一、人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达（论文文献综述）
董世建[1]（2020）在《聚乙二醇化重组人干扰素α2b的制备工艺及质量研究》文中研究说明重组人干扰素α2b（rh IFNα2b）是最早运用基因工程技术实现量产的细胞因子之一,临床上主要用于急慢性病毒性肝炎（乙型、丙型等）、尖锐湿疣、白血病、淋巴瘤、艾滋病相关性卡波济氏肉瘤、恶性黑色素瘤等的治疗。但因其用药间隔短,很多研究人员致力于开发长效干扰素制剂,聚乙二醇修饰技术是解决蛋白质药物半衰期短的有效手段之一。本学位论文采用分子量20KD的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（m PEG-Succinimidyl Carbonate,m PEG-SC）对rh IFNα2b进行修饰,开发了能够获取高纯度聚乙二醇化重组人干扰素α2b（PEG-rh IFNα2b）的制备方法,并对所获产品进行了理化性质、生物学活性、稳定性等质量研究。（1）聚乙二醇化重组人干扰素α2b（PEG-rh IFNα2b）的制备和纯化。采用DOE试验设计,优化p H、投料比、rh IFNα2b浓度等参数,确定PEG-rh IFNα2b的制备工艺;以离子交换层析结合凝胶过滤层析纯化目标物。最优的工艺为:修饰反应在p H7.0、温度2～8℃、时间约4小时、rh IFNα2b浓度为1.8mg/ml～2.7mg/ml、投料比为2.2～3.0条件下,所获PEG-rh IFNα2b单体含量为44%以上;建立的阳离子交换层析、凝胶过滤层析两步纯化工艺,能有效去除修饰反应副产物NHS和副产物游离PEG,所获PEG-rh IFNα2b纯度在95%以上。（2）聚乙二醇化重组人干扰素α2b（PEG-rh IFNα2b）的理化性质和稳定性。所获PEG-rh IFNα2b相对分子质量为39206.6道尔顿,等电点为5.8～6.0,紫外最大吸收峰波长为280nm,电泳纯度为98.1%～98.4%,HPLC纯度为98.08%～99.74%,产品中未检出游离PEG;通过PEG-rh IFNα2b位置异构体电荷性质存在的微弱差异,采用离子交换高效液相色谱可有效分离出电泳条带位置一致的5个位置异构体;将PEG-rh IFNα2b分别置于2～8℃、25±2℃、37±2℃条件下,在不同时间点考察蛋白含量、电泳纯度、HPLC纯度、游离干扰素、比活性、游离PEG等指标,3批PEG-rh IFNα2b原液在2～8℃条件下保存时间12个月,在25℃±2℃条件下保存3个月,37℃±2℃条件下保存2个月,各项考察指标均符合规定,37℃贮存条件下放置3个月纯度检测不合格。（3）聚乙二醇化重组人干扰素α2b（PEG-rh IFNα2b）的生物活性。对《中国药典》中干扰素生物学活性测定法进行专属性和精密度考察。结果表明《中国药典》中收录的干扰素生物学活性测定法测定PEG-rh IFNα2b生物活性专属性强,溶媒和少量游离PEG对PEG-rh IFNα2b生物活性测定无干扰;精密度良好,RSD=14%（n=6）。
何艺宾[2]（2018）在《海洋动物抗菌肽Scygonadin-Hepcidin融合基因在藻类和拟南芥中的高效表达及其抗菌功能的研究》文中提出抗菌肽（antimicrobialpeptides）是一类具有抗微生物活性的小分子多肽,广泛分布于各生物体内,是生物体内天然免疫防御系统的一个重要组成部分。抗菌肽具有抗菌谱广、易溶于水、进入生物体内无有害残留、不易产生耐药性等优点,有望成为一种新型、高效、环保的抗生素替代品。天然抗菌肽在生物体内含量少、不易分离与提取,且制备的费用较高,因此利用基因工程技术是实现抗菌肽规模化生产的主要手段之一。生物反应器（Bioreactor）是指利用生物系统实现有重要经济价值外源蛋白质的大规模生产。小球藻作为真核细胞具有生长周期短、生产成本低、易于大规模培养等特点,因而转基因小球藻作为生物反应器生产生物活性物质已成为基因工程研究的热点之一。本研究利用本实验室已分离鉴定的拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin和大黄鱼抗菌肽Hepcidin融合基因,通过基因工程技术,实现了抗菌肽Scy-hepc融合基因在转基因小球藻中的稳定表达,并研究了其基因表达产物的抗菌活性及探索了转抗菌肽Scy-hepc融合基因的小球藻在水产养殖业的应用,为未来抗菌肽Scy-hepc的产业化提供理论依据和技术支撑。同时获得了转抗菌肽Scy-hepc融合基因的拟南芥新品种,研究了抗菌肽Scy-hepc在转基因拟南芥中的表达及其抗菌活性,为Scy-hepc在农作物生产中的应用提供理论依据和技术支撑。主要研究结果如下:1.转抗菌肽Sty-hepc融合基因小球藻的构建、稳定表达及其抗菌活性:构建了抗菌肽Scy-hepc融合基因植物双元表达载体,利用电转化方法,经过潮霉素抗性筛选、PCR鉴定、Western blotting分析和GFP荧光检测,获得了稳定表达抗菌肽Scy-hepc融合基因的转基因小球藻,结果表明其表达产物具有抗菌活性,能够抑制嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长。2.转Scy-hepc融合基因的小球藻具有免疫保护作用:以黑鲷和珍珠龙胆石斑鱼为实验对象,以灌胃方式分别喂食转Scy-hepc融合基因的小球藻和野生型小球藻,进一步用嗜水气单胞菌人工侵染上述两种鱼类,发现喂食转基因小球藻的黑鲷和珍珠龙胆石斑鱼的成活率均显着高于对照组。3.抗菌肽Scy-hepc融合基因在细基江蓠繁枝变种中的表达:优化了酶解条件,成功分离出细基江蓠繁枝变种的原生质体,利用电转化方法,实现了抗菌肽Scy-hepc融合基因在细基江蓠繁枝变种原生质体中的瞬时表达,Western blotting分析能够检测到特异性目的蛋白条带;利用植物激素,成功诱导出细基江蓠繁枝变种外植体的类愈伤组织,利用农杆菌介导法,实现了抗菌肽Scy-hepc融合基因在类愈伤组织中的表达,转基因类愈伤组织在荧光显微镜下观察能见到发GFP绿色荧光的细胞团。4.转抗菌肽Scy-hepc融合基因拟南芥的构建、稳定表达及其抗菌活性:利用农杆菌介导的方法,用携带抗菌肽Scy-hepc融合基因的农杆菌侵染拟南芥花絮获得了转基因种子,经过潮霉素抗性筛选、PCR鉴定和Western blotting分析获得了 F1代转基因植株种子;再经过潮霉素抗性筛选、PCR鉴定和Westem blotting分析获得了 F2代稳定表达抗菌肽Scy--hepc融合基因的转基因拟南芥新品系;提取的F2代转基因植株叶片总蛋白具有抗菌活性,能够抑制金黄色葡萄球菌的生长,F2代转基因植株叶片具有抗禾谷镰孢菌侵染的能力。
陈杰[3]（2008）在《高密度培养盘基网柄菌及重组可溶性人Fas配体表达的研究》文中认为盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）,又称为阿米巴虫是一种简单的原生动物。它的细胞个体（直径5-10μm）大于微生物,生长速率高于动物细胞,培养基中不需要添加血清,更重要的是,它们具有类似于高等动物的蛋白糖基化修饰能力。因此在作为宿主细胞表达复杂的重组药用蛋白（特别是糖蛋白）方面,有广阔的应用前景,但也存在着细胞密度及蛋白质表达水平低等问题有待于解决。本论文通过对摇瓶和发酵罐培养条件的优化提高了盘基网柄菌培养密度,并建立了模拟细胞生长规律的生长动力学模型。进行了盘基网柄菌固定化培养研究,研制了以聚氨酯泡沫、棉纤维织物为固定化载体的固定化生物反应器。同时以可溶性人Fas配体（shFasL）作为示例蛋白,对重组表达系统进行了基因工程改造,考察了可溶性人Fas配体生产的工艺条件,并对其分离及纯化工艺进行了初步探索。通过摇瓶培养条件的单因素优化,确定盘基网柄菌AX3-pLu8的最佳培养条件为:温度22℃,pH 6.5,摇床转速150rpm,培养时间100-120小时左右;培养基最佳碳源为葡萄糖,最佳葡萄糖浓度为15g/l。通过在HL-5C培养基中分别添加0.2g l-1色氨酸和0.4g l-1半胱氨酸显着提高最高细胞密度。在上述优化条件下,最高细胞密度达到了3.5×107ml-1。在此基础上,在5L发酵罐上对分批发酵培养盘基网柄菌进行了考察,确定最优批次发酵条件为pH6.5,通气量1vvm,根据菌体生长情况分阶段改变转速,在最优条件下,菌体的对数生长期被有效地延长到了70小时,最高菌体密度达到3.7×107ml-1。