一、人树突状细胞体外经HBsAg刺激后的抗病毒作用（论文文献综述）
郭玲[1]（2020）在《CXCR5+CD8+T细胞在慢性HBV感染中的特点与免疫作用研究》文中研究说明背景慢性乙型病毒性肝炎是一种免疫介导肝脏损伤的疾病。宿主的免疫功能对乙型肝炎病毒（HBV）感染的控制和疾病的临床转归有重要作用。CD8+T细胞免疫反应在控制慢性HBV感染中占据重要的地位,其功能“耗竭”是导致HBV感染慢性化的重要原因。但不断有研究表明CD8+T细胞是由表型和功能异质的亚群组成的。不同CD8+T细胞亚群可能在HBV感染中发挥不同作用。因此,深入探索CD8+T细胞的亚群可能有助于寻找慢乙肝治愈的新策略。目的本研究通过慢性HBV感染患者横向队列和抗病毒治疗患者的纵向队列探索CXCR5+CD8+T细胞在慢性HBV感染和抗病毒治疗中的表型和功能特点;分析肝内CXCL13表达对CXCR5+CD8+T细胞的趋化作用及与预测抗病毒治疗疗效的关系;最后通过小鼠细胞免疫过继实验阐明CXCR5+CD8+T细胞在肝内发挥抗病毒作用的免疫机制。方法在健康志愿者（HCs）、慢性HBV感染患者横向人群和临床抗病毒治疗纵向队列中,利用流式细胞术、酶联免疫实验、RNA测序等方法检测CXCR5+CD8+T细胞的表型与功能特点,利用体外共培养实验检测其对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用。接着利用HBV感染者的肝癌（HCC）标本分析肝内CXCR5+CD8+T细胞的特点。另外,我们还通过检测抗病毒治疗纵向队列以及停药队列患者血清CXCL13的水平,并分析其与患者预后的关系,明确CXCL13趋化CXCR5+CD8+T细胞到肝内发挥抗病毒的分子机制。然后,我们利用高压尾静脉注射法（HDI）注射pAAV-HBV1.2质粒建立HBV感染小鼠模型,并利用IL-21受体基因敲除（IL-21RKO）小鼠和B细胞缺陷型（μMT）小鼠,检测CXCR5+CD8+T细胞在外周血、肝和脾脏中的表型与功能差异,以及探索IL-21R信号通路和B细胞对CXCR5+CD8+T细胞功能的影响。最后通过CXCR5+CD8+T细胞过继免实验,明确CXCR5+CD8+T细胞的抗病毒作用。结果1.慢性HBV感染患者CXCR5+CD8+T细胞中的特点1.1 HBV感染患者与HBsAg loss（慢性HBV感染患者HBsAg清除）患者CXCR5+CD8+T细胞频数显着高于HCs,且HBsAg loss患者CXCR5+CD8+T细胞频数也高于HBV组。1.2 相比于 CXCR5-CD8+T 细胞,CXCR5+CD8+T 细胞上 PD-1、CTLA-4、TIM-3、CD38、CD69、CCR7、CD45RO、CD62L 表达更高,分泌干扰素（IFN）-γ、IL-2、IL-4、IL-17和IL-21能力更增强,但分泌granzyme B能力降低。1.3我们通过收集HBV感染的肝癌患者肝内淋巴细胞与外周血单个核细胞（PBMC）,发现肝内 CXCR5+CD8+T 细胞表达更高的 PD-1、CTLA-4、TIM-3、CD38、CD69、HLA-DR和CCR2等趋化因子受体。且肝内CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ能力比外周血CXCR5+CD8+T细胞强。通过五聚体标记HBV C18-27肽特异性CD8+T细胞时,我们发现肝内HBV特异性CXCR5+CD8+T细胞中的比例显着高于外周血。2.外周血CXCR5+CD8+T细胞与CXCL13表达预测替比夫定抗病毒治疗疗效2.1我们通过检测替比夫定抗病毒治疗队列患者PBMC中CXCR5+CD8+T细胞的动态改变,结果发现52周完全应答的患者（CR组）基线和第12周外周血CXCR5+CD8+T细胞频数升高,且该细胞亚群分泌IFN-γ能力在基线和第24周也显着升高。2.2抗病毒治疗基线和治疗第12周外周血CXCR5+CD8+T细胞频数与第52周时HBV DNA水平呈显着负相关。2.3通过替比夫定抗病毒治疗纵向队列血清检测,发现在抗病毒治疗的基线、第12周和第52周时间点,完全应答（CR）组患者血清CXCL13水平显着高于非完全应答（NCR）组。抗病毒治疗停药后,未复发组患者血清CXCL13水平也显着高于复发组。而我们利用HBV感染患者肝穿标本,发现肝内CXCL13 mRNA表达水平与外周血CXCL13水平呈正相关。3.CXCR5+CD8+T细胞通过分泌IFN-γ和辅助B细胞产生抗体控制HBV感染3.1分选外周血CXCR5+CD8+T细胞和CXCR5-CD8+T细胞,体外使用anti-CD3/CD28刺激,结果发现,相比于CXCR5-CD8+T细胞培养组,CXCR5+CD8+T细胞的培养上清中IFN-γ分泌升高,而granzymeB分泌减弱。利用培养上清刺激HepG2.2.15细胞后,我们发现CXCR5+CD8+T细胞组中HBsAg和HBeAg表达量降低更显着,而对HepG2.2.15细胞的杀伤作用更弱。3.2分选CXCR5+CD8+T细胞和CXCR5-CD8+T细胞后分别与B细胞共培养,结果发现CXCR5+CD8+T细胞的共培养体系中,分泌HBcAb的B细胞频数增加。4.HBV感染小鼠模型中CXCR5+CD8+T细胞的特点及对病毒控制的作用4.1通过注射pAAV-HBV1.2质粒建立HBV感染小鼠模型,我们发现HBV感染小鼠脾脏和肝内CXCR5+CD8+T细胞频数均高于外周血。与CXCR5-CD8+T细胞相比,CXCR5+CD8+T细胞上高表达PD-1、CCR7、CD62L和ICOS等受体。4.2分离肝、脾淋巴细胞后,通过anti-CD3/anti-CD28刺激,我们发现脾脏和肝脏的CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ和IL-21能力显着强于CXCR5-CD8+T细胞。而肝内CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ能力强于脾脏。4.3我们分选CXCR5+CD8+T细胞和CXCR5-CD8+T细胞,通过尾静脉过继免疫到HBV感染小鼠上,发现过继转移24h和48h时可以在肝脏内检测到到较高的CXCR5+CD8+T细胞频数。而且接受了 CXCR5+CD8+T细胞的小鼠血清HBsAg水平显着降低,且可以检测到相对更高水平的HBcAb。5.影响CXCR5+CD8+T细胞的抗病毒作用的分子机制5.1 HBV相关性HCC患者肝脏和外周血CXCR5+CD8+T细胞的IL-21R表达较CXCR5-CD8+T细胞的高,且其在肝脏内表达也显着高于外周血。5.2体外实验使用PD-1或TIM-3抑制性抗体以及IL-21刺激均可以使CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-y增加,而IL-21联合免疫检查点抑制剂作用更强。5.3在IL-21R-KO小鼠上建立HBV感染小鼠模型,结果发现IL-21R-KO小鼠和WT小鼠肝脏、脾脏或外周血CXCR5+CD8+T细胞频数无差异,但IL-21R KO小鼠肝内和外周血CXCR5+CD8+T细胞IFN-γ的能力下降。5.4在μMT小鼠上建立HBV模型,结果发现μMT小鼠肝脏和脾脏CXCR5+CD8+T细胞频数较WT小鼠显着降低,同时肝内和外周血CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力下降。结论CXCR5+CD8+T细胞频数和其IFN-γ分泌功能与慢性HBV感染者的替比夫定抗病毒治疗应答相关。CXCR5+CD8+T细胞可以通过IFN-γ分泌以及辅助B细胞分泌抗体,发挥抗病毒作用。慢性HBV感染者肝炎活动时CXCL13表达升高,有助于趋化CXCR5+CD8+T细胞到肝内从而控制HBV。虽然CXCR5+CD8+T细胞呈现部分耗竭状态,但是体外和动物实验表明,IL-21可以显着增强其抗病毒功能。
