一、Smad3基因剔除小鼠6月龄的生物学特性研究（论文文献综述）
孙嘉鸿[1]（2020）在《儿童早期超重肥胖的孕期相关因素及DNA甲基化机制研究》文中研究指明研究背景:儿童超重肥胖已成为重要的公共卫生问题,其发生发展受到遗传和环境因素的综合影响。生命早期1,000天内（即从受孕到出生后两岁）的营养状况可能影响个体代谢“编程”,进而对后期的体重状态产生重要影响。如孕前体重、孕期血压均可能通过改变宫内环境导致子代超重肥胖的发生,但这两个因素之间的交互作用对子代超重肥胖的影响尚未明确。母乳作为儿童生命早期的个性化营养来源,有诸多益处;然而母乳喂养持续时间对儿童超重肥胖的预防作用结论尚不统一。另外,流行病学研究中观察到孕期因素与儿童超重肥胖的关联性背后的机制尚不明确。越来越多的证据提示,表观遗传改变（如DNA甲基化等）可能起重要作用。基于以上科学问题。本文将分为以下三个部分进行探索。第一部分孕前体重状态、孕期血压状态与婴儿期12月龄体重状态的关联目的:探讨孕前超重肥胖、妊娠期高血压综合征与婴儿期体质指数-z评分（Body mass index z score,BMI-z score）和12月龄高体重状态的关联。方法:研究对象来源于2009-2010年在中国沈阳、武汉和广州市建立的第1出生队列和2014-2016年在中国珠海市建立的第2出生队列。最终共有3,765对母婴纳入本研究进行合并分析（队列1中0、3、6和12月中分别为1,969、1,698、1,574和1,605对母婴;队列2中0、3、6和12月中分别为1,796、1,601、1,574和1,665对母婴）。人口学信息均通过问卷调查获得,体格测量信息由专业人员测量或者医学记录获得。根据中国肥胖工作组超重肥胖标准,将孕前BMI≥24kg/m2的母亲判定为超重肥胖;由于缺乏蛋白尿等数据,本研究将妊娠期收缩压和/或舒张压（Systolic blood pressure,SBP和/或Diastolic blood pressure,DBP）≥140/90 mm Hg判定为妊娠期高血压综合征;按世界卫生组织儿童生长标准,将婴儿12月龄的性别、年龄别BMI≥85th百分位数判定为高体重状态。采用广义估计方程模型,评价孕前体重状态和孕期血压状态与儿童出生、3月、6月以及12月龄BMI-z评分的相关性。利用Andersson等设计的Excel表计算两者间具有生物学意义的相加交互作用（孕前超重肥胖和妊娠期高血压综合征的相加交互作用对子代12月龄高体重状态的影响）,即超额相对危险度（Relative excess risk of interaction,RERI）和归因百分比（Attributable proportion,AP）,RERI>0或AP>0被认为交互作用具有统计学意义。结果:控制协变量后,与孕前正常体重+孕期正常血压组比较,孕前超重肥胖+妊娠期高血压综合征组子代12月龄BMI-z评分水平高0.62个单位。孕前超重肥胖和妊娠期高血压综合征的联合作用可增加子代12月龄婴儿高体重状态的风险（Odds ratio,OR 3.10,95%CI 1.59,6.04）,其中51%（AP 0.51,95%CI 0.13,0.89）风险归因于相加交互作用。结论:孕前超重肥胖与妊娠期高血压综合征的交互作用对子代高体重状态有较大影响。孕前监测体重状态以及孕期监测血压状态对于预防子代高体重状态具有重要意义。第二部分孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联目的:探讨孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联。方法:研究对象来源于2017-2018珠海市的横断面研究,共1,899例3岁学龄前儿童纳入本研究。人口学信息均通过问卷调查获得,体格测量数据由专业人员测量获得。按中国工作组超重肥胖标准,将孕前BMI≥24kg/m2的母亲判定为超重肥胖。依据李辉等制定的2-18岁中国儿童青少年BMI参照标准,即BMI≥同性别、年龄超重界值点(成人接轨法,BMI24)判定为学龄前儿童超重肥胖。母乳喂养（包括纯母乳喂养和混合母乳喂养）持续时间分为<6个月和≥6个月。采用限制性立方样条模型分析母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的剂量-反应关系。采用logistic回归模型分析孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联。结果:学龄前儿童（3岁）超重肥胖率为12.2%（男生14.5%,女生9.7%）。孕前超重肥胖可显着增加学龄前儿童超重肥胖的风险（OR 2.36,95%CI 1.41,3.94）。限制性立方样条结果显示,母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖存在非线性剂量-反应关系（P<0.001）。在母乳喂养持续时间≥6个月的组中,未见孕前超重肥胖与学龄前儿童超重肥胖的统计学关联（OR 1.70,95%CI 0.79,3.63）。结论:孕前超重肥胖可能是学龄前儿童超重肥胖的危险因素。保证6个月的母乳喂养对于降低儿童早期超重肥胖风险,以及部分抵消孕前超重肥胖对子代体重的不良影响至关重要。第三部分学龄前儿童超重肥胖的脐血DNA甲基化机制研究目的:探讨孕前BMI、脐血/孕早期母亲血全基因组DNA甲基化区域/位点和学龄前儿童BMI-z评分的线性关联;探索学龄前儿童超重肥胖组与正常体重组脐血的全基因组DNA差异甲基化区域/位点;并对上述筛选的位点进行验证。方法:研究对象的母亲孕早期血样和脐血来源于第2出生队列且随访到3岁。选取母亲孕前体重和身高以及学龄前儿童体重和身高等信息完整的30对母亲孕早期血样、新生儿脐血进行甲基化850k芯片检测,并分别分析母亲血/脐血全基因组DNA甲基化与孕前BMI和3岁BMI-z评分的关联。选择4例超重肥胖学龄前儿童,按性别、年龄别匹配12例体重正常的儿童,分析病例和对照的脐血全基因组DNA甲基化的差异。基于上述全基因组甲基化关联和差异分析,筛选脐血相关和差异甲基化位点及附近易感区域内（100-700bp）位点进行验证。随后,基于性别、年龄别进行匹配,对10例超重肥胖和10例体重正常学龄前儿童的脐血进行分析,对上述筛选的甲基化位点和附近易感区域内位点进行验证。学龄前儿童超重肥胖依据李辉等制定的2-18岁中国儿童青少年BMI参照标准判定,即BMI≥同性别、年龄超重界值点(成人接轨法,BMI24)。通过R语言中CHAMP包中的线性回归,分析孕前BMI、母血/脐血全基因组DNA甲基化位点和BMI-z评分的关联;CHAMP包中Bumphunter算法用于分析超重肥胖组与对照组间（4:12）脐血全基因组差异甲基化区域;CHAMP包中线性模型中的分类变量方法用于分析学龄前儿童超重肥胖组与对照组间（4:12）脐血全基因组差异甲基化位点。采用高斯模型进行广义线性回归分析验证样本中学龄前儿童超重肥胖与对照组（10:10）间筛选的脐血差异甲基化位点以及分析筛选的相关甲基化位点与孕前BMI或3岁BMI-z评分的关联。结果:30对母亲血与脐血的全基因组DNA甲基化关联研究中,经FDR校正后,未见与孕前BMI以及3岁BMI-z评分相关的母亲血/脐血甲基化位点,但P值较小的位点（接近1×10-6）提示可能与孕前BMI或3岁BMI-z评分相关。性别、年龄别匹配的学龄前儿童超重肥胖与体重正常组（4:12）的脐血全基因组DNA甲基化关联研究结果发现59个脐血差异甲基化区域和371个差异位点。脐血差异甲基化区域主要富集于代谢通路、脂肪细胞因子通路、胰高血糖素信号通路和缺氧诱导因子-1信号通路,而差异甲基化位点主要富集于肌动蛋白骨架调控和细胞分子粘附通路。利用性别、年龄别匹配的超重肥胖与体重正常（10:10）组的脐血验证样本对以下筛选位点及附近易感区域内位点进行验证:基于30例脐血与3岁BMI-z评分全基因组甲基化关联分析中筛选的P值排在第1（FOXN3基因中的cg23501836）,第2位（ZNF264基因中的cg27437574）和第4位的位点（SKIV2L基因中的cg13015485）,和基于4例超重肥胖与12例体重正常组脐血的全基因组甲基化差异分析中筛选的4个差异甲基化位点（AHRR基因中的cg26487191、ARNT2基因中的cg16622471、SORCS2基因中的cg26686068和SMAD3基因中的cg17726760）。其中,FOXN3基因的甲基化位点cg23501836不仅与3岁BMI-z评分的脐血全基因组甲基化关联分析中P值排在第1位,且在4例超重肥胖与12例体重正常组脐血全基因组甲基化差异分析中差异也有统计学意义。10例学龄前超重肥胖与10例体重正常组脐血验证结果显示（结合全基因组甲基化关联和差异结果进行展示）,AHRR基因中的chr5:355067–355068、FOXN3基因中的chr14:89630264–89630272和chr14:89630387–89630388位点差异有统计学意义（P<0.05）。并且FOXN3基因的chr14:89630264–89630272和chr14:89630387–89630388甲基化位点与孕前BMI水平相关（P<0.05,其中孕前BMI与脐血全基因组甲基化关联分析中,FOXN3甲基化cg23501836位点的P值排在第62位）。FOXN3基因的chr14:89630264–89630272和chr14:89630295–89630296及ZNF264基因的chr19:57703104–57703107和chr19:57703301–57703307甲基化位点与3岁BMI-z评分相关（P<0.05）。结论:本脐血全基因组DNA甲基化研究和验证结果共同提示脐血FOXN3和AHRR基因甲基化可能与儿童早期超重肥胖相关,脐血FOXN3以及ZNF264基因甲基化可能与儿童早期BMI-z评分相关,且脐血FOXN3基因甲基化与孕前BMI相关,提示其可能介导孕前BMI与儿童早期BMI-z评分或超重肥胖的关联。
