一、小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定(论文文献综述)
才文道力玛[1](2021)在《蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的初步建立》文中研究说明蒙古马是世界上最古老的马品种之一,是我国优秀的马种资源。具有耐寒耐旱、耐粗饲、适应能力强等特征。此外,马匹关节和肌腱的解剖学、生理学以及损伤性质与人类高度相似,因此马是用于研究软骨损伤或退化细胞疗法的传统动物模型之一。诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)是将特定的转录因子导入体细胞重编程而获得的类似胚胎干细胞的一类细胞。iPSCs可以来源于任意体细胞,能够自我更新并分化为所有类型体细胞,因此在生物医学上可以用于建立疾病模型,以研究疾病的发生、药物检测以及疾病治疗,而在农业方面,它还可以用于研发转基因动物或者保护优秀遗传资源。但迄今为止,尽管有许多团队尝试建立马的iPSCs,但仍没有真正的马iPSCs的报道,在国内外均没有关于蒙古马iPS细胞的研究。因此,为了建立蒙古马诱导多能干细胞系,在本研究中,我们采用多顺反子慢病毒载体,将OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四个外源基因导入至蒙古马胚胎成纤维细胞中进行重编程。为后续进一步建立蒙古马生物学及医学细胞模型奠定基础。我们的实验结果如下:1.通过消化法分离培养了蒙古马34天胚胎成纤维细胞和小鼠13.5天胚胎成纤维细胞。两种细胞形态都符合成纤维细胞形态特征,能够正常消化传代,并且经过冻存、复苏后能够正常增殖且形态无异常。可以为后续研究提供重编程供体细胞及马iPSCs的饲养层。2.为了优化多顺反子慢病毒包装体系,我们使用脂质体3000和脂质体LTX两种转染试剂转染293T细胞,并比较了编码绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒的转染效率及包装病毒感染细胞的能力。最终显示,脂质体3000在病毒质粒的转染效率和包装病毒颗粒对细胞的感染能力方面都显示出较好的效果,分别为79.4±6.3%和74±3.6%。3.通过感染编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的多顺反子慢病毒,我们成功获得了蒙古马iPS样细胞(E-iPS):⑴蒙古马iPS样细胞显示出清晰的边缘、呈细胞集落生长;⑵对蒙古马iPS样细胞进行碱性磷酸酶染色,结果呈阳性,表明其具有多能性;⑶提取蒙古马iPS样细胞RNA,实时荧光定量PCR方法检测蒙古马iPS样细胞多能性相关基因的m RNA表达水平,结果显示,蒙古马iPS样细胞高表达Oct4、Sox2、Nanog、Bmp4、Rex1等5个多能性相关基因;⑷对获得的蒙古马iPS样细胞进行免疫荧光染色实验,结果显示蒙古马iPS样细胞表达多能性标记Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、SSEA-1以及SSEA-4;⑸将蒙古马iPS细胞培养液中成分2i、LIF及BFGF撤去后观察其形态变化。结果显示,培养液撤去2i和BFGF时,E-iPS失去克隆形态,表明蒙古马iPS细胞可能通过BFGF途径来维持多能性。
李学亮[2](2021)在《组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究》文中研究表明精子发生过程包括三个阶段,即精原干细胞的自我更新与分化、精母细胞的减数分裂和单倍体圆形精细胞的变形。这一过程受到基因表达的精密调控。条件性敲除胚胎期生殖细胞内的H3K9me2去甲基化酶基因Jmjd1a和Jmjd1b导致基因表达紊乱和精子发生受损。因此,探究组蛋白甲基化修饰对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制,对于雄性不育的诊治具有一定的指导意义。组蛋白甲基转移酶SETDB1能够催化组蛋白H3K9甲基化,在干细胞多能性维持,神经细胞分化等过程中发挥重要作用。然而,SETDB1调控精原干细胞增殖与分化的确切机制仍不清楚。因此,本研究利用细胞免疫荧光,染色质免疫共沉淀,RNA-seq,ATAC-seq和Ch IP-seq等方法探究SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制。主要结果如下:(1)Ed U和细胞流式检测结果显示Setdb1-KD导致小鼠精原干细胞增殖速率降低,细胞周期阻滞在S期。细胞免疫荧光与TUNEL检测结果表明,Setdb1敲低诱导细胞DNA断裂和凋亡水平升高。这表明Setdb1-KD阻碍了精原干细胞增殖,导致细胞凋亡。(2)Setdb1-KD导致精原干细胞NADPH氧化酶4(NOX4)及其配体P22PHOX表达量上升,活性氧水平升高。挽救试验发现,相对于Setdb1敲低组,Setdb1和Nox4同时敲低组的细胞内活性氧含量较低,细胞凋亡增加和增殖速率减慢的表型得到部分挽救。此外,使用活性氧清除剂褪黑色素直接清除细胞内的活性氧,也可以在一定程度上抑制Setdb1-KD诱导的细胞凋亡。这表明NOX4上调介导的活性氧水平升高参与到Setdb1敲低诱导的细胞凋亡和增殖速率减慢。(3)Setdb1-KD导致细胞内p-P38和p-JNK水平升高、FOXO4活化,这表明Setdb1-KD激活了细胞内活性氧下游p38/JNK-FOXO4信号通路。(4)SETDB1-Ch IP-qPCR和H3K9me3-Ch IP-qPCR结果显示,Nox4基因启动子区域几乎没有SETDB1和H3K9me3的富集,说明SETDB1对Nox4的调控不是直接的,有可能是由于Setdb1-KD导致Nox4基因临近处的转座子激活,从而使得NOX4表达量升高。(5)在小鼠精原细胞内,Ythdf2-KO导致SETDB1与H3K9me3修饰水平降低。蛋白质免疫共沉淀结果表明,SETDB1与γH2AX之间相互作用。当发生DNA损伤时,Setdb1-sh RNA介导的Setdb1-KD导致精原细胞的克隆形成能力降低,细胞凋亡增加,γH2AX阳性细胞数增加。同时,当发生DNA损伤时,Ythdf2-KO的精原细胞出现了与Setdb1-KD类似的表型。而且体内试验结果发现,当用DNA损伤药物etoposide诱导发生DNA损伤时,Ythdf2 c KO小鼠(Stra8-Cre,Ythdf2loxp/loxp)睾丸组织平均每个曲细精管内的γH2AX阳性细胞数和c PARP阳性细胞数均高于对照组。这表明在小鼠精原细胞,YTHDF2能够调控Setdb1的表达,且它们均参与DNA损伤应答反应。(6)挽救试验发现,当发生DNA损伤时,在Ythdf2-KO的精原细胞过表达Setdb1,部分挽救了Ythdf2-KO介导的细胞克隆形成能力降低的表型。此外,RNA-seq分析表明,在DNA损伤条件下,SETDB1过表达使得Ythdf2-KO组中部分促凋亡基因转录水平降低。这表明Ythdf2-KO诱导的精原细胞DNA损伤敏感性增加部分是由于SETDB1下调导致的。(7)借助流式细胞术和STA-PUT分选猪精原干细胞和分化精原细胞,结合ATAC-seq,Ch IP-seq和RNA-seq解析猪精原干细胞分化过程中SETDB1,H3K9me3修饰以及染色质可及性变化。RNA-seq分析结果表明,精原干细胞分化过程中有684个基因表达上调,702个基因表达下调。而且,在分化过程中,促分化相关基因c-Kit启动子处的SETDB1和H3K9me3修饰富集水平降低,染色质可及性升高。因此,推测SETDB1可能通过H3K9me3修饰调控促分化相关基因表达,从而调控精原干细胞分化。综上所述,本研究发现SETDB1通过调控NADPH氧化酶NOX4的表达和细胞内的活性氧水平,调控小鼠精原干细胞的存活;Ythdf2-KO导致SETDB1下调,从而诱导DNA损伤敏感性增加;SETDB1通过H3K9me3修饰调控猪精原干细胞分化过程中染色质可及性,引起分化相关基因表达变化,从而调控精原干细胞的分化。本研究为组蛋白甲基化修饰对雄性精子发生的调控机制提供理论参考。