吕梦娇[2]（2020）在《过表达Tapasin的Dexs诱导CD8+TLC自噬增强CTLs反应抑制HBV复制的研究》文中研究说明目的:明确转染过表达分子伴侣Tapasin慢病毒的树突状细胞来源外泌体（TPN-Dexs）是否成功表达Tapasin;探讨TPN-Dexs促进T淋巴细胞（TLC）活化和诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应的能力,并进一步验证其在M-Tg HBV转基因小鼠体内的抗病毒作用;明确TPN-Dexs是否促进CD8+TLC自噬,并检测信号通路相关蛋白在诱导CD8+TLC自噬中蛋白水平的变化,阐明PI3K/AKT/mTOR通路参与CD8+TLC自噬发生。方法:1.将H149:pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag慢病毒质粒中的克隆位点MCS基因片段替换成Tapasin基因,构建过表达Tapasin的H8902:pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-Tapasin-3Flag慢病毒质粒,包装成慢病毒载体;将慢病毒H149和H8902分别转染至树突状细胞（DCs）,观察绿色荧光蛋白GFP表达,并采用超高速差速离心法收集其分泌的外泌体;通过扫描电镜、粒径分析、Western blotting和外泌体摄取实验鉴定外泌体提取成功且高表达Tapasin,即TPN-Dexs。2.体外验证TPN-Dexs功能:将PBS、HBcAg、Dexs、TPN-Dexs、TPN-Dexs+Rap、TPN-Dexs+3-MA分别与小鼠脾脏原代TLC共培养,CCK8法检测TLC增殖能力,ELISA法检测其分泌细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α和IL-10）水平,LDH法检测其诱导CTL免疫反应的能力;流式分选仪分选出小鼠原代CD8+TLC,分别加入PBS、Dexs、TPN-Dexs、TPN-Dexs+Rap培养,通过透射电镜观察自噬小体,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin-1表达。3.体内验证TPN-Dexs功能:用PBS、HBcAg、IFN-α、Dexs、TPN-Dexs、TPN-Dexs+Rap、TPN-Dexs+3-MA分别通过尾静脉注射免疫M-Tg HBV转基因小鼠,每周一次,免疫4次后处死M-Tg HBV转基因小鼠,收集血清、肝脏和脾脏;检测血清HBV DNA、ALT、AST水平,免疫组化染色检测肝细胞HBcAg、HBsAg表达;提取脾脏TLC,培养并检测TLC增殖、分泌细胞因子和诱导CTL免疫反应的能力（方法同上）;分选CD8+TLC培养并检测自噬小体和自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin-1表达（方法同上）,同时Western blotting和Real-Time PCR检测不同自噬条件下AKT和mTOR蛋白表达情况,以验证自噬发生机制。结果:1.GFP荧光表达表明慢病毒转染成功;电镜观察外泌体呈囊泡状,NTA分析粒径大小在100至150nm左右,WB显示H8902成功表达Tapasin,而对照组不表达,两者外泌体皆不同程度表达Alix、HSP90和CD81,共聚焦显微镜观察DCs吞噬PKH26标记的外泌体的现象,且随着时间逐渐至细胞核,表明TPN-Dexs提取成功。2.体外实验结果发现,TPN-Dexs组TLC增殖、分泌细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α和IL-10以及细胞毒性CTLs反应均增强,且诱导自噬小体增加,自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin-1表达增加;与TPN-Dexs组相比,TPN-Dexs+Rap（自噬诱导剂）组TLC各项检测增加更多,而TPN-Dexs+3-MA（自噬抑制剂）组TLC各项检测降低,这些结果表明在体外TPN-Dexs能促进TLC增殖,促进细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α和IL-10分泌,增强CTLs反应,同时诱导CD8+TLC发生自噬。3.M-Tg HBV转基因小鼠体内实验结果,与体外实验结果一致,表明在体内TPN-Dexs能促进TLC增殖,促进细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α和IL-10分泌,增强CTLs反应,同时诱导CD8+TLC发生自噬;肝脏HE和免疫组化染色结果表明TPN-Dexs能升高小鼠血清ALT和AST水平,降低肝脏HBsAg、HBcAg表达,同时抑制HBV病毒复制;从TPN-Dexs组与TPN-Dexs+3-MA组的AKT表达可以看出,TPN-Dexs能促进AKT表达上调,当加入PI3K抑制剂3-MA时AKT表达下调,表明3-MA抑制了TPN-Dexs激活的PI3K/AKT通路;从TPN-Dexs组、TPN-Dexs+Rap组的mTOR表达可以看出,TPN-Dexs能使mTOR表达下调,从而促进自噬发生,加入mTOR抑制剂Rap后mTOR表达显着下调,表明TPN-Dexs与Rap协同下调mTOR表达。这些结果表明PI3K/AKT/mTOR信号通路参与诱导CD8+TLC自噬发生。结论:TPN-Dexs在体内和体外均能促进TLC增殖,促进细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α和IL-10分泌,增强CTLs反应,同时诱导CD8+TLC自噬;在体内PI3K/AKT/mTOR信号通路参与诱导CD8+TLC自噬发生;在M-Tg HBV转基因小鼠体内TPN-Dexs能抑制HBV病毒复制,同时升高小鼠血清ALT、AST水平和降低肝脏HBsAg、HBcAg表达。
金莲花[3]（2019）在《LPS/TLR4信号通路对肝星状细胞活化及增殖的作用机制》文中研究指明目的:本实验探讨脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）/Toll 样受体 4（Toll-like receptor-4,TLR4）信号通路对肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）活化及增殖的作用机制,为以HSC作为靶标治疗非酒精性脂肪肝纤维化提供新思路。方法:HSC分4组:①空白组;②对照组;③样本组1（100ng/ml LPS）④样本组2（200ng/mlLPS）,每组5个复孔,继续培养24h、48h、72h、96h,采用MTT法测定HSC存活率。另分3组:①对照组;②100ng/ml LPS组;③200ng/ml LPS组,每组各5个培养皿,再继续培养12h、24h、36h、48h,分别留取细胞提取总RNA,采用Real-Time PCR法测定 100ng/ml LPS 组第 12h、24h、36h 的 TLR4、type I collagen、MMP-13,2、TIMP-1,2、BAMBI mRNA水平;用第48h的细胞,提取蛋白质,采用蛋白免疫印迹法测定α-SMA和TLR4表达水平;另分3组:①对照组;②LPS组、③TLR4中和抗体组;采用MTT法检测各组细胞增殖情况,采用Real-Time PCR法比较各组的type I collagen和BAMBI mRNA水平。结果:1.LPS添加后HSC细胞增长非常旺盛,呈星形或多边形,体积显着增大,胞突向外伸展,胞质内脂滴显着减少甚至消失,细胞间相互融合呈局灶性或单层生长,以200ng/mlLPS组更显着。2.MTT法检测结果显示:以不同浓度加入LPS后,细胞增殖率明显增加,呈时间依赖性,差异有统计学意义（P<0.01）,与同期对照组相比,经LPS处理后增殖率明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）。加入TLR4中和抗体1mg/ml和LPS 100ng/ml后,与对照组相比,添加LPS组细胞增殖率明显升高,呈时间依赖性,差异有统计学意义（P<0.01）,而TLR4中和抗体组则增高不明显（P>0.05）。3.Real-Time PCR检测结果显示:经100ng/ml LPS处理后,HSC细胞的TLR4、type I collagen、MMP-13,2 和 TIMP-1mRNA 表达量与对照组相比,24h、36h明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）,与LPS处理0小时比较24h、36h显着升高,差异有统计学意（P<0.01）,而TIMP-2、BAMBI mRNA的表达量与对照组相比,24h、36h明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）。HSC 中加入 TLR4 中和抗体（1mg/mL）和 LPS（1OOng/ml）后,与对照组相比,添加LPS组type I collagen mRNA表达量明显升高,BAMBI mRNA表达量明显降低,差异有统计学意义（p<0.01）,而抗TLR4中和抗体组则无明显差异（p>0.05）。4.蛋白免疫印迹法检测结果示加入LPS的两组中TLR4、α-SMA的蛋白表达量,与对照组相比显着增高,呈浓度依赖性,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:1.LPS刺激HSC的活化,增加TLR4的表达。2.LPS通过LPS/TLR4信号通路促进HSC的增殖及活化。3.活化的 HSC 表达 α-SMA、MMP-13,2、TIMP-1,2、type Ⅰ collagen。4.LPS通过TLR4信号通路,下调BAMBI的表达,促使HSC活化。
