细胞色素 P450 2A6 在人嗅黏膜中的发育表达

一、人嗅粘膜内细胞色素P450 2A6的发育表达（论文文献综述）

季明辉^[1]（2016）在《香烟烟雾提取物中CYP2A13的新底物5-HMF的发现及毒性研究》文中研究指明在人类57种CYP450酶中,仅有十几个酶负责外源化学物的代谢,这些代谢酶存在组织特异性,人细胞色素P450 2A13 （CYP2A13）是一种主要在呼吸系统中表达的肝外代谢酶。前期研究发现,CYP2A13高效代谢活化AFB1生成多种代谢产物,与I)NA、RNA和蛋白质等生物大分子结合形成加合物,引发细胞毒性、炎症、DNA损伤、肿瘤等毒效应。吸烟导致呼吸道损伤,而长期吸烟易高发肺癌,NNK和尼古丁是香烟烟雾中公认的CYP2A13底物,研究表明NNK可经CYP2A13的代谢活化导致小鼠肺癌的发生。尼古丁是香烟烟雾抽提物（CSE）中含量最多的物质,约占CSE总含量的1%。研究表明,尼古丁及其代谢产物介导的物质毒性相对较低,但可能导致CYP2A13的急剧消耗,进而抑制CYP2A13对香烟烟雾其他物质的代谢活化。前期研究发现,去除尼古丁可导致CYP2A13介导的CSE毒性显着增强,由于NNK在CSE中的含量很低,因此推测CSE中可能存在含量相对较高的CYP2A13新底物。为此,本研究利用标准参比烟3R4F,采用经高效液相色谱系统结合已经建立的稳定表达人CYP2A13的BEAS-2B细胞（B-2A13）,解析CSE中与CYP2A13代谢活化相关组分,并进一步分离、纯化和鉴定,试图发现CYP2A13的新底物；然后利用体外代谢反应进一步确定与CYP2A13代谢相关的单体；再利用B-2A13和B-2A5细胞以及CYP2A5敲除小鼠（CYP2A5-/-）,系统阐明CYP2A13在代谢活化候选单体所致呼吸道损伤中的作用,明确CYP2A13与候选CSE组分单体的关系。研究结果不仅可为吸烟所致呼吸系统损伤的机制研究提供新的研究策略,也可为控制吸烟并寻找切实可行的预防控制措施提供依据,有望为环境空气污染物／致癌物的健康风险评估提供可行的技术支撑。第一部分CSE中CYP2A13的新底物5-HMF的发现与鉴定目的：利用色谱技术结合细胞毒性评价,初步筛选CSE中与CYP2A13代谢相关的组分,并利用质谱和核磁共振技术鉴定出候选化学物。方法：利用HPLC将CSE分离及通过B-2A13与B-V细胞毒性筛选毒性组分、候选组分的进一步分离、纯化后采用GC-MS/MS、NMR、HPLC鉴定,运用纯品进行B-2A13与B-V细胞代谢毒性验证,并与标准品进行毒性比对确认。结果：（1）利用HPLC将CSE分为尼古丁部分和非尼古丁部分,结果发现,非尼古丁部分对B-2A13细胞的毒性显着增强,4%浓度时的细胞活力仅10%左右,且可被CYP酶抑制剂8-MOP所逆转,而尼古丁部分的毒性较弱；（2）按照CSE在HPLC中的保留时间按每10min收集为4组,分别处理B-2A13细胞和B-V细胞,结果发现前10min的组分细胞毒性最强,而含NNK的组分（10-20 min）并未显示出明显毒性；将前10min组分按每分钟收集再处理细胞,发现5min段的组分细胞毒性最强； （3）将5min段的CSE组分进行再分离、纯化、浓缩后进行鉴定,GC-MS/MS显示该组分单体在4.88min处有明显的吸收峰,结合离子特征和数据库,推定可能为5-羟甲基糠醛（5-HMF）; NMR的检测结果也证明,该物质与5-HMF的结构极为相似； （4）无论是HPLC检测还是细胞毒性实验,均显示该物质与5-HMF标准品完全一致。结论：CSE中存在CYP2A13的新的底物,该物质极有可能是5-HMF,且可被CYP2A13代谢活化增强其细胞毒性。第二部分CYP2A13对5-HMF的体外代谢活性研究目的：构建体外代谢反应体系,评价CYP2A13对5-HMF的体外代谢活性,明确两者间的代谢关系。方法： （1）为了获得有蛋白活性的CYP2A13,建立了POR与CYP2A13蛋白在Baculovirus/sf9中共表达的体系： 首先通过分子克隆构建pFastBac-dual-POR-CYP2A13质粒,再运用DH10Bac大肠杆菌将其转化为杆状病毒)NA （Bacmid-POR-CYP2A13）,然后将杆状病毒DNA转化入sf9细胞产生CYP2A13-POR的病毒液并表达有代谢活性的CYP2A13和POR蛋白。