张云峰[3](2021)在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中认为绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞(ESC)的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞(iPSC)代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞(PGCLC),进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:(1)筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;(2)初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;(3)建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:(1)组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞(SKC),作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞(MEF),丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。(2)结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶(AP)染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。(3)利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。(4)通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。(5)设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。(6)组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:(1)成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。(2)筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;(3)成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;(4)双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;(5)成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;(6)成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:(1)成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;(2)oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。(3)利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
相立峰[4](2020)在《人胚胎原肠前动态发育研究》文中研究指明伴随工业水平的进步和生活水平的提高,不良的生活环境、不健康的饮食习惯和日益增加的生存压力等导致育龄夫妇的精子与卵子质量急速下降,不孕不育已成为威胁生殖健康的一个重要问题。当胚胎发育至第7天,人胚胎需植入母体的子宫中才能继续存活和发育。这个阶段胚胎在子宫体内发生的变化以及导致这些变化的关键细胞和分子事件,由于材料的无法获得以及缺乏相应技术导致这些问题仍处在黑匣子状态。胚胎植入失败以及在此阶段的发育异常是导致早期流产的主要原因。因此,对人胚胎原肠前发育过程的研究将为我们理解生命起源、探索早期胚胎发育动态变化过程和分子调控机制提供重要的理论依据。2016年的两篇报道在小鼠胚胎体外培养的基础上,建立了着床后人胚胎体外2D培养体系,该体系能够将胚胎在体外培养至13天,并观察到一些谱系分离的现象。然而2D条件下胚胎存在一些重要缺陷,如2D培养的胚胎是扁平的,缺乏体内3D的拓扑结构;虽然2D培养胚胎的滋养外胚层12天后仍在继续存活,但整个胚胎结构发生了坍塌和出现了发育的紊乱,导致很多细胞类型(羊膜上皮)、腔(羊膜腔、卵黄囊)和结构(基底膜、前后轴、原条)无法在2D培养的胚胎中清楚地观测到。因此,这些缺陷限制了2D体系很难真正模拟体内胚胎的发育,无法揭示胚胎在该阶段的发育事件和机制。为了克服以上这些缺陷,我们开展了本论文的研究。我们在获得严格的伦理允许和病人知情同意的条件下,利用临床上捐献的胚胎,通过改善培养基和培养方法,开发了一个三维(3D)人囊胚培养体系,并采用该体系首次将人囊胚在3D条件下培养到原条原基阶段。这些3D胚胎能高度地模拟体内胚胎的发育,经历不同形态的发育并自发组装成2D条件下无法产生的3D结构,包括胚胎双层胚盘、羊膜(amnion)、基底膜(basal membrane)、初级和灵长类独特的次级卵黄囊、前后轴和原条前体。利用这个体系,我们揭示了人原肠前胚胎的关键发育事件:(1)通过单细胞转录表达谱的分析,揭示了上胚层细胞、下胚层细胞和滋养层细胞谱系分化和发育的动态和分子调控网络。(2)羊膜上皮细胞(AME)是上胚层细胞分离出来的第一类细胞系,不同于啮齿类动物,人AME发生于原条形成之前,但其特性和分子机制不清楚。我们发现:与上胚层细胞相比,AME显着地下调多能性基因,其形成与基底膜的缺失显着相关,并有独特的分子表达谱。(3)首次阐明细胞滋养层(cytotrophoblast)、绒毛外细胞滋养层(extravillous cytotrophoblast)和合胞体滋养细胞(syncytiotrophoblast)在胚胎着床后的分化以及引起分化的信号和转录因子,揭示了绒毛外细胞滋养层在早期胚胎中不同于中、后期胎盘的功能。(4)揭示了上胚层细胞(PSCs,多能干细胞)着床后将很快从naive到primed状态的转变。PSCs从着床至第14天期间保持相对的稳定状态,而其发育和转化是由不同的多能因子协调作用所决定的。(5)通过人和非人灵长类胚胎的转录组分析,发现非人灵长类和人上胚层细胞在代谢上具有明显差异,而在维持干细胞多能性以及发育的关键分子和信号通路上具有保守性。本论文利用独创的人胚胎体外3D培养体系详细阐述了胚胎在发育过程中谱系的分离、羊膜腔的形成、羊膜上皮的分离、卵黄囊的形成、胚胎极性的产生和原条的形成等发育学事件。本论文回答了EPI多能性的维持和转化、羊膜上皮的形成机制、滋养层分化发育的机制等科学问题。本研究成果为胚胎的早期发育和干细胞的相关研究提供了新的模型,为组织再生和器官再生提供了研究的理论基础,为研究胚胎因素的着床失败和早期流产提供了理论支持,为不孕症治疗和辅助生殖技术中现存问题的解决提供了研究思路和研究方向。