葛军[4]（2017）在《慢性乙型肝炎患者体内Toll样受体7的表达和抗病毒功能及其与Peg-IFN-α-2a抗病毒治疗的关系》文中研究指明研究背景:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界函待解决的公共卫生难题。寻找新的治疗靶点是当前的研究热点和难点。大量研究表明,宿主的免疫系统在慢性HBV感染中发挥着重要作用,其中,Toll样受体（TLR）的表达抑制及其介导的天然免疫功能失衡也参与其中。TLR参与识别多种病原体,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。TLR7配体（TLR7-L）用于慢性HBV感染治疗,在小鼠、土拨鼠及黑猩猩模型中均显示出良好的应用前景。并且,我们前期实验也发现,TLR7-L刺激慢性乙型肝炎（CHB）患者的PBMC,可以抑制HepG2.2.15细胞内HBV复制。提示以TLR7为靶点的天然免疫应答调控,可以作为新的慢乙肝治疗研究方向。研究目的:检测TLR7在慢乙肝感染不同阶段的表达和与抗病毒治疗应答的关系,并进一步探讨其在CHB患者体内可能的抗病毒机制。研究方法:1.研究对象1.1横向研究:纳入3组共106例慢性HBV感染患者（34例免疫耐受[IT]、39例免疫活化[IA]及33例非活动性携带[IC]）及31例健康对照（HC）。1.2纵向研究:纳入25例Peg-IFN-α-2a治疗的HBeAg+CHB患者,根据停药后24w是否仍具有HBeAg血清学转换及HBVDNA<1000 copies/mL分为持续应答组（SVR）和非持续应答组（NSVR）。2.动物建模6-8周龄雄性C57BL/6j小鼠,使用HBV1.2质粒和/或小鼠IFN-α-2a表达质粒高压尾静脉注射建模,联合/不联合尾静脉注射TLR7-L,定期监测sAg、eAg的表达,并检测肝内及脾内特异性及非特异性CD8+T细胞应答。3.实验方法外周血单个核细胞（PBMC）采用梯度离心法进行分离。TLR7及目的基因的表达使用realtime-RT-PCR进行测定。目的细胞亚群（CD19+B细胞等）使用流式分选及磁珠分选获得。细胞因子的分泌,细胞增殖、活化及抗体分泌等分别使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验、酶联免疫斑点测定法进行检测。研究结果1.横向研究慢性HBV感染时,IT组和IC组TLR7的表达明显低于HC组,而IA组TLR7的表达显着恢复。并且与ALT水平呈正相关。2.纵向研究25例Peg-IFN-α-2a治疗患者PBMC上TLR7的表达在治疗期间稳定增加,在第24周时,两组TLR7的表达具有明显的统计学差异,提示24周稳定高表达TLR7的患者可能更容易在治疗停止后获得持续应答。3.功能研究3.1 TLR7体外抗病毒效应TLR7-L刺激可以诱导PBMC分泌大量的IFN-α,且IA患者明显高于HC。将HepG2.2.15细胞暴露于TLR7-L刺激的PBMC上清,可以明显抑制HBV相关抗原表达。同时,IFN-α刺激可以上调PBMC中TLR7的表达,提示两者间存在相互促进的正反馈调节效应。3.2 TLR7对B细胞功能的影响TLR7在B细胞中高表达,使用IFN-α刺激后,B细胞上TLR7的表达显着增加。TLR7-L和IFN-α可以显着增加B细胞增殖、活化的能力和细胞因子、抗体的表达及分泌,且两者间存在明显的协同效应。3.3 TLR7体内抗病毒效应TLR7-L可以与IFN-α协同作用,明显增高小鼠肝内及脾内CD8+T细胞的频数,并有促进脾内特异性CD8+T细胞向靶器官肝脏募集的趋势。同时,协同刺激组肝内及脾内能够产生IFN-γ及TNF-α的特异性及非特异性CD8+T细胞频数也明显增加。结论:TLR7可以通过诱导IFN-α的分泌对HBV复制发挥抑制效应,而其表达和抗病毒作用在IA患者中均上调。此外,通过Peg-IFN-α-2a治疗,TLR7表达上调,24周时TLR7高表达可能与停药后的持续病毒学应答相关。并且TLR7-L可以与IFN-α协同作用增强B细胞的功能和慢性HBV感染小鼠体内CD8+T细胞应答。提示Peg-IFN-α-2a与TLR7-L序贯治疗策略在CHB患者中可能会具有很好的应用前景。
陈坤[5]（2017）在《组蛋白甲基转移酶SETD2调控干扰素介导的抗病毒效应的分子机制研究》文中研究指明Ⅰ型干扰素（Type Ⅰ Interferon,IFN-Ⅰ）是一类由机体产生的具有抗病毒功能的细胞因子,它通过激活细胞内JAK-STAT信号通路诱导一系列干扰素诱导基因（IFN-stimulated gene,ISG）的表达,并通过这些基因直接发挥抑制病毒生命周期、激活免疫细胞对感染病毒的细胞进行杀伤等作用,为机体建立起抗病毒感染的第一道防线。相反,干扰素信号调节的异常与感染性疾病和过度的炎症反应的发生密切相关。因此,机体内的干扰素信号需要受到严格且精确的调控以确保其在实现抗病毒作用的同时,避免因为信号异常产生细胞毒性,破坏机体稳态。干扰素信号的调控是细胞内多个水平的分子调控间相互协同作用的结果。近年来,表观遗传调控与非经典的蛋白质翻译后修饰在该信号传导过程中的作用被逐渐揭示,然而它们调控干扰素介导的抗病毒免疫应答的分子机制目前尚不清楚。为了研究干扰素抗病毒免疫应答的表观遗传调控及其机制,本研究首先以稳定表达HBV的人肝癌细胞株HepG2.2.15为模型,探索调控IFN抗病毒效应的表观遗传修饰酶。我们针对目前已经报道的编码所有表观遗传修饰的基因（共711个基因）进行高通量的RNA干扰筛选,并通过初步筛选和二次验证,发现组蛋白甲基转移酶SETD2的干扰显着减弱了 IFNα抗HBV的效应。即SETD2的干扰使IFNα作用下HepG2.2.15细胞内HBV拷贝数增加,HBsAg的分泌量增多。此外,在HBV急性感染的小鼠模型实验中发现,肝脏特异性敲除Setd2小鼠的血清中具有更高的HBsAg的分泌、其肝脏组织有更多的HBcAg的表达。进一步研究发现,在不携带病毒的肝细胞系中敲除或敲低SETD2显着地减弱了 IFNα诱导的STAT1磷酸化,并广泛地降低了ISG表达和IFNα抑制病毒（如HBV、VSV）复制的效应。随后进一步证明SETD2也能够促进Ⅱ型与Ⅲ型IFN的信号转导。上述结果表明,SETD2能够通过正向调控IFN信号转导,促进IFN的抗病毒效应。接着,我们对SETD2介导干扰素的抗病毒效应的分子机制展开研究。通过体内和体外的蛋白互作分析发现,含有SET结构域的SETD2截短体片段可以与STAT1发生直接的相互作用,并通过SET结构域发挥其甲基转移酶活性,催化STAT1的第525位赖氨酸发生单甲基化修饰（STAT1-K525mel）。同时,STAT1 K525的单甲基化修饰促进了 IFNα诱导的STAT1磷酸化激活,进而激活下游ISG的表达。此外,SETD2还可以选择性的催化一些ISG（如ISG15等）远端启动子区发生组蛋白H3K36me3的修饰从而直接促进这些基因转录活化,上调它们的表达。我们还通过RNA-seq鉴定到一个新的ISG——RARRES3,初步研究显示该基因具有显着的抗HBV复制的功能。总的来说,SETD2通过蛋白质翻译后修饰和表观遗传修饰这两种重要的调节方式正向调控IFN下游的信号传导,从而增强IFN介导的抗病毒效应。综上所述,本研究发现了甲基转移酶SETD2正向调控IFN信号的新功能,鉴定出IFN信号关键转录因子STAT1上一个能够增加其磷酸化激活的新的甲基化修饰位点——K525,同时揭示了 SETD2通过催化STAT1的甲基化修饰以及ISG基因远端启动子区的H3K36me3修饰以增强IFN信号以及抗病毒活性的新机制,从而进一步完善了IFN信号的调控网络,并为临床上研发新的抗病毒药物提供新的潜在的研究靶标。
贾琳,孟庆华[6]（2015）在《乙型肝炎病毒感染中树突细胞免疫异常的研究进展》文中认为病毒感染早期,免疫反应的诱发因素被认为是影响疾病临床转归的关键因素。DC起源于骨髓中的髓样前体细胞,主要来源于单核细胞系,在启动免疫应答中起着重要作用[1]。人类DC表达CD45、人类白细胞抗原（HLA）-DR,不表达lineage谱系标记（CD3、CD14、CD16、CD19和CD56）。根据是否表达整合蛋白CD11c和CD123（IL-3受体α链）,将DC分为髓系DC[mDC（CD11c+、CD123-）]和浆系DC[pDC（CD11c-、CD123+）][2]。mDC表达TLR3、TLR4、TLR7和TLR8,主要产生IL-12,是功能最强的抗原提呈细胞（APC）,