对盘基网柄菌的生长动力学进行了研究,建立了一个四参数逻辑方程生长动力学模型,完整地模拟了盘基网柄菌细胞生长直至死亡的全过程。在摇瓶条件下,分别考察了利用聚氨酯泡沫以及棉纤维织物作为载体固定化盘基网柄菌的培养,在此研究的基础上,研制了以聚氨酯泡沫为固定化载体的旋转式生物反应器和以棉纤维织物为固定化载体的纤维床生物反应器（旋转式、外循环式）。在聚氨酯泡沫旋转式生物反应器中最高菌体密度达到了4.2×107ml-1,在旋转式纤维床生物反应器中固定化细胞密度最高达到8.2×107 mL-1,而在外循环式纤维床生物反应器中固定化细胞密度进一步提高到了1.37×108 mL-1,远高于普通悬浮培养时1～2×107ml-1的平均细胞密度。对原有的盘基网柄菌重组表达系统进行改造,构建了带有His-tag的重组pMB74-shFasL-H质粒载体,并转入盘基网柄菌AX3宿主菌进行表达,目的蛋白shFasL的表达量达到了157.8μg l-1。而在外循环式纤维床反应器固定化培养条件下,shFasL的表达量可进一步提高到173.7μg l-1,在此基础上进行的重复批次发酵实现了在360小时中shFasL的持续表达,且发酵过程中细胞密度、蛋白产率均没有明显下降。对产物shFasL的分离纯化进行了初步研究,最终获得的重组蛋白的纯度可达到91.0%,回收率达到了92.1%。此外,在攻读博士学位期间,本人还参与了国家“863”计划目标导向项目“微生物高效生产聚谷氨酸功能材料的新技术和新工艺”的部分研究工作,对原有的γ-聚谷氨酸发酵生产工艺和培养基配方进行了改进,大幅度降低了γ-聚谷氨酸发酵的氮源成本,成功地进行了100 L规模发酵罐的中师放大实验,γ-聚谷氨酸产量达到了54 g l-1,为工业规模生产γ-聚谷氨酸打下了坚实的基础。这部分内容单独列于本论文的附录中。
刘延锋[4]（2008）在《极细链格孢菌激活蛋白PeaT1在毕赤酵母中的表达及其互作蛋白的研究》文中研究说明本研究室从极细链格孢菌（Alternaria tenuissima） JH505中分离纯化获得一种能诱导植物产生系统抗性、促进植物生长的激活蛋白PeaT1,其表观分子量约为35 kD;克隆了编码该蛋白的基因peaT1（登录号CH44 5335）并在大肠杆菌中获得了表达,确定了表达蛋白具有促进小麦生长和诱导烟草抗TMV的功能。本研究在此基础上,将peaT1基因转入巴斯德毕赤酵母中,建立PeaT1蛋白的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探索利用基因工程手段进行大规模生产激活蛋白奠定了基础。同时为了探讨激活蛋白PeaT1诱导植物系统抗性、促进植物生长的作用机理,本文利用噬菌体展示技术和酵母双杂交技术研究了PeaT1的结合短肽和互作蛋白。主要研究结果如下:1、构建了PeaT1蛋白的毕赤酵母表达体系,获得了具有生物活性的分泌表达蛋白。亚克隆构建了重组表达载体pPIC9K-peaT1,酶切线性化后电击转入毕赤酵母GS115菌株中,经MD平板筛选和PCR鉴定得到整合有外源基因的重组菌株。SDS-PAGE检测表明,表达蛋白的表观分子量约为35 kD,与预期的结果一致。通过胶内酶切与LC-MS技术对重组蛋白进行了鉴定,表明PeaT1蛋白在毕赤酵母中获得了正确表达。重组酵母菌株具有良好的遗传稳定性。HPLC分析显示,培养上清/L经超滤浓缩和离子交换层析后可纯化目的蛋白16.13 mg,蛋白纯度达96%;生物测定结果表明,该纯化蛋白可显着地促进小麦幼苗的生长。2、以PeaT1蛋白为固相筛选分子,对噬菌体十五肽库进行了亲和筛选,获得了与PeaT1蛋白特异结合的短肽。经过三轮的生物淘洗,通过每轮逐渐增加洗脱次数,特异性噬菌体克隆得到了有效富集。经单克隆ELISA鉴定和DNA序列分析获得了9个与PeaT1蛋白特异结合的多肽。在NCBI上提交拟南芥的蛋白质数据库,获得了6个包含上述9个多肽之一的蛋白。3、利用酵母双杂交技术筛选拟南芥cDNA文库,获得PeaT1蛋白的互作蛋白。采用SMART技术,通过RT-PCR和LD-PCR合成了拟南芥的ds cDNA,与线性化的pGADT7-Rec在酵母体内修复酶的作用下同源重组形成完整的AD文库。以PeaT1为诱饵蛋白,共转化酵母细胞,筛选到5个能使报告基因ADE2和HIS3同时转录表达的转化子。α-半乳糖苷酶活性分析表明,它们也都能使第三个报告基因MEL1得以表达,说明它们在酵母体内确实能够与PeaT1诱饵蛋白发生相互作用。序列分析结果显示,5个阳性转化子中的4个序列是一致的,最后得到了2个与PeaT1互作的蛋白,分别命名为PIP-1和PIP-2。4、PIP-1是拟南芥中的ATLFNR1（NADPH脱氢酶）,参与体内电子运输。PIP-2是含有初生多肽复合酶结构域的蛋白,其与烟草NbBTF3（β-NAC）蛋白的相似性为80.6%,也可能对叶绿体和线粒体的发育及生理产生影响,进而对植物的生长产生影响,其功能还有待于进一步验证。
孙丽[5]（2008）在《人乳铁蛋白和CD14蛋白在植物中的表达研究》文中研究指明乳铁蛋白可以抑制和杀死许多革兰氏阳性、阴性细菌及一些真菌,具有抗氧化、调节人体免疫反应等重要的生物学功能,可以作为高效补铁剂、防腐剂、抗氧化剂、抗肿瘤剂、潜在的饲用抗生素代替品等,具有广阔的应用前景。CD14是机体免疫反应过程中的关键分子,包括脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、磷壁酸（LTA）在内的多种细菌产物都通过CD14的途径激活单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞等免疫细胞,释放细胞因子及其它炎症介质,介导一系列生理和病理反应。CD14分子以两种形式存在:膜结合型CD14（mCD14）和可溶性CD14（sCD14）。sCD14可以预防感染、提高机体免疫力并且对一些疾病具有一定的治疗作用。开发和研究乳铁蛋白和CD14已经引起了广泛关注。但目前乳铁蛋白工业化生产成本高,产量不理想,CD14在乳汁等中含量低,又存在其他大量存在的蛋白的影响,大量纯化也很难。所以,近年来注目的焦点是利用基因工程等技术来开发低成本的乳铁蛋白和CD14,期望这两种蛋白得到充分利用。植物作为生物反应器来生产重组蛋白已有许多成功的实例。在现存的各种重组蛋白表达系统中,植物生物反应器是最经济的一种表达系统。利用植物生物反应器生产外源蛋白具有一定的优势,它所表达的蛋白在折叠和组装上和动物细胞的更为相似,从而具有和高等动物细胞表达的产物基本一致的免疫原性和生物活性,并且不会存在被一些动物病毒、病原体污染的可能。但是,植物表达系统还处于发展阶段,存在着外源蛋白表达量低等问题。本工作拟为利用玉米作为生物反应器生产人乳铁蛋白和CD14的研究奠定基础。首先从人乳腺cDNA中克隆得到了乳铁蛋白和CD14的全长cDNA序列,为了提高重组蛋白在转基因植物中的积累量,又从玉米种子cDNA中克隆得到了玉米醇溶蛋白信号肽编码序列。然后,利用基因重组技术用玉米醇溶蛋白信号肽代替了乳铁蛋白和CD14基因原有的信号肽,构建融合基因和乳铁蛋白基因、CD14基因的植物表达载体,采用农杆菌介导法将乳铁蛋白基因、CD14基因转入烟草和玉米,获得了转基因植株。通过对转基因烟草植株进行Western Blot检测,肯定了乳铁蛋白和CD14在烟草中被成功表达。ELISA定量检测结果显示,转基因烟草植株表达的重组蛋白量分别为0.41%（转带有玉米醇溶蛋白信号肽乳铁蛋白基因）、0.46%（转带有玉米醇溶蛋白信号肽CD14基因）、0.17%（转带原有信号肽乳铁蛋白基因）和0.21%（转带原有信号肽CD14基因）,更换有玉米醇溶蛋白信号肽序列的融合基因在转基因烟草植株中表达的重组蛋白量成倍高于带原有信号肽序列的乳铁蛋白基因和CD14基因的表达量,证明了玉米醇溶蛋白信号肽的引入确实增加了重组蛋白在转基因植株中的积累量。重组乳铁蛋白抑菌试验结果表明,更换有玉米醇溶蛋白信号肽和带原有信号肽的转基因烟草植株表达的重组乳铁蛋白具有相同的生物活性,说明玉米醇溶蛋白信号肽序列的引入不影响重组蛋白的生物活性。转基因烟草中的表达研究为这两个基因转入玉米中的研究提供了资料。在转基因玉米中,为了进一步提高重组蛋白的积累量,采用了玉米种子胚乳特异性启动子启动乳铁蛋白基因和CD14基因表达,拟将重组蛋白定位在玉米种子胚乳中。转基因玉米检测的工作正在进行中。
