NK细胞的发育。随后基于这些表观调控元件我们利用HOMER和Genomica富集了调控NK细胞分化不同阶段的转录因子。利用这些富集的转录因子及其基因的表达,我们构建了NK细胞分化过程中的转录调控网络并描述了转录调控网络随着NK细胞发育动态变化的过程。最后我们发现除已知的转录因子以外,FOSL2和EGR2在NK细胞分化过程中显着富集并且他们调控的基因会富集免疫反应相关的功能,暗示FOSL2和EGR2会调控NK细胞的分化,随后我们通过敲低实验证明FOSL2和EGR2确实会影响NK细胞的分化和成熟。在第二部分工作中,首先我们利用流式细胞术从小鼠胸腺中分选得到CD45阳性的淋巴细胞,之后通过10X Genomics建库并测序后得到单细胞RNA-seq数据。该数据包括1986个细胞,平均每个细胞可以检测到1784个基因。通过对单细胞RNA-seq数据进行分群和细胞类型注释,我们一共得到15个细胞亚群,分别对应于胸腺T细胞发育的DN、DP、CD4单阳性和CD8单阳性等不同阶段,以及一些抗原呈递细胞和非传统的淋巴细胞,并且利用假时间分析描述了胸腺T细胞的发育过程。其次我们通过单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq的整合分析揭示了调控T细胞发育的转录因子,除了已知的转录因子在其发挥功能的阶段富集外,我们也发现了一些新的转录因子的富集。并且根据这些富集的转录因子及其调控的差异表达的基因,我们构建了胸腺T细胞发育过程的转录调控网络。随后我们发现Ly6d和CD2这两个表面marker可以将DP细胞分选为更为精细的细胞亚群。通过精细的分群我们也发现了一些胸腺T细胞发育过程中未曾揭示的现象:（1）DP细胞独特的增殖方式:DPbla细胞的分化伴随着有丝分裂同时进行,DPbla细胞的增殖能力明显减弱并且在分裂结束后倾向于退出有丝分裂。而DPbla细胞增殖能力减弱可能是导致青春期后胸腺T细胞不断减少的原因。（2）除了传统上认为的胸腺上皮细胞,胸腺T细胞本身也可以作为抗原提呈细胞为T细胞的发育提呈抗原,我们通过免疫荧光发现胸腺细胞之间确实存在免疫突触,证明胸腺细胞确实可以作为抗原呈递细胞促进CD8细胞的选择过程。最后,我们下载并分析了人类胸腺细胞的单细胞数据,通过跨物种比较分析揭示了人和鼠在转录水平上的差异并结合ChIP-seq数据发现Gata1可能调控这些物种之间的转录差异。
康宇[10]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中研究说明哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
二、Cloning and Characterization of Fiber-specific Genes Through High Throughput Analysis（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cloning and Characterization of Fiber-specific Genes Through High Throughput Analysis（论文提纲范文）
（1）小鼠Kupffer细胞的转分化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 前言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏概述 |
| 1.2 肝脏纤维化 |
| 1.2.1 肝细胞的死亡与凋亡 |
| 1.2.2 肝纤维化发展 |
| 1.2.3 肝纤维化中肌成纤维细胞的组成 |
| 1.3 KCs在肝脏学中的研究进展 |
| 1.3.1 KCs的起源 |
| 1.3.2 KCs在肝脏结构中的定位 |
| 1.3.3 KCs的免疫作用 |
| 1.3.4 KCs的异质性 |
| 1.3.5 KCs的可塑性 |
| 1.3.6 KCs与肝脏疾病 |
| 1.4 细胞谱系追踪技术 |
| 1.4.1 细胞谱系追踪技术的基本原理 |
| 1.4.2 细胞谱系追踪的标记方法 |
| 1.4.3 细胞谱系追踪在肝脏研究中的应用 |
| 1.4.4 细胞谱系追踪的未来 |
| 1.6 细胞的转分化 |
| 1.6.1 细胞转分化概述 |
| 1.6.2 自然发生的转分化 |
| 1.6.3 实验性转分化 |
| 1.6.4 肝脏中的转分化 |
| 1.6.5 转分化应用于再生医学的优点和局限性 |
| 第2章 KCs在体外非实质细胞培养过程中的形态和表型变化研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 2.2.4 主要实验试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 非实质细胞分离 |
| 2.3.2 收集培养的非实质细胞 |
| 2.3.3 多聚体免疫共沉淀 |
| 2.3.4 RNA提取 |
| 2.3.5 基因表达分析 |
| 2.3.6 免疫荧光成像 |