李平利[7]（2014）在《硫酸化可德兰多糖的制备、体外免疫调节、抗乙肝病毒感染活性及体内用作乙肝疫苗佐剂研究》文中提出研究目的乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）感染可以造成急慢性肝脏疾病,如病毒性肝炎、肝硬化及肝癌等,是危害人类健康的主要病因。我国HBV携带者约占全国总人口的10%,是乙型肝炎的高发区。目前临床使用抗HBV感染的典型药物有拉米夫定和α-干扰素,但是存在容易诱发病毒耐药突变以及副作用较多的问题,限制了疗效的发挥。HBV感染能够破坏机体免疫平衡,导致机体抗病毒免疫功能低下或紊乱,因此,抑制HBV感染需要激活机体抗病毒免疫应答。给易感人群接种乙肝疫苗是预防HBV感染的有效手段,但是仍有5%-10%的人接种后抗体水平很低或者无应答。铝佐剂是目前唯一可以用于乙肝疫苗的佐剂,虽然较安全,但是因其不能引起机体细胞免疫应答,使疫苗在预防和治疗HBV感染方面存在一定的不足,因而研制新型乙肝疫苗佐剂尤为重要。可德兰多糖（curdlan）是由产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）发酵产生的一种胞外多糖,具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗凝血等活性,因其安全无毒且加热可成凝胶,被FDA批准用于食品工业。研究发现,curdlan硫酸化产物—硫酸化可德兰（curdlan sulfate）具有良好的抗HIV活性,并已对其开展Ⅱ期临床试验。鉴于curdlan和curdlan sulfate二者良好的免疫调节及抗病毒活性,我们期望通过本课题研究能够得到一种具有抗病毒感染作用的免疫调节剂,能够在免疫治疗方面发挥抗HBV感染的作用,同时还能增强重组乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）的免疫原性,改善疫苗在预防和治疗HBV感染方面的应用。通过研究curdlan sulfate对小鼠免疫相关细胞的影响,考察其体外免疫调节活性,采用表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）技术研究其结合的受体；利用HepG2.2.15细胞上清液浓缩得到的HBV感染HepG2及HepaRG细胞,研究curdlan sulfate是否可以干扰病毒感染细胞的过程,并用SPR技术研究多糖与重组HBsAg的结合情况；最后,将curdlan sulfate与重组HBsAg联合注射BALB/c小鼠,研究其能否增强疫苗的免疫原性,提高产生的抗体水平。本课题研究将为curdlan sulfate开发成为一种新型抗HBV的免疫预防及治疗剂提供重要的依据和基础。研究方法1Curdlan sulfate的制备及结构表征首先我们采用DMSO为溶剂、SO3-吡啶为硫酸化试剂,对curdlan进行修饰。通过控制反应温度,制备出四种curdlan sulfates。采用红外光谱分析技术鉴定所制备样品结构,凝胶渗透色谱-多角度激光散射（GPC-MALLS）联用技术测定重均分子量（Mw）,元素分析仪测定硫（S）含量。2Curdlan sulfate体外免疫调节活性及机制的研究分离小鼠脾淋巴细胞,采用MTT法测定curdlan sulfate对其增殖的影响。采用小鼠RAW264.7细胞系,研究curdlan sulfate对巨噬细胞活化的作用,包括：用细胞吞噬中性红和FITC-dextran实验来分析其对巨噬细胞吞噬功能的影响；Griess试剂法测定RAW264.7细胞经curdlan sulfate作用后产生NO的水平；ELISA试剂盒测定curdlan sulfate对RAW264.7分泌IL-6、IL-1β及TNF-α细胞因子的影响；iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-a的mRNA水平采用荧光定量PCR （FQ-PCR）进行分析。分离并培养小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）,采用流式细胞术检测curdlan sulfate对BMDCs表面成熟标志分子表达的影响。机制研究采用Westernblot实验检测RAW264.7细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）途径相关蛋白的表达以及NF-κB的活化情况,并运用SPR技术分析curdlan sulfates与小鼠重组dectin-1的结合情况。3Curdlan sulfate体外抗HBV感染活性及机制的研究采用PEG8000对HepG2.2.15细胞上清液进行浓缩得到HBV,用其感染HepG2及HepaRG细胞。采用FQ-PCR测定受感染细胞中HBV DNA的含量来考察curdlan sulfate对HBV黏附及入胞过程的影响；用HBsAg及HBeAg ELISA试剂盒检测受感染细胞培养第7d的细胞上清中HBsAg及HBeAg的含量,来考察curdlan sulfate对HBV感染细胞的影响；采用氯酸钠及硫酸乙酰肝素酶（HPA）处理HepG2及HepaRG细胞,用FQ-PCR检测HBV感染细胞的情况,并进一步用SPR技术分析curdlan sulfates与重组HBsAg的结合情况,探讨硫酸根在curdlansulfate与HBsAg结合中的作用,并进一步分析其作用机制。4Curdlan sulfate体内用作乙肝疫苗佐剂的研究Curdlan sulfate与重组HBsAg联合免疫BALB/c小鼠,于第0、14、28d共接种3次,第35d取小鼠脾淋巴细胞,采用流式细胞仪检测脾淋巴细胞巨噬细胞募集和树突状细胞成熟、CD4+、CD8+分群以及CD4活化情况；取小鼠脾淋巴细胞进行体外培养并用HBsAg再刺激,测定其增殖能力以及分泌IFN-γ、IL-17A、 IL-4、IL-10的水平；流式细胞术胞内染色法分析小鼠脾淋巴细胞中Th1、Th2及Th17类细胞因子的胞内表达情况。另外,在每次免疫后7d收集小鼠血清,用anti-HBs ELISA试剂盒测定血清中抗体的含量,并用间接ELISA方法测定anti-HBs免疫球蛋白亚型IgG1、IgG2a的含量,分析小鼠产生的免疫应答类型。研究结果1Curdlan sulfate的制备及结构表征通过控制反应条件,共制备了四种不同分子量及S含量的curdlan sulfates,分别命名为CS1、CS2、CS3及CSⅢ。红外光谱检测结果显示,curdlan sulfates在curdlan原有特征吸收峰基础上,在1258cm-1及816cm-1附近处出现了不对称S=O的伸缩振动峰及对称C-O-S的伸缩振动峰,说明curdlan已被成功硫酸化修饰。CS1、CS2、CS3和CSIII的Mw经GPC-MALLS测定为25.87kDa、87.03kDa、171.9kDa和62.54kDa,S含量分别为（4.806±0.30）%、（6.288±0.03）%、（9.340±0.16）%和（7.312±0.11）%。由于CS3含有最高的S含量,下面的活性检测均采用CS3样品进行实验。2CS3体外免疫调节活性与MAPKs途径有关CS3促进小鼠细胞脾淋巴细胞增殖效果显着,在400μg/mL时增殖率达到85.87%,但对RAW264.7细胞的增殖没有明显作用。CS3能增强RAW264.7吞噬中性红及FITC-dextran的能力,显着提高细胞产生NO、IL-6、IL-1β及TNF-α的水平,而且对细胞中iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-a mRNA的水平也有一定的提高,并呈剂量依赖性。另外,CS3可促进BMDCs上调表达MHCⅡ、CDllc、 CD40、CD80、CD86分子,产生IL-12和IL-6,刺激细胞成熟。Western blot结果显示CS3可以通过促进MAPKs途径中Erkl/2和SAPK/JNK的磷酸化来传递信号,活化NF-κB,提高iNOS的表达。SPR技术表明curdlan sulfates可以与curdlan已知受体dectin-1结合,说明curdlan经硫酸化修饰后主要受体并未改变。3CS3可以抑制HBV感染的黏附过程FQ-PCR结果显示,CS3可以抑制HBV与HepG2及HepaRG细胞的黏附,500μg/mL时的抑制率为分别52.06%、50.43%；HBV感染细胞后上清中HBsAg及HBeAg的测定结果表明,CS3可以抑制HBV对细胞的感染。CS3对黏附过程的抑制率远高于其对HBV感染细胞的抑制率,说明CS3抗HBV感染的作用阶段主要是干扰病毒黏附入胞过程,而不是干扰病毒DNA复制等过程。氯酸钠和HPA作用的细胞不表达或低表达硫酸乙酰肝素（HS）,用HBV感染分别经氯酸钠和HPA处理后的HepG2细胞,发现病毒感染水平分别降低为阴性对照的（11.44±2.30）%和（57.17±0.79）%；感染经二者处理后的HepaRG细胞,感染率分别降低为阴性对照的（9.86±2.29）%和（49.70±±16.07）%。SPR技术分析发现curdlan sulfates可以与重组HBsAg结合,并且硫酸根含量越高,亲和力越强,提示CS3可能与HBV包膜蛋白结合,干扰HBV入胞。4CS3可以增强重组HBsAg免疫原性流式细胞术检测经3次免疫接种后的小鼠脾淋巴细胞结果表明,CS3联合重组HBsAg免疫小鼠,可以促进巨噬细胞在脾脏中的募集,F4/80阳性细胞数增加,占脾淋巴细胞总数的（34.27±±3.47）%,明显高于商品HB疫苗（HB vaccine）组（**p<0.01）；同时可以刺激树突状细胞的成熟,使细胞高表达MHCⅡ、CD11c、CD40和CD86分子；CD4+及CD8+T细胞亚群在脾淋巴细胞中的比例明显升高,与HB vaccine相比有显着性差异（*p<0.05）,且CD4+CD69+细胞数与单独注射HBsAg相比有显着性增加；分离小鼠脾淋巴细胞进行HBsAg体外再刺激,发现经CS3作用的小鼠脾细胞增殖能力增强,分泌Th1类型细胞因子IFN-y的量明显高于HB vaccine组（**p<0.01）,CS3在高剂量时可以促进Th2类型细胞因子IL-4和IL-10的产生,但在低、中剂量时则作用不明显甚至有一定的抑制作用,而对Thl7类细胞因子IL-17A则没有明显作用；采用流式细胞术分析胞内Thl及Th2类细胞因子蛋白的表达情况与细胞上清中测定结果一致。