彭颖[5](2020)在《Dll1在小鼠骨骼肌发育和再生中的作用及机制研究》文中研究指明Notch信号是一种进化保守且能调节多种细胞发育的信号通路,在发育过程中其对细胞间的通讯和细胞命运的决定具有重要意义,也是组织稳态所必需的。Notch的配体(Dll1、3、4和Jag1、2)和受体(Notch1-4)均为跨膜蛋白,经典的Notch激活方式是当膜上的配体与相邻受体结合后会促使受体胞内结构域剪切入核,作为转录共激活子与RBPJ共同激活下游靶基因的转录。大量的研究已表明,Notch信号通路在早期肌节和四肢骨骼肌的发育过程中均具有重要的作用;在胎儿期,Notch可以调控肌肉干细胞定位到基质膜与肌纤维膜之间形成出生后再生过程所必须的肌卫星细胞(SCs);而在成年期,Notch调控着肌卫星细胞静息状态的维持、自我更新和分化的平衡。虽然在肌肉发育过程中Notch信号的作用已经明确,但在活体水平具体是来自何种肌肉细胞的哪一种配体主要调控Notch信号及肌肉干细胞功能还不明确。因此本试验首先通过分析肌肉组织和肌肉干细胞数据库解析了5个配体在肌肉中的表达模式以及表达水平,并通过实验验证其表达,确定了Dll1是肌肉发育过程中高表达的配体。接着,通过制备Myo DCre、MLCCre以及Pax7Cre ER驱动的Dll1肌肉细胞特异性敲除鼠,探索来自哪类肌细胞的Dll1对肌肉的发育和再生产生影响。随后,通过成肌细胞及肌纤维培养、活体追踪等实验进一步明确了Dll1对肌肉干细胞命运的调控。最后,探索了在肌肉干细胞中Dll1调控Notch信号的作用方式。获得主要结果如下:1.对已有的肌肉相关测序数据分析显示,在肌肉组织和肌肉干细胞中配体Dll1和Jag1的表达水平较高;在成肌分化过程中Dll1、Jag2和Dll4表达水平显着上升,Jag1变化波动不明显。2.通过cre-loxp系统构建了MLCCre-Dll1(Dll1MLCKO)敲除鼠。分析肌肉显示,肌纤维中敲除Dll1并不影响肌肉的发育;肌纤维中敲除Dll1并不能显着影响肌肉的再生且对SCs的数目无显着调节;跑步测试实验证明肌纤维中敲除Dll1不影响肌肉的运动能力。3.Myo DCre-Dll1(Dll1Myo DKO)敲除鼠在15天左右出先胚胎死亡。肌肉细胞中敲除Dll1导致了严重肌肉发育不良,并且出现肌肉干细胞的严重缺失。进一步研究发现Dll1Myo DKO敲除鼠从E11.5天开始出现肌节和四肢骨骼肌肌肉干细胞的消耗。这一过程伴随着Myo G阳性细胞数比例的瞬时上调。4.Pax7Cre ER-Dll1(Dll1Pax7KO)敲除鼠在出生后诱导Dll1敲除,下调了肌肉重量及肌纤维大小,同时伴随着肌肉干细胞数目的显着下降。出生后敲除Dll1损害了肌肉的再生,且显着下调了再生状态下SCs的数目。成年期注射TMX诱导Dll1在肌肉干细胞中特异性敲除,显着下调了稳态下的SCs数目。在单次CTX损伤后,敲除Dll1并不能显着影响再生,但SCs数目显着下调。CTX诱导多次损伤后,Dll1Pax7KO鼠出现严重的再生缺陷且伴随着SCs大量缺失。5.体内外实验显示,敲除Dll1抑制了肌肉干细胞的自我更新,对成肌细胞的增殖无显着影响,但促进了成肌细胞的分化。6.共培养成肌细胞实验证明,野生鼠成肌细胞与Dll1KO成肌细胞共培养后并不能回补Dll1的作用,且Notch信号无差异。综上所述,在肌肉组织中肌纤维源的Dll1对肌肉干细胞的功能无显着影响,而肌肉干细胞特异的Dll1对其功能的维持是必不可少的。Dll1能够通过调控肌肉干细胞的稳态的维持、自我更新和分化来调控肌肉干细胞库。并且在这一调控过程中Dll1以细胞自主的方式调控自身Notch和细胞功能。
史鸣飞[6](2020)在《中药有效成分促人诱导多能干细胞神经方向分化功效的评价研究》文中研究说明研究目的:使用小鼠胚胎干细胞报告细胞系及人诱导多能干细胞系对中药有效成分促神经分化功效进行检测,筛选出具有较强促神经分化功效的中药有效成分,为研发促内源性神经再生药物提供实验数据支持。研究方法:1.应用诱导多能干细胞技术,对从健康人与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者尿液中分离的人肾上皮细胞进行重编程,获得人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)系。通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、体内畸胎瘤形成实验以及核型分析等,对所构建的人iPSCs进行鉴定。获取可用于促神经分化功效检测的人iPSCs细胞系。2.应用来源于小鼠的胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)报告细胞系CGR8-21uc,以非那吡啶盐酸盐作为阳性对照药物,对中药有效成分与天然产物库中464种药物促神经分化功效进行检测,应用双荧光素酶检测试剂盒,对反映细胞增殖的海肾荧光素酶表达,以及反映细胞神经方向分化的萤火虫荧光素酶表达进行检测。采用K-Means聚类对筛选结果进行聚类分析,筛选得到较阳性对照药物促神经分化功效更强的候选药物,进行后续实验。3.应用构建的健康人iPSCs,对筛选得到的药物促神经分化功效进行验证。使用单层细胞分化方案,按照确定的药物安全浓度干预细胞分化7天,随后将细胞传代至聚-L-鸟氨酸与层粘连蛋白复合包被的培养板中,继续培养7天后,对神经干细胞标志物Pax6、Nestin以及早期神经元标志物β-微管蛋白Ⅲ(Class Ⅲβ-tubulin,Tuj1)进行免疫荧光染色,定量分析神经突长度,比较药物促神经分化功效。研究结果:1.实验室所构建的健康人及AD患者iPSCs碱性磷酸酶染色阳性,多能性标志物Oct4、Nanog、Tra-1-60免疫荧光染色结果阳性,细胞移植入免疫缺陷小鼠后可形成畸胎瘤,经HE染色鉴定,存在内、中、外三胚层代表性细胞、组织,核型鉴定显示均为正常染色体核型。2.通过聚类分析,将所筛选药物分为4类,其中第一类为促进神经分化而对细胞增殖无影响药物,筛选得到此类药物中较阳性对照药物促神经分化功效更强的药物9种。3.免疫荧光染色结果显示QCJ干预组未出现Nestin与Pax6双阳性神经干细胞(Neural stem cells,NSCs);其余药物干预组均出现花环样Nestin与Pax6双阳性神经干细胞;神经突定量分析结果显示,MBHS与DDG能够显着促进诱导多能干细胞向成熟神经元方向分化。结论:本实验室构建的健康人及AD患者尿液肾上皮细胞来源的iPSCs具有正常的多向分化功能。应用小鼠ESCs报告细胞系CGR8-21uc筛选得到9种具有较强促神经分化功效药物。应用人iPSCs对9种药物促神经分化功效进行验证,发现MBHS与DDG具有较强的促人iPSCs向成熟神经元方向分化功效。
汤玥雯[7](2019)在《小分子化合物诱导成纤维细胞和间充质干细胞转分化为神经干细胞的研究》文中研究表明目的:在神经系统疾病的治疗中,神经干细胞表现出巨大的可塑性,可以被诱导分化成各种类型的成熟神经细胞,但是由于神经干细胞难以直接获取,来源问题已成为应用于临床治疗的关键。本课题主要确定了一种培养条件,利用化合物组合极大提高了小鼠成纤维细胞和间充质干细胞转分化为神经干细胞的效率,进而继续探究其潜在机制,阐明了生长因子与核孔蛋白在诱导过程中发挥的重要作用,为进一步推动神经干细胞应用于临床治疗奠定了基础。方法:从Nestin-GFP荧光标记的转基因小鼠体内分离GFP阴性小鼠原代胚胎成纤维细胞和尾尖成纤维细胞,用添加有化合物组合的优化培养基激活神经干细胞相关基因表达。流式细胞分选分离获得带有荧光标记的细胞群,在神经基础培养基中进一步诱导获得化学诱导神经干细胞。通过实时荧光定量PCR、免疫荧光染色鉴定其神经相关基因和标志物表达情况,CCK-8、免疫荧光测试其增殖和分化能力。对转分化各个阶段的细胞进行转录组和表观基因组测序分析,探究其中高表达生长因子的作用机制。转分化过程细胞核大小发生变化,利用小干扰RNA干扰抑制核孔蛋白合成,研究核孔蛋白在转分化过程中的作用。同时尝试在间充质干细胞中建立小分子化合物诱导转分化为神经干细胞的体系。结果:在以M5300为基础培养基,VPA、CHIR99021和Repsox为化合物组合的条件下,第四天即可见Nestin-GFP阳性细胞。化学诱导神经干细胞的Sox2和Pax6基因被激活,经过长期培养依然维持自我更新能力和多向分化潜能。转录组和表观基因组分析表明,IL6在转分化初期表达升高,FGF5和LIF在后期被动态激活并促成细胞命运的改变。在培养条件中仅加入这些生长因子也可促使成纤维细胞转化为神经祖细胞样细胞。此外,核孔蛋白Nup210激活SoxB1家族转录因子参与了化合物组合或生长因子联合作用诱导直接重编程的多个阶段。使用小分子化合物诱导间充质干细胞,检测到神经干细胞相关基因表达量升高。结论:本课题发现在条件培养基中加入化合物组合可以将小鼠成纤维细胞直接重编程为神经干细胞。生长因子IL6、FGF5、LIF和核孔蛋白Nup210的阶段性激活对于成功诱导发挥着至关重要的作用。本研究揭示了细胞外信号和内部因素在直接细胞重编程中的联合作用。