| 2.3.7 统计学方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 精密肝切片培养实验过程中,KCs特征性基因表达下调 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 3.2.4 主要实验试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在精密肝切片培养和体外非实质细胞培养实验中,KCs中纤维化相关基因表达分析研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 KCs在培养过程中转录因子基因表达研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 KCs与肝片中胶原沉积的初步探索研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 主要实验耗材与设备 |
| 6.1.4 主要实验试剂配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 KCs耗竭 |
| 6.2.2 肝片培养、基因分析等方法同前所述 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 本实验创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）基于RNA探针的拟干酪乳杆菌启动子库构建及高质量乳酸生产菌株研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳酸概述 |
| 1.1.1 乳酸的性质及其应用 |
| 1.1.2 乳酸的生产方法 |
| 1.1.3 乳酸生产菌 |
| 1.2 微生物基因编辑方法研究进展 |
| 1.2.1 Cre/loxP位点特异性基因重组系统 |
| 1.2.2 Red/RecET介导的单双链同源重组系统 |
| 1.2.3 基于质粒的同源重组系统 |
| 1.2.4 CRISPR-Cas9基因编辑系统 |
| 1.2.5 乳酸菌基因编辑方法研究进展 |
| 1.3 乳酸菌基因表达系统研究进展 |
| 1.3.1 表达载体研究进展 |
| 1.3.2 启动子研究进展 |
| 1.3.3 报告基因研究进展 |
| 1.3.4 乳酸菌中启动子研究进展 |
| 1.4 本课题研究内容与意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 常用试剂 |
| 2.1.4 工具酶和试剂盒 |
| 2.1.5 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种培养和保藏 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 拟干酪乳杆菌感受态制备 |
| 2.2.4 重组质粒的构建 |
| 2.2.5 质粒DNA的提取 |
| 2.2.6 DNA的胶回收 |
| 2.2.7 PCR片段的纯化 |
| 2.2.8 一步克隆连接 |
| 2.2.9 拟干酪乳杆菌基因组DNA提取 |
| 2.2.10 RNA反转录cDNA |
| 2.2.11 qPCR反应 |
| 2.3 检测方法 |
| 2.3.1 发酵液中L-乳酸和D-乳酸检测 |
| 2.3.2 菌体生物量测定 |
| 2.3.3 发酵液中葡萄糖含量的测定 |
| 2.3.4 发酵液中乙酸和乙偶姻测定 |
| 2.3.5 荧光检测方法 |
| 第三章 RNA探针Pepper作为报告基因的乳酸菌启动子构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 本章所用引物 |
| 3.2.3 重组大肠杆菌荧光强度测定 |
| 3.2.4 电转化条件优化 |
| 3.2.5 技术路线图 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 以Pepper为报告基因的平台质粒构建 |
| 3.3.2 以eGFP为报告基因的平台质粒构建 |
| 3.3.3 大肠杆菌重组菌荧光强度比较 |
| 3.3.4 拟干酪乳杆菌重组菌构建 |
| 3.3.5 拟干酪乳杆菌重组菌荧光强度比较 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于高通量筛选的拟干酪乳杆菌启动子库构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验用菌株及质粒 |
| 4.2.2 实验用引物 |
| 4.2.3 易错PCR |
| 4.2.4 大肠杆菌高通量筛选方法 |
| 4.2.5 拟干酪乳杆菌细胞启动子库构建 |
| 4.2.6 技术路线图 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 易错PCR获得启动子突变片段及表达载体的构建 |