王颖[6]（2007）在《重组盘基网柄菌高密度发酵合成培养基的优化研究》文中认为盘基网柄菌Dictyostelium discoideum作为一个新兴的真核生物表达系统,用于表达需要翻译后修饰的药用蛋白具有广阔的应用前景,但其较慢的生长速度（代时为8-12h）以及较低的细胞密度(1-2×107mL-1)严重限制了它成为通用表达系统的应用。为有效利用盘基网柄菌这一真核表达系统生产异源蛋白诸如人类可溶性Fas配体,有必要实现盘基网柄菌的高密度悬浮培养。本文以可高通量表达人类可溶性Fas配体的重组盘基网柄菌AX3-pLu8为研究对象,以全合成SIH培养基为研究起点,通过优化培养基组成的方法改善其培养,提高细胞生长速度及细胞浓度。发展了柱前衍生反相高效液相色谱检测氨基酸的方法。采用2,4-二硝基氯苯为衍生剂,衍生方法简便,可同时对16种氨基酸进行定性分离和定量检测反应生成的DNP-氨基酸峰面积与氨基酸浓度具有良好的线性关系,线性相关系数在0.992～0.999之间。用该法分析重组盘基网柄菌AX3-pLu8对SIH培养基中氨基酸的利用情况,发现对赖氨酸的利用最为彻底,发酵末期赖氨酸被完全消耗;对蛋氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸的利用也比较充分,在发酵末期这四种氨基酸的含量都降到初始含量的15%以下;而对天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸的需求不大,末期含量仍接近或高于初始含量的50%。采用单次单因素法,分析SIH培养基中各组分对AX3-pLu8细胞生长的影响。葡萄糖为细胞生长的必需营养成分,最佳的初始葡萄糖浓度在10g L-1左右。Mg2+对细胞生长有明显的促进作用,可显着提高最大细胞密度及缩短世代时间。最佳的Mg2+浓度为1.25 mmol L-1,这时最大细胞密度可达5.5×107 mL-1,远高于在标准SIH培养基所能达到的培养水平3.5×107mL-1。Ca2+不是盘基网柄菌细胞生长的必需金属离子,且Ca2+浓度高于3.75 mmol L-1时对细胞生长有抑制作用。少量Fe3+的添加能显着提高细胞的生长速度,但对最大细胞密度影响不大;而高浓度的Fe3+对细胞生长出现明显的抑制作用,细胞几乎不生长,较适添加量为0.1mmol L-1。维生素中,生物素、叶酸及核黄素是AX3-pLu8生长的必需维生素,当培养基中缺少这三种维生素中的任何一种时,细胞几乎不生长,较适合的添加量为生物素10μgL-1,叶酸0.2mgL-1,核黄素2.5mgL-1。VB12和VB1均不是细胞生长所必需的维生素,且添加量对菌体生长影响不大。虽然AX3-pLu8在不添加硫辛酸时也能生长,但最大细胞密度仅能达到1.6×107mL-1,且硫辛酸的添加量对细胞密度的影响也较为明显,最佳硫辛酸浓度为0.4mgL-1。
郑瑞娟[7]（2006）在《黑曲霉木聚糖酶在同源宿主中的分泌性表达及酶学特性研究》文中研究指明木聚糖酶（Xylanase），又称β—D—1，4-内切木聚糖酶，是降解木聚糖的关键酶，它能水解木聚糖主链上的β—1，4—糖苷键，将木聚糖降解为低聚糖和木糖，广泛应用于饲料、造纸和食品医药等行业，具有广阔的应用前景。但木聚糖酶的单位产量较低，是限制木聚糖酶应用的主要因素之一。本研究应用同源高效表达策略，在丝状真菌表达系统中构建高产的黑曲霉木聚糖酶基因工程菌。本课题首先从黑曲霉菌（Aspergillus niger）TS1菌株中提取总RNA，以其为模板运用RT-PCR的方法成功克隆出678bp的木聚糖酶xynB基因，将该基因片段插入融合蛋白基因表达载体pYG1.2葡萄糖淀粉酶编码基因的下游，融合之处设计内胰蛋白酶（KEX2）加工位点，构建融合表达质粒pYG1.2—xynB。测序结果表明，该木聚糖酶基因序列与A.niger IBT-90木聚糖酶（GenBank accession AY536639）基因序列具有99.4％的同源性，有4个碱基的差异，仅一个碱基的突变导致氨基酸改变，编码的蛋白质序列同源性达99.5％。随后运用原生质体转化法将pYG1.2—xynB转化尿嘧啶缺陷型宿主黑曲霉菌M54，获得重组菌株。SDS-PAGE结果表明，重组木聚糖酶在转化菌株中获得了高效分泌性表达，其分子量约为21KD。在1％木聚糖为诱导物的培养条件下，重组菌分泌的木聚糖酶酶活有明显提高，最高酶活达507 IU／ml，分别是原始出发菌和宿主菌的6.7倍和3.89倍。对获得的转化子进行连续传代培养结果表明，重组菌生长特性十分稳定，具有良好遗传稳定性。重组菌最佳产酶时间为培养后72h，最适反应pH为5.2，属酸性木聚糖酶；最适反应温度为50℃，在50℃-60℃之间热稳定性较好，60℃保温30min后残余酶活为63.95％。本实验首次运用同源表达的策略，将黑曲霉木聚糖酶基因在同源丝状真菌中表达。研究结果表明，木聚糖酶在重组黑曲霉中获得了高效分泌性表达。重组菌发酵周期短，产酶活性高，具有重要的应用前景，为酸性木聚糖酶的广泛应用奠定了一定基础。
李佳,刘钟滨[8]（2004）在《耐热植酸酶基因phyA的克隆及新型表达载体的构建》文中进行了进一步梳理目的 克隆烟曲霉耐热植酸酶基因 ,构建分泌性的真核表达质粒 ,以获取耐热的基因工程植酸酶。方法 提取烟曲霉菌的基因组 ,以此为模板PCR扩增成熟肽编码序列 ,双酶切后与包含黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和基因片断的真核表达载体 pYG 1 .2相连接 ,转化入大肠杆菌DH5α ,从转化菌株中提取质粒进行序列测定和分析。 结果 PCR扩增出 1 32 6bp的植酸酶编码序列 ,插入 pYG 1 .2质粒中 ,构建了重组质粒 ,重复实验结果表明 ,该植酸酶基因序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列有 2个碱基的差异 ,编码的蛋白质序列有 99.8%的同源性。结论 成功构建了用于黑曲霉菌真核表达耐热植酸酶的重组质粒。
刘超男[9]（2003）在《益生素及其联合ND疫苗对雏鸡免疫功能和IL-2活性的影响及机理》文中研究说明本实验以1日龄雏鸡为研究对象，应用细胞培养技术、MTT测定法，在益生素及其与新城疫（ND）疫苗协同免疫和ND强毒攻击后，对雏鸡胸腺和脾脏T细胞白细胞介素2（IL-2）诱生活性、外周血液和免疫器官T和B淋巴细增殖反应的动态变化进行测定。旨在全面系统的揭示益生素及其与ND疫苗协同免疫和在ND强毒攻击后，雏鸡细胞因子的免疫调节及血液和免疫器官细胞和体液免疫功能的变化规律。研究结果发现： 雏鸡饲喂益生素后4～10天，其中枢免疫器官胸腺和外周免疫器官脾脏T细胞IL-2诱生活性较未饲喂益生素的对照雏鸡明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；外周血液、胸腺、脾脏T细胞增殖反应于4～10天均明显增强（P＜0.05或P＜0.01）；血液、法氏囊和脾脏B细胞增殖反应分别于饲喂后7～18天和4～10天显着高于相应对照雏鸡（P＜0.05或P＜0.01）。表明雏鸡应用益生素后不但免疫器官的细胞因子分子调节、细胞和体液免疫功能明显增强，而且血液的细胞和体液免疫功能也明显提高。益生素雏鸡免疫器官细胞和体液免疫功能的变化，与其相应的分子免疫调节功能增强密切相关，而外周血液细胞和体液免疫功能的增加则是免疫器官免疫功能增强的外在表现。 益生素雏鸡ND疫苗免疫后7～21天，其胸腺和脾脏T细胞IL-2诱生活性均显着高于单独疫苗免疫雏鸡（P＜0.05或P＜0.01）；胸腺、脾脏和外周血液T细胞增殖反应分别于7～21天和7～14天明显高于单独疫苗免疫雏鸡（P＜0.05或P＜0.01）；血液、法氏囊和脾脏B细胞增殖反应于7～21天均不同程度高于单独疫苗免疫雏鸡（P＜0.05或P＜0.01）。表明益生素ND疫苗免疫雏鸡其免疫器官细胞和体液免疫功能得到明显的提高，此与益生素促进机体细胞因子的生物合成增加，使其免疫调节功能增强密切相关。益生素能够提高雏鸡血液和免疫器官对ND疫苗的细胞和体液免疫应答。 ND强毒攻击后，应用益生素ND疫苗免疫雏鸡IL-2诱生活性较单独疫苗免疫雏鸡增强，血液和免疫器官的细胞和体液免疫功能显着提高；未免疫对照雏鸡IL-2诱生活性和T、B细胞增殖反应均明显下降，表现免疫功能衰竭。说明益生素可显着提高ND疫苗免疫雏鸡细胞因子的调节功能，增强外周血液、免疫器官的细胞和体液免疫功能，从而提高ND疫苗免疫雏鸡对NDV攻击的免疫保护力。 上述研究结果首次从细胞和分子水平全面地揭示了益生素增强雏鸡免疫功能，提高对ND疫苗的免疫应答，为益生素的开发利用提供科学理论依据。