黄帅波[2]（2019）在《小鼠TGFβ-Smad2/3信号通路在心肌梗死后心脏重构中的作用及机制研究》文中提出研究背景:急性心肌梗死（AMI）是全球范围内最主要的死亡原因之一。心梗后心脏修复和重构与肌成纤维细胞转分化密切相关。在受损心肌修复过程中,转化生长因子β（TGF-βs）是调节肌成纤维细胞反应最重要的细胞因子之一,由TGF-βs介导的细胞内信号通路主要分为Smad依赖性和非Smad依赖性信号通路。在Smad依赖性信号通路中,转化生长因子β受体（TGF-βR）通过磷酸化方式激活Smad2和Smad3,进而调控细胞核内相关基因表达。我们最近有研究表明,肌成纤维细胞特异性TGF-β/Smad3信号通路对心肌梗死后心肌组织修复有保护作用;相反,心肌细胞特异性TGF-β/Smad3信号通路促进心脏不良重构。作为与Smad3高度同源的Smad2蛋白,成纤维细胞和心肌细胞特异性TGF-β/Smad2信号通路在心脏基线结构和功能,以及心肌梗死后心脏重构修复过程中的作用尚不清楚。研究目的:分别比较心脏成纤维细胞、心肌细胞特异性TGF-β/Smad2和TGF-β/Smad3信号通路对机体稳态、基线心脏结构、基线心功能以及心肌梗死后心脏重构过程中发挥的作用,并且探讨TGF-β介导的Smad2和Smad3信号蛋白在肌成纤维细胞转化过程中发挥不同作用的细胞生物学和分子生物学机制。研究方法:本研究结合在体动物实验和体外细胞实验,分别比较细胞特异性Smad2和Smad3信号蛋白对维持正常心脏稳态、心肌缺血损伤后心脏修复重构作用的不同影响及可能机制。在体动物实验部分,通过Cre-loxP系统构建成纤维细胞特异性（Col1α2-Cre）、心肌细胞特异性（αMHC-Cre）、激活的肌成纤维细胞特异性（Periostin-Cre）Smad2和Smad3基因敲除小鼠,首先观察成纤维细胞特异性和心肌细胞特异性Smad2/3信号蛋白对心脏基线结构和功能、小鼠机体稳态的影响;随后通过非再灌注急性心肌梗死模型（AMI）,观察比较肌成纤维细胞特异性Smad2和Smad3基因敲除（FS2KO和FS3KO）对心梗后心脏修复和纤维化重构的影响差异,以及Smad2/3对肌成纤维细胞功能、梗死瘢痕区成纤维细胞形态、排列结构等表型的影响差异。体外细胞实验部分,利用广泛Smad3基因敲除（Global S3KO）小鼠来源的心脏成纤维细胞,或通过小干扰RNA（siRNA）敲除成纤维细胞Smad2/3,从分子生物学角度观察并比较Smad2和Smad3对介导成纤维细胞激活的整合素（integrins）基因、成纤维细胞基质合成（ECMs）基因、平面细胞极化通路基因（PCPs）表达的影响,从而解释TGF-β介导的Smad2和Smad3信号通路对损伤后心肌重构产生不同影响的可能机制。研究结果:与野生型（WT）心脏成纤维细胞不同,S3KO小鼠来源的心脏成纤维细胞基质金属蛋白酶MMP-8表达不受转化生长因子（TGF-β1）的抑制;而且成纤维细胞特异性Smad3敲除可以显着增加TGF-β1刺激下MMP-8的分泌及其活性。蛋白质免疫印记（Western Blot,WB）结果提示,正常心脏组织有Smad2基线磷酸化激活,而Smad3无基线磷酸化激活。通过小干扰RNA（siRNA）分别沉默体外心脏成纤维细胞的Smad2和Smad3基因,发现对高张环境下成纤维细胞黏附分子（Adhesion Molecule）和细胞外基质（ECMs）合成基因的表达产生不同的影响;在体动物研究发现,他莫昔芬诱导的成纤维细胞特异性Smad2和Smad3基因敲除小鼠,对小鼠机体稳态、心脏基线结构和功能等方面均无显着影响。与心肌细胞特异性Smad3基因敲除（CMS3KO）小鼠不同,心肌细胞Smad2敲除（CMS2KO）雄性小鼠在6个月后心脏收缩功能较对照组Smad2 fl/fl显着下降,左心室出现明显的扩张性肥厚,但是随访到12月龄未见恶化;雌性CMS2KO小鼠心脏功能障碍的出现延迟到9月龄;蛋白质免疫印迹结果显示,雄性CMS2KO小鼠心肌组织中Smad2表达下调达90%,而雌性CMS2KO小鼠只有50%。在小鼠非再灌注心肌梗死模型中,双重免疫荧光染色结果显示,肌成纤维细胞Smad2和Smad3信号通路激活均在冠状动脉结扎后7天达高峰。体外细胞实验提示外源性TGF-β（10ng/ml,30min）通过磷酸化方式直接激活成纤维细胞Smad2/3信号通路,但是,骨形态蛋白（BMPs）和血管紧张素II（AngiotensinII）不能直接激活Smad2/3蛋白。在心梗晚期,肌成纤维细胞特异性Smad3基因敲除（FS3KO）小鼠表现出更高的死亡率和不良心脏重构,心室破裂发生率显着增加。与之相反,肌成纤维细胞特异性Smad2基因敲除（FS2KO）小鼠与对应的Smad2 fl/fl小鼠心梗后死亡率并无显着性差异。相反,FS2KO小鼠在心肌梗死后7天,左心室收缩功能、扩张性重构显着性优于Smad2 fl/fl组;而随访至心梗后28天,FS2KO和Smad2 fl/fl在心脏功能和重构方面无显着性差异。梗死心脏组织切片免疫荧光染色结果提示,尽管FS2KO和FS3KO小鼠心梗部位的肌成纤维细胞密度均显着性增加,却只有FS3KO小鼠梗死瘢痕结构紊乱,这与肌成纤维细胞在心肌梗死区、边缘区的形态异常、极化排列紊乱有关。整合素（integrin）参与成纤维细胞的激活,体外细胞实验结果显示,通过Smad3 siRNA干扰低张环境下的成纤维细胞Smad3基因（S3KD）,可以显着下调collagen pad中成纤维细胞整合素α2和α5（integrinα2,α5）表达水平,但是Smad2 siRNA基因干扰（S2KD）对integrins表达无显着影响。在高张环境的培养皿中,成纤维细胞Smad3基因沉默（S3KD）可以显着下调参与细胞极化、细胞骨架重组调控的Rho GTP酶蛋白A（RhoA）的表达,相反,Smad2基因沉默（S2KD）却显着上调RhoA表达水平。此外,平面细胞极化（PCP）基因通路的核心家族还有多次跨膜蛋白卷曲家族成员Frizzled（Fz）,通过分析发现,心脏成纤维细胞Smad2和Smad3体外基因沉默对Fz各个基因成员表达的影响各有差异。研究结论:心肌细胞特异性Smad2信号通路对维持正常心脏基线结构和功能发挥一定的作用,而心肌细胞Smad3信号通路主要参与心肌梗死后心脏重构。在正常心脏,成纤维细胞特异性Smad2/3对心脏稳态均无显着影响。在心肌梗死模型中,肌成纤维细胞特异性TGF-β/Smad3信号通路对心脏修复和重构有保护作用;而肌成纤维细胞Smad2基因敲除（FS2KO）可以暂时性显着改善心肌梗死后心脏收缩功能和心室扩张性重构。成纤维细胞特异性TGF-β/Smad3信号通路对心梗后组织修复的分子生物学机制与Smad3依赖的integrin介导的成纤维细胞的激活有关。同时,肌成纤维细胞的正常形态、结构排列、细胞外基质的合成对心肌梗死后心脏的修复和纤维化反应也发挥重要作用。RhoA作为平面细胞极化（PCP）信号通路的重要分子,其表达水平在S3KD成纤维细胞中显着下调,而在S2KD细胞中显着上调。综上所述,心肌细胞特异性Smad2参与心脏稳态调节;肌成纤维细胞特异性TGF-β/Smad2和TGF-β/Smad3信号通路在心肌梗死后心脏修复过程中的差异性效应与Smad2和Smad3信号分子对integrin和RhoA表达水平的差异性调节有关。
张维娅[3]（2018）在《不同年龄骨骼肌卫星细胞的分化能力及调控机制研究》文中指出骨骼肌作为一类横纹肌,是生物体中最重要的运动器官,而畜禽的骨骼肌不仅可以作为重要的运动器官,还是人类摄取优质蛋白质的重要来源之一,因此对畜禽骨骼肌发育的研究就显得尤为重要。卫星细胞作为动物骨骼肌的祖细胞,是一类未分化的单核细胞,定位于肌纤维基膜和肌细胞膜之间的间隙,紧紧粘附于肌纤维。卫星细胞可以参与肌纤维的发育并为其所附着的肌纤维提供细胞核。动物出生后骨骼肌中的卫星细胞会逐渐转为静息状态。当肌纤维受损时,卫星细胞可以被激活并开始进行不对称分裂,一部分子细胞进入细胞循环开始大量增殖并进行肌源性分化,参与肌纤维的再生;另一部分子细胞则退出细胞循环转为静息状态,进行自我更新,从而维持处于静息状态的卫星细胞数目的稳定,因此卫星细胞具有干细胞的特性,是一种肌源性的祖细胞。本研究用C57/BL6小鼠为模型,在细胞水平和组织水平探讨骨骼肌发育过程中卫星细胞的分化能力以及调控机制,并对猪骨骼肌卫星细胞的发育规律进行了初步研究。取得了以下结果:（1）哺乳动物出生后骨骼肌中PAX7+细胞数目逐渐减少。本研究选取出生后1天、8天、2周、4周、6周、8周、10周、12周、24周以及52周共10个时间点的小鼠的腓肠肌进行组织切片免疫荧光检测,结果发现,PAX7+细胞数目在小鼠出生后1天时约为19.7%,但随着年龄的增长显着下降,在大于10周龄的小鼠中PAX7+细胞数目的比率则稳定在0.5%以下。（2）出生后小鼠卫星细胞中MYF5、MYOD以及myogenin的表达模式。本研究对不同年龄小鼠腓肠肌进行组织切片免疫荧光检测,结果发现,MYF5+细胞数目在小鼠出生1天到8周龄虽然有轻微的下降,但总体维持在较高水平,而在10周龄后则显着下降。MYOD+细胞数目在小鼠出生后不同的年龄段均维持在一个较低的水平。Myogenin+细胞数目在小鼠出生后1天到2周显着下降,但在4周和6周时显着上升,随后又显着下降。（3）骨骼肌卫星细胞的分化能力随着年龄的增长而下降。本研究选取出生后2周、4周、6周、8周、10周以及12周共6个时间点的小鼠腿肌用于卫星细胞的分离和培养,然后利用免疫荧光和Q-PCR实验检测卫星细胞的分化能力。免疫荧光和Q-PCR结果表明,骨骼肌卫星细胞被诱导分化24 h和48 h后,分化标志基因Mck和肌浆球蛋白（myosin）的表达水平随着小鼠年龄的增长而呈现逐渐下调的趋势。（4）不同时期卫星细胞的差异表达基因鉴定。本研究分离了2周、4周、6周、8周、10周以及12周六个时间点的小鼠腿肌卫星细胞,并对其进行转录组分析。通过基因差异表达分析,本研究共得到了2907个DEGs。WGCNA分析发现,这2907个DEGs可以被富集到6个主要的表达模块,其中有1739个基因被富集到红色模块,且红色模块中的基因多与骨骼肌的发育过程相关（p<0.01）。Pathway分析表明这1739个差异基因主要富集到12个信号通路（p<0.01）,包括细胞粘附,肥厚型心肌病,Wnt以及MAPK等。综合Q-PCR验证分析和共表达网络分析,本研究筛选出三个关键基因,即Tgfβ2、Wnt9a和Fgfr4。（5）TGFβ2、TGFβ3以及WNT9a可以有效地抑制卫星细胞的分化。在细胞水平,卫星细胞分化时期Tgfβ2、Tgfβ3、Wnt9a、Akt2和Mknk2的表达水平与增殖期相比显着上调;利用si-RNA或Pirfenidone抑制TGFβ2、TGFβ3和WNT9a可以显着促进肌管的形成和MyHC2d以及Mck基因的表达。在组织水平,利用Pirfenidone抑制小鼠体内TGFβ2蛋白的表达可以有效地促进卫星细胞的激活和分化,从而促使卫星细胞与肌管融合以及骨骼肌的再生。（6）FGFR4可以有效地促进卫星细胞的分化。在卫星细胞分化时期Fgfr4基因的表达与增殖期相比显着上调。在卫星细胞中抑制FGFR4蛋白表达可以显着抑制肌管的形成和分化marker基因MyHC2d以及Mck的表达。（7）TGFβ2、FGFR4以及WNT9a通过影响卫星细胞的激活状态来调控骨骼肌的发育。本研究利用si-RNA抑制卫星细胞中TGFβ2、TGFβ3、FGFR4和WNT9a蛋白的表达,或利用Pirfenidone抑制细胞水平和组织水平TGFβ2的表达。Western blotting结果表明,TGFβ2、TGFβ3和WNT9a可以促进PAX7的表达,抑制MYOD的表达;FGFR4可以抑制PAX7的表达,促进MYOD的表达。（8）TGFβ2,FGFR4和WNT9a蛋白之间具有相互调节作用。Western blotting结果表明,TGFβ2可以抑制FGFR4、WNT9a、AKT2和MKNK2蛋白的表达;FGFR4可以抑制TGFβ2和WNT9a的表达,促进AKT2和MKNK2蛋白的表达;而WNT9a可以促进TGFβ2和FGFR4的表达,但是对AKT2和MKNK2蛋白水平的影响不显着。（9）对猪骨骼肌卫星细胞的初步研究。本研究选取大白猪胚胎35天、胚胎55天、出生1天、1月龄、2月龄、3月龄、6月龄以及12月龄共八个时间点的背最长肌进行免疫荧光检测。结果表明,MYF5+细胞数目随着骨骼肌的发育逐渐减少;MYOD+细胞数目在胚胎期55天最高,但是在其它时期均较低;myogenin+细胞数目从胚胎期到出生后逐渐下降。本研究通过对分离培养的卫星细胞进行诱导分化发现,MYOD和myogenin作为分化早期marker,在细胞分化启动时表达上调,随后又显着下调。