| 4.3.2 大肠杆菌P_(32)突变启动子库的高通量筛选 |
| 4.3.3 拟干酪乳杆菌中P_(32)突变启动子强度验证 |
| 4.3.4 启动子序列分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 适应性进化结合代谢工程选育高质量乳酸高性能生产菌株 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验菌株及质粒 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 本实验用引物 |
| 5.2.4 菌落PCR扩增基因组片段 |
| 5.2.5 敲除基因的选择 |
| 5.2.6 D-2-HDH基因的sgRNA序列 |
| 5.2.7 抗生素最小抑菌浓度 |
| 5.2.8 适应性进化策略 |
| 5.2.9 开放式发酵 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 适应性进化提高菌株的高温耐受性 |
| 5.3.2 耐高温菌株开放模式下高性能乳酸高效生产 |
| 5.3.3 CRISPR-Cas9基因编辑提高L-乳酸光学纯度尝试 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 已发表或已录用的论文(专利) |
（3）戴瑞羊乳腺上皮细胞建系及Myostatin基因g.+6723位点HRM快速基因分型方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 一 引言 |
| 1.1 戴瑞羊简介 |
| 1.2 乳腺上皮细胞研究进展 |
| 1.2.1 乳腺的发育和结构概述 |
| 1.2.2 乳腺上皮细胞的分离培养方法 |
| 1.2.3 乳腺上皮细胞的纯化 |
| 1.2.4 乳腺上皮细胞的鉴定 |
| 1.2.5 细胞永生化 |
| 1.3 绵羊MSTN基因多态性研究进展 |
| 1.4 SNP分型方法研究进展 |
| 1.4.1 DNA测序 |
| 1.4.2 限制性内切酶片段多态性 |
| 1.4.3 单链构象多态性 |
| 1.4.4 变性高效液相色谱技术 |
| 1.4.5 高分辨率熔解曲线技术 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 二 戴瑞羊乳腺上皮细胞系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养液配方 |
| 2.1.5 SMECs的体外分离及培养 |
| 2.1.6 SMECs的鉴定 |
| 2.1.7 SV40 LT基因稳转细胞系的获得 |
| 2.1.8 SV40-SMECs的鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SMECs的体外分离及培养 |
| 2.2.2 SMECs的生长曲线 |
| 2.2.3 RT-PCR检测SMECs特异性基因的表达 |
| 2.2.4 SMECs CK7免疫荧光检测 |
| 2.2.5 SMECs染色体数目分析 |
| 2.2.6 最佳嘌呤霉素筛选浓度的测定结果 |
| 2.2.7 质粒pBABE-puro SV40酶切鉴定和扩增 |
| 2.2.8 病毒感染后阳性细胞的获得 |
| 2.2.9 SV40-SMECs的形态学观察 |
| 2.2.10 RT-PCR检测SV40-SMECs中SV40 LT的表达 |
| 2.2.11 SV40-SMECs的生长曲线 |
| 2.2.12 RT-PCR检测SV40-SMECs特异性基因的表达 |
| 2.2.13 SV40-SMECs CK7免疫荧光检测 |
| 2.2.14 SV40-SMECs染色体数目分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 乳腺上皮细胞的原代培养 |
| 2.3.2 乳腺上皮细胞的纯化 |
| 2.3.3 乳腺上皮细胞的鉴定 |
| 2.3.4 SV40 LT稳转细胞系的建立 |
| 2.4 小结 |
| 三 绵羊Myostatin基因g.+6723位点快速分型方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| A突变对戴寒F1产肉性能的影响'>3.1.4 验证MSTN基因g.+6723G>A突变对戴寒F1产肉性能的影响 |
| 3.1.5 MSTN基因g.+6723位点快速分型方法的建立 |
| 3.1.6 最佳HRM反应体系的摸索 |
| 3.1.7 数据分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 血液基因组DNA的提取 |
| 3.2.2 戴寒F1 MSTN基因g.+6723位点分型结果 |
| A突变对绵羊生产性能的影响'>3.2.3 验证MSTN基因g.+6723G>A突变对绵羊生产性能的影响 |
| 3.2.4 HRM引物的确定 |
| 3.2.5 确定HRM反应体系最佳Mg~(2+)浓度 |