李敏[10]（2002）在《一. 力达霉素（C-1027）生物合成酶基因的克隆、表达和性质研究 二. 人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达》文中认为C-1027是从我国湖北省土壤中分离得到的一株球孢链霉菌Streptomyces globisporus C-1027产生的新型抗肿瘤抗生素。它具有极强的抗肿瘤活性，比临床上常用的阿霉素高1000倍以上。C-1027的分子结构由一个酸性辅基蛋白和一个发色团以非共价键结合而成，辅基蛋白含有110个氨基酸，本身无明显的抗肿瘤活性，但对维持发色团的稳定性十分重要。发色团由一个九元烯二炔核心结构与氮氧杂萘甲酸、氨基吡啶糖和β-酪氨酸四部分组成，是抗肿瘤的活性部位。其作用机理为烯二炔核心结构与DNA双螺旋小沟结合，通过电子重排形成不稳定双自由基吸引DNA脱氧核糖上的氢原子，从而切断DNA。 近年来，C-1027由于具有独特的分子结构，极强的抗肿瘤作用和新颖的作用机制而成为众多学者的研究对象。关于C-1027已见诸多报道，但尚未有C-1027生物合成酶的相关报道。刘文首次从S．globisporus C-1027中克隆获得长度为75kb，包含33个开放阅读框架（opening reading frame，ORF）的C-1027生物合成基因簇，并用基因中断和基因互补实验证实了10个ORFs与C-1027生物合成相关。为了确定这些ORF编码酶的性质，以期获得C-1027的生物合成路径，需对每个ORF的表达产物进行定性分析。在本文报道的研究中，我们选择了ORF24和ORF4为研究对象。 C-1027生物合成基因簇中ORF24的大小为1620bp，编码一个540-aa的蛋白。经同源性分析，ORF24编码的蛋白与一些不同来源的组氨酸或苯丙氨酸脱氨酶具有一定的同源性，由于脱氨过程是一个可逆反应，我们推测ORF24可能编码氨基变位酶（aminomutase），催化α-酪氨酸转化成β-酪
二、人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达（论文提纲范文）
（1）聚乙二醇化重组人干扰素α2b的制备工艺及质量研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 蛋白质药物 |
| 1.1.1 蛋白质药物发展历程简介 |
| 1.1.2 我国蛋白质药物的开发现状 |
| 1.2 干扰素 |
| 1.2.1 α-干扰素 |
| 1.2.2 重组人干扰素α |
| 1.3 蛋白质类药物的修饰方法 |
| 1.3.1 蛋白质的定点突变 |
| 1.3.2 蛋白质的聚乙二醇(Polyethyleneglyeol,PEG)化修饰 |
| 1.3.3 蛋白质的脂肪酸链修饰 |
| 1.3.4 蛋白质的糖基化修饰 |
| 1.3.5 融合蛋白药物 |
| 1.3.6 微球及脂质体技术 |
| 1.4 聚乙二醇(Polyethyleneglyeol,PEG) |
| 1.4.1 聚乙二醇的发现 |
| 1.4.2 聚乙二醇的理化性质 |
| 1.4.3 不同空间结构聚乙二醇 |
| 1.5 聚乙二醇(Polyethyleneglyeol,PEG)化修饰 |
| 1.5.1 聚乙二醇修饰剂 |
| 1.5.2 聚乙二醇修饰位点 |
| 1.6 聚乙二醇(Polyethyleneglyeol,PEG)化干扰素 |
| 1.7 课题研究背景和意义 |
| 1.8 论文研究主要内容和技术方案 |
| 1.8.1 论文主要研究内容 |
| 1.8.2 技术方案 |
| 第二章 聚乙二醇化重组人干扰素α2b制备工艺研究 |
| 2.1 材料与仪器设备 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 材料 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 试验内容与方法 |
| 2.2.1 试验内容 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 修饰偶联反应条件的摸索与优化 |
| 2.3.2 聚乙二醇化重组人干扰素α2b的纯化 |
| 2.3.3 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的去除 |
| 2.3.4 游离聚乙二醇(PEG)的去除 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 聚乙二醇化重组人干扰素α2b理化性质研究 |
| 3.1 材料与仪器设备 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要材料 |
| 3.2 试验内容与方法 |
| 3.2.1 试验内容 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PEG-rhIFNα2b的理化性质 |
| 3.3.2 PEG-rhIFNα2b的纯度分析 |
| 3.3.3 位置异构体的分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 聚乙二醇化重组人干扰素α2b稳定性研究 |
| 4.1 材料与仪器设备 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 稳定性放样方法 |
| 4.2.2 检测方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 聚乙二醇化重组人干扰素α2b生物学活性研究 |
| 5.1 材料与仪器设备 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 主要材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 专属性 |
| 5.2.2 精密度 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 专属性检测结果 |
| 5.3.2 精密度测定结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 |
（2）海洋动物抗菌肽Scygonadin-Hepcidin融合基因在藻类和拟南芥中的高效表达及其抗菌功能的研究（论文提纲范文）
| 缩略词中英文对照表 |
| 摘要 |
| Absract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 海洋动物抗菌肽研究进展 |
| 1.1.1 已发现的海洋动物抗菌肽 |
| 1.1.2 抗菌肽抗菌作用机制 |
| 1.1.3 抗菌肽与抗生素协同作用 |
| 1.1.4 抗菌肽的免疫调节活性 |
| 1.1.5 抗菌肽主要应用前景 |
| 1.1 6 大黄鱼抗菌肽Hepcidin |
| 1.1.7 拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin |
| 1.1.8 Scygonadin-Hepcidin融合基因抗菌活性研究 |
| 1.2. 微藻基因工程研究进展 |
| 1.2.1 微藻概述 |
| 1.2.2 微藻-生物反应器研究 |
| 1.2.3 藻类基因工程表达载体 |
| 1.2.4 微藻转基因技术 |
| 1.2.5 微藻基因工程应用前景 |
| 1.3 小球藻研究概述 |
| 1.3.1 小球藻概述 |
| 1.3.2 小球藻的应用研究进展 |
| 1.4. 江蓠研究概述 |
| 1.4.1 江蓠概述 |
| 1.4.2 江蓠的应用研究进展 |
| 1.5 海水养殖水产品的主要病害及防治措施 |
| 1.5.1 海水养殖鱼类的主要病害及防止措施 |
| 1.5.2 鲍鱼的主要病害及防止措施 |
| 1.6 转基因食品的安全性评价 |
| 1.6.1 转基因食品的定义 |
| 1.6.2 转基因食品的优势 |
| 1.6.3 转基因食品的安全性评价 |
| 1.7 本研究的技术路线、目的和意义 |
| 1.7.1 技术路线 |
| 1.7.2 研究目的和意义 |
| 第2章 抗菌肽Scy-hepc融合基因在小球藻中稳定表达的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 抗菌肽Sqy-hepc融合基因植物表达载体的构建 |
| 2.3.2 小球藻对潮霉素抗生素的灵敏度实验 |
| 2.3.3 转基因小球藻的抗性筛选实验结果 |