小鼠血清中anti-HBs检测结果显示,CS3可以明显提高HBsAg产生的anti-HBs水平,高剂量组要明显优于HB vaccine组。Anti-HBs免疫球蛋白亚型IgGl的水平经CS3作用后下降,IgG2a的水平显着升高,且Ig2a/IgG1的值与HB vaccine组相比明显升高（*p<0.05）,说明CS3用作HBsAg佐剂可以使机体免疫类型向Thl方向发展。创新性和结论（1）首次采用DMSO/SO3吡啶反应体系,制备了不同Mw和S含量的curdlan sulfates,此法安全方便,毒性较低,并且所得样品的Mw和S含量随反应温度的升高而降低。（2）首次研究了curdlan sulfate的体外免疫调节活性,样品CS3可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖、RAW264.7细胞活化及BMDCs成熟。（3）首次采用SPR技术研究了curdlan sulfate与curdlan已知受体dectin-1的结合情况,确定dectin-1是curdlan sulfate的主要受体,明确CS3发挥体外免疫调节活性的机制是通过与免疫细胞表面dectin-1受体结合,激活MAPKs信号通过中的Erkl/2和SAPK/JNK途径,导致NF-κB向核内移位,调节相关基因的转录。（4）首次研究了curdlan sulfate体外抗HBV感染的活性,发现CS3可以抑制HBV感染HepG2和HepaRG细胞,并且主要是干扰HBV黏附细胞的过程。（5）采用氯酸钠、HPA处理HepG2和HepaRG细胞发现HS在HBV感染细胞过程中发挥一定的作用,借助SPR技术研究curdlan sulfates与重组HBsAg的结合能力,提示CS3发挥体外抗HBV感染活性的机制可能是通过与HBV包膜蛋白结合,干扰HS-HBV的相互作用,影响HBV与靶细胞的黏附和融合。（6）首次进行了curdlan sulfate用作乙肝疫苗佐剂的研究,CS3可以提高重组HBsAg的免疫原性,增强小鼠机体的免疫水平,提高血清中抗体滴度,并且主要诱导机体免疫应答向Thl型发展。
熊晓佳,彭雁忠,潘兴飞,徐启桓,李刚[8]（2012）在《树突状细胞MicroRNA表达谱在HBsAg刺激后的变化》文中研究表明目的建立HBsAg刺激树突状细胞（DC）前后microRNA（miRNA）表达的差异谱,为研究miRNA在乙型肝炎病毒感染的免疫机制中的作用提供理论基础。方法体外培养原代DC,分别用HBsAg、LPS、TNFα刺激24h后提取细胞总RNA,利用基因芯片技术进行比较,筛选出HBsAg刺激后差异表达显着的miRNA,利用计算机软件技术进行靶基因初步预测。结果 HBsAg刺激前后miRNA差异表达2倍以上者共30个,其中16个上调,14个下调。三个不同刺激组间miRNA差异谱存在不同差异。筛选出的靶基因中包含DC信号通路的相关成分。结论 HBsAg刺激DC后的miRNA表达谱的变化存在特异性;靶基因的初步筛选结果进一步提示了miRNA在乙型肝炎病毒感染的免疫机制中可能起着重要作用。
胡珊珊[9]（2012）在《补肾解毒法与健脾解毒法对HBV慢性感染不同阶段患者外周血树突状细胞介导的T淋巴细胞功能影响的研究》文中提出目的：拟运用HBV慢性感染过程不同阶段的患者外周血DCs与T淋巴细胞体外共培养的细胞模型和中药血浆药理实验方法,比较补肾解毒、健脾解毒哪种方法更能促进DCs活化特异性T淋巴细胞,哪种方法是提高HBV慢性感染后免疫细胞功能、免疫学应答恢复,治疗慢性乙型肝炎的主要方法,为临床提高中医治疗慢乙肝的疗效提供客观依据、治疗思路和研究基础。方法：本研究通过前后抽取HBV慢性感染免疫耐受期和免疫清除期共16例患者外周血80ml,另设健康对照组8例,分离培养出成熟的树突状细胞,在培养过程中采用补肾解毒与健脾解毒复方中药药物血浆分别对DCs进行体外干预,并负载HBV核心蛋白,然后与自身的T淋巴细胞共培养72小时,应用流式细胞技术检测T细胞表面分子CD3、CD28、 CD4、CD8及PD-1的表达水平,并用ELISA试剂盒检测T细胞上清液中IFN-γ分泌水平。比较哪种方法干预对免疫细胞功能的恢复影响更大。结果：1.干预前的T淋巴细胞（未经中药血浆干预也未与DCs共培养的T细胞）上CD4、CD28的表达水平,健康人组明显高于免疫耐受组和免疫清除组,而以免疫耐受组的患者表达最低,差异有统计学意义（p<0.05）。CD8、PD-1的表达健康人组明显低于免疫耐受组和免疫清除组,其中又以免疫耐受组的表达最高,差异有统计学意义（p<0.05）。CD3的检测结果健康人和免疫清除期组患者差异无显着意义（p>0.05）,但耐受期组患者表达明显低下（p<0.05）。上清液中分泌的IFN-γ水平在健康人和免疫清除期组患者差异无显着意义（p>0.05）,在耐受期组患者分泌水平明显低下（p<0.05）。2.在免疫耐受组和免疫清除组的HBV慢性感染患者经补肾解毒（六味甘露中剂量）和健脾解毒（四君甘露小剂量）药物血浆干预后的DC与T细胞共培养,检测其T细胞表面分子的表达率。两种方法在一定程度上都能提高CD3、CD4、CD28的表达水平和上清液中分泌的IFN-γ水平,降低CD8、PD-1的表达水平。结论：1.慢性HBV感染免疫清除期和免疫耐受期患者存在T淋巴细胞功能的缺陷,以免疫耐受期患者细胞免疫功能是最低的。2.通过补肾解毒、健脾解毒药物血浆在一定程度上能够促进HBV慢性感染患者树突状细胞的成熟,使得DCs激活T细胞的功能明显提高,促进T细胞表面分子的表达,并且补肾解毒法对慢性HBV感染免疫耐受期患者细胞免疫学功能的影响更为显着。
吴学杰,王贵强[10]（2011）在《树突状细胞疫苗在肝病治疗中的研究进展》文中研究表明树突状细胞（dendritic cell,DC）疫苗疗法是很有前景的一种生物疗法。目前对DC疫苗用于黑色素瘤、恶性淋巴瘤和肝癌等恶性肿瘤已进行了大量的临床研究,其中一些研究结果令人鼓舞。此外,对DC疫苗用于慢性HBV和HIV感染也进行了初步临床研究,并显示出一定的疗效。本文对DC疫苗在肝癌和慢性乙型肝炎治疗中的研究进展进行综述。
二、人树突状细胞体外经HBsAg刺激后的抗病毒作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人树突状细胞体外经HBsAg刺激后的抗病毒作用（论文提纲范文）
（1）CXCR5+CD8+T细胞在慢性HBV感染中的特点与免疫作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 慢性HBV感染患者和抗病毒治疗队列CXCR5+CD8+T细胞的特点 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 1.2.3 血清学和病毒学检测 |
| 1.2.4 实验方法 |
| 1.3 研究结果 |
| 1.3.1 慢性HBV感染患者外周血CXCR5+CD8+T细胞频数升高 |
| 1.3.2 慢性HBV感染患者CXCR5+CD8+T细胞呈现不同表型与转录谱 |
| 1.3.3 肝内与外周血CXCR5+CD8+T细胞表型表达对比特点 |
| 1.3.4 肝脏内CXCR5+CD8+T细胞IFN-γ和IL-21分泌水平更强 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 外周血CXCR5+CD8+T细胞与CXCL13表达预测替比夫定抗病毒治疗疗效 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 2.2.3 血清学和病毒学检测 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.3.1 抗病毒治疗队列CXCR5~+CD8~+T细胞频数与功能动态变化特点 |
| 2.3.2 抗病毒治疗队列CXCR5~+CD8~+T细胞频数与治疗后HBVDNA负相关 |
| 2.3.3 慢性HBV感染患者肝内CXCL13表达和免疫细胞频数显着高于健康人 |
| 2.3.4 肝脏内CXCL13水平与血清CXCL13水平和ALT水平呈正相关 |
| 2.3.5 CXCL13水平与抗病毒治疗队列治疗预后有关 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CXCR5~+CD8~+T细胞通过分泌IFN-γ和辅助B细胞产生抗体控制HBV感染 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 3.2.3 研究对象 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 外周血CXCR5~+CD8~+T细胞通过IFN-γ发挥抗病毒功能 |