| 3.2.6 确定HRM反应体系最佳引物浓度 |
| 3.2.7 确定HRM反应体系最佳模板浓度 |
| 3.2.8 确定最佳HRM反应体系 |
| 3.2.9 验证HRM反应体系的准确性 |
| 3.3 讨论 |
| A突变对绵羊屠宰性状的影响'>3.3.1 MSTN基因g.+6723G>A突变对绵羊屠宰性状的影响 |
| 3.3.2 不同基因分型方法的比较 |
| 3.3.3 HRM反应体系的优化 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）沙门氏菌全基因组数据库构建及其分子靶标挖掘与应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 沙门氏菌概述 |
| 1.1.1 沙门氏菌生物学特性 |
| 1.1.2 沙门氏菌血清分型 |
| 1.2 沙门氏菌致病性 |
| 1.3 沙门氏菌分子检测方法 |
| 1.3.1 基于PCR的变温核酸扩增技术 |
| 1.3.2 恒温核酸扩增技术 |
| 1.4 沙门氏菌的防控 |
| 1.4.1 物理学方法 |
| 1.4.2 化学方法 |
| 1.4.3 生物学方法 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 沙门氏菌全基因组数据库的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 全基因组数据库 |
| 2.3.2 泛基因组分析结果 |
| 2.3.3 核心基因组分析结果 |
| 2.3.4 毒力和耐药基因分析结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 沙门氏菌属靶标的挖掘及LAMP体系的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 沙门氏菌属特异性检测靶标 |
| 3.3.2 LAMP靶基因的选择 |
| 3.3.3 LAMP的最佳反应条件 |
| 3.3.4 LAMP的特异性和灵敏度 |
| 3.3.5 人工污染和实际样品中LAMP的应用 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 沙门氏菌血清群靶标的挖掘及m PCR体系的构建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 沙门氏菌血清群特异性检测靶标 |
| 4.3.2 mPCR的组合 |
| 4.3.3 mPCR的特异性和灵敏度 |
| 4.3.4 实际样品中mPCR的应用 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 沙门氏菌血清型靶标的挖掘及链置换LAMP量子点荧光微球免疫层析试纸条体系的构建 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 B群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.2 D群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.3 C1 群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.4 C2 群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.5 E群常见血清型特异性检测靶标 |
| 5.3.6 链置换LAMP量子点荧光微球免疫层析试纸条 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 沙门氏菌属靶标与毒力岛2 相关基因功能的初步研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 突变株的构建 |
| 6.3.2 突变株生物表型分析 |
| 6.3.3 突变株毒力分析 |
| 6.3.4 转录组结果分析 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 新型沙门氏菌噬菌体分离与应用 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验方法 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 噬菌体vB_SalP_TR2 的形态学 |
| 7.3.2 噬菌体vB_SalP_TR2 生物学特征 |
| 7.3.3 噬菌体vB_SalP_TR2 基因组特征 |
| 7.3.4 噬菌体vB_SalP_TR2 的应用 |