| 2.3.4 抗性小球藻转化子的PCR鉴定结果 |
| 2.3.5 PCR阳性小球藻转化子GFP荧光检测 |
| 2.3.6 转基因小球藻产抗菌肽Scy-hepc融合蛋白SDS-page分析 |
| 2.3.7 转基因小球藻产抗菌肽Scy-hepc融合蛋白Western blotting分析结果 |
| 2.3.8 转基因小球藻产抗菌肽Scy-hepc融合蛋白抑菌圈实验结果 |
| 2.3.9 转基因小球藻传代中抗菌肽Scy-hepc融合基因的表达稳定性分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 抗菌肽Scy-hepc融合基因在细基江蓠繁枝变种中的表达研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 细基江蓠繁枝变种对潮霉素的灵敏性实验 |
| 3.3.2 细基江蓠繁枝变种原生质体提取条件的优化 |
| 3.3.3 电转化法Scy-hepc融合基因在原生质体的瞬时表达 |
| 3.3.4 瞬时表达Scy-hepc融合蛋白的SDS-PAGE及Western blotting分析 |
| 3.3.5 茉莉酸甲酯对细基江蓠繁枝变种外植体生长的影响 |
| 3.3.6 细基江蓠繁枝变种类愈伤组织的诱导结果 |
| 3.3.7 农杆菌EHA105介导的Scy-hepc融合基因转化类愈伤组织 |
| 3.3.8 转基因类愈伤组织的再生分化 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 抗菌肽Scy-hepc融合基因在拟南芥中的表达研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 农杆菌GV3101重组子的PCR鉴定结果 |
| 4.3.2 拟南芥F1代阳性转化子的筛选结果 |
| 4.3.3 F1代转基因拟南芥抗性幼苗GFP绿色荧光观察结果 |
| 4.3.4 F1代转基因拟南芥的PCR鉴定 |
| 4.3.5 F1代转基因植株叶片中抗菌肽Scy-hepc融合蛋白的表达检测 |
| 4.3.6 F2代转基因植株的抗性筛选结果 |
| 4.3.7 F2代转基因植株叶片基因组中Scy-hepc融合基因的PCR检测结果 |
| 4.3.8 3号F2代转基因植株叶片总蛋白的抑菌圈实验结果 |
| 4.3.9 转抗菌肽Scy-hepc融合基因拟南芥抗禾谷镰孢菌感染的实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 喂食转抗菌肽Scy-hepc融合基因小球藻的鱼类抗细菌感染能力的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 黑鲷感染嗜水气单胞菌半致死的菌悬液浓度确定 |
| 5.3.2 黑鲷感染嗜水气单胞菌的主要症状 |
| 5.3.3 黑鲷喂饲转基因小球藻72h后感染嗜水气单胞菌的实验结果 |
| 5.3.4 黑鲷灌胃转基因小球藻72h后主要免疫指标的检测 |
| 5.3.5 黑鲷灌胃转基因小球藻72h后肠道形态观察 |
| 5.3.6 嗜水气单胞菌侵染珍珠龙胆石斑鱼的致死实验研究结果 |
| 5.3.7 珍珠龙胆石斑鱼感染嗜水气单胞菌的主要症状 |
| 5.3.8 珍珠龙胆石斑鱼喂食转基因小球藻72h后感染嗜水气单胞菌的实验结果 |
| 5.3.9 珍珠龙胆石斑鱼灌胃转基因小球藻72h后主要免疫指标的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 在学期间参加的科研项目及成果 |
| 致谢 |
（3）高密度培养盘基网柄菌及重组可溶性人Fas配体表达的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 盘基网柄菌的生物学特征 |
| 1.1.1 盘基网柄菌的生命周期 |
| 1.2 盘基网柄菌的基因组 |
| 1.3 盘基网柄菌的培养 |
| 1.3.1 细菌培养 |
| 1.3.2 无菌培养 |
| 1.3.2.1 常用无菌培养菌株 |
| 1.3.2.2 无菌培养基 |
| 1.3.2.3 盘基网柄菌营养生长的抑制因素 |
| 1.4 盘基网柄菌的高密度发酵 |
| 1.4.1 常见的高密度发酵方法 |
| 1.4.1.1 补料-分批培养 |
| 1.4.1.2 膜截流的循环培养 |
| 1.4.1.3 固定化培养 |
| 1.4.1.4 纤维床生物反应器研究进展 |
| 1.4.2 盘基网柄菌高密度发酵研究进展 |
| 1.4.2.1 盘基网柄菌的补料分批培养 |
| 1.4.2.2 盘基网柄菌的微过滤截留培养 |
| 1.4.2.3 盘基网柄菌的固定化培养 |
| 1.5 盘基网柄菌表达系统 |
| 1.5.1 盘基网柄菌表达蛋白的糖基化结构特点 |
| 1.5.2 盘基网柄菌表达系统的优点 |
| 1.5.3 盘基网柄菌系统表达异源蛋白质的研究进展 |
| 1.5.3.1 寄生生物糖蛋白 |
| 1.5.3.2 病毒蛋白 |
| 1.5.3.3 人类蛋白 |
| 1.5.4 重组盘基网柄菌表达人可溶性Fas配体 |
| 1.5.4.1 细胞凋亡与可溶性人Fas配体(shFasL) |
| 1.5.4.2 重组人FasL的生产 |
| 1.6 本工作的研究基本思路及拟研究内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 菌种与质粒 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 抗体 |
| 2.2.3 工具酶及试剂盒 |
| 2.2.4 主要试剂 |
| 2.3 培养基和培养条件 |
| 2.3.1 主要培养基与缓冲液 |
| 2.3.1.1 大肠杆菌培养基 |
| 2.3.1.2 盘基网柄菌培养基 |
| 2.3.1.3 缓冲液 |
| 2.3.2 培养条件 |
| 2.3.2.1 菌种保藏 |
| 2.3.2.2 菌种活化 |
| 2.3.2.3 悬浮培养条件 |
| 2.3.2.4 分批培养条件 |
| 2.4 分析测定方法 |
| 2.4.1 pH测定 |
| 2.4.2 细胞密度的测定 |
| 2.4.3 葡萄糖浓度的测定 |
| 2.4.3.1 DNS法 |
| 2.4.3.2 酶电极测定 |
| 2.4.4 分子克隆相关实验 |
| 2.4.5 盘基网柄菌染色体外质粒(穿梭质粒)的提取与鉴定 |
| 2.4.6 盘基网柄菌染色体外质粒的电转化 |
| 2.4.7 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 2.4.8 Western-blot分析 |
| 2.4.9 重组可溶性人Fas配体(FasL)浓度的测定 |
| 2.4.10 扫描电镜样品制备方法 |
| 第三章 盘基网柄菌培养条件优化及生长动力学 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 菌种 |
| 3.2.1.2 培养基 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 培养方法 |
| 3.2.2.2 AX3-pLu8生长曲线的测定 |
| 3.2.2.3 培养条件优化 |
| 3.2.2.4 氨基酸的影响 |
| 3.2.2.5 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 盘基网柄菌的摇瓶发酵条件优化 |
| 3.3.1.1 盘基网柄菌AX3-pLu8的生长曲线 |
| 3.3.1.2 培养温度对菌体生长的影响 |
| 3.3.1.3 摇床转速对盘基网柄菌生长的影响 |
| 3.3.1.4 pH值对盘基网柄菌生长的影响 |
| 3.3.1.5 碳源种类对盘基网柄菌生长的影响 |
| 3.3.1.6 碳源浓度对盘基网柄菌生长的影响 |
| 3.3.1.7 添加氨基酸对于盘基网柄菌生长的影响 |
| 3.3.1.8 氨基酸添加量对盘基网柄菌生长的影响 |
| 3.3.2 盘基网柄菌的分批发酵条件优化 |
| 3.3.2.1 pH对分批发酵过程的影响 |
| 3.3.2.2 通气量对分批发酵过程的影响 |
| 3.3.2.3 搅拌转速对分批发酵过程的影响 |