（2）采用western b1 ot检测CYP2A13和POR蛋白的表达、经CO差示光谱法和细胞色素C还原法分别检测CYP2A13和POR蛋白的活性、以NNK为代谢底物检验共表达CYP2A13和POR蛋白的代谢能力。（3）将制备的CYP2A13蛋白用于5-HMF的代谢研究中,分析其代谢产物,评价其代谢动力学和代谢活性。结果：（1）采用Baculovirus/Sf9系统体外联合表达CYP2A13和POR蛋白,免疫印迹结果显示,所获得的微粒体蛋白中存在较明亮的CYP2A13和POR蛋白的特异性条带,提示联合表达成功；（2）经CO差示光谱法和细胞色素C还原法,CYP2A13活性为0.62 pmol/min/pmol蛋白,POR蛋白的活性为38.9nmol/min/mg蛋白；采用CYP2A13的经典底物NNK进行验证,结果显示表达的CYP2A13可显着代谢NNK生成其代谢产物NNAL,代谢动力学结果显示其代谢活性为：Vmax （pmol/min/pmol）:2.5±0.4; Km （μM）:12.0±2.6; Vmax/Km：0.208；进一步提示所表达的CYP2A13表达具有良好的代谢活性； （3）CYP2A13可在120min内将5-HMF完全代谢生成其代谢产物5-HMFA;代谢动力学结果显示其代谢活性为：Vmax （pmol/min/pmol）:2.7±0.2; Km （μM）: 50.9±8.3; Vmax/Km:0.05;结果提示CYP2A13对5-HMF有较好的代谢活性。结论：体外成功地表达了具有较好活性的CYP2A13和POR蛋白,5-HMF是CYP2A13的新的底物。第三部分CYP2A13/CYP2A5对CSE中5-HMF所致呼吸毒性的影响目的：通过动物实验,初步阐明CYP2A13在代谢5-HMF及其所致小鼠呼吸系统急性损伤中的作用。方法：小鼠CYP2A5与人CYP2A13同源,两者在功能上非常接近,由于同步构建的人源化CYP2A13小鼠未能在呼吸系统检测到CYP2A13蛋白,因此采用同期构建的CYP2A5敲除小鼠（CYP2A5-/-）进行功能研究。（1）为评价CYP2A5与CYP2A13在代谢活化5-HMF中的功能差异,先利用pLJM慢病毒体系构建稳定表达CYP2A5的BEAS-2B细胞（B-2A5）；经鉴定构建成功后,检测其5-HMF的代谢毒性,并与B-2A13细胞的代谢毒性相比较。 （2）5-HMF鼻腔滴注染毒CYP2A5-/-小鼠以及野生型小鼠,通过病理学检查比较两者的鼻腔、肺损伤；通过检测肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞数量与种类以及炎症因子的表达比较两者肺部炎症情况。结果：（1）经GFP验证,拟构建的B-2A5细胞绿色荧光明亮、充满,转染效率接近100%； （2）细胞毒性结果显示,5-HMF对B-2A5和B-2A13细胞的毒性基本一致,且都可以被8-MOP所逆转,提示CYP2A5对5-HMF也具有相近的代谢活化作用； （3）动物实验显示,5-HMF处理的野生型小鼠可见鼻中隔粘膜结构破损断裂、纤毛脱落,大量嗜酸性粒细胞浸润,而CYP2A5-/-小鼠的纤毛结构完整、上皮细胞排列整齐；野生型小鼠的肺部炎症明显、肺泡壁细胞显着增厚,而CYP2A5-/-小鼠肺的炎症不明显；5-HMF处理的野生型小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞显着高于5-HMF处理的CYP2A5-/-小鼠,肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-6、TNF-α的浓度也显着升高。结论：CYP2A5可显着介导5-HMF的呼吸毒性,由于CYP2A5与CYP2A13的同源性以及对5-HMF代谢活化作用的一致性,因此可以推断CYP2A13可以通过代谢活化5-HMF导致呼吸系统的急性损伤。