| 7.4 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（5）黑色素瘤耐药性基因相互作用和机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 黑色素瘤耐药基因的相互作用网络构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 黑色素瘤耐药基因相互作用对耐药表型的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 黑色素瘤耐药基因相互作用对vemurafenib促敏表型影响的机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 黑色素瘤特征及耐药研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 癌细胞的异质性与耐药可塑性机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）尿素循环障碍的临床与遗传学研究及PBMC来源hiPSC和肝类器官的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言(文献综述) |
| 第一部分 尿素循环障碍的临床表现与遗传学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 OTCD病人PBMC来源iPS细胞系构建及验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 OTCD病人iPS细胞来源肝类器官的建立及OTC表达验证 |
| 1.实验材料与实验方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（7）单细胞技术在Lepr+骨髓基质细胞分析中的应用及单细胞ATAC-seq分析软件的开发（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1.绪论 |
| 1.1 单细胞测序简介 |
| 1.1.1 单细胞测序 |
| 1.1.2 单细胞测序数据分析 |
| 1.2 scRNA-seq技术 |
| 1.2.1 单细胞分离和捕获 |
| 1.2.2 scRNA-seq文库制备 |
| 1.3 scRNA-seq数据分析 |
| 1.3.1 构建单细胞基因表达矩阵 |
| 1.3.2 单细胞数据预处理 |
| 1.3.3 基于细胞维度解析scRNA-seq数据 |
| 1.3.4 基于基因维度解析scRNA-seq数据 |
| 1.3.5 scRNA-seq数据分析的应用和挑战 |
| 1.4 scATAC-seq技术与数据分析 |
| 1.4.1 染色质可及性与基因表达调控 |
| 1.4.2 scATAC-seq技术 |
| 1.4.3 scATAC-seq数据分析 |
| 1.5 骨髓基质细胞 |
| 1.6 论文思路和主要工作 |
| 2.数据来源与分析方法 |
| 2.1 scRNA-seq实验材料和方法 |
| 2.1.1 实验小鼠 |
| 2.1.2 scRNA-seq实验 |
| 2.2 scRNA-seq数据分析方法 |
| 2.2.1 scRNA-seq测序结果质控,比对和基因表达水平量化 |
| 2.2.2 单细胞基因表达矩阵的筛选与过滤 |
| 2.2.3 基因表达水平标准化 |
| 2.2.4 批次效应矫正 |
| 2.2.5 特征基因筛选和降维 |
| 2.2.6 细胞分群与可视化 |
| 2.2.7 差异表达分析和基因功能富集分析 |
| 2.2.8 细胞类群注释 |
| 2.2.9 单细胞转录因子调控网络分析 |
| 2.2.10 细胞轨迹分析 |
| 2.2.11 scRNA-seq数据分析软件及版本 |
| 2.3 scATAC-seq测序数据来源与预处理 |
| 2.3.1 模拟测试数据集 |
| 2.3.2 包含6种人源体外培养细胞系的真实scATAC-seq测序数据 |
| 2.3.3 包含8种不同类型的人源造血系统来源的细胞的scATAC-seq数据集 |
| 2.3.4 不同胚胎发育阶段小鼠前脑组织的scATAC-seq数据集 |
| 2.3.5 SHARE-seq数据集 |
| 2.4 scATAC-seq数据分析 |
| 2.4.1 scATAC-seq分析软件使用说明 |
| 2.4.2 不同scATAC-seq算法的分群效果检验 |
| 2.4.3 转录因子motif富集分析 |
| 2.4.4 scATAC-seq分析软件及版本 |
| 3.整合多种单细胞数据分析技术解析小鼠Lepr~+骨髓基质细胞异质性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 批次效应矫正分析 |
| 3.3 细胞基因型鉴定分析 |
| 3.4 绘制稳态和不同压力刺激下Lepr~+细胞的单细胞转录组图谱 |
| 3.5 成脂细胞谱系细胞异质性分析 |
| 3.5.1 识别成脂细胞谱系细胞亚型及分子标记 |
| 3.5.2 探究成脂细胞谱系细胞内不同细胞亚型的发育关系 |
| 3.6 成骨细胞谱系细胞的发育轨迹和基因表达水平的动态变化分析 |
| 3.6.1 识别成骨细胞谱系细胞内的异质性 |
| 3.6.2 重构成骨细胞谱系细胞发育轨迹 |