张乐[4]（2018）在《秦川牛Smad2和Smad3基因转录调控研究》文中进行了进一步梳理TGF-β信号通路是参与肌肉和脂肪生长发育调控的重要信号通路之一,而且是肌细胞和脂肪细胞分化的强抑制剂。Smads蛋白家族在TGF-β信号通路中起到至关重要的作用,它们能将信号由细胞膜转至细胞核中从而调节靶基因的转录。而Smad2/Smad3是由激活素TGF-β激活的R-Smads。研究证实在TGF-β1抑制成肌和成脂分化过程中起到关键作用的是Smad3基因而不是Smad2基因。鉴于Smad3可能存在的抑制成肌细胞和前体脂肪细胞分化的潜在作用,本研究通过腺病毒介导Smad3基因过表达和沉默的方法,探讨Smad3在调控牛成肌细胞和前体脂肪细胞分化过程中的作用。同时,虽然Smad2和Smad3的氨基酸相似性高,但其结构、功能和转录调控都存在显着的差异,本实验从细胞转录水平上对牛Smad2和Smad3基因的转录调控机制及相互之间的调控关系进行了初步的研究。主要研究结果如下:（1）成功克隆了秦川牛Smad3基因CDS区序列,全长为1278bp,编码了425个氨基酸残基,并筛选得到一条靶向Smad3基因干扰效率高达83.3%的sh RNA序列。构建了秦川牛Smad3基因的腺病毒穿梭载体p DC316-m CMV-EGFP-b SMAD3和p DC316-EGFP-Sh RNA-b SMAD3-1405,用这两种携带目的基因的重组质粒分别和骨架质粒共转染到HEK293A细胞中包装病毒,扩繁浓缩获得为高滴度病毒,用La SRT法测定病毒滴度,过表达腺病毒AD-b Smad3和AD-NC（空载病毒）的滴度均为1×1010PFU/m L;干扰腺病毒AD-Sh RNA-b SMAD3,AD-Sh RNA-NC（空病毒）的腺病毒滴度也均为1×1010PFU/m L。（2）在前体脂肪细胞中过表达Smad3基因,显着抑制了成脂标志基因PPARγ,FABP4,C/EBPα和C/EBPβ的表达,相反干扰沉默Smad3基因后,促进了PPARγ,FABP4,C/EBPα和C/EBPβ的表达。油红O染色发现在前体脂肪细胞过表达Smad3基因,抑制细胞中脂滴的积累,干扰沉默Smad3基因后,前体脂肪细胞中脂滴的含量升高。因而证明Smad3基因能够显着地抑制秦川牛前体脂肪细胞的分化。同样,在成肌细胞中过表达Smad3基因,显着抑制了肌细胞分化标志基因Myo D和Myo G的表达,而干扰沉默Smad3基因后,促进了Myo D和Myo G的表达。细胞形态观察发现干扰Smad3基因后,肌管变长变多。（3）克隆得到Smad3基因5’侧翼序列1143bp,其核心启动子区位于-337-41bp之间。通过定点突变转录因子结合位点,确定了KLF6、KLF15、KLF7和MZF1在维持Smad3基因启动子活性中的作用;体外EMSA实验进一步证实KLF6、KLF15、KLF7和MZF1是Smad3基因的关键转录因子。转染KLF6-si RNA、KLF15-si RNA、KLF7-si RNA、MZF1-si RNA以及对照Control si RNA到前体牛脂肪细胞和成肌细胞中,采用Real-time PCR方法检测发现,KLF6、KLF15、KLF7和MZF1是维持牛Smad3基因启动子基本转录活性必需的顺式作用元件。（4）采用Real-time PCR方法检测发现,Smad2和Smad3基因在牛的各个组织中广泛表达,氨基酸相似性高达89.2%。在成肌细胞分化过程中,Smad2和Smad3基因表达趋势相同,随着肌管形成其表达量显着增加。但是Smad3对Smad2基因的转录表达是抑制作用,无论是牛成肌细胞处于高血清生长培养基（GM:F12/DMEM+20%FBS）还是低血清培养基分化培养基（DM:F12/DMEM+2%HS）。（5）采用5’末端c DNA快速扩增法（SMART RACE c DNA Amplification）,确定牛Smad2基因存在的的转录起始位点,与已报道Smad2基因的mRNA序列（NM001046218）转录起始位点相比,我们将Smad2基因m RNA序列的5’UTR在原有基础上向前推进5 bp。克隆得到牛Smad2基因5’侧翼序列1243 bp,而其核心启动子区域位于-158-35bp。通过定点突变转录因子结合位点,确定了C/EBPα和C/EBPβ结合在Smad2基因核心启动子区域。体外EMSA实验进一步证实C/EBPα和C/EBPβ转录因子能够结合在牛Smad2基因的核心启动子区域。（6）细胞培养基的不同会影响C/EBPα和C/EBPβ转录因子、Smad2和Smad3基因的调控。在低血清的分化培养基条件下的牛成肌细胞中C/EBPα和C/EBPβ抑制Smad2基因的表达,Smad3基因促进C/EBPα和C/EBPβ基因的表达;而在高血清生长培养基条件下的牛成肌细胞中,C/EBPα和C/EBPβ转录因子促进Smad2基因的表达,Smad3基因抑制C/EBPα和C/EBPβ基因的表达。Smad3基因调控Smad2基因的表达可能是通过调控其关键转录因子C/EBPα和C/EBPβ的表达。综上所述:本文应用腺病毒介导的基因过表达与干扰沉默技术,探讨了Smad3基因在调控秦川牛前体脂肪细胞与成肌细胞分化过程中的作用,以及对一些在肌肉生长发育和脂质代谢过程中发挥重要作用的功能基因转录水平的影响;也探讨了Smad2和Smad3基因之间在转录水平上的调控机制,为进一步研究TGF-β信号通路在秦川牛肌肉和脂肪的形成过程中的调控机制提供一定的理论依据,也为下一步的中国肉牛育种工作奠定基础。
王权[5]（2017）在《ALK5信号通路在关节软骨稳态维持和骨关节炎中的作用及机制研究》文中研究说明骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是最常见的关节退行性疾病。骨关节炎基本病理特征包括进行性关节软骨纤维化及退变,滑膜炎性浸润和增生,骨赘形成及软骨下骨硬化。随着病情进展患者出现移动性疼痛,关节僵直,行动受限甚至造成终生残疾。然而OA的致病尚未完全阐明,目前还没有有效的干预手段延缓或治愈OA。关节软骨是一种无血管和神经支配的高度特化的纤维结缔组织。关节软骨覆盖关节表面,可减少关节面间摩擦和机械损伤。关节软骨细胞外基质包括II型胶原（type II collagen,Col II）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan,ACAN）。在病理情况下如OA发生中,细胞外基质蛋白可以被多种蛋白酶降解,其中基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase）如MMP3、9、13和蛋白聚糖酶如adamts4和adamts5主要参与软骨基质降解。软骨细胞是关节软骨中最主要细胞类型,通过分泌软骨细胞外基质及蛋白酶类降解多余的软骨基质降解维持软骨细胞外基质代谢平衡,参与关节软骨稳态维持,并受多种生长因子、细胞因子和机械刺激所调控。一旦软骨细胞受损失去维持关节软骨稳态的能力将导致软骨退变并最终引起OA。虽既往研究显示多种生长因子和及下游信号通路如低氧诱导因子信号通路（Hif）、Wnt/β-连锁蛋白（Wnt/β-catenin）及成纤维生长因子/受体（FGFs/FGFRs）信号通路通过调控软骨细胞参与关节软骨稳态维持和OA发生发展。但OA发生的详细机制仍未完全阐明,进一步阐明调控软骨稳态和OA发生发展的分子机制将有助于开发和筛选有效的OA生物治疗药物。近年来,转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）信号通路在软骨稳态维持中的作用越来越受到重视。在经典的Smad依赖的TGF-β信号通路中,TGF-β配体首先与II型TGF-β受体（TGF-βRII）结合,然后TGF-βRII募集I型TGF-β受体（TGF-βRI）（又称为活化素受体样激酶5,ALK5）至膜上形成异源四聚体起始TGF-β信号通路。在TGF-β配体作用下,自身磷酸化并激活的TGF-βRII磷酸化ALK5,活化的ALK5特异性识别结合并磷酸化激活型Smad蛋白（Smad2和Smad3）,激活的Smad2/3与受体解离与胞浆内Smad4结合,形成Smad蛋白异源复合物。Smad蛋白复合物共同入核结合核内相应转录因子启动TGF-β靶基因的表达。在Smad非依赖的TGF-β信号通路中,TGF-β与TGF-βRⅡ和ALK5受体结合后通过Smad非依赖方式激活MAPK、PI3K/AKT和GTPases下游信号通路。遗传水平干预TGF-β信号通路中重要组分的研究表明TGF-β信号失调将导致OA发生。骨组织过表达显性负突变的TGFβRII（DN-TGFβRII）转基因小鼠或软骨细胞可诱导敲除TGFβRII的小鼠,在TGFβRII受体水平抑制TGF-β信号,软骨细胞中MMP13和Adamts5蛋白表达水平升高,最终小鼠关节出现进行性加重的OA样表型。与此类似的,全身或软骨细胞内特异敲除Smad3基因,在Smad3水平抑制TGF-β信号,可降低软骨细胞内Col II和ACAN表达,上调MMP13和X型胶原（Col X）表达最终导致小鼠出现模拟人OA样的软骨退变表型。基于以上研究结果,我们认为软骨细胞中TGF-β/TGFβRII-Smad3信号轴在关节软骨稳态维持和OA发生发展中发挥重要作用。然而,作为TGF-β信号通路中重要组分,ALK5及其下游信号通路在软骨稳态维持中作用尚未完全阐明。ALK5在人和小鼠关节软骨中均有表达,并且随着年龄增加和OA发生,关节软骨中ALK5蛋白表达水平逐渐降低。体外软骨细胞中过表达ALK5增加Aggrecan m RNA表达水平,而软骨细胞中敲低Alk5基因则上调Mmp13 m RNA表达水平。关节腔注射ALK5阻断剂SB-505124明显促进软骨表层到中层软骨基质的丢失。这些结果提示软骨细胞中ALK5信号可能通过促进软骨基质合成并抑制其降解维持关节软骨细胞代谢平衡。