柏庆然[8](2018)在《神经干细胞表面标志物鉴定和发育过程中的转录调控研究》文中研究说明神经干细胞具有自我更新和分化产生不同类型神经细胞的潜能,是大脑复杂结构和功能的细胞基础。神经干细胞在大脑中的数目随着发育过程的进行逐渐降低,其形态,细胞生物学特征及所分化产生的子代细胞类型也相应变化,且具有异质性。神经干细胞和神经前体细胞因缺乏特异性的分子标记物,尚不能从分子层面予以定义和区分,因此发掘鉴定用于分离纯化不同亚型神经干细胞的表面标志物,对于探索神经干细胞生物学特征和拓展其在转化医学领域里的应用具有重要意义。神经干细胞增殖和分化潜能的变化在大脑发育过程中体现出高度的时序性,受到细胞固有的转录调控网络的精确调控。对不同发育期神经干细胞转录调控网络的研究有助于加深对神经干细胞命运决定机制的认识,为神经干细胞体外定向分化以及治疗神经系统疾病提供新的策略。本论文以小鼠为模式动物,针对大脑皮层发育,分别围绕上述两个问题展开相应研究。为了鉴定神经干细胞的表面标志物,我同合作者结合血管内皮细胞-神经干细胞共培养系统和非天然唾液酸代谢标记系统,在体外对从小鼠胚胎大脑皮层中分离的原代神经干细胞进行扩增和膜蛋白代谢标记。我们找到了若干在神经干细胞和前体细胞中特异性表达,或表达丰度相较其他神经细胞类型显着升高的膜蛋白。我们发现Igsf8特异性地在中间前体细胞中高表达,有望作为首个用以分离纯化此类在神经发生过程中起重要作用的神经前体细胞的表面标志物。为研究在胚胎大脑皮层发育过程中参与神经干细胞基因转录调控的分子机制,我们并以前脑特异性表达的转录因子FOXG1为切入点,在发育不同阶段分选得到神经干细胞和前体细胞进行FOXG1染色质免疫共沉淀测序分析。我们发现FOXG1在神经干细胞和前体细胞基因组上呈动态分布,并结合生物信息分析,在体外初步鉴定了与FOXG1发生互作的转录因子。综上所述,本论文阐述建立高效鉴定神经干细胞表面标志物的新方法,并鉴定到Igsf8可作为中间前体细胞表面标志物。本论文描绘了转录因子FOXG1在神经干细胞和前体细胞基因组的动态分布图,并鉴定了与其互作的转录因子,以解释FOXG1在神经干细胞中介导的转录调控的分子机制。本论文的研究结果为进一步纯化鉴定神经干细胞类型及功能、研究神经干细胞命运决定及分子调控机制打下基础,有助于推动神经干细胞在转化医学中的应用。
张凤兰[9](2017)在《TAG1/APP通过调控miR-218-5p抑制胚胎神经干细胞分化为神经元及机制研究》文中研究表明[目的]目前,阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是全球医疗保健的研究热点,但是其致病原因仍不清楚。研究表明淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)的 C 末端胞内结构域(APP intracellular C-termial domain,AICD)具有转录因子活性,可以调控多种基因表达,且AICD转基因小鼠具有阿尔兹海默病症状,因此AICD逐渐成为阿尔兹海默病的研究新热点。前期研究发现TAG1是APP的功能性配体,能促进APP剪切出AICD,抑制胚胎神经干细胞(embryonic neural stem cells,eNSC)向神经元方向分化。己知阿尔兹海默病的病理学特点之一是神经元减少,因此TAG1-APP信号通路可能与阿尔兹海默病的发生、发展具有相关性,也可能是将来治疗阿尔兹海默病的潜在药物靶点。但是TAG1/APP结合后产生的AICD分子调控eNSC分化的具体机制目前仍不清楚。已知microRNA(miRNA)能够调控神经干细胞的增殖、分化、凋亡等多个过程。故推测在TAG1-APP信号通路中,AICD可能是通过调控miRNA的表达从而抑制了 eNSC向神经元方向的分化。另外,己知miRNA是通过调控下游靶基因mRNA表达发挥功能,因此我们将进一步筛选和验证TAG1-APP信号通路中miRNA的下游功能靶基因。[方法]首先,通过细胞免疫荧光实验和实时荧光定量PCR实验(realtime PCR)检测最佳胎鼠取材年龄和部位,分离培养eNSC。然后,通过分析SH-SY5Y细胞系中AICD ChIP-Seq实验结果、TAG1 KO和APPKO成体小鼠SVZ组织中miRNA microarray实验结果筛选出与AICD、TAG1和APP相关miRNA作为初筛miRNA。再通过real time PCR检测初筛miRNA中在分离培养的eNSC里同时受AICD、TAG1和APP调控的miRNA,将其作为候选miRNA。接着主要通过real time PCR、细胞免疫荧光实验和细胞计数分析检测候选miRNA在神经系统中的表达情况,在eNSC增殖、分化、凋亡过程中的功能以及其能否有效逆转AICD、TAG1和APP对eNSC分化为神经元的影响。最后,主要通过mRNA microarray实验、生物信息学预测和real time PCR实验筛选受AICD和候选miRNA调控的下游靶基因,并通过双荧光素酶实验确定候选miRNA和下游靶基因的靶向关系。再通过real time PCR实验、免疫荧光实验检测靶基因的mRNA-和蛋白质在神经系统的表达情况。进一步通过细胞免疫荧光实验和细胞计数分析检测靶基因对eNSC分化为神经元的影响以及其能否有效逆转候选miRNA对eNSC分化为神经元的作用。[结果]研究发现分离胎龄14天(E14)小鼠的前脑组织能培养出纯度为98%左右的具有增殖和分化能力的优质NSC用于后期实验。通过分析AICD ChIP-Seq实验和miRNA microarray实验共筛选出10个与AICD、TAG1和APP有关miRNA。进一步通过real time PCR实验发现在eNSC中只有miR-218-5p的表达同时受AICD、TAG1和APP的调控。随后,通过real-time PCR实验、细胞免疫荧光实验和细胞计数分析发现miR-218-5p在小鼠神经系统中的表达具有时空特异性和细胞特异性,并具有促进eNSC增殖、抑制eNSC向神经元分化的功能,但它对eNSC和诱导分化的eNSC的凋亡没有影响。另外还发现miR-218-5p能有效逆转AICD、TAG1和APP对eNSC分化为神经元的影响。最后通过mRNA microarray实验、生物信息学预测、real time PCR实验以及双荧光素酶报告实验发现Phc3是miR-218-5p的下游靶基因。并且发现Phc3 mRNA在神经系统中的表达具有时间特异性、Phc3蛋白在神经系统中的表达具有细胞亚结构特异性、Phc3 siRNA抑制eNSC向神经元方向的分化,还能有效逆转miR-218-5p inhibitor对eNSC分为神经元的上调作用。[结论]本课题主要发现TAG1/APP结合产生AICD后主要通过调控miR-218-5p的表达抑制体外分离培养的eNSC向神经元方向的分化,而在此过程中miR-218-5p可以通过调控Phc3的表达来完成此功能。本课题详细研究了TAG1-APP信号通路的具体过程,为进一步深入研究此信号通路在阿尔兹海默病发生、发展过程中的作用及其潜在治疗价值提供前期研究基础。
李社芳,苗灵娟,李宁,梁鹤,任德启,郭健[10](2017)在《甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响》文中指出背景:甘草苷对神经细胞有保护和营养作用,但甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响尚未见报道。目的:研究不同质量浓度甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响。方法:从孕14 d昆明白小鼠胚胎脑组织中分离出神经干细胞并培养,采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞,利用qR T-PCR检测神经干细胞特异性基因表达,MTT法绘制神经干细胞生长曲线。取生长旺盛的神经干细胞,分别以0(对照),1,2,4,8 g/L的甘草苷干预,干预48 h后,MTT法检测细胞增殖。结果与结论:(1)培养第5天时,所有单个的神经干细胞全部聚集成球,随着时间的延长,细胞球体积越来越大,细胞球融合成更大的细胞团;(2)免疫细胞化学鉴定显示,100%的神经干细胞球呈巢蛋白阳性表达;(3)qR T-PCR检测显示,神经干细胞巢蛋白阳性表达较强,不表达神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白;(4)神经干细胞刚开始生长缓慢,处于生长缓慢期,第二三天起,细胞增殖迅速,进入指数生长期;第4天后,细胞增殖逐步减缓,细胞整体进入生长平台期;(5)2,4,8 g/L甘草苷组细胞增殖明显高于对照组(P<0.05),并且随着甘草苷质量浓度的升高,神经干细胞增殖速度逐渐升高;(6)结果表明,2-8 g/L甘草苷能促进小鼠胚胎脑神经干细胞的增殖。