| 3.7 骨折刺激诱导产生的骨外膜细胞异质性与分子特征解析 |
| 3.8 单细胞转录因子调控网络分析 |
| 3.8.1 预测并构建稳态和不同压力刺激下成骨细胞谱系细胞的基因调控网络 |
| 3.8.2 比较骨外膜细胞与软骨细胞中不同细胞亚群的转录因子调控活性差异 |
| 3.9 本章小结 |
| 4.scATAC-seq数据分析软件开发 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 scART算法设计与实现 |
| 4.2.1 用于统计测序结果的计数单位选取和单细胞染色质可及性矩阵构建 |
| 4.2.2 基于KNN imputation算法的缺失值填补 |
| 4.2.3 染色质可及性区域筛选与过滤 |
| 4.2.4 基于TF-IDF的权重计算 |
| 4.2.5 矩阵降维 |
| 4.2.6 细胞分群 |
| 4.2.7 数据可视化 |
| 4.2.8 细胞轨迹分析 |
| 4.2.9 基因注释和转录因子motif富集分析 |
| 4.3 scART分析性能讨论 |
| 4.3.1 scART能更准确地识别细胞异质性 |
| 4.3.2 scART可以快速实现大规模scATAC-seq数据分析 |
| 4.3.3 scART可以识别稀有细胞群 |
| 4.3.4 scART对低测序深度数据具有更高的分群灵敏度 |
| 4.3.5 利用scART重构造血系统不同谱系细胞的发育轨迹 |
| 4.4 利用scART解析小鼠胚胎前脑组织的异质性并构建细胞发育轨迹 |
| 4.5 本章小结 |
| 5.总结与讨论 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 附表1.小鼠骨髓基质细胞scRNA-seq样本说明 |
| 附表2.数据来源说明 |
| 附表3.软件包说明 |
| 作者简历 |
| 附件 |
（8）基于共振能量转移检测食品中致病微生物的技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 非洲猪瘟病毒 |
| 1.1.1 非洲猪瘟病毒 |
| 1.1.2 非洲猪瘟病毒的检测方法 |
| 1.2 致病菌 |
| 1.2.1 致病菌 |
| 1.2.2 致病菌的检测方法 |
| 1.3 共振能量转移技术 |
| 1.3.1 荧光共振能量转移 |
| 1.3.2 化学发光共振能量转移 |
| 1.3.3 其他RET传感器在微生物检测中的应用 |
| 1.4 CRISPR/Cas系统 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas系统 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas系统在分析检测中的应用 |
| 1.5 免疫层析试纸条 |
| 1.5.1 免疫层析试纸条技术的原理 |
| 1.5.2 基于化学发光的免疫层析试纸条在检测中的应用 |
| 1.6 论文的出发点和主要内容 |
| 第2章 一种荧光DNA生物传感器用于食品中非洲猪瘟病毒的检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验原理 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 仪器与试剂 |
| 2.3.2 ss-DNA-QDs(探针 1)的制备 |
| 2.3.3 AuNPs的制备 |
| 2.3.4 ss'-DNA -AuNPs(探针 2)的制备 |
| 2.3.5 探针的表征 |
| 2.3.6 基于FRET的DNA传感器标准曲线的建立 |
| 2.3.7 实际样品分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 探针的表征 |
| 2.4.2 基于FRET的DNA传感器检测ASFV的可行性 |
| 2.4.3 基于FRET的DNA传感器检测性能的优化 |
| 2.4.4 基于FRET的DNA传感器定量检测ASFV |
| 2.4.5 基于FRET的DNA传感器检测食品中的ASFV |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 基于CRISPR/Cas 13a与化学发光共振能量转移(CRET)联用检测食品中金黄色葡萄球菌的技术研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验原理 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 仪器与试剂 |
| 3.3.2 验证适配体(aptamer)对靶标菌的特异性识别 |
| 3.3.3 荧光法验证aptamer与cRNA的互补识别 |
| 3.3.4 荧光法验证cRNA的释放 |
| 3.3.5 无酶化AuNPs的制备 |
| 3.3.6 AuNPs-RNA1和AuNPs-RNA1-HRP的制备 |
| 3.3.7 定量AuNPs-RNA1上的RNA1量 |