然而ALK5信号在关节软骨稳态维持和OA发生发展中的作用仍然缺乏遗传学证据。本课题首先利用可诱导软骨细胞特异性敲除Alk5基因的策略研究软骨细胞中ALK5信号通路在关节软骨稳态维持和OA发生中的作用,我们发现软骨细胞内ALK5信号可部分通过PKA/CREB依赖的信号通路上调软骨细胞内蛋白聚糖4（Proteoglycan 4,PRG4）表达参与关节稳态维持和延缓OA发生发展。PRG4又称润滑素（Lubricin）或表层蛋白（Superficial Zone Proteins,SZP）,主要由关节软骨表层区细胞分泌。关节软骨表层区由于其表层分布位置,特定的结构和功能构成了防止OA起始的第一道防线。关节软骨表层由两到四层扁平状关节软骨表层细胞沿关节面平行排列而成,关节软骨表层细胞分泌特殊的细胞外基质蛋白如PRG4和肌糖蛋白,并形成特定的胶原纤维网络平行分布于关节表面。关节表层具有多种功能包括:分泌润滑素,携带软骨干/祖细胞以及抵抗剪切力等。TGF-β配体及受体在关节表层细胞内均有表达,TGF-β处理软骨表层细胞明显上调软骨表层标志基因PRG4的表达,软骨表层细胞Micromass培养并给予TGF-β处理能明显诱导PRG4和软骨基质蛋白如Col2和Aggrecan表达,表明软骨表层细胞具有向软骨分化的软骨干/祖细胞特性,同时TGF-β信号能明显诱导具有软骨干/祖细胞特性的表层细胞向软骨细胞分化,提示TGF-β信号在促进表层细胞标志基因的表达和促进具有干/祖细胞特性的表层细胞向软骨细胞分化过程中发挥重要作用,然而目前仍然缺乏遗传学证据。本课题利用可诱导关节软骨表层细胞特异性敲除Alk5基因的策略研究表层细胞中ALK5信号通路在关节软骨表层功能维持和OA发生中的作用。我们发现表层细胞内ALK5信号对关节软骨表层功能维持和延缓OA进展至关重要,进一步调控软骨表层中ALK5信号可作为OA治疗的新的靶点。研究方法:第一部分:软骨细胞内可诱导性敲除Alk5基因导致小鼠出现进行性加重的骨关节炎样改变1.出生后可诱导性敲除软骨细胞的Alk5基因:Alk5flox/flox;Col2α1-Cre ERT2(简称Alk5Col2ERT2)和Alk5flox/flox（Cre-Negative）小鼠均于出生后2周腹腔连续五天注射他莫昔芬（1mg/10g体重小鼠）驱动软骨细胞内Cre表达,实现软骨细胞内可诱导性敲除Alk5基因（此后称为Alk5 cKO小鼠）。免疫组织化学检测ALK5及下游靶分子pSmad3在2月龄Alk5 cKO和Cre-Negative小鼠关节软骨中表达。2.2、3、6月龄Cre-Negative和Alk5 c KO小鼠关节切片行藏红固绿染色观察软骨、滑膜及软骨下骨组织形态学变化。参考关节炎研究学会（Osteoarthrisits Research Society International,OARSI）推荐方法对软骨退变程度进行评分。3.定量PCR、WB和免疫组化检测Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节软骨细胞中软骨基质合成和降解相关分子的表达。4.TUNEL和活化的caspase 3免疫组化检测2月龄Cre-Negative和Alk5 c KO小鼠关节软骨细胞的凋亡情况。5.HE染色检测3月龄Cre-Negative和Alk5 c KO小鼠滑膜组织形态学变化。6.检测ALK5信号对关节软骨细胞中PRG4表达水平的影响1)免疫组化检测2月龄Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节软骨PRG4表达水平。2)定量PCR检测Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节软骨中Prg4表达水平。3)关节软骨细胞给予不同浓度的ALK5抑制剂SB-505124（0.1,0.5和1μM）处理24小时或1μM SB-505124处理不同时间点（6,12和24小时）后行定量PCR检测Prg4 mRNA表达变化。7.检测软骨细胞中ALK5信号在TGF-β1诱导的PRG4表达中的作用1)关节软骨细胞给予逐渐增加浓度的TGF-β1（5,10和20ng/ml）处理24小时或10ng/ml TGF-β1处理不同时间点（6,12和24小时）后行定量PCR和WB检测PRG4表达变化。2)关节软骨细胞给予1μM SB-505124预处理30分钟后,给予10ng/ml TGF-β1、1μM SB-505124或二者联合处理24小时后行定量PCR和WB检测PRG4的表达变化。3)Cre-Negative和Alk5敲除的关节软骨细胞给予10ng/ml TGF-β1处理24小时后行定量PCR检测Prg4 m RNA的表达变化。4)关节软骨细胞转染持续激活的ALK5过表达载体和空白载体,转染12小时后给予1μM SB-505124继续处理12小时后行定量PCR检测Prg4 m RNA的表达变化。8.检测软骨细胞中PKA-CREB信号在TGF-β1/ALK5信号通路诱导的PRG4表达中的作用1)关节软骨细胞给予10μM PKA抑制剂H89预处理30分钟后,给予10ng/ml TGF-β1、10μM H89或二者联合处理24小时后行定量PCR和WB检测PRG4表达。2)关节软骨细胞给予10μM H89或1μM SB-505124预处理30分钟后,给予10ng/ml TGF-β1、10μM H89/1μM SB-505124或二者联合处理30分钟后行WB检测磷酸化CREB水平。3)Cre-Negative和Alk5敲除的关节软骨细胞给予10ng/ml TGF-β1处理30分钟后行WB检测磷酸化CREB的表达。4)免疫组化检测2月龄Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节软骨磷酸化CREB表达水平。5)关节软骨细胞给予10μM CBP-CREB结合抑制剂预处理30分钟后,给予10ng/ml TGF-β1、10μM CBP-CREB结合抑制剂或二者联合处理24小时后行定量PCR和WB检测PRG4的表达。5)梯度浓度的PKA/CREB激动剂弗斯可林（Forskolin,FSK）处理24小时后行定量PCR检测Prg4 m RNA的表达变化。第二部分:ALK5信号在关节软骨表层细胞表型功能维持及骨关节炎中的作用及机制研究1.出生后可诱导性敲除关节软骨表层细胞中的Alk5基因:Alk5flox/flox;Prg4GFPCre ERT2/+(Alk5prg4ERT2)and Alk5flox/flox（Cre-Negative）小鼠均于出生后20天腹腔连续10天注射他莫昔芬（1mg/10g体重小鼠）驱动关节软骨表层细胞内Cre表达,实现可诱导的关节软骨表层细胞敲除Alk5基因（此后称为Alk5 pcKO）。免疫组织化学检测ALK5及下游靶分子p Smad3在2月龄Cre-Negative和Alk5 pcKO和小鼠关节表层中表达。2.4和8月龄Cre-Negative和Alk5 pcKO小鼠关节切片行藏红固绿染色观察年龄相关的关节软骨组织形态学变化。3.2月龄雄性Cre-Negative和Alk5 pc KO右侧膝关节制作内侧半月板不稳定手术模型诱导小鼠发生关节炎,左膝关节仅打开内囊作为假手术对照组。术后8周取材后切片行藏红固绿染色观察手术诱导的关节软骨织形态学变化。4.HE染色检测4月龄Cre-Negative和Alk5 c KO小鼠股骨关节表层细胞数目。5.小鼠出生后11天给予腹腔连续5天注射Edu（按照50mg/kg体重）,2月龄取材,行Edu和TUNEL法分别检测关节软骨中Edu-标记的细胞和凋亡细胞。6.分离并鉴定软骨表层细胞。7.MTT实验结合形态学观察检测TGF-β1/ALK5信号对关节表层细胞增殖的影响。8.定量PCR和免疫组化检测TGF-β1/ALK5对关节表层细胞标志基因表达的影响。9.定量PCR和阿尔新兰染色检测ALK5信号对表层细胞向软骨细胞分化的影响。结果:第一部分:软骨细胞内可诱导性敲除Alk5基因导致小鼠出现进行性骨关节炎样改变1.免疫组化结果显示,相比于Cre-Negative小鼠,ALK5和p Smad3阳性细胞数在Alk5 cKO小鼠关节软骨中明显降低,表明Alk5基因在关节软骨中有效敲除。2.藏红固绿染色显示从2月到6月龄,Alk5 cKO出现进行性加重的关节炎样表型,包括软骨基质丢失、增加的肥大软骨细胞、软骨组织缺失、骨赘形成及软骨下骨硬化。3.软骨特异敲除Alk5基因明显增加软骨中Col X、MMP13和Adamts5表达,但降低Col2和Aggrecan的表达。4.TUNEL和IHC结果显示,相比于Cre-Negative小鼠,TUNEL-和活化的caspase 3-阳性细胞数在Alk5 c KO小鼠关节软骨中明显增加。5.HE染色显示Alk5 cKO小鼠出现明显的滑膜增生。6.Alk5 c KO小鼠关节软骨中PRG4表达明显降低1)免疫组化结果显示,相比于Cre-Negative小鼠,PRG4阳性细胞数在Alk5 c KO小鼠关节软骨中明显降低。2)定量PCR结果显示Prg4 mRNA表达水平在Alk5缺失的软骨细胞中明显降低。3)定量PCR结果显示SB-505124以剂量和时间依赖的方式降低Prg4 mRNA表达水平。7.TGF-β1通过ALK5依赖的方式诱导PRG4表达1)定量PCR和WB结果显示TGF-β1以剂量和时间依赖的方式促进PRG4蛋白和m RNA表达。2)软骨细胞内敲除Alk5或使用ALK5阻断剂阻断软骨细胞内ALK5信号减弱TGF-β1诱导的PRG4表达。3)持续激活的ALK5过表达载体直接上调Prg4 m RNA表达,给予ALK5阻断剂阻断持续激活的ALK5诱导的软骨细胞中Prg4 m RNA表达。8.TGF-β1/ALK5通过PKA-CREB诱导软骨细胞中PRG4的表达1)定量PCR和WB结果显示PKA阻断剂H89减弱了TGF-β1诱导的PRG4蛋白和m RNA表达。2)WB结果显示在关节软细胞中H89或SB-505124减弱了TGF-β1激活的磷酸化的CREB蛋白表达水平。3)软骨细胞内敲除Alk5减弱了TGF-β1激活的磷酸化的CREB蛋白表达水平。4)免疫组化结果显示,相比于Cre-Negative小鼠,pCREB阳性细胞数在Alk5 cKO小鼠关节软骨中明显降低。5)定量PCR和WB结果显示在关节软骨细胞中CBP-CREB结合抑制剂减弱了TGF-β1诱导的PRG4蛋白和mRNA表达。6)定量PCR结果显示弗斯可林处理可回救由于Alk5缺失所致的降低的Prg4 m RNA的表达。第二部分:ALK5信号在关节软骨表层细胞表型功能维持及骨关节炎中的作用及机制研究1.免疫组化结果显示,相比于Cre-Negative小鼠,ALK5和p Smad3阳性细胞数在Alk5 pcKO小鼠关节表层中明显降低,表明Alk5基因在关节表层中有效敲除。2.