王二豪^[2]（2014）在《芹菜提取物对CYP2A6酶活性的影响》文中认为细胞色素P450酶是人体中重要的代谢酶，主要负责多种内源性及包括药物在内的外源性物质的代谢，现在研究表明影响体内CYP450酶代谢活性的因素对药物疗效以及毒副作用的产生有至关重要作用。日常生活中的食物可能会对CYP450酶活性产生抑制或诱导，从而引起药物治疗作用的降低或严重不良反应的发生。因此，食物-药物相互作用已经引起人们越来越多的关注。芹菜具有平肝降压，利尿消肿等药用价值，目前也已被开发成多种药品及保健品上市。以往有文献通过药效学实验证明芹菜提取物可以抑制小鼠体内CYP450的酶活性，提示芹菜有可能引起食物药物相互作用，从而为药物的安全使用带来风险。CYP2A6是CYP450酶系亚家族CYP2A中的重要一员，负责丙戊酸钠、咖啡因及尼古丁等药物的代谢，与吸烟成瘾性密切相关。小鼠体内CYP2A5与人体内CYP2A6在基因序列上有高度的同源性，且与CYP2A6功能相似，故常用于CYP2A6的前期替代研究。虽然已有研究发现芹菜提取物会对药物代谢酶产生影响，但其是否会对人体内CYP2A6产生影响及其影响机制却未见报道。本研究经过初筛将芹菜石油醚提取物作为实验对象，研究其对CYP2A6酶活性的影响，先以小鼠肝微粒体为研究模型，考察芹菜石油醚提取物对小鼠肝微粒体CYP2A5酶活性的影响，然后进一步在人肝微粒体中研究芹菜石油醚提取物对CYP2A6的作用及其影响机制。结果显示，芹菜石油醚提取物对CYP2A5/2A6产生抑制，且对CYP2A5是一个可逆性抑制，K1i=277.5μg·L-，对CYP2A6是一个不可逆性抑制，KI=1.055mg·mL-1，Kinact=0.315min。最后在小鼠体内验证其抑制效果，比较考察体内体外芹菜石油醚提取物对CYP2A5/2A6的影响，体内实验结果显示给药组与对照组相比，酶活性降低约16.7%，进一步证明了芹菜提取物对小鼠体内CYP2A5产生抑制，提示芹菜提取物可能会对CYP2A6产生影响。本研究首次以小鼠及人肝微粒体为研究对象，通过体内体外实验综合分析芹菜石油醚提取物对CYP2A5/2A6酶活性的影响。结果表明：1)芹菜石油醚提取物对小鼠CYP2A5及人体CYP2A6有抑制作用，且由于小鼠与人的种属性差异故使得芹菜石油醚提取物对两者抑制机制不同；2)芹菜石油醚提取物对CYP2A5/2A6的抑制并非全部由芹菜中的呋喃香豆素类成分提供，还可能有其他物质共同参与；3)芹菜石油醚提取物在体内对CYP2A5/2A6酶活性有抑制作用，故使用主要经CYP2A6代谢的药物时，应尽量避免此类食物药物相互作用的发生。

王二豪,郭延垒,张有金,石亮,张远冬,王应雄,杨竹,于超^[3]（2013）在《HPLC-RF测定小鼠肝微粒体中CYP2A5的酶活性》文中指出目的以香豆素为探针底物建立测定小鼠肝微粒体中CYP2A5酶活性的方法。方法用Waters Symmetry C18柱;流动相为0.1%醋酸-乙腈=70∶30;流速为1.0 mL·min-1,柱温30℃,E x=340 nm,E m=458 nm。香豆素与小鼠肝微粒体在37℃孵育20 min,加入含内标的冰乙腈终止,4℃、12000 r·min-1离心15 min,取上清液,用HPLC测定其代谢产物7-羟基香豆素的含量,以GraphPad Prism 5.0作图计算酶动力学参数。结果 7-羟基香豆素与内标两者分离良好。7-羟基香豆素的检测限为2 nmol·L-1（S/N≥3）,线性范围为8～800nmol·L-1。日内日间精密度RSD小于5%,回收率为91.3%～101.4%。香豆素羟化反应的K m为2.15μmol·L-1;V max为9.74 pmol·（min·mg protein）-1。结论该方法稳定可靠,灵敏度高,适于体外CYP2A5酶活性的测定。