| 3.3.3 盘基网柄菌的生长动力学研究 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 盘基网柄菌固定化及新型固定化细胞反应器研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 菌种 |
| 4.2.1.2 培养基与缓冲液 |
| 4.2.1.3 固定化载体材料 |
| 4.2.1.4 旋转式生物反应器 |
| 4.2.1.5 纤维床生物反应器(FBB) |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 培养方法 |
| 4.2.2.2 菌体密度测定 |
| 4.2.2.3 固定化载体上吸附情况的测定 |
| 4.2.2.4 葡萄糖浓度的测定 |
| 4.2.2.5 扫描电镜观察 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 利用聚氨酯泡沫固定化培养盘基网柄菌 |
| 4.3.1.1 盘基网柄菌在聚氨酯泡沫固定化载体上的吸附 |
| 4.3.1.2 聚氨酯泡沫载体尺寸和形状对固定化培养的影响 |
| 4.3.1.3 聚氨酯泡沫添加量对固定化培养的影响 |
| 4.3.1.4 聚氨酯泡沫固定化培养盘基网柄菌 |
| 4.3.1.5 利用旋转式生物反应器PUF固定化培养盘基网柄菌 |
| 4.3.2 利用棉纤维织物固定化培养盘基网柄菌 |
| 4.3.2.1 棉纤维织物的选择 |
| 4.3.2.2 棉纤维织物添加量对吸附效果的影响 |
| 4.3.2.3 盘基网柄菌在棉纤维织物上的吸附 |
| 4.3.2.4 棉纤维织物直接固定化培养盘基网柄菌 |
| 4.3.2.5 棉纤维织物分段式固定化培养盘基网柄菌 |
| 4.3.2.6 棉纤维织物固定化培养盘基网柄菌的扫描电镜观察 |
| 4.3.3 利用旋转式纤维床生物反应器(RFBB)固定化培养盘基网柄菌 |
| 4.3.3.1 单层棉纤维织物载体纤维床 |
| 4.3.3.2 单层棉纤维织物填充PUF纤维床 |
| 4.3.4 利用纤维床生物反应器(FBB)固定化培养盘基网柄菌 |
| 4.3.4.1 棉纤维织物填充量对固定化培养的影响 |
| 4.3.4.2 纤维床容积对固定化培养的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 在盘基网柄菌中重组表达可溶性人Fas配体 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.1.1 菌种 |
| 5.2.1.2 质粒 |
| 5.2.1.3 PCR引物 |
| 5.2.1.4 培养基 |
| 5.2.1.5 工具酶及试剂盒 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 盘基网柄菌染色体外质粒的提取 |
| 5.2.2.2 PCR反应扩增shFasL基因并添加His-Tag |
| 5.2.2.3 PCR产物的回收及鉴定 |
| 5.2.2.4 表达载体构建 |
| 5.2.2.5 表达载体电转化入盘基网柄菌 |
| 5.2.2.6 培养方法 |
| 5.2.2.7 发酵液预处理 |
| 5.2.2.8 亲和层析 |
| 5.2.2.9 目标蛋白的浓缩 |
| 5.2.2.10 SDS-PAGE蛋白电泳及Western Blot分析 |
| 5.2.2.11 可溶性hFasL浓度的ELISA方法测定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 pMB74质粒的获得 |
| 5.3.2 His-tag的引入 |
| 5.3.3 pMB74-shFasL-H载体的构建及转化 |
| 5.3.4 重组shFasL蛋白的表达 |
| 5.3.5 重组蛋白shFasL表达的初步优化 |
| 5.3.5.1 HL-5C培养基碳氮源含量的影响 |
| 5.3.5.2 HL-5C培养基pH对重组蛋白表达的影响 |
| 5.3.6 利用FBB固定化盘基网柄菌表达重组shFasL |
| 5.3.6.1 单一批次FBB固定化培养 |
| 5.3.6.2 重复批次FBB固定化培养 |
| 5.3.7 亲和层析分离重组蛋白shFasL |
| 5.3.7.1 丙酮沉淀浓缩及SDS-PAGE电泳鉴定 |
| 5.3.7.2 Western blot鉴定 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 展望 |
| 附录 γ-聚谷氨酸发酵的优化与放大 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 微生物发酵生产γ-PGA的研究进展 |
| 7.3 材料与方法 |
| 7.3.1 实验材料 |
| 7.3.1.1 菌种 |
| 7.3.1.2 培养基 |
| 7.3.2 实验方法 |
| 7.3.2.1 培养方法 |
| 7.3.2.2 培养条件优化 |
| 7.3.3 分析方法 |
| 7.3.3.1 菌体密度测定 |
| 7.3.3.2 发酵液粘度测定 |
| 7.3.3.3 谷氨酸及葡萄糖浓度测定 |
| 7.3.3.4 γ-PGA的测定 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 γ-PGA发酵培养基的氮源优化 |
| 7.4.2 γ-PGA发酵接种时间的优化 |
| 7.4.3 γ-PGA发酵初始碳源浓度的优化 |
| 7.4.4 γ-PGA发酵的放大 |
| 7.5 小结 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 论文发表情况 |
（4）极细链格孢菌激活蛋白PeaT1在毕赤酵母中的表达及其互作蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 蛋白激发子 |
| 1.2 极细链格孢菌植物激活蛋白 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统的生物学及遗传特性 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统的优点 |
| 1.3.3 毕赤酵母表达宿主菌 |
| 1.3.4 毕赤酵母表达载体 |
| 1.3.5 外源基因在毕赤酵母中的表达 |
| 1.3.6 毕赤酵母表达系统的局限性及解决策略 |
| 1.4 蛋白质相互作用的研究方法 |
| 1.4.1 噬菌体展示系统 |
| 1.4.2 酵母双杂交系统 |
| 1.4.3 免疫共沉淀 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PeaT1 在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 重组酵母表达载体pPIC9K-peaT1 的构建及鉴定 |
| 2.2.2 酵母的转化及筛选 |
| 2.2.3 重组酵母的PCR 鉴定 |
| 2.2.4 表达产物的SDS-PAGE 分析 |
| 2.2.5 表达蛋白的质谱鉴定 |
| 2.2.6 重组酵母蛋白表达量与诱导培养时间的关系 |
| 2.2.7 表达蛋白的热稳定性分析 |
| 2.2.8 重组酵母遗传稳定性分析 |
| 2.2.9 表达蛋白的分离纯化 |
| 2.2.10 纯化蛋白的HPLC 分析 |
| 2.2.11 纯化的表达蛋白对小麦幼苗生长的影响 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 利用噬菌体展示技术筛选 PeaT1 的结合多肽 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 饥饿态细胞的制备 |
| 3.1.3 亲和淘洗 |
| 3.1.4 噬菌体的滴定与扩增 |
| 3.1.5 噬菌体的纯化 |
| 3.1.6 ELISA 鉴定噬菌体克隆的结合活性 |
| 3.1.7 噬菌体单链DNA 的提取和序列测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 高亲和力的噬菌体筛选 |
| 3.2.2 ELISA 鉴定噬菌体克隆的结合活性 |
| 3.2.3 单克隆噬菌体序列测定与氨基酸分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 利用酵母双杂交筛选 PeaT1 的互作蛋白 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 诱饵载体pGBKT7-peaT1 的构建及鉴定 |