藏红固绿染色显示4月龄Alk5 pcKO关节软骨表层和中层出现异常增加的肥大软骨细胞,8月龄Alk5 pc KO关节软骨出现软骨组织撕裂和缺失。3.术后8周,藏红固绿染色显示,相比于Cre-Negative小鼠中等程度的软骨缺损退变,Alk5 cKO表现为更为严重的软骨基质和软骨组织的丢失。4.HE染色显示,相比于Cre-Negative小鼠,软骨表层细胞数量在4月龄Alk5 pcKO小鼠中明显降低。5.Edu染色结果显示,相比于Cre-Negative小鼠,Edu标记的长时程缓慢增殖的细胞在2月龄Alk5 pc KO小鼠中明显降低,然而TUNEL-阳性的凋亡细胞在2月龄Alk5 pcKO小鼠中明显增加。6.从出生后小鼠关节软骨表层成功分离的得到表层细胞。显微镜下观察表层细胞呈现为长梭和成纤维样细胞形态,而软骨细胞呈现出与之前报道一致的多边形和表皮样细胞形态。表层细胞高表达间充质细胞标志分子如CD73、CD90和CD105,同时高表达关节表层特异标志性基因如Prg4、Erg和Tenascin C,但低表达软骨特异基因如Col2、Aggrecan（Acan）和Matrilin-1（Mat-1）。7.MTT和细胞形态学分析显示表层细胞敲除Alk5明显抑制表层细胞的增殖,并且减弱了TGF-β1促表层细胞增殖的效果。8.定量PCR结果显示表层细胞敲除Alk5明显抑制关节表层特异标志性基因如Prg4和Tenascin C表达,并且减弱了TGF-β1诱导的Prg4和Tenascin C的表达。与此一致的,免疫组化结果显示表层细胞敲除Alk5抑制PRG4蛋白在关节表层表达。9.显微镜下观察结合阿尔新兰染色结果显示表层细胞具有向软骨分化的潜能。定量PCR和阿尔新兰染色结果显示表层细胞敲除Alk5通过降低Col2和Aggrecan表达抑制其向软骨分化,同时通过上调Col10,Mmp13和Adamts5表达促进其肥大分化及基质降解。结论:1.软骨细胞内可诱导性敲除Alk5基因可通过下调软骨细胞中PKA-CREB信号通路和PRG4表达水平导致小鼠出现年龄依赖的进行性加重的骨关节炎样表型。2.表层细胞内可诱导敲除Alk5基因导致表层细胞的增殖活性,表层和干性特异标志基因表达及向软骨分化能力受损,加速年龄依赖和手术诱导的骨关节炎进展。
姚力丹[6]（2016）在《巴什拜羔羊MSTN/Smad信号通路基因表达、DNA甲基化与产肉性能关联性研究》文中认为本文通过RT-PCR技术检测初生和5月龄巴什拜羊MSTN/Smad信号通路基因（MSTN、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、TGFβRⅠ、TGFβRⅡ）在不同组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌和尾脂）和1-5月龄腿肌和尾脂表达量,分析不同月龄MSTN/Smad信号通路基因表达量与生长性状的关联性,探索巴什拜羊MSTN基因在不同组织,不同发育阶段的表达规律;同时研究DNA甲基化修饰与MSTN基因表达量的相关性,为巴什拜羊遗传育种选育提供分子生物学依据。1.MSTN/Smad信号通路基因各组织表达量研究初生时:MSTN基因在尾脂和小肠的表达量显着高于其他各组织（P<0.05）,脾脏、股二头肌、半腱肌显着高于除尾脂和小肠之外的其他各组织（P<0.05）;Smad2基因在肾脏和小肠的表达量显着高于其他各组织（P<0.05）;Smad3基因除背最长肌之外,内脏组织显着高于肌肉组织（P<0.05）;Smad4基因除肺脏、半腱肌、背最长肌和尾脂之外,内脏组织显着高于肌肉组织（P<0.05）;Smad7基因肝脏、脾脏、肺脏、小肠和尾脂与肾脏、股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌和背最长肌之间存在显着差异;TGFβRⅠ基因在脾脏、肾脏和小肠的表达量显着高于其他各组织（P<0.05）;TGFβRⅡ基因在心脏、肺脏、肾脏和尾脂显着高于其他各组织（P<0.05）。5月龄时:MSTN基因在尾脂表达量显着高于其他各组织（P<0.05）;Smad2基因在尾脂表达量显着高于其他各组织（P<0.05）,在肝脏、股三头肌和背最长肌均无表达;Smad3基因在肺脏的表达量显着高于半膜肌（P<0.05）股三头肌中无表达;Smad4基因在肾脏和脾脏的表达量显着高于股三头肌、半膜肌、背最长肌和尾脂（P<0.05）,肺脏、股二头肌和半腱肌均无表达;Smad7基因各组织之间无差异显着性（P>0.05）;TGFβRⅠ基因尾脂的表达量显着高于其他各组织（P<0.05）;TGFβRⅡ基因在肝脏的表达量显着高于小肠（P<0.05）。2.MSTN/Smad信号通路基因不同月龄表达量研究肌肉组织:MSTN基因表达量1月龄显着高于2月龄、3月龄、4月龄和5月龄（P<0.05）。初生显着低于2月龄、3月龄、4月龄、5月龄（P<0.05）;Smad2基因表达量5月龄显着高于其他各月龄（P<0.05）;Smad3、Smad7基因表达量4月龄显着高于其他各月龄（P<0.05）;Smad4基因表达量各月龄之间差异不显着（P>0.05）;TGFβRⅠ基因表达量2月龄和3月龄显着高于其他各月龄（P<0.05）;TGFβRⅡ基因表达量2月龄、3月龄和4月龄显着高于初生、1月龄和5月龄（P<0.05）。脂肪组织:MSTN基因表达量5月龄显显着高于其他各月龄（P<0.05）,3月龄显着低于初生、1月龄、4月龄（P<0.05）;Smad2、Smad4、Smad7基因表达量4月龄显着高于其他各月龄（P<0.05）;Smad3基因表达量3月龄显着高于初生,1月龄、2月龄和5月龄（P<0.05）,4月龄显着高于初生、1月龄、2月龄和5月龄（P<0.05）;TGFβRⅠ基因表达量3月龄和4月龄显着高于其他各月龄（P<0.05）;TGFβRⅡ基因表达量4月龄显着高于其他各月龄（P<0.05）。3.MSTN/Smad信号通路基因与生长性状和各基因关联分析肌肉组织:MSTN基因表达量与体重呈极显着负相关（r=-0.864,P<0.01）;Smad3基因与体重呈极显着负相关（r=-0.522,P<0.01）,与管围呈显着负相关（r=-0.479,P<0.05）,TGFβRⅠ基因与体长呈显着负相关（r=-0.461,P<0.05）;MSTN基因与Smad3基因呈显着负相关（r=-0.421,P<0.05）,与TGFβRⅠ基因呈中负相关（r=-0.342）。脂肪组织:Smad2和Smad3基因与体长呈显着正相关（r=0.617,r=0.588,P<0.05）,Smad7和TGFβRⅡ基因与体长呈极显着正相关（r=0.640,r=0.632,P<0.01）;MSTN基因与TGFβRⅠ基因呈中负相关（r=-0.334）。4.MSTN基因DNA甲基化相关性分析股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌和尾脂的甲基化概率分别为74.2%、74.2%、83.2%、83.7%、82.1%和25.3%。DNA甲基化概率与MSTN基因的表达量呈显着负相关（r=-0.48,p<0.05）。DNA甲基化对其屠宰性状有一定的影响。
祖玲玲[7]（2015）在《MSTN/Smad信号通路基因在哈萨克羔羊上的表达规律研究与相关性分析》文中指出本文通过荧光定量MSTN/Smad信号通路基因（MSTN、Smad3、Smad4、Smad7、TGFBR1、TGFBR2）在新生和6月龄哈萨克羔羊12种不同组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肠、肾脏、尾脂、背最长肌半膜肌、半键肌、股二头肌、股三头肌）的表达量和1-6月龄哈萨克羔羊肌肉和脂肪组织中的相对表达量,相关性分析MSTN基因在1-6月龄肌肉中的表达量与各项生长指标的关联性,探索MSTN基因在不同组织的、不同生长阶段的表达差异,为MSTN基因的表达规律和表达途径的研究提供基础资料,为哈萨克羊的良种选育提供生物学资料。本试验得到的结果如下:（1）MSTN在新生和6月龄哈萨克羔羊12种组织中的表达规律MSTN基因在新生哈萨克羔羊尾脂中的表达量显着高于各肌肉和内脏组织（P<0.05）,在心脏中的表达量显着高于肌肉组织和脾脏、肠、肺脏、肾脏（P<0.05）。MSTN在6月龄羔羊肌肉组织中的表达量显着高于除肝脏以外其它各内脏组织和尾脂。（2）Smads在新生和6月龄哈萨克羔羊12种组织中的表达规律Smad3基因在新生和6月龄哈萨克羔羊肾脏、肺脏、尾脂中的相对表达量均高于各肌肉组织（P<0.05）,在股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌中的相对表达量均较低。Smad4基因在新生和6月龄哈萨克羔羊尾脂的表达量均最高,各内脏组织和尾脂的表达量高于各肌肉组织,各肌肉组织中的表达量较低。Smad7基因在新生和6月龄哈萨克羔羊各内脏组织表达量均高于肌肉组织的表达量,在6月龄哈萨克羔羊尾脂中的表达量较高,但在新生哈萨克羔羊尾脂中的表达量较低。（3）TGFBR1、TGFBR2在新生和6月龄哈萨克羔羊12种组织中的表达规律TGFBR1基因在新生和6月龄哈萨克羔羊尾脂中的表达量较高,在各肌肉组织中的表达量低于尾脂与各内脏组织的表达量。TGFBR2基因在6月龄哈萨克羔羊尾脂中的相对表达量显着高于其它各组织中（P<0.05）,TGFBR2基因在新生和6月龄哈萨克羔羊肝脏、肾脏中的表达量显着高于其它各组织的表达量（P<0.05）。（4）MSTN在1-6月龄哈萨克羔羊肌肉与脂肪组织中的发育性变化MSTN在1-6月龄哈萨克羔羊肌肉中,5月龄的相对表达量最高,1、2、4月龄的相对表达量显着高于6月龄。6月龄表达量较低。MSTN在1-6月龄哈萨克羔羊尾脂中:6月龄的相对表达量最高,1、2、3、4各月龄之间的相对表达量无显着性差异（P>0.05）,5月龄相对表达量为最低。（5）Smads在1-6月龄哈萨克羔羊肌肉与脂肪组织中的发育性变化在1-6月龄哈萨克羔羊肌肉中:Smad3、Smad4基因在2月龄的相对表达量均为最高,1月龄最低。Smad3在3、5月龄的相对表达量显着高于1、4月龄（P<0.05）。Smad4在2、6月龄的相对表达量显着高于1、3、4月龄（P<0.05）。Smad7基因在5月龄表达量为最高,1月龄最低（P<0.05）,其它各月相对表达量差异不显着（P>0.05）。在1-6月龄哈萨克羔尾脂中:Smad3在6月龄相对表达量最高,1、5月龄相对表达量较低,其它各月差异不显着。Smad4在6月龄的相对表达量为最高,显着高于2、3、4月龄相对表达量（P<0.05）。Smad7基因在6月龄的相对表达量为最高,在5、6月龄相对表达量显着高于1、2、4月龄的相对表达量（p<0.05）。（6）TGFBR1、TGFBR2在1-6月龄哈萨克羔羊肌肉与脂肪组织中的发育性变化在1-6月龄哈萨克羔羊肌肉组织中:TGFBR1在5月龄的表达量最高,6月龄表达量最低。1、2、3、4各月龄之间相对表达量无显着相差异（P>0.05）。TGFBR2在3、5月龄相对表达量显着高于2、4、6月龄相对表达量（P<0.05）。1、2、4、6各月龄之间无显着相差异（P>0.05）。4月龄相对表达量为最低。在1-6月龄哈萨克羔羊尾脂中:TGFBR1在5月龄的表达量最高,2、3、4各月龄显着低于1、5月龄相对表达量（P<0.05）,6月龄相对表达量最低。TGFBR2在2月龄的相对表达量最高,显着高于1、3、4、6月龄（P<0.05）,4月龄表达量最低。关联性分析得出:MSTN基因的表达量与体长呈显着负相关,相关系数为0.472,与体重、胸围呈负相关,与管围、体高呈弱正相关。MSTN基因与Smad3基因呈极显着中正相关相关系数为0.535,与Smad4、Smad7呈微弱正相关,与TGFBR1、TGFBR2呈极显着正相关,相关系数为0.517、0.480。