二、小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定(论文提纲范文)
(1)蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的初步建立(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
缩略词表 |
1 前言 |
1.1 多能干细胞 |
1.1.1 胚胎干细胞 |
1.1.2 核移植ESCs |
1.1.3 诱导多能干细胞 |
1.2 多能干细胞的诱导方法 |
1.2.1 整合方法 |
1.2.2 非整合方法 |
1.3 诱导多能干细胞的研究意义 |
1.3.1 iPSCs与疾病建模及治疗 |
1.3.2 iPSCs与再生医学 |
1.3.3 iPSCs与农业经济 |
1.4 马多能干细胞研究历程 |
1.4.1 马胚胎干细胞 |
1.4.2 马诱导多能干细胞 |
1.5 本研究目的及意义 |
1.6 技术路线 |
2 实验一蒙古马胚胎成纤维细胞的培养及小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备 |
2.1 试验耗材与试剂 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 主要试剂药品 |
2.1.3 主要仪器设备 |
2.1.4 试剂配制 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 蒙古马胚胎成纤维细胞原代培养 |
2.2.2 蒙古马胚胎成纤维细胞传代培养 |
2.2.3 蒙古马胚胎成纤维细胞冻存 |
2.2.4 蒙古马胚胎成纤维细胞复苏 |
2.2.5 蒙古马胚胎成纤维细胞生长曲线绘制 |
2.2.6 小鼠成纤维细胞原代培养 |
2.2.7 饲养层细胞制备 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 蒙古马胚胎成纤维细胞的形态学观察 |
2.3.2 蒙古马胚胎成纤维细胞生长曲线 |
2.3.3 小鼠胚胎成纤维细胞形态学观察 |
2.3.4 蒙古马胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞的对比 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
3 实验二多顺反子慢病毒包装体系的优化 |
3.1 试验耗材与试剂 |
3.1.1 实验材料 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 主要仪器设备 |
3.2 试验方法 |
3.2.1 慢病毒质粒的转化及提取 |
3.2.2 293T细胞培养 |
3.2.3 慢病毒包装 |
3.2.4 慢病毒感染 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 慢病毒质粒转染效率的比较 |
3.3.2 慢病毒感染效率的比较 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
4 实验三蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的建立及鉴定 |
4.1 试验耗材与试剂 |
4.1.1 实验材料 |
4.1.2 主要试剂耗材 |
4.1.3 主要仪器设备 |
4.1.4 主要培养液及试剂配制 |
4.2 试验方法 |
4.2.1 蒙古马胚胎成纤维细胞培养 |
4.2.2 慢病毒质粒的转化及提取 |
4.2.3 慢病毒颗粒包装及EEF测滴度 |
4.2.4 慢病毒感染蒙古马胚胎成纤维细胞 |
4.2.5 iPS克隆的分离与培养 |
4.2.6 蒙古马iPS样细胞的传代、冻存与复苏 |
4.2.7 蒙古马iPS样细胞生物学特性检测 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 EEF测慢病毒滴度 |
4.3.2 EEF细胞诱导后碱性磷酸酶及多能性标记物的检测 |
4.3.3 多顺反子体系诱导获得蒙古马iPS样细胞及其鉴定 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
结论 |
致谢 |
参考文献 |
作者简介 |
(2)组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
文献综述 |
第一章 精子发生与精原干细胞 |
1.1 精子发生 |
1.2 精原干细胞 |
1.3 精原干细胞增殖调控 |
1.3.1 GDNF对精原干细胞增殖的调控 |
1.3.2 ETV5 对精原干细胞增殖的调控 |
1.3.3 BCL6B对精原干细胞增殖的调控 |
1.3.4 ID4 对精原干细胞增殖的调控 |
1.3.5 PLZF对精原干细胞增殖的调控 |
1.3.6 POU5F1 对精原干细胞增殖的调控 |
1.3.7 FOXO1 对精原干细胞增殖的调控 |
1.3.8 活性氧对精原干细胞增殖的调控 |
1.4 精原干细胞分化调控 |
1.4.1 SOX3 对精原干细胞分化的调控 |
1.4.2 STAT3 对精原干细胞分化的调控 |
1.4.3 NGN3 对精原干细胞分化的调控 |
1.4.4 SOHLH1和SOHLH2 对精原干细胞分化的调控 |
1.4.5 DMRT1 对精原干细胞分化的调控 |
第二章 表观修饰与SETDB1 的研究进展 |
2.1 组蛋白甲基化 |
2.2 H3K9me3 修饰 |
2.2.1 H3K9me3 与异染色质形成 |
2.2.2 H3K9me3 与细胞命运决定 |
2.3 组蛋白甲基化修饰与DNA损伤应答 |
2.3.1 H3K4 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
2.3.2 H3K9 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
2.3.3 H3K27 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
2.3.4 H3K36 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
2.3.5 H3K9 甲基化和DNA甲基化对转座子的调控 |
2.4 组蛋白甲基化对精原干细胞增殖与分化的调控 |
2.5 m~6A修饰对精原干细胞增殖与分化的调控 |
2.6 SETDB1 的结构 |
2.7 SETDB1 的亚细胞定位 |
2.8 SETDB1 对转座子的调控 |
2.9 SETDB1 在雄性生殖细胞中的功能 |
2.10 研究目的与意义 |
试验部分 |
第三章 SETDB1 对小鼠精原干细胞存活的调控作用 |
3.1 材料和方法 |
3.1.1 细胞系 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 主要仪器设备 |
3.1.4 试验方法 |
3.2 结果 |
3.2.1 Setdb1 si RNA干扰效率检测 |
3.2.2 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞内活性氧水平的影响 |
3.2.3 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞存活的影响 |