| 3.3.8 考察AuNPs-RNA1连接streptavidin-HRP的饱和浓度 |
| 3.3.9 验证cRNA识别CRISPR/cas13a后剪切荧光探针(FQ)的可行性 |
| 3.3.10 验证cRNA识别CRISPR/cas13a后剪切CRET探针(AuNPs-RNA_1-HRP)的可行性 |
| 3.3.11 利用CRET探针优化aptamer与c RNA的浓度比例 |
| 3.3.12 基于CRISPR/Cas 13a与CRET联用检测S. aureus的可行性实验 |
| 3.3.13 基于CRISPR/Cas 13a与CRET联用检测S. aureus的条件优化 |
| 3.3.14 基于CRISPR/Cas 13a与CRET联用定量检测S. aureus |
| 3.3.15 基于CRISPR/Cas 13a与CRET联用检测S. aureus的选择性实验 |
| 3.3.16 真实样本实验 |
| 3.3.17 免疫层析试纸条检测S. aureus |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 验证aptamer对靶标菌的特异性识别 |
| 3.4.2 验证aptamer-BHQ1与FAM-c RNA的识别 |
| 3.4.3 荧光法验证c RNA的释放 |
| 3.4.4 探针AuNPs-RNA1-HRP的表征 |
| 3.4.5 偶联到AuNPs上RNA1的定量 |
| 3.4.6 考察AuNPs-RNA1连接streptavidin-HRP的饱和浓度 |
| 3.4.7 验证cRNA识别CRISPR/cas13a后剪切荧光探针的可行性 |
| 3.4.8 验证cRNA识别CRISPR/cas13a后剪切AuNPs-RNA_1-HRP的可行性 |
| 3.4.9 利用CRET探针优化aptamer与c RNA的浓度比例 |
| 3.4.10 基于CRISPR/Cas 13a与CRET联用检测S. aureus的可行性实验 |
| 3.4.11 基于CRISPR/Cas 13a与CRET联用检测S. aureus的浓度优化 |
| 3.4.12 基于CRISPR/Cas 13a与CRET联用定量检测S. aureus |
| 3.4.13 基于CRISPR/Cas 13a与CRET联用检测S. aureus的选择性实验 |
| 3.4.14 真实样本实验 |
| 3.4.15 免疫层析试纸条检测S. aureus |
| 3.4.16 基于CRISPR/Cas 13a与CRET联用检测S. aureus与其他方法比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.1.1 论文的创新点 |
| 4.1.2 论文的不足之处 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（9）基于多组学和生物信息学的淋巴细胞分化发育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 淋巴细胞发育研究 |
| 1.1.1 淋巴细胞概述 |
| 1.1.2 NK细胞发育研究 |
| 1.1.3 胸腺T细胞发育研究 |
| 1.2 多组学和生物信息学及其应用 |
| 1.2.1 多组学概述及相关二代测序技术 |
| 1.2.2 生物信息学概述 |
| 1.2.3 多种组学技术和生物信息学在NK细胞研究中的应用 |
| 1.2.4 多种组学技术和生物信息学在T细胞发育研究中的应用 |
| 1.3 论文思路和主要工作 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样本 |
| 2.1.2 构建ATAC-seq文库的相关试剂 |
| 2.1.3 NK细胞分化研究中使用的其他试剂及仪器 |
| 2.1.4 实验小鼠 |
| 2.1.5 构建单细胞RNA-seq文库的相关试剂 |
| 2.1.6 构建单细胞ATAC-seq文库的相关试剂 |
| 2.1.7 胸腺T细胞发育研究中使用的抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 NK细胞体外培养 |
| 2.2.2 ATAC-seq文库构建 |
| 2.2.3 免疫荧光染色 |
| 2.2.4 RNA分离和real-time PCR |
| 2.2.5 慢病毒的产生和转导 |
| 2.2.6 慢病毒载体的构建 |
| 2.2.7 胸腺细胞分离 |
| 2.2.8 流式细胞术 |
| 2.2.9 胸腺细胞之间免疫突触的成像 |
| 2.2.10 细胞增殖染色 |
| 2.2.11 单细胞RNA-seq文库构建 |
| 2.2.12 单细胞ATAC-seq文库构建 |
| 2.3 ATAC-seq数据分析 |
| 2.3.1 测序数据预处理 |
| 2.3.2 数据质量检测 |
| 2.3.3 差异分析 |
| 2.3.4 鉴定时期特异性的基因和染色质开放区域 |
| 2.3.5 转录因子富集分析 |
| 2.3.6 转录因子“足迹”分析 |