吐来力江·哈木太[8]（2014）在《MSTN/Smad信号通路与阿勒泰羊肌肉生长发育、产肉性能关联性的研究》文中研究指明本研究采用荧光定量PCR技术检测了阿勒泰羊羔羊不同月龄和不同组织MSTN/Smad信号通路基因（MSTN、Smad2、Smad3、Smad4、TGFBR1、TGFBR2）表达量，并利用SPSS统计分析软件分析0月龄、6月龄不同组织和06月龄羔羊肌肉组织和脂肪组织MSTN/Smad信号通路基因表达量的差异。同时对MSTN/Smad信号通路基因表达量和体重、体尺、屠宰率等指标进行相关性分析，得到了阿勒泰羊羔羊不同组织和不同生长阶段MSTN/Smad信号通路基因的表达特性，掌握阿勒泰羊MSTN基因作用机制和规律，为改善阿勒泰羊肉生产性能和肉品质提供分子水平的理论依据。一、新疆阿勒泰羊羔羊MSTN mRNA表达的定量研究MSTN mRNA在0月龄羔羊背最长肌表达量为最高，在肺中表达为最低；在6月龄羔羊股三头肌中的表达为最高，肠中的表达为最低。从0月龄至4月龄随着肌肉年龄的增加MSTN mRNA的表达逐渐上升，4月至6月龄随年龄的增加而下降。06月龄羔羊脂肪组织中MSTN基因mRNA表达量逐渐上升。二、新疆阿勒泰羊羔羊Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达的定量研究0月龄羔羊Smad3基因mRNA在股二头肌、半腱肌、背最长肌和脾中的相对表达量显着高于肺中的表达量（P＜0.05）；Smad4mRNA在心中的表达显着高于肺脏中的表达量（P＜0.05）。6月龄羔羊Smad2mRNA在背最长肌肉中的表达显着高于其它11个组织（P＜0.05），在肺中的表达为最低。Smad3、Smad4mRNA在股三头肌、股二头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌肉等组织中的表达显着高于尾脂、心、肺、肝、脾和肠中的表达（P＜0.05）。3、4月龄羔羊肌肉和脂肪中Smad2mRNA表达显着高于其它月龄中的表达；4月龄羔羊肌肉和脂肪Smad3mRNA表达显着高于其他月龄羔羊肌肉和脂肪中表达（P＜0.05）；3月龄时肌肉Smad4mRNA表达显着高于其他月龄羔羊肌肉中的表达（P＜0.05）；4月龄时脂肪Smad4mRNA表达显着高于其他月龄羔羊肌肉中的表达（P＜0.05）。三、新疆阿勒泰羊羔羊TGFBR1、TGFBR2mRNA表达的定量研究在0月时TGFBR1基因mRNA在心脏中的相对表达量为最高，肺脏中的表达量为最低；TGFBR2基因mRNA在心脏、脾脏、肾脏、肝脏中的表达量极显着高于股三头肌、半腱肌、半膜肌和背最长肌肉、尾脂、肺脏、和肾脏中的表达量（P＜0.01），显着高于股二头肌肉中的表达量（P＜0.05）。6月龄时，TGFBR1mRNA在股三头肌、股二头肌肉、半腱肌肉、半膜肌肉、背最长肌肉中的表达显着高于肝、心、脾、肠等组织中的表达量（P＜0.05）；TGFBR2mRNA在股三头肌、股二头肌、半腱肌、半膜肌和背最长肌肉中的表达显着高于尾脂、心脏、脾脏、肾脏、肝脏中的表达量（P＜0.05）。46月龄羔羊TGFBR1mRNA在肌肉中的相对表达量显着高于其它月龄（P＜0.05）。2月龄羔羊脂肪中TGFBR1mRNA显着高于其它月龄中的表达（P＜0.05）。2月龄羔羊肌肉组织中TGFBR2mRNA表达高于其它月龄肌肉组织中的表达（P＜0.05）。2月龄脂肪组织中TGFBR2mRNA表达显着高于其它月龄脂肪组织（P＜0.05）。四、MSTN/Smad信号通路与生长发育、产肉性能指标的关联性分析MSTN基因表达量与Smad3基因表达量呈极显着的正相关（r=0.905，P＜0.01），与Smad2、Smad4、TGFBR1、TGFBR1基因都无显着相关（P＞0.05）；Smad2基因表达与Smad3表达呈显着的正相关（r=0.758，P＜0.05），与Smad4基因表达之间存在极显着的正相关（r=0.895，P＜0.01），与TGFBR1，TGFBR2基因表达无显着相关（P＞0.05）；Smad3、Smad4、TGFBR1、TGFBR2之间无显着相关（P＞0.05）；TGFBR1表达与TGFBR2表达呈极显着的正相关（r=0.998，P＜0.01）。MSTN基因表达量与体重呈极显着的负相关（r=0.997，P＜0.01），与体高、体长、胸围、胴体重、屠宰率之间无显着相关（P＞0.05）；Smad2基因表达量与体重、体高、体长、胸围、管围、胴体重、屠宰率都无显着相关（P＞0.05）。Smad3基因与屠宰率呈显着的负相关（P＜0.05）。Smad4、TGFBR1、TGFBR2表达与体高、体长、胸围、胴体重、屠宰率都没有显着相关（P＞0.05）。
安外尔·热合曼[9]（2014）在《MSTN/Smad信号通路与吐鲁番黑羊肌肉生长发育、产肉性能关联性的研究》文中指出吐鲁番黑羊俗称“托克逊黑羊”。吐鲁番黑羊羊肉品质优异，是值得推广的新肉羊品种，但目前吐鲁番黑羊的分子遗传学方面的研究比较少。本研究以吐鲁番黑羊为研究对象对，产肉性能有关的MSTN/Smad信号通路功能基因进行了mRNA水平上的表达量测定。本文主要研究内容如下：①采用实时荧光定量PCR技术分析对吐鲁番黑羊MSTN、Smad2、 Smad3、Smad4、TGFBR1及TGFBR2基因1-6月龄吐鲁番黑羊的腿肌和尾脂以及0月龄和6月龄吐鲁番黑羊股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌和尾脂等6种不同部位骨骼肌组织和肝、肺、脾、肠、心和肾等6种内脏组织的mRNA表达水平进行分析，了解MSTN/Smad信号通路基因的时空表达特征和表达模式。②采用常规方法和组织学方法测定0-6月龄肌肉生长发育指标（肌纤维数量和肌纤维面积）和产肉性能指标，分析吐鲁番黑羊肌肉生长发育规律及其与相互之间的差异，探讨MSTN/Smad信号通路与肌肉生长发育及产肉性能的关系。研究结果显示：1)0月龄不同部位组织经过内参基因校正后，其中TGFBR1基因在肺组织中没有表达以外此基因和MSTN、Smad2、 Smad3、Smad4及TGFBR2基因在股二头肌、股三头肌、半腱肌、半膜肌、背最长肌、尾脂、肝、肺、脾、肠、心、肾等不同组织中均有表达。2)0-6月龄的腿肌和尾脂MSTN/Smad信号通路基因在腿肌和尾脂组织中均有表达，不同月龄对于MSTN/Smad信号通路基因在腿肌和尾脂中的表达量有影响；MSTN/Smad信号通路基因在16月龄的表达量没有出现随着月龄的增加而一直增加或下降的趋势。3)对MSTN、Smad2、Smad3、Smad4、TGFBR1、TGFBR2基因在在16月龄吐鲁番黑羊肌肉中表达量进行了相关性分析。结果发现，Smad2基因表达量跟Smad3基因的表达量呈极显着的正相关（r=0.905， P <0.01），Samd2基因的表达量MSTN、Smad4与基因的表达量呈显着负相关（r=-0.914， P <0.05）和（r=-0.957， P <0.05），MSTN与Smad2、TGFBR1、TGFBR2基因都无显着相关（P>0.05）；Smad3基因表达与Smad4表达呈显着的正相关（r=0.848， P <0.05）。4)通过MSTN、Smad2、Smad3、Smad4、TGFBR1及TGFBR2基因与体重、体高、体长、胸围、管围、胴体、屠宰率之间进行相关性分析。结果发现，MSTN基因表达量与体重呈显着的负相关（r=-0.993， P <0.05），与体高、体长、胴体重、屠宰率之间无显着相关（P>0.05）；与管围之间存在极显着负相关（r=-0.957，P <0.01）；Smad2基因表达量与屠宰率呈显着负相关（r=-0.918，P <0.05），与体重、体高、体长、胸围、管围、胴体重都无显着相关（P>0.05）。Smad3基因与体重、体高、体长、胸围、管围、胴体和屠宰率都无显着相关（P>0.05）。Smad4、TGFBR1、TGFBR2表达与体高、体长、胸围、胴体重和屠宰率都没有显着相关（P>0.05）。
陈燕[10]（2014）在《利用基因剔除小鼠模型研究MrgF和Agk的生物学功能》文中认为第一部分孤儿G蛋白偶联受体MrgF在伤害性感受中的作用研究利用小鼠基因敲除技术,从整体动物水平来研究基因功能、人类疾病发病机制、胚胎发育过程和寻找新的药物靶点,已成为现代生物学各个研究领域最常用的技术手段之一。孤儿G蛋白偶联受体MrgF属于Mas相关G蛋白偶联受体家族成员之一,其配基和生物学功能未知。该家族大部分成员的mRNA特异性地选择分布于与痛觉产生和传导相关的感觉传入神经元上,提示该家族受体可能参与了对疼痛的感受和调节的神经回路。我们在前期实验中通过大量的文献阅读和生物信息学分析,成功建立了MrgF基因剔除小鼠。通过一系列的行为学实验,发现MrgF基因剔除小鼠与同窝野生型小鼠相比对外周热痛觉和痒觉的感受没有显着性差异,而在辣椒素和福尔马林诱导的炎性痛模型上与正常野生型小鼠相比有显着性改变,表现出对伤害性疼痛耐受增加,痛敏水平降低。进一步的研究中显示MrgF受体的表达特异性地分布于小脑的浦肯野细胞和脊髓背根神经节感受神经元上。背根神经节内Creb介导的磷酸化水平影响了疼痛相关c-fos和Penk基因的表达。在疼痛产生中发挥重要作用的Runx1、电压门控钠通道Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9在MrgF基因剔除小鼠都发生了显着性下降。实验结果显示MrgF受体在伤害感受中扮演着重要的角色,进一步补充了对Mrgs受体家族功能的研究。第二部分Agk基因与线粒体病的相关性研究线粒体病是由于线粒体DNA或细胞核DNA遗传缺损,引起线粒体结构或功能的缺陷致使ATP合成障碍、能量来源不足导致的一组疾病的表现。疾病的症状复杂多样,确诊困难,目前没有有效的治疗方法。通过携带有线粒体DNA突变或细胞核DNA突变的线粒体病小鼠模型研究线粒体功能障碍与疾病的因果关系,对发现新的治疗线粒体病的方法有重要意义。Sengers综合征（MIM 212350）是一类由细胞核基因AGK突变引起的线粒体病,为常染色体隐性遗传性疾病。该病的主要临床症状表现为先天性白内障、肥厚性心肌病、骨骼肌病变、运动耐受力缺乏以及乳酸酸中毒。AGK基因结构的改变产生线粒体病的分子机制目前仍不是很明确。我们通过条件性基因剔除技术建立了Agk条件性基因剔除小鼠,并进一步通过生殖系统表达的Cre小鼠实现了Agk基因的全身性敲除。Agk基因剔除纯合子小鼠心肌、骨骼肌表现出与人类Sengers综合征相似的组织病理改变,出现了线粒体氧化磷酸化水平下降和线粒体结构功能受损,但没有出现Sengers综合征的先天性白内障表型。基因剔除纯合子小鼠MEF细胞线粒体膜电位下降,提示Agk基因缺失导致的细胞异常凋亡,与Sengers综合征的发生密切相关。Agk基因剔除小鼠的建立,有助于我们从整体动物水平阐明线粒体病发生、发展的生理、病理机制,并可为寻找新的药物靶点提供了实验基础。