| 4.2.2 诱饵载体pGBKT7-peaT1 转录激活特性及诱饵蛋白毒性分析 |
| 4.2.3 拟南芥ds cDNA 的合成 |
| 4.2.4 酵母双杂交文库的建立和筛选 |
| 4.2.5 Ade+His+转化子的α-半乳糖苷酶活性分析 |
| 4.2.6 酵母质粒的提取及双酶切鉴定 |
| 4.2.7 阳性克隆测序分析 |
| 4.2.8 阳性克隆的再次验证 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 PeaT1 互作蛋白功能分析 |
| 5.1 噬菌体展示技术与酵母双杂交筛选结果的分析 |
| 5.2 PeaT1 互作蛋白 PIP-2 的结构与功能分析 |
| 全文结论 |
| 1、构建了 PeaT1 在毕赤酵母中的分泌表达系统 |
| 2、利用噬菌体展示技术获得了9 个结合短肽 |
| 3、利用酵母双杂交技术获得了两个互作蛋白 |
| 4、互作蛋白的同源比对分析 |
| 5、本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（5）人乳铁蛋白和CD14蛋白在植物中的表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 前言 |
| 1.1 植物生物反应器的研究进展 |
| 1.1.1 植物生物反应器生产外源蛋白的优势 |
| 1.1.2 几种主要的植物生物反应器 |
| 1.1.3 植物生物反应器生产抗体 |
| 1.1.4 植物生物反应器生产口服疫苗 |
| 1.1.5 植物生物反应器生产其它蛋白质和多肽 |
| 1.1.6 植物生物反应器生产外源蛋白的发展趋势 |
| 1.2 乳铁蛋白基因的研究进展 |
| 1.3 CD14基因的研究进展 |
| 1.4 本工作的目的和意义 |
| 第二部分 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和质粒载体 |
| 2.1.3 药品及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人乳铁蛋白和CD14基因全长cDNA的克隆 |
| 2.2.2 玉米醇溶蛋白信号肽的克隆 |
| 2.2.3 乳铁蛋白和CD14基因去信号肽 |
| 2.2.4 植物表达载体的构建 |
| 2.2.5 农杆菌介导的烟草遗传转化 |
| 2.2.6 转基因烟草植株的检测 |
| 第三部分 结果与分析 |
| 3.1 人乳铁蛋白和CD14基因全长EDNA的克隆 |
| 3.2 玉米醇溶蛋白信号肽的克隆 |
| 3.3 人乳铁蛋白和CD14基因去信号肽 |
| 3.4 植物表达载体的构建 |
| 3.4.1 用于烟草转化的CPA-LF和CPA-CD14表达载体的构建 |
| 3.4.2 用于玉米转化的植物表达载体的构建 |
| 3.4.3 用于烟草转化的植物表达载体CPE-Zsignal-LF和CPE-Zsignal-CD14的构建 |
| 3.5 转基因烟草的检测 |
| 3.5.1 PCR检测 |
| 3.5.2 Western Blot分析 |
| 3.5.3 重组蛋白的ELISA定量分析 |
| 3.5.4 转乳铁蛋白基因烟草表达的重组蛋白的活性检测 |
| 第四部分 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）重组盘基网柄菌高密度发酵合成培养基的优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 盘基网柄菌Dictyostelium discoideum介绍 |
| 1.1.1 盘基网柄菌的(无性)生命周期 |
| 1.1.2 盘基网柄菌的应用研究 |
| 1.2 盘基网柄菌表达系统 |
| 1.2.1 盘基网柄菌表达系统与各种通用表达系统的比较 |
| 1.2.2 重组盘基网柄菌表达异源蛋白质研究进展 |
| 1.2.3 重组盘基网柄菌表达人可溶性Fas配体 |
| 1.3 盘基网柄菌的培养研究进展 |
| 1.3.1 几种常用的盘基网柄菌培养基 |
| 1.3.2 限制细胞密度的自分泌因子 |
| 1.3.3 盘基网柄菌的高密度培养策略 |
| 1.4 本论文的研究内容及研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 重组盘基网柄菌AX3-pLu8的构建 |
| 2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 培养基和缓冲溶液 |
| 2.4.1 无菌培养基 |
| 2.4.2 缓冲溶液 |
| 2.5 菌种保存 |
| 2.5.1 磷酸盐-琼脂平板 |
| 2.5.2 盘基网柄菌的孢子收集方法 |
| 2.6 孢子活化和细胞对SIH培养基的适应 |
| 2.7 盘基网柄菌的悬浮培养 |
| 2.8 分析方法 |
| 2.8.1 细胞密度的测定 |
| 2.8.2 葡萄糖浓度的测定 |
| 2.8.3 氨浓度的测定 |
| 2.8.4 氨基酸浓度的测定 |
| 2.8.5 表达产物shFasL浓度的测定 |
| 2.9 微生物的生长动力学 |
| 2.10 数据模拟 |
| 第三章 重组盘基网柄菌AX3-pLu8对氨基酸的利用情况 |
| 3.1 氨基酸标准品的HPLC分析 |
| 3.1.1 混合氨基酸标准品的配制 |
| 3.1.2 流动相洗脱梯度的确定 |
| 3.1.3 混合氨基酸标准品的HPLC分析 |
| 3.1.4 标准曲线和精密度实验 |
| 3.2 SIH培养基中氨基酸成分的HPLC检测分析 |
| 3.3 重组盘基网柄菌AX3-pLu8对SIH培养基中氨基酸的利用情况 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 培养基组成对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.1 重组盘基网柄菌AX3-pLu8在标准SIH培养基中的生长 |
| 4.2 葡萄糖对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.3 半胱氨酸对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.4 SIH培养基中无机盐组分对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.4.1 Mg~(2+)浓度对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.4.2 Ca~(2+)浓度对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.4.3 Fe~(3+)浓度对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.5 SIH培养基中维生素组分对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.5.1 生物素对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.5.2 维生素B_(12)对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.5.3 叶酸对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.5.4 硫辛酸对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.5.5 核黄素对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响 |
| 4.5.6 盐酸硫胺对重组盘基网柄菌生长的影响 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）黑曲霉木聚糖酶在同源宿主中的分泌性表达及酶学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 仪器和材料 |
| 2.1 仪器及物品 |