| 2.3.7 基因模块和蛋白质相互作用分析 |
| 2.3.8 转录调控网络构建 |
| 2.4 单细胞数据分析 |
| 2.4.1 单细胞测序 |
| 2.4.2 单细胞RNA-seq数据预处理 |
| 2.4.3 细胞分群和鉴定 |
| 2.4.4 整合Tabula Muris小鼠胸腺单细胞数据 |
| 2.4.5 发育路径和假时间分析 |
| 2.4.6 鉴定动态变化的基因 |
| 2.4.7 利用SCENIC富集转录因子 |
| 2.4.8 鉴定转录因子和差异基因的调控关系 |
| 2.4.9 单细胞ATAC-seq数据分析 |
| 2.4.10 单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq整合分析 |
| 2.4.11 细胞周期分析 |
| 2.4.12 人和鼠跨物种分析 |
| 第三章 NK细胞分化的转录调控研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 NK细胞相关的免疫疗法 |
| 3.1.2 体外诱导NK细胞 |
| 3.1.3 应用染色质可及性研究转录调控网络 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.2.1 获得NK细胞分化过程中的染色质可及性图谱 |
| 3.2.2 NK细胞分化过程中染色质开放区域的动态变化 |
| 3.2.3 调控NK细胞分化的转录因子 |
| 3.2.4 FOSL2和EGR2调控NK细胞分化相关的基因 |
| 3.2.5 FOSL2和EGR2影响NK细胞的分化 |
| 3.2.6 NK细胞分化过程中转录调控网络的动态变化 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 单细胞分辨率下胸腺细胞发育研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 研究结果 |
| 4.2.1 单细胞转录组图谱描述胸腺中αβ-T细胞的发育 |
| 4.2.2 单细胞ATAC-seq揭示新的与胸腺细胞发育相关的转录因子 |
| 4.2.3 Ly6d和CD2可以作为分选DP细胞各个亚群的新的表面marker |
| 4.2.4 DPbla细胞在细胞周期中发育为DPre细胞 |
| 4.2.5 DP细胞亚群之间的差异与胸腺T细胞发育相关 |
| 4.2.6 胸腺细胞充当CD8相关胸腺选择的抗原呈递细胞 |
| 4.2.7 物种特异性转录因子在人鼠胸腺细胞发育中调控跨物种的转录差异 |
| 4.3 本章小结 |
| 4.4 本章研究中使用的简称 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 5.1 NK细胞分化的转录调控研究 |
| 5.2 单细胞分辨率下胸腺细胞发育研究 |
| 参考文献 |
| 附录一 ATAC-seq接头序列信息 |
| 附录二 ATAC-seq测序质量 |
| 附录三 单细胞ATAC-seq接头序列信息 |
| 附录四 本研究中使用的其他试剂、耗材及仪器 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（10）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
四、Cloning and Characterization of Fiber-specific Genes Through High Throughput Analysis（论文参考文献）
- [1]小鼠Kupffer细胞的转分化研究[D]. 李昕宇. 吉林大学, 2021(01)
- [2]基于RNA探针的拟干酪乳杆菌启动子库构建及高质量乳酸生产菌株研究[D]. 刘雪华. 华东理工大学, 2021(08)
- [3]戴瑞羊乳腺上皮细胞建系及Myostatin基因g.+6723位点HRM快速基因分型方法的建立[D]. 张晓然. 内蒙古大学, 2021(12)
- [4]沙门氏菌全基因组数据库构建及其分子靶标挖掘与应用研究[D]. 尚玉婷. 江南大学, 2021
- [5]黑色素瘤耐药性基因相互作用和机制研究[D]. 余裕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [6]尿素循环障碍的临床与遗传学研究及PBMC来源hiPSC和肝类器官的建立[D]. 阎贝贝. 山东大学, 2021(10)
- [7]单细胞技术在Lepr+骨髓基质细胞分析中的应用及单细胞ATAC-seq分析软件的开发[D]. 郭晶鑫. 浙江大学, 2021(01)
- [8]基于共振能量转移检测食品中致病微生物的技术研究[D]. 乐莉. 西南大学, 2021(01)
- [9]基于多组学和生物信息学的淋巴细胞分化发育研究[D]. 李坤. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [10]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)