| 3.3.2 CXCR5~+CD8~+T细胞可能通过分泌IL-21促进B细胞产生抗体控制病毒 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 HBV感染小鼠模型肝内CXCL13升高可募集CXCR5~+CD8~+T细胞到肝脏内发挥抗病毒作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 HBV感染小鼠模型外周血、肝脏和脾脏CXCR5~+CD8~+T细胞频数、表型与功能特点 |
| 4.3.2 CXCL13趋化过继转移的CXCR5~+CD8~+T细胞在HBV感染小鼠体内呈现向肝脏募集趋势 |
| 4.3.3 HBV感染小鼠模型CXCR5~+CD8~+T细胞可以抑制HBsAg表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 影响CXCR5~+CD8~+T细胞抗病毒作用的分子免疫机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.2.1 研究对象 |
| 5.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 5.2.3 人/小鼠血清学和病毒学检测 |
| 5.2.4 实验方法 |
| 5.3 研究结果 |
| 5.3.1 PD-1阻断和IL-21对CXCR5~+CD8~+T细胞功能的作用 |
| 5.3.2 CXCR5~+CD8~+T细胞的抗病毒功能受B细胞的调节 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文略缩词对照表 |
| 附录 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（2）过表达Tapasin的Dexs诱导CD8+TLC自噬增强CTLs反应抑制HBV复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 过表达Tapasin的 Dexs(TPN-Dexs)的收集、纯化和鉴定 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.2 过表达Tapasin的表达质粒的构建和鉴定 |
| 2.3 慢病毒H8902 的包装、滴度测定和荧光检测 |
| 2.4 小鼠骨髓DCs的分离、培养和诱导 |
| 2.5 慢病毒H8902 和对照组H149 转染至DCs |
| 2.6 骨髓树突状细胞来源外泌体的提取、纯化和鉴定 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 H8902:pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-Tapasin-3Flag的结构示意图 |
| 3.2 H8902：pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-Tapasin-3Flag的基因图谱 |
| 3.3 克隆菌落中阳性克隆的测序结果 |
| 3.4 慢病毒滴度的测定结果 |
| 3.5 慢病毒H8902 转染293T细胞的荧光检测 |
| 3.6 小鼠骨髓DCs的培养、诱导和鉴定 |
| 3.7 慢病毒转染至DCs |
| 3.8 慢病毒转染至DCs分泌外泌体的透射电镜(TEM) |
| 3.9 DCs分泌外泌体的粒径分析(NTA) |
| 3.10 DCs分泌外泌体的蛋白印迹分析(WB) |
| 3.11 DCs分泌外泌体与DC2.4 细胞共培养的细胞吞噬 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二部分 TPN-Dexs诱导TLC相关免疫反应和自噬发生的体外研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.2 实验动物及分组 |
| 2.3 TPN-Dexs促进TLC增殖 |
| 2.4 ELISA法检测TLC分泌细胞因子IL-2、TNF-α,、IL-4、INF-γ和IL-10 |
| 2.5 LDH法检测TLCCTLs反应 |
| 2.6 透射电镜观察CD8+TLC自噬小体产生 |
| 2.7 WB检测CD8+TLC自噬相关蛋白LC-3、P62、Beclin-1 表达 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 TPN-Dexs体外促进小鼠TLC增殖 |
| 3.2 TPN-Dexs体外促进小鼠TLC分泌细胞因子 |
| 3.3 TPN-Dexs体外诱导CTL免疫反应 |
| 3.4 TPN-Dexs体外诱导小鼠CD8+TLC自噬发生 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三部分 TPN-Dexs通过诱导TLC自噬增强CTLs反应抑制HBV转基因小鼠病毒复制的体内研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.0 主要仪器与试剂 |
| 2.1 实验动物、分组及操作 |
| 2.2 各组小鼠TLC增殖活性检测 |
| 2.3 各组小鼠TLC分泌细胞因子IL-2、TNF-α,、IL-4、INF-γ和 IL-10 的浓度检测 |
| 2.4 各组小鼠CTL活性检测 |
| 2.5 透射电镜观察各组小鼠CD8+TLC自噬小体产生 |
| 2.6 WB检测各组小鼠CD8+TLCLC3、p62、Beclin-1、AKT和 mTOR的表达 |
| 2.7 各组小鼠血清AST、ALT、HBV DNA水平检测 |
| 2.8 各组小鼠肝脏HBs Ag和 HBcAg免疫组织化学染色 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 TPN-Dexs在体内能促进TLC增殖 |
| 3.2 TPN-Dexs在体内能促进TLC分泌细胞因子 |
| 3.3 TPN-Dexs在体内能诱导CTLs反应 |
| 3.4 TPN-Dexs在体内能诱导CD8+TLC自噬小体产生 |
| 3.5 TPN-Dexs能调节CD8+TLCLC3、p62和Beclin-1 表达 |
| 3.6 TPN-Dexs能促进CD8+TLC内 AKT和 mTOR的表达 |
| 3.7 TPN-Dexs在 M-Tg HBV转基因小鼠体内增加ALT、AST水平,抑制HBV复制 |
| 3.8 TPN-Dexs对 HBV转基因小鼠肝脏HBs Ag、HBcAg表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表或录用的文章 |
（3）LPS/TLR4信号通路对肝星状细胞活化及增殖的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据统计 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 LPS对HSC细胞活化的影响 |
| 3.2 LPS刺激对HSC TLR4蛋白和MRNA表达的影响 |
| 3.3 LPS刺激对HSC细胞CA-SMA表达的影响 |
| 3.4 LPS刺激对HSC表达TYPE Ⅰ COLLAGEN、MMP-13,2和TIMP-1 ,2MRNA的影响 |
| 3.5 LPS刺激HSC后表达BAMBI的变化 |
| 3.6 加入TLR4中和抗体后LPS对HSC增殖的影响 |
| 3.7 加入TLR4中和抗体后LPS对HSC表达TYPE Ⅰ COLLAGEN和BAMBI MRNA的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）慢性乙型肝炎患者体内Toll样受体7的表达和抗病毒功能及其与Peg-IFN-α-2a抗病毒治疗的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 乙型肝炎病毒感染概述 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒感染的流行病学概述 |
| 1.1.2 HBV分子病毒学概述 |
| 1.1.3 HBV感染肝细胞及其复制 |
| 1.1.4 HBV感染的免疫学特点 |
| 1.1.5 慢性HBV感染自然史 |
| 1.1.6 HBeAg血清学转换的重要意义及相关免疫学因素 |
| 1.2 TLR7概述 |
| 1.2.1 TLR及其信号通路概述 |
| 1.2.2 TLR与抗HBV免疫 |
| 1.2.3 TLR7与慢性HBV感染 |
| 1.2.4 抗病毒治疗与TLR7表达及功能的关系 |