胡屹屹^[4]（2006）在《猪肝微粒体细胞色素P450酶系的初步研究》文中进行了进一步梳理目前肝微粒体水平的药物代谢相互作用研究日趋增多，但用食品动物猪肝微粒体进行药物代谢研究在国内尚未见报道。本科题研究了不同年龄和性别猪肝CYP450酶系的检测方法、四种临床常用药物对猪肝CYP450酶系的作用和探针药物法评价新兽药氟尼辛葡甲铵对猪肝CYP450酶系的影响。具体研究内容如下： 1．用生物化学法和紫外分光光度法检测猪肝微粒体蛋白含量和P450酶系活性。 取新鲜猪肝样品匀浆，差速离心法制备肝微粒体，Bradford法测定蛋白浓度，分光光度计法检测6种肝细胞色素P450酶含量及活性。测定一月龄至八月龄不同性别的猪，肝微粒体蛋白含量、CYP450含量、CYPb5含量、NADPH-细胞色素C还原酶活性、氨基比林-N-脱甲基酶活性、红霉素-N-脱甲基酶活性和苯胺-4-羟化酶活性。结果表明，猪一到八月龄肝微粒体蛋白含量变化范围为6.646±0.457.13.596±1.077mg／ml，细胞色素P450含量变化范围为0.270±0.044-0.587±0.043 nmol／mg protein，细胞色素b5含量变化范围为0.105±0.019-0.251±0.018 nmol／mg protein，NADPH-细胞色素C还原酶活性变化范围为1.632±0.255.3.043±0.229 nmol／min／mg protein，氨基比林-N-脱甲基酶（AND）活性变化范围为0.625±0.071-2.990±0.144 nmol／min／mgprotein，红霉素-N-脱甲基酶（ERND）活性变化范围为0.562±0.095-2.540±0.177nmol／min／mg protein，苯胺-4-羟化酶（AH）活性变化范围为0.090±0.016-0.231±0.021nmol／min／mg protein。建立的猪P450酶系检测方法灵敏可靠，简单易行，重复性较好。猪肝微粒体蛋白含量和P450酶系活性随着年龄增长，含量增加，活性增强。同时肝微粒体蛋白含量、CYP450含量和红霉素-N-脱甲基酶活性呈现有一定的性别差异。 2．几种临床常用药物对猪肝微粒体细胞色素P450酶系的影响。 四种药物红霉素、环丙沙星、地塞米松和乙醇，每天按正常治疗剂量的5倍进行肌肉注射，连续给药10天。差速离心法制备猪肝微粒体，Bradford法测定蛋白浓度，分光光度法检测6种肝细胞色素P450酶含量及活性，结果进行统计学分析处理。研究表明，四种药物（除环丙沙星外）对P450酶的总活性均产生显着影响，同时地塞米松组的微粒体蛋白含量和红霉素-N-脱甲基酶活性，乙醇组的苯胺-4-羟化酶活性和红霉素组的红霉素-N-脱甲基酶活性，与对照组相比均差异显着。说明环丙沙星和红霉素对猪肝细胞色素P450酶系有选择性抑制作用，而地塞米松和乙醇对其起选择性诱导效应。 3．用Cocktail探针药物法研究氟尼辛葡甲铵对猪肝细胞色素P450酶系的影响。

史丽^[5]（2005）在《人类CYP2A13基因SNPs及其与喉、咽、鼻恶性肿瘤危险性的相关性研究》文中认为目的 检测分析可能改变酶的代谢活性的人类细胞色素P450（CYP）2A13基因的单核苷酸多态性。测定CYP2A13基因的等位突变位点频率并分析其意义。 方法 收集32例中国患者（10例喉癌和6例下咽癌,2例鼻腔肿瘤,5例鼻息肉和9例其他的头颈部疾病患者）外周血DNA标本,采用长片段聚合酶链式反应（Long-Distance PCR）方法,根据全人类基因数据库（GenBank accession no. AC008962[GenBank]）中的CYP2A 13基因序列进行设计,5′端上游引物1和3′端下游引物2被用来扩增全长CYP2A 13基因。32例基因DNA样本被扩增为包含人类CYP2A 13基因的基因片断,扩增片断9456bp,开始于ATG起始密码前1117 bp,终止于终止密码TGA后869 bp。所有的PCR产物用扩增引物进行排序,排序区间涵盖ATG起始密码前约1千个碱基对、所有的外显子和外显子与内含子的连接以及TGA终止密码后约100 bp。所有的长片段-PCR扩增产物均使用QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN）进行凝胶纯化然后经自动DNA测序仪（model 3100）进行测序检测。 结果 检测结果共有14个突变位点被发现,其中4个位于编码区,而其他10个则位于非编码区:2个位于5′侧翼,2个位于3′非翻译区,6个位于内含子。所有检测到的不同等位基因均为杂合子。 检测到的4个编码区单核苷酸多态中,位于外显子5由3375C>T错义突变引起的精氨酸（Arg）257（Cys）半胱氨酸,在7个样本中被发现,