3.2.4 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞增殖速率的影响 |
3.2.5 Setdb1-KD诱导活性氧上调的分子机制 |
3.2.6 Setdb1-KD通过调节细胞内活性氧水平调控精原干细胞存活 |
3.2.7 Setdb1-KD激活活性氧下游信号通路 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
第四章 SETDB1在Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加过程中的功能 |
4.1 材料和方法 |
4.1.1 细胞系 |
4.1.2 主要试剂 |
4.1.3 主要仪器设备 |
4.1.4 试验方法 |
4.2 结果 |
4.2.1 Ythdf2-KO导致小鼠精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
4.2.2 Ythdf2-KO影响DNA损伤修复 |
4.2.3 体内试验说明Ythdf2 cKO影响DNA损伤修复 |
4.2.4 Ythdf2-KO对 H3K9me3 修饰的影响 |
4.2.5 Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加的分子机制 |
4.2.6 SETDB1与γH2AX具有相互作用 |
4.2.7 Setdb1-KD导致精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
4.2.8 Setdb1-KD影响DNA损伤修复 |
4.3 讨论 |
4.4 小结 |
第五章 SETDB1 对猪精原干细胞分化的调控 |
5.1 材料和方法 |
5.1.1 主要试剂 |
5.1.2 试验方法 |
5.2 结果 |
5.2.1 猪精原干细胞的分离纯化及其鉴定 |
5.2.2 猪分化精原细胞的分离纯化及其鉴定 |
5.2.3 猪精原干细胞分化过程中的基因表达分析 |
5.2.4 猪精原干细胞分化过程中染色质可及性变化 |
5.2.5 SETDB1 介导的H3K9me3 修饰与染色质可及性之间的关系 |
5.3 讨论 |
5.4 小结 |
结论 |
创新点 |
后续研究工作 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
个人简历 |
(3)促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第一章 绪论 |
1 研究的目的和意义 |
2 国内外研究进展 |
2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
2.1.1 体细胞重编程的机制 |
2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
2.3 miRNAs与多能干细胞 |
2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
3 研究内容 |
4 技术路线 |
第二章 试验研究 |
试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
1.材料和方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 动物和细胞 |
1.1.2 主要仪器和设备 |
1.1.3 主要试剂耗材 |
1.1.4 质粒 |
1.2 方法 |
1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
1.2.5 慢病毒包装 |
1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
1.2.8 siPSC的鉴定 |
1.2.9 数据统计分析 |
2 结果与分析 |
2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
2.4 成功包装各类慢病毒 |
2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
2.6.1 AP染色鉴定 |
2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
2.6.5 siPSC核型分析 |
2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
3 讨论 |
3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
4 小结 |
试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
1 材料和方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 细胞和载体 |
1.1.2 重要仪器和设备 |
1.1.3 主要试剂 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
1.2.7 数据统计分析 |
2 结果与分析 |
2.1 miR-200c靶基因的预测 |
2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
3 讨论 |
3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
3.2 miRNA提高重编程的机制 |
4 小结 |
试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
1 材料和方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 细胞和载体 |
1.1.2 重要仪器和设备 |
1.1.3 主要试剂 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
1.2.3 慢病毒滴度测定 |
1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
1.2.7 数据统计分析 |
2 结果与分析 |
2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
3 讨论 |
3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
4 小结 |
全文结论 |
创新点 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
作者简历 |
石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
(4)人胚胎原肠前动态发育研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第一章 绪论 |
1.1 环境因素与生殖健康 |
1.1.1 环境污染与生殖健康 |
1.1.2 生活方式与配子发生 |
1.1.3 胚胎体外培养环境压力与表观遗传改变 |
1.2 早期胚胎发育概述 |
1.2.1 早期胚胎发育 |
1.2.2 多能干细胞与胚胎发育 |
1.3 着床前胚胎发育 |
1.3.1 辅助生殖技术现状 |
1.3.2 着床前胚胎发育过程 |
1.3.3 着床前胚胎基因调控 |
1.4 着床后胚胎发育 |
1.4.1 胚胎2D体外培养体系的建立 |
1.4.2 着床后胚胎发育过程 |
1.4.3 着床后胚胎发育转录因子调控 |
1.4.4 人类胚胎干细胞模型 |
1.5 信号通路在胚胎发育及干细胞中的研究 |
1.5.1 Wnt信号通路与胚胎发育 |
1.5.2 TGF-β/Activin/Nodal信号通路对胚胎发育的作用 |
1.6 论文的立题依据及主要研究内容 |
第二章 实验材料及方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 材料来源 |