| 2.2 菌株和质粒 |
| 2.3 试剂及溶液 |
| 第3章 方法 |
| 3.1 Trizol提取黑曲霉菌TS1总RNA |
| 3.2 PcR引物设计 |
| 3.3 RT-PCR |
| 3.4 质粒pYG1.2的提取 |
| 3.5 PCR产物及质粒pYG1.2的双酶切 |
| 3.6 酶切产物的连接反应 |
| 3.7 Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞 |
| 3.8 重组质粒的大肠杆菌转化 |
| 3.9 重组质粒的鉴定 |
| 3.10 重组质粒pYG1.2-xynB转化宿主黑曲霉菌M54 |
| 3.11 重组木聚糖酶在黑曲霉菌M54中的表达 |
| 3.12 SDS-PAGE |
| 3.13 DNS法测定重组木聚糖酶的活性 |
| 3.14 重组木聚糖酶酶学特性研究 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 黑曲霉菌TS1总RNA电泳图 |
| 4.2 RT-PCR扩增木聚糖酶xynB基因 |
| 4.3 融合表达载体的构建 |
| 4.4 酶切鉴定pYG1.2-xynB重组质粒 |
| 4.5 xynB基因编码序列测序结果 |
| 4.6 pYG1.2-xynB重组质粒转化宿主黑曲霉菌M54实验结果 |
| 4.7 蛋白表达产物的SDS-PAGE |
| 4.8 重组木聚糖酶活性测定 |
| 4.9 重组木聚糖酶酶学性质 |
| 第5章 分析讨论 |
| 5.1 丝状真菌表达系统 |
| 5.2 同源表达策略 |
| 5.3 木聚糖酶的诱导表达 |
| 5.4 黑曲霉M54原生质体的制备 |
| 5.5 重组木聚糖酶酶学性质 |
| 第6章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 综述 |
| 个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）耐热植酸酶基因phyA的克隆及新型表达载体的构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种和质粒 |
| 1.2 酶和生化试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 烟曲霉菌总DNA的提取 |
| 1.5 烟曲霉植酸酶基因phyA的扩增 |
| 1.6 PCR产物的克隆和序列鉴定 |
| 2 结 果 |
| 2.1 PCR扩增烟曲霉植酸酶成熟肽DNA序列 |
| 2.2 烟曲霉植酸酶编码基因的克隆与鉴定 |
| 2.3 植酸酶基因编码序列测定结果 |
| 3 讨 论 |
（9）益生素及其联合ND疫苗对雏鸡免疫功能和IL-2活性的影响及机理（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 微生态制剂研究进展 |
| 1.1.1 动物微生态制剂的概念 |
| 1.1.2 微生态制剂的菌种与分类 |
| 1.1.3 微生态制剂在动物生产中的应用 |
| 1.1.4 微生态制剂对动物免疫功能的影响 |
| 1.2 新城疫研究进展 |
| 1.2.1 病原变异趋势 |
| 1.2.2 流行特点及发病的分子基础 |
| 1.2.3 临床症状 |
| 1.2.4 病理变化 |
| 1.2.5 防治 |
| 1.3 禽类免疫系统研究进展 |
| 1.3.1 禽类免疫系统的特点 |
| 1.3.2 禽类T细胞分化抗原与受体 |
| 1.3.3 禽类T、B细胞介导的免疫反应 |
| 1.3.4 禽类白细胞介素-2(IL-2)及白细胞介素-2受体(IL-2R) |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 益生素 |
| 2.1.3 ND疫苗和ND强毒(NDV) |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验动物分组及处理 |
| 2.2.2 被检材料的采取 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 检测指标及方法 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 雏鸡应用益生素后IL-2诱生活性和淋巴细胞增殖变化 |
| 3.1.1 雏鸡应用益生素后免疫器官IL-2诱生活性变化 |
| 3.1.2 雏鸡应用益生素后淋巴细胞增殖反应变化 |
| 3.2 益生素雏鸡ND疫苗免疫后IL-2诱生活性和淋巴细胞增殖变化 |
| 3.2.1 益生素雏鸡ND疫苗免疫后IL-2诱生活性变化 |
| 3.2.2 益生素雏鸡ND疫苗免疫后淋巴细胞增殖反应变化 |
| 3.3 益生素ND疫苗免疫雏鸡NDV攻击后IL-2诱生活性和淋巴细胞增殖变化 |
| 3.3.1 益生素ND疫苗免疫雏鸡NDV攻击后IL-2诱生活性变化 |
| 3.3.2 益生素ND疫苗免疫雏鸡NDV攻击后淋巴细胞增殖变化 |
| 3.4 NDV攻击后的保护情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 益生素对雏鸡IL-2诱生活性和免疫功能的影响及其机理 |
| 4.1.1 益生素对雏鸡IL-2诱生活性的影响及机理 |
| 4.1.2 益生素对雏鸡细胞免疫功能的影响及机理 |
| 4.1.3 益生素对雏鸡体液免疫功能的影响及机理 |
| 4.2 益生素雏鸡对ND疫苗的免疫应答及其机理 |
| 4.2.1 雏鸡ND疫苗免疫后IL-2诱生活性和免疫应答的变化及其机理 |
| 4.2.2 益生素雏鸡ND疫苗免疫后IL-2活性和免疫应答变化及机理 |
| 4.3 菌种对免疫功能的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）一. 力达霉素（C-1027）生物合成酶基因的克隆、表达和性质研究 二. 人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达（论文提纲范文）
| 综述一：烯二炔类抗肿瘤抗生素生物合成研究进展 |
| 综述二：丝状真菌基因表达系统的研究进展 |
| 第一部分：力达霉素(C-1027)生物合成酶基因的克隆、表达和性质研究 |
| (一) 中文摘要 |
| (二) 英文摘要 |
| (三) 前言 |
| (四) 材料与方法 |
| (五) 结果与讨论 |
| 第二部分：人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达 |
| (一) 中文摘要 |
| (二) 英文摘要 |
| (三) 材料与方法 |
| (四) 结果与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达（论文参考文献）
- [1]聚乙二醇化重组人干扰素α2b的制备工艺及质量研究[D]. 董世建. 合肥工业大学, 2020(02)
- [2]海洋动物抗菌肽Scygonadin-Hepcidin融合基因在藻类和拟南芥中的高效表达及其抗菌功能的研究[D]. 何艺宾. 厦门大学, 2018(08)
- [3]高密度培养盘基网柄菌及重组可溶性人Fas配体表达的研究[D]. 陈杰. 浙江大学, 2008(03)
- [4]极细链格孢菌激活蛋白PeaT1在毕赤酵母中的表达及其互作蛋白的研究[D]. 刘延锋. 中国农业科学院, 2008(10)
- [5]人乳铁蛋白和CD14蛋白在植物中的表达研究[D]. 孙丽. 山东大学, 2008(01)
- [6]重组盘基网柄菌高密度发酵合成培养基的优化研究[D]. 王颖. 厦门大学, 2007(08)
- [7]黑曲霉木聚糖酶在同源宿主中的分泌性表达及酶学特性研究[D]. 郑瑞娟. 同济大学, 2006(09)
- [8]耐热植酸酶基因phyA的克隆及新型表达载体的构建[J]. 李佳,刘钟滨. 同济大学学报(医学版), 2004(06)
- [9]益生素及其联合ND疫苗对雏鸡免疫功能和IL-2活性的影响及机理[D]. 刘超男. 东北农业大学, 2003(03)
- [10]一. 力达霉素（C-1027）生物合成酶基因的克隆、表达和性质研究 二. 人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达[D]. 李敏. 中国协和医科大学, 2002(11)