二、Smad3基因剔除小鼠6月龄的生物学特性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Smad3基因剔除小鼠6月龄的生物学特性研究（论文提纲范文）
（1）儿童早期超重肥胖的孕期相关因素及DNA甲基化机制研究（论文提纲范文）
| 全文缩写词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 孕前体重状态、孕期血压状态与婴儿期12月龄体重状态的关联 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 研究内容及方法 |
| 1.3 研究结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 创新性与局限性 |
| 第二部分 孕前超重肥胖、母乳喂养持续时间与学龄前儿童超重肥胖的关联 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 研究内容及方法 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 创新性与局限性 |
| 第三部分 学龄前儿童超重肥胖的脐血DNA甲基化机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 研究内容及方法 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 创新性与局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 儿童早期超重肥胖的孕期相关因素与 DNA 甲基化机制进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）小鼠TGFβ-Smad2/3信号通路在心肌梗死后心脏重构中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 小鼠成纤维细胞特异性Smad2和Smad3对机体稳态和正常心脏基线结构功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 小鼠心肌细胞特异性Smad2和Smad3对机体稳态和心脏基线结构功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 肌成纤维细胞特异性Smad2和Smad3对心肌梗死后心脏修复和重构的作用差异及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 论文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 成纤维细胞及生长转化因子在心肌梗死后心脏重构中的作用机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）不同年龄骨骼肌卫星细胞的分化能力及调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 骨骼肌卫星细胞研究概述 |
| 1.2.2 骨骼肌卫星细胞的来源 |
| 1.2.3 骨骼肌卫星细胞发育及分化过程的研究 |
| 1.2.4 骨骼肌卫星细胞的自我更新特性以及在肌纤维再生过程中的作用 |
| 1.2.5 骨骼肌卫星细胞的功能受个体年龄因素的影响 |
| 1.2.6 骨骼肌卫星细胞发育的相关通路研究 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 本研究的技术路线 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 动物实验方案 |
| 2.3.1 试剂配制 |
| 2.3.2 动物体内药物抑制实验 |
| 2.3.3 动物肌肉损伤实验 |
| 2.4 免疫组织化学 |
| 2.4.1 石蜡切片制作 |
| 2.4.2 组织免疫荧光技术 |
| 2.4.3 苏木精-伊红染色法(H&E染色) |
| 2.5 骨骼肌卫星细胞分离技术(组织块消化法) |
| 2.5.1 试剂配制 |
| 2.5.2 细胞分离步骤 |
| 2.6 细胞处理 |
| 2.6.1 siRNA转染 |
| 2.6.2 细胞药物抑制实验 |
| 2.7 细胞免疫荧光技术 |
| 2.8 蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting) |
| 2.8.1 试剂配制 |
| 2.8.2 抗体 |
| 2.8.3 总蛋白质的提取 |
| 2.8.4 蛋白质免疫印迹实验步骤 |
| 2.9 RNA的提取与检测 |
| 2.9.1 RNA的提取 |
| 2.9.2 RNA的质量检测 |
| 2.10 实时荧光定量PCR(Q-PCR) |
| 2.11 转录组分析 |
| 2.11.1 总RNA的提取与纯化 |
| 2.11.2 总RNA测序 |
| 2.11.3 转录组数据分析 |
| 2.11.4 相关基因网络图的绘制 |
| 2.12 其他与生物信息学相关的查阅工具 |
| 2.13 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 出生后骨骼肌发育过程中卫星细胞marker基因的动态表达模式 |
| 3.1.1 PAX7 的表达模式分析 |
| 3.1.2 MYF5,MYOD以及myogenin的表达模式分析 |
| 3.2 在骨骼肌发育过程中卫星细胞的分化能力显着下降 |
| 3.2.1 卫星细胞的分离培养及鉴定 |
| 3.2.2 卫星细胞分化能力的评估 |
| 3.3 不同时期卫星细胞的差异表达基因鉴定 |
| 3.4 TGFβ2和TGFβ3 可以抑制卫星细胞的分化 |
| 3.5 FGFR4 可以促进卫星细胞的分化 |
| 3.6 WNT9a可以抑制卫星细胞的分化 |
| 3.7 TGFβ2、FGFR4 以及WNT9a通过影响卫星细胞的激活状态来影响肌源性分化过程 |
| 3.8 TGFβ2、FGFR4 以及WNT9a蛋白之间的相互调控关系 |
| 3.9 TGFβ2 的体内药物抑制实验 |
| 3.9.1 抑制TGFβ2 后相关蛋白的表达变化 |
| 3.9.2 抑制TGFβ2 可以促进骨骼肌的再生 |
| 3.9.3 体内抑制TGFβ2 对离体培养的卫星细胞的分化能力以及相关蛋白表达的影响 |
| 3.10 猪骨骼肌卫星细胞发育的初步研究 |
| 3.10.1 骨骼肌发育过程中卫星细胞marker基因的动态表达模式 |
| 3.10.2 猪骨骼肌卫星细胞的分离培养及分化检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 卫星细胞marker基因在骨骼肌发育过程中的表达模式分析 |
| 4.2 在骨骼肌发育过程中卫星细胞分化能力的评估 |
| 4.3 不同年龄小鼠卫星细胞差异表达基因的鉴定 |
| 4.4 TGFβ2、WNT9a和 FGFR4 在卫星细胞发育过程中发挥的作用 |
| 4.5 TGFβ2、WNT9a和 FGFR4 蛋白之间的相互调控关系 |
| 4.6 对猪骨骼肌卫星细胞发育的初步研究 |
| 5 小结 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的创新点 |
| 5.3 本研究不足之处与进一步工作建议 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文题录 |
| 致谢 |
（4）秦川牛Smad2和Smad3基因转录调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 成肌细胞分化研究进展 |
| 1.2.1 成肌细胞分化的起源 |
| 1.2.2 成肌细胞分化的分子调控机制 |
| 1.3 脂肪细胞分化研究进展 |
| 1.3.1 脂肪细胞分化的起源 |
| 1.3.2 脂肪细胞分化的分子调控机制 |
| 1.4 Smads家族 |
| 1.4.1 Smads家族蛋白的发现和命名 |
| 1.4.2 Smads家族蛋白的分类 |
| 1.4.3 Smads家族蛋白的结构 |
| 1.4.4 Smads家族蛋白的作用 |
| 1.4.5 Smad2和Smad3之间的比较 |
| 1.5 转化生长因子β信号通路 |
| 1.5.1 TGF-β信号通路的组成 |
| 1.5.2 TGF-β信号通路的调控机制 |
| 1.5.3 TGF-β信号通路对骨骼肌和脂肪作用的研究进展 |
| 1.6 腺病毒载体系统 |
| 1.6.1 腺病毒载体的结构 |
| 1.6.2 腺病毒载体的分类 |
| 1.6.3 腺病毒载体的优点 |
| 1.6.4 腺病毒载体构建常用的方法 |
| 1.7 RNAi |
| 1.8 本研究的目标、意义和内容 |
| 1.8.1 研究的目的和意义 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 第二章 腺病毒介导Smad3基因在秦川牛成肌细胞和前体脂肪细胞的表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Smad3基因组织表达谱分析 |
| 2.2.2 秦川牛Smad3基因CDS区的克隆及鉴定 |
| 2.2.3 牛Smad3基因过表达腺病毒载体的构建与鉴定 |
| 2.2.4 牛Smad3基因干扰腺病毒载体的构建与鉴定 |
| 2.2.5 重组腺病毒的包装、扩增及滴度测定 |
| 2.2.6 腺病毒感染细胞最佳MOI值测定 |
| 2.2.7 超表达效率和干扰效率检测 |