| 1.2.5 IFN-α对机体免疫应答的影响 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第二章 TLR7在慢性HBV感染不同阶段的表达及与Peg-IFN-α-2a抗病毒治疗的关系 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 研究对象及标本采集 |
| 2.2.2 试剂耗材 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 PBMC的分离、冻存 |
| 2.2.5 PBMC的复苏 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 RNA逆转录为cDNA |
| 2.2.8 实时荧光定量聚合酶链反应 |
| 2.2.9 血清生化学和病毒学检测 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 横向研究受试者基本资料 |
| 2.3.2 不同慢性HBV感染阶段患者PBMC中TLR7-mRNA表达水平的比较 |
| 2.3.3 Peg-IFN-α-2a抗病毒治疗对CHB患者PBMC上TLR7表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 慢性HBV感染状态下TLR7与IFN-α介导的抗病毒效应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 研究对象及标本采集 |
| 3.2.2 试剂耗材 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 PBMC的准备 |
| 3.2.5 体外TLR7-L刺激培养PBMC |
| 3.2.6 HepG2.2.15细胞培养及处理 |
| 3.2.7 血清生化学指标检测 |
| 3.2.8 TLR7-L刺激上清IFN-γ及TNF-α ELISA检测 |
| 3.2.9 TLR7-L刺激上清IFN-α ELISA检测 |
| 3.2.10 IFN-α及Peg-IFN-α-2a对CHB患者PBMC上TLR7表达的影响 |
| 3.2.11 各细胞亚群TLR7表达的检测 |
| 3.2.12 IFN-α及Peg-IFN-α-2a对目的细胞亚群上TLR7表达的影响 |
| 3.2.13 IFN-α及TLR7-L协同刺激对B细胞特异性增殖能力的影响 |
| 3.2.14 IFN-α及TLR7-L协同刺激对B细胞抗病毒细胞因子表达的影响 |
| 3.2.15 IFN-α及TLR7-L协同刺激对B细胞分化的影响 |
| 3.2.16 IFN-α及TLR7-L协同刺激对B细胞抗体分泌的影响 |
| 3.2.17 IFN-α及TLR7-L协同刺激对anti-HBc及anti-HBe分泌的影响 |
| 3.2.18 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TLR7-L刺激PBMC对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的影响 |
| 3.3.2 TLR7-L刺激PBMC抗病毒细胞因子分泌的影响 |
| 3.3.3 TLR7在PBMC细胞亚群上的表达 |
| 3.3.4 IFN-α及Peg-IFN-α-2a刺激对PBMC及TLR7高表达的细胞亚群内TLR7表达的影响 |
| 3.3.5 IFN-α及TLR7-L协同刺激对B细胞增殖、分化、细胞因子表达及抗体分泌的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 TLR7-L与IFN-α在慢性HBV感染小鼠模型中的协同抗病毒效应 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 高压尾静脉小鼠建模 |
| 4.2.2 试剂耗材 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 质粒提取 |
| 4.2.5 高压尾静脉注射 |
| 4.2.6 眼眶采血及血清收集 |
| 4.2.7 小鼠血清IFN-α检测 |
| 4.2.8 处死小鼠及肝、脾内淋巴细胞的分离 |
| 4.2.9 小鼠肝内及脾内淋巴细胞特异性及非特异性刺激 |
| 4.2.10 小鼠肝脾内淋巴细胞Dimer染色 |
| 4.2.11 血清生化学指标检测 |
| 4.2.12 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 TLR7-L及IFN-α-2a注射对小鼠体内IFN-α表达的影响 |
| 4.3.2 TLR7-L及IFN-α-2a注射对小鼠血清HBsAg及HBeAg表达的影响 |
| 4.3.3 TLR7-L及IFN-α-2a注射对小鼠肝内及脾内特异性或非特异性CD8+T细胞频数的影响 |
| 4.3.4 TLR7-L及IFN-α-2a注射对小鼠肝内及脾内特异性或非特异性CD8+T细胞功能的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 主要研究结果 |
| 5.2 研究中不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）组蛋白甲基转移酶SETD2调控干扰素介导的抗病毒效应的分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 序言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 高通量筛选体系的建立 |
| 3.2 高通量筛选调节IFNα抗HBV感染的表观修饰酶 |
| 3.3 SETD2促进IFNα的抗HBV效应 |
| 3.4 SETD2通过其甲基转移酶活性促进IFN信号活化 |
| 3.5 SETD2调节IFNα的抗病毒反应具有广泛性 |
| 3.6 SETD2促进三种亚型的IFN信号下游STATl的磷酸化以及ISG的表达 |
| 3.7 SETD2通过其甲基转移酶活性促进STAT1发生单甲基化修饰 |
| 3.8 SETD2通过SET结构域与STAT1直接相互作用 |
| 3.9 STATl赖氨酸甲基化修饰位点的鉴定 |
| 3.10 STAT1的磷酸化及转录活性依赖于K525甲基化修饰 |
| 3.11 SETD2催化STATl发生K525位点的甲基化修饰 |
| 3.12 SETD2选择性地催化部分ISGs基因区发生H3K36me3修饰从而促进转录 |
| 3.13 RARRES3是一种具有抑制HBV复制功能新的ISG |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 综述: Ⅰ型干扰素信号通路调控的分子机制 |
| 1 干扰素概述 |
| 1.1 干扰素及其产生 |
| 1.2 经典的IFN-Ⅰ信号转导 |
| 1.3 非经典的IFN-Ⅰ信号转导 |
| 2 IFN的功能 |
| 3 干扰素信号转导的分子调控机制 |
| 4 IFN信号转导的蛋白质翻译后修饰调节 |
| 4.1 磷酸化 |
| 4.2 泛素化 |
| 4.3 类泛素化修饰 |
| 4.4 乙酰化 |
| 4.5 甲基化 |
| 5 IFN信号转导的表观修饰调节 |
| 5.1 组蛋白修饰 |
| 5.2 染色质重塑 |
| 5.3 DNA甲基化 |
| 5.4 非编码RNA |
| 6 IFN-Ⅰ信号转导的失调与疾病的发生发展 |
| 7 展望 |
| 参考文献 |
| 作者筒历 |
（7）硫酸化可德兰多糖的制备、体外免疫调节、抗乙肝病毒感染活性及体内用作乙肝疫苗佐剂研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| CATALOGUE |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 HBV感染 |
| 1.1 HBV |
| 1.2 HBV生命周期 |
| 1.3 HBV入胞机制 |
| 1.4 HBV感染与机体免疫应答 |
| 2 Curdlan |
| 2.1 Curdlan的结构与性质 |
| 2.2 Curdlan衍生物的制备方法及活性研究 |
| 3 硫酸化多糖抗病毒活性研究 |
| 4 多糖用作疫苗佐剂的研究 |
| 5 本课题设计思路及拟解决问题 |
| 第二章 硫酸化可德兰多糖及可德兰寡糖的制备及结构表征 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 实验设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 硫酸化可德兰多糖(curdlan sulfate)的制备 |
| 2.2 可德兰寡糖(CRDO)的制备 |
| 2.3 Curdlan sulfate及CRDO的结构分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Curdlan sulfates |