任翔,陈瑛,张克杰,史丽,丁元萍^[6]（2003）在《人嗅粘膜内细胞色素P450 2A6的发育表达》文中进行了进一步梳理目的:探讨细胞色素P4502A6（cytochromeP4502A6,CYP2A6）在不同胎龄胎儿嗅粘膜内的发育表达。方法:应用免疫组化法观察CYP2A6在胚胎发育16、18、22、28和38周胎儿嗅粘膜内的表达情况。结果:CYP2A6的表达始于孕18周,在支持细胞核上区胞浆顶端阳性着色,彼此相连呈一条带状,上皮中、下层个别支持细胞核下区也呈现稍弱的免疫阳性反应。到孕22周时,固有层Bowman腺细胞浆内开始出现CYP2A6阳性着色,但此时Bowman腺体数量较少,腺细胞仅单层排列围成腺腔。随胎儿发育CYP2A6表达强度不断增大,孕28周时整个支持细胞的阳性着色更加清晰,固有层内Bowman腺数量明显增多,并且腺细胞呈多层排列,胞浆内CYP2A6阳性强度开始超出上皮层内的支持细胞。孕38周时免疫反应达峰值,其中支持细胞的染色勾画出其独特的极性结构:细胞核上区宽阔,胞浆内CYP2A6染色清晰,而核下区逐渐缩窄,以足状突的形式附着于基膜上。结论:人胎儿发育时期嗅粘膜内有CYP2A6酶表达,并且与嗅感受神经元发育基本同步,二者可能存在共同的调控因子。固有层Bowman腺细胞内CYP2A6的开始表达时间晚于上皮层支持细胞,但却是嗅粘膜内CYP2A6表达的主要部位以及嗅素代谢转化的主要场所。

二、人嗅粘膜内细胞色素P450 2A6的发育表达（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、人嗅粘膜内细胞色素P450 2A6的发育表达（论文提纲范文）

（1）香烟烟雾提取物中CYP2A13的新底物5-HMF的发现及毒性研究（论文提纲范文）

（2）芹菜提取物对CYP2A6酶活性的影响（论文提纲范文）

（3）HPLC-RF测定小鼠肝微粒体中CYP2A5的酶活性（论文提纲范文）

（4）猪肝微粒体细胞色素P450酶系的初步研究（论文提纲范文）

（5）人类CYP2A13基因SNPs及其与喉、咽、鼻恶性肿瘤危险性的相关性研究（论文提纲范文）

（6）人嗅粘膜内细胞色素P450 2A6的发育表达（论文提纲范文）

四、人嗅粘膜内细胞色素P450 2A6的发育表达（论文参考文献）

• [1]香烟烟雾提取物中CYP2A13的新底物5-HMF的发现及毒性研究[D]. 季明辉. 南京医科大学, 2016(02)
• [2]芹菜提取物对CYP2A6酶活性的影响[D]. 王二豪. 重庆医科大学, 2014(02)
• [3]HPLC-RF测定小鼠肝微粒体中CYP2A5的酶活性[J]. 王二豪,郭延垒,张有金,石亮,张远冬,王应雄,杨竹,于超. 中国临床药理学杂志, 2013(09)
• [4]猪肝微粒体细胞色素P450酶系的初步研究[D]. 胡屹屹. 南京农业大学, 2006(02)
• [5]人类CYP2A13基因SNPs及其与喉、咽、鼻恶性肿瘤危险性的相关性研究[D]. 史丽. 山东大学, 2005(08)
• [6]人嗅粘膜内细胞色素P450 2A6的发育表达[J]. 任翔,陈瑛,张克杰,史丽,丁元萍. 山东大学学报(医学版), 2003(06)

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