2.1.2 主要试剂及配制方法 |
2.1.3 使用抗体 |
2.1.4 仪器设备 |
2.1.5 耗材 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 胚胎样品的准备 |
2.2.2 胚胎体外培养 |
2.2.3 Matrigel浓度的选择 |
2.2.4 全胚染色 |
2.2.5 胚胎冰冻切片及切片染色 |
2.2.6 共聚焦显微镜拍照 |
2.2.7 单细胞消化分离 |
2.2.8 细胞测序过程 |
2.2.9 测序结果分析 |
第三章 人胚胎原肠前动态发育研究实验结果 |
3.1 引言 |
3.2 人胚胎体外3D培养体系的建立 |
3.2.1 人胚胎体外培养体系探索 |
3.2.2 着床后胚胎发育过程是谱系动态变化的过程 |
3.3 EPI动态发育研究 |
3.3.1 EPI发育过程是naive向 primed转变的过程 |
3.3.2 EPI发育阶段互相联系又各自表达不同基因 |
3.3.3 人类与非人灵长类EPI发育既有差异又有保守性 |
3.4 着床后胚胎关键结构的形成 |
3.4.1 羊膜上皮是从EPI中迁移出来的一群独特的细胞 |
3.4.2 胚胎前后轴及原条前体的形成 |
3.5 滋养层细胞发育是分化发育的过程 |
第四章 讨论 |
4.1 人胚胎体外培养体系的突破 |
4.2 本研究填补了着床后人胚胎发育分子机制的空白 |
4.3 胚胎发育过程是多能性细胞从naive到 primed态转变过程 |
4.4 人类胚胎与其他物种胚胎发育的差异 |
4.5 人胚胎发育过程中特殊结构的形成 |
4.6 滋养层细胞发育分化 |
4.7 小结 |
第五章 总结与展望 |
5.1 总结 |
5.2 论文的创新性 |
5.3 展望 |
致谢 |
参考文献 |
附录 A 攻读博士期间取得的科研成果及奖励 |
附录 B 医学伦理证明 |
(5)Dll1在小鼠骨骼肌发育和再生中的作用及机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
主要符号对照表 |
第一章 骨骼肌发育、NOTCH信号通路及其配体Dll1的研究进展 |
引言 |
1.1 骨骼肌的发育 |
1.1.1 骨骼肌简介 |
1.1.2 骨骼肌的起源、形成和发育 |
1.1.3 骨骼肌卫星细胞 |
1.1.4 肌卫星细胞的静息、激活、增殖、不对称分裂及自我更新 |
1.1.5 成年骨骼肌损伤后再生的修复机制 |
1.1.6 肌肉干细胞成肌分化的分子机制 |
1.1.7 肌纤维类型及肉质 |
1.2 NOTCH信号通路的研究进展 |
1.2.1 NOTCH信号通路在肌肉方面的研究 |
1.2.2 NOTCH信号通路在脂肪方面的研究 |
1.2.3 NOTCH信号通路在其他领域的研究 |
1.3 Dll1的研究进展 |
本研究的主要目的、意义及研究内容 |
第二章 NOTCH各配体在骨骼肌发育过程的表达 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 试验动物 |
2.1.2 试验方法 |
2.1.3 数据统计 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 肌肉测序数据库分析各配体在肌肉组织中的表达水平 |
2.2.2 NOTCH信号通路各配体在肌卫星细胞分化过程中的表达模式 |
2.2.3 配体Dll1在静息期和激活期的肌卫星细胞中的表达 |
2.2.4 Dll1在肌卫星细胞静息、激活、增殖、分化过程中的表达模式 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
第三章 肌纤维源的Dll1敲除对肌卫星细胞及肌肉发育和再生的影响 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 试验动物 |
3.1.2 试验方法 |
3.1.3 数据统计 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 Dll1在肌纤维中的表达及Dll1肌纤维特异性敲除鼠的构建 |
3.2.2 肌纤维源Dll1的敲除对肌肉发育及功能的影响 |
3.2.3 肌纤维中敲除Dll1对肌肉再生的影响 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
第四章 肌肉细胞中特异性敲除Dll1对胚胎期肌肉发育的影响 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 试验动物 |
4.1.2 试验方法 |
4.1.3 数据统计 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 MyoD~(Cre)特异性敲除Dll1小鼠的构建 |
4.2.2 敲除Dll1对小鼠胚胎期肌肉形态的影响 |
4.2.3 敲除Dll1对肌肉干细胞的影响 |
4.2.4 敲除Dll1对肌肉起源的体节发育的影响 |
4.3 讨论 |
4.4 小结 |
第五章 肌肉干细胞特异性敲除Dll1对出生后肌肉发育及成年肌肉再生的影响 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 试验动物 |
5.1.2 试验方法 |
5.1.3 数据统计 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 肌肉干细胞中Dll1特异性敲除鼠的构建 |
5.2.2 出生后敲除Dll1对肌肉发育的影响 |
5.2.3 出生后敲除Dll1对青年小鼠肌肉再生的影响 |
5.2.4 成年后敲除Dll1对肌卫星的影响 |
5.2.5 成年后敲除Dll1对CTX诱导损伤后8天肌肉再生的影响 |
5.2.6 成年后敲除Dll1对CTX诱导损伤28天肌肉再生的影响 |
5.2.7 成年后敲除Dll1对CTX诱导的多次损伤后肌肉再生的影响 |
5.3 讨论 |
5.4 小结 |
第六章 Dll1 调控SCs的自我更新和定向分化 |
6.1 材料与方法 |
6.1.1 试验动物及细胞 |
6.1.2 试验方法 |
6.1.3 数据统计 |
6.2 结果与分析 |
6.2.2 Dll1通过调控SCs的非对称分裂影响SCs的自我更新 |
6.2.3 体外敲除Dll1对成肌细胞的增殖无显着影响,但促进了成肌细胞的分化 |
6.2.4 出生后体内敲除Dll1促进了SCs的过早分化 |
6.3 讨论 |
6.4 小结 |
第七章 Dll1以细胞自主的方式调控肌肉干细胞的功能 |
7.1 材料与方法 |
7.1.1 试验细胞 |
7.1.2 试验方法 |
7.1.3 数据统计 |
7.2 结果与分析 |
7.2.1 SCs中缺失Dll1对肌肉组织中巨噬细胞和内皮细胞的数目无显着影响 |
7.2.2 Dll1主要以细胞自主的方式调控肌肉干细胞的功能 |
7.3 讨论 |
7.4 小结 |
结论 |
创新点 |
后续研究 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
个人简历 |
(6)中药有效成分促人诱导多能干细胞神经方向分化功效的评价研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩略词表 |
文献综述 |
前言 |
第一章 健康人/AD患者iPSCs细胞系的建立研究 |
前言 |
1 材料和方法 |
2 实验结果 |
3 讨论 |
第二章 基于小鼠ESCs报告细胞系的促神经分化功效药物初步筛选研究 |
前言 |
1 材料和方法 |
2 实验结果 |
3 讨论 |
第三章 基于健康人iPSCs细胞系的药物促神经分化功效的初步验证研究 |
前言 |
1 材料和方法 |
2 实验结果 |
3 讨论 |
结论 |
研究不足与展望 |
参考文献 |
致谢 |
(7)小分子化合物诱导成纤维细胞和间充质干细胞转分化为神经干细胞的研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