| 3.2 CRDO |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 Curdlan sulfate体外免疫调节活性及机制的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CS3对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.2 CS3对小鼠RAW264.7细胞活化的影响 |
| 2.3 CS3对小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)成熟的影响 |
| 2.4 SPR技术分析不同curdlan sulfates与dectin-1的结合性质研究 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CS3对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.2 CS3对小鼠RAW264.7细胞活化的影响 |
| 3.3 CS3对小鼠BMDCs成熟的影响 |
| 3.4 Curdlan sulfates与dectin-1的结合性质研究 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 Curdlan sulfate体外抗乙肝病毒感染活性及机制的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 乙肝病毒浓缩液制备 |
| 2.2 HBV感染易感细胞 |
| 2.3 SPR分析硫酸化多糖与rHBsAg的结合性质研究 |
| 2.4 氯酸钠对HBV感染HepG2、HepaRG细胞的影响 |
| 2.5 HPA对HBV感染HepG2、HepaRG的影响 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CS3对HBV感染易感细胞的影响 |
| 3.2 硫酸化多糖与rHBsAg亲和力分析 |
| 3.3 氯酸钠对HBV感染HepG2、HepaRG细胞的影响 |
| 3.4 HPA对HBV感染HepG2、HepaRG细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 Curdlan sulfate用于重组乙肝疫苗佐剂的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及免疫接种 |
| 2.2 小鼠脾淋巴细胞制备 |
| 2.3 流式细胞术分析小鼠脾淋巴细胞表面标志分子 |
| 2.4 小鼠脾淋巴细胞体外增殖实验 |
| 2.5 小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-17A、IL-4、IL-10细胞因子检测 |
| 2.6 细胞内染色法检测胞内细胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-4 |
| 2.7 小鼠血清中anti-HBs抗体滴度测定以及HBsAg特异性IgG亚型含量测定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CS3对免疫小鼠脾脏中巨噬细胞及树突状细胞募集和成熟的影响 |
| 3.2 CS3对小鼠脾脏中T淋巴细胞分群及活化的影响 |
| 3.3 CS3对小鼠脾淋巴细胞体外增殖能力的影响 |
| 3.4 CS3对小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17A细胞因子的影响 |
| 3.5 CS3对小鼠脾淋巴细胞胞内表达IFN-γ、IL-4及IL-17A蛋白的影响 |
| 3.6 CS3对小鼠外周血中淋巴细胞胞内表达IFN-γ及IL-17A蛋白的影响 |
| 3.7 CS3对免疫小鼠体内产生anti-HBs及HBsAg特异性免疫球蛋白亚型IgG1、IgG2a的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| Article 1 |
| Article 2 |
| Article 3 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
| 附表 |
（9）补肾解毒法与健脾解毒法对HBV慢性感染不同阶段患者外周血树突状细胞介导的T淋巴细胞功能影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 |
| 1 材料 |
| 1.1 血液标本采集 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 外周血单个核细胞(PBMCs)的提取(密度梯度离心法) |
| 2.2 外周血DCs的分离、培养及鉴定 |
| 2.3 外周血自体T细胞的分离 |
| 2.4 DCs与自身T淋巴细胞共培养 |
| 2.5 T淋巴细胞表面分子的流式检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 倒置显微镜下观察DCs培养过程中的形态结构变化 |
| 3.2 电镜下DCs的形态学特征 |
| 3.3 健康人经药物血浆干预及未经药物血浆干预的DCs与T共培养后的T淋巴细胞表面分子表达的结果 |
| 3.4 部分流式结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 大鼠补肾解毒与健脾解毒药物血浆的制备及分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验中药复方 |
| 1.3 主要器材与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 复方中药汤剂的制备 |
| 2.2 实验动物分组 |
| 2.3 实验动物给药方法 |
| 2.4 大鼠腹主动脉采血 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 |
| 1 实验资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 病例纳入标准 |
| 1.3 病例排除标准 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验分组 |
| 2.4 具体实验步骤 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 入组患者及健康人基本情况 |
| 3.2 T淋巴细胞表面分子及功能检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间主要研究成果及发表论文 |
（10）树突状细胞疫苗在肝病治疗中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 DC疫苗的制备 |
| 2 DC疫苗在肝癌治疗中的研究进展 |
| 3 DC疫苗治疗慢性乙肝的研究进展 |
| 3.1 小鼠DC疫苗的临床前研究 |
| 3.2 人DC疫苗的临床前研究 |
| 3.3 DC疫苗的临床研究 |
| 4 结语与展望 |
四、人树突状细胞体外经HBsAg刺激后的抗病毒作用（论文参考文献）
- [1]CXCR5+CD8+T细胞在慢性HBV感染中的特点与免疫作用研究[D]. 郭玲. 南方医科大学, 2020
- [2]过表达Tapasin的Dexs诱导CD8+TLC自噬增强CTLs反应抑制HBV复制的研究[D]. 吕梦娇. 上海交通大学, 2020
- [3]LPS/TLR4信号通路对肝星状细胞活化及增殖的作用机制[D]. 金莲花. 延边大学, 2019(01)
- [4]慢性乙型肝炎患者体内Toll样受体7的表达和抗病毒功能及其与Peg-IFN-α-2a抗病毒治疗的关系[D]. 葛军. 南方医科大学, 2017(01)
- [5]组蛋白甲基转移酶SETD2调控干扰素介导的抗病毒效应的分子机制研究[D]. 陈坤. 浙江大学, 2017(05)
- [6]乙型肝炎病毒感染中树突细胞免疫异常的研究进展[J]. 贾琳,孟庆华. 中华传染病杂志, 2015(03)
- [7]硫酸化可德兰多糖的制备、体外免疫调节、抗乙肝病毒感染活性及体内用作乙肝疫苗佐剂研究[D]. 李平利. 山东大学, 2014(10)
- [8]树突状细胞MicroRNA表达谱在HBsAg刺激后的变化[J]. 熊晓佳,彭雁忠,潘兴飞,徐启桓,李刚. 中华实验和临床病毒学杂志, 2012(05)
- [9]补肾解毒法与健脾解毒法对HBV慢性感染不同阶段患者外周血树突状细胞介导的T淋巴细胞功能影响的研究[D]. 胡珊珊. 湖南中医药大学, 2012(10)
- [10]树突状细胞疫苗在肝病治疗中的研究进展[J]. 吴学杰,王贵强. 传染病信息, 2011(04)