英文缩略语表 |
绪论 |
第一部分 小分子化合物诱导小鼠成纤维细胞转分化为神经干细胞分子机制研究 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 结论 |
第二部分 小分子化合物诱导间充质干细胞转分化为神经干细胞的体系建立 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 结论 |
展望 |
参考文献 |
致谢 |
硕士研究生期间发表论文 |
(8)神经干细胞表面标志物鉴定和发育过程中的转录调控研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1章 前言 |
1.1 哺乳动物大脑皮层的发育过程 |
1.1.1 哺乳动物大脑皮层的神经元类型 |
1.1.2 哺乳动物大脑皮层的神经元产生顺序 |
1.2 神经干细胞和前体细胞的研究进展 |
1.2.1 神经干细胞和前体细胞的定义 |
1.2.2 神经干细胞在前脑发育过程中的演变 |
1.2.3 神经干细胞和前体细胞的异质性 |
1.2.4 主要的神经干细胞和前体细胞类型 |
1.2.5 神经干细胞和前体细胞分裂模式 |
1.3 神经干细胞和前体细胞命运决定的调控机制 |
1.3.1 神经干细胞和前体细胞分化的时序性受细胞内在程序调控 |
1.3.2 神经干细胞自我更新和分化的能力受环境因素影响 |
1.4 神经干细胞和前体细胞表面标志物的研究 |
1.4.1 细胞表面蛋白的唾液酸化修饰 |
1.4.2 大脑唾液酸化修饰与神经干细胞发育 |
1.4.3 非天然唾液酸代谢标记 |
1.5 FOXG1 的研究进展 |
1.5.1 FOXG1 基因和蛋白的分子特征 |
1.5.2 FOXG1 在神经系统的表达模式和亚细胞定位 |
1.5.3 FOXG1 在前脑发育中的功能研究 |
1.5.4 FOXG1 的作用机制 |
1.5.5 FOXG1 在神经发育性疾病的相关研究 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 主要实验仪器和设备 |
2.1.2 主要实验试剂耗材 |
2.1.3 质粒,菌株及细胞系 |
2.1.4 小鼠 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 生物化学及分子生物学实验方法 |
2.2.2 细胞生物学实验方法 |
2.2.3 免疫组织化学及免疫荧光实验 |
第3章 神经干细胞表面标志物鉴定 |
3.1 引言 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 检测胚胎大脑皮层中唾液酸的含量及分布 |
3.2.2 利用非天然唾液酸合成前体标记小鼠胚胎神经干细胞 |
3.2.3 建立Ac4ManNAz标记血管内皮共培养系统扩增原代神经干细胞系统 |
3.2.4 标记,比较,鉴定神经干细胞和前体细胞特异性高表达膜蛋白质组 |
3.2.5 鉴定Igsf8 作为潜在中间前体细胞表面标志物 |
3.3 小结与讨论 |
第4章 神经干细胞中FOXG1 介导的转录调控网络 |
4.1 引言 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 检测胚胎大脑皮层中FOXG1 的表达模式 |
4.2.2 分选不同发育阶段的皮层神经干细胞 |
4.2.3 不同发育阶段的皮层神经干细胞中FOXG1的ChIP-seq |
4.2.4 FOXG1 在不同发育阶段的皮层神经干细胞中的分布特征分析 |
4.2.5 FOXG1 在不同发育阶段神经干细胞基因组上的动态变化 |
4.2.6 鉴定FOXG1 在神经干细胞基因组上的结合基序 |
4.2.7 FOXG1 在神经干细胞中靶向重要调控因子的启动子区 |
4.2.8 鉴定FOXG1 在大脑发育中相互作用蛋白 |
4.3 小结与讨论 |
第5章 总结与展望 |
5.1 论文总结 |
5.1.1 神经干细胞表面标志物鉴定研究总结 |
5.1.2 FOXG1 介导的神经干细胞转录调控网络研究总结 |
5.2 论文展望 |
5.2.1 神经干细胞表面标志物鉴定研究展望 |
5.2.2 FOXG1 参与神经干细胞转录调控网络研究展望 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
(9)TAG1/APP通过调控miR-218-5p抑制胚胎神经干细胞分化为神经元及机制研究(论文提纲范文)
缩略词表(以字母顺序排列) |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定 |
一、材料与方法 |
二、结果 |
三、讨论 |
第二部分 TAG1/APP通过调控miR-218-5p抑制胚胎神经干细胞分化为神经元 |
一、材料与方法 |
二、结果 |
三、讨论 |
第三部分 miR-218-5p通过调控Phc3抑制胚胎神经干细胞分化为神经元 |
一、材料与方法 |
二、结果 |
三、讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读学位期间获得的学术成果 |
致谢 |
(10)甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响(论文提纲范文)
0引言Introduction |
1 材料和方法Materials and methods |
1.1 设计 |
1.2 时间及地点 |
1.3 材料 |
1.4 实验方法 |
1.4.1 小鼠胚胎脑神经干细胞的分离及培养[23] |
1.4.2 小鼠胚胎脑神经干细胞的传代 |
1.4.3 神经干细胞的免疫细胞化学鉴定 |
1.4.4 q RT-PCR检测神经干细胞特异性基因 |
1.4.5 MTT法绘制神经干细胞生长曲线 |
1.4.6 甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响[24] |
1.5 主要观察指标 |
1.6 统计学分析 |
2 结果Results |
2.1 小鼠胚胎脑神经干细胞分离及培养结果 |
2.2 小鼠胚胎脑神经干细胞的鉴定 |
2.3 小鼠胚胎脑神经干细胞的生长曲线 |
2.4 甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响 |
3 讨论Discussion |
四、小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定(论文参考文献)
- [1]蒙古马胚胎成纤维细胞多顺反子体系诱导多能干细胞系的初步建立[D]. 才文道力玛. 内蒙古农业大学, 2021(02)
- [2]组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究[D]. 李学亮. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究[D]. 张云峰. 石河子大学, 2021(01)
- [4]人胚胎原肠前动态发育研究[D]. 相立峰. 昆明理工大学, 2020(04)
- [5]Dll1在小鼠骨骼肌发育和再生中的作用及机制研究[D]. 彭颖. 西北农林科技大学, 2020
- [6]中药有效成分促人诱导多能干细胞神经方向分化功效的评价研究[D]. 史鸣飞. 中国中医科学院, 2020(01)
- [7]小分子化合物诱导成纤维细胞和间充质干细胞转分化为神经干细胞的研究[D]. 汤玥雯. 上海交通大学, 2019(06)
- [8]神经干细胞表面标志物鉴定和发育过程中的转录调控研究[D]. 柏庆然. 清华大学, 2018(04)
- [9]TAG1/APP通过调控miR-218-5p抑制胚胎神经干细胞分化为神经元及机制研究[D]. 张凤兰. 昆明医科大学, 2017(01)
- [10]甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响[J]. 李社芳,苗灵娟,李宁,梁鹤,任德启,郭健. 中国组织工程研究, 2017(21)