| 2.2.8 Smad3基因抑制秦川牛成肌细胞和前体脂肪细胞分化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Smad3基因的转录调控研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 秦川牛不同月龄肌肉和脂肪组织中Smad3基因的组织表达谱分析 |
| 3.2.2 Smad3基因的启动子区序列扩增 |
| 3.2.3 Smad3基因启动子逐段缺失报告载体构建 |
| 3.2.4 Smad3基因缺失片段启动子荧光素酶活性检测 |
| 3.2.5 Smad3基因核心启动子结合的转录因子预测结果 |
| 3.2.6 KLF6-KLF15、KLF7和MZF1转录因子调控Smad3基因的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Smad2与Smad3之间调控关系的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Smad2基因和Smad3基因序列生物学分析 |
| 4.2.2 Smad2和Smad3基因在成肌细胞分化过程中mRNA相对表达量.. |
| 4.2.3 过表达和干扰Smad3基因影响Smad2基因的表达 |
| 4.2.4 Smad2基因转录起始位点的确定 |
| 4.2.5 Smad2基因的启动子序列PCR扩增 |
| 4.2.6 Smad2基因启动子逐段缺失报告载体构建 |
| 4.2.7 Smad3转录因子不能直接调控Smad2基因启动子转录活性 |
| 4.2.8 Smad2基因启动子缺失片段荧光素酶活性检测 |
| 4.2.9 Smad2基因核心启动子区结合的关键转录因子预测 |
| 4.2.10 C/EBPα和C/EBPβ转录因子调控Smad2基因启动子转录活性 |
| 4.2.11 C/EBPα和C/EBPβ转录因子调控Smad2基因表达 |
| 4.2.12 Smad3基因调控C/EBPα和C/EBPβ转录因子的表达 |
| 4.2.13 Smad3基因调控Smad2基因的表达通过转录因子C/EBPα和C/EBPβ |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 实验结论 |
| 5.2 创新点 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）ALK5信号通路在关节软骨稳态维持和骨关节炎中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 ALK5信号通路在关节软骨稳态维持和骨关节炎中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第二章 软骨细胞内可诱导性敲除Alk5基因导致小鼠骨关节炎样改变 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 ALK5信号在关节软骨表层功能维持及骨关节炎中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果及分析 |
| 3.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 转化生长因子-β信号通路在骨关节炎中作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）巴什拜羔羊MSTN/Smad信号通路基因表达、DNA甲基化与产肉性能关联性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 (Abbreviations) |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 绵羊的研究进展 |
| 1.2 巴什拜羊简介 |
| 1.3 MSTN基因介绍 |
| 1.4 DNA甲基化研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 MSTN/Smad信号通路基因表达量分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 MSTN/Smad信号通路基因表达量与生长性状相关性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 MSTN/Smad信号通路基因表达量与屠宰性状相关性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 MSTN基因表达量与DNA甲基化相关性研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）MSTN/Smad信号通路基因在哈萨克羔羊上的表达规律研究与相关性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 绵羊产业发展现状 |
| 1.2 哈萨克羊简介 |
| 1.3 MSTN基因简介 |
| 1.4 MSTN/Smad通路简介 |
| 1.5 实时荧光定量PCR技术 |
| 第2章 新生哈萨克羔羊试验研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 1-6 月龄哈萨克羔羊试验研究与相关性分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 6 月龄哈萨克羔羊试验研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 全文结论 |
| 第6章 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）MSTN/Smad信号通路与阿勒泰羊肌肉生长发育、产肉性能关联性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 (Abbreviations) |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 国内外绵羊 MSTN 基因研究现状 |
| 1.2 阿勒泰羊的概述 |
| 1.3 肌肉生长抑制素（MSTN）基因 |
| 1.4 Smad 蛋白 |
| 1.5 实时荧光定量 PCR 技术 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 阿勒泰羊羔羊 MSTN mRNA 表达的定量研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 阿勒泰羊羔羊 Smad2,Smad3,Smad4 mRNA 表达的定量研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 阿勒泰羊羔羊 TGFBR1,TGFBR2 mRNA 表达的定量研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 MSTN/Smad 信号通路与阿勒泰羊产肉性能的关联性分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）MSTN/Smad信号通路与吐鲁番黑羊肌肉生长发育、产肉性能关联性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语英文中文 |
| 第1章 我国绵羊品种的概况及肌肉生成的分子遗传学机制 |
| 1.1 我国绵羊品种 |
| 1.2 新疆绵羊品种概况 |
| 1.3 吐鲁番黑羊的现状 |
| 1.4. 骨骼肌的简介 |
| 1.5 TGF-β/Smads 信号通路 |
| 1.6 肌肉生长抑制素的概述 |
| 1.7 实时荧光定量 PCR 技术 |
| 1.8 本研究的目的意义 |
| 第2章 MSTN/Smad 信号通路基因在 0 月龄吐鲁番黑羊羔羊不同部位组织的 mRNA 表达水平研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 吐鲁番黑羊 MSTN 基因表达的发育性变化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 吐鲁番黑羊 Smad2、Smad3、Smad4 基因表达的发育性变化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 吐鲁番黑羊 TGFBR1、TGFBR2 基因表达的发育性变化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 MSTN/Smad 信号通路与吐鲁番黑羊肌肉生长发育、产肉性能的关联性分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 谢辞 |
| 作者简介 |
（10）利用基因剔除小鼠模型研究MrgF和Agk的生物学功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 孤儿G蛋白偶联受体MrgF在伤害性感受中的作用研究 |
| 前言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Agk基因与线粒体病的相关性研究 |
| 前言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
| 攻读学位期间承担的科研项目 |
四、Smad3基因剔除小鼠6月龄的生物学特性研究（论文参考文献）
- [1]儿童早期超重肥胖的孕期相关因素及DNA甲基化机制研究[D]. 孙嘉鸿. 华中科技大学, 2020
- [2]小鼠TGFβ-Smad2/3信号通路在心肌梗死后心脏重构中的作用及机制研究[D]. 黄帅波. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(10)
- [3]不同年龄骨骼肌卫星细胞的分化能力及调控机制研究[D]. 张维娅. 华中农业大学, 2018
- [4]秦川牛Smad2和Smad3基因转录调控研究[D]. 张乐. 西北农林科技大学, 2018(11)
- [5]ALK5信号通路在关节软骨稳态维持和骨关节炎中的作用及机制研究[D]. 王权. 第三军医大学, 2017(10)
- [6]巴什拜羔羊MSTN/Smad信号通路基因表达、DNA甲基化与产肉性能关联性研究[D]. 姚力丹. 新疆农业大学, 2016(03)
- [7]MSTN/Smad信号通路基因在哈萨克羔羊上的表达规律研究与相关性分析[D]. 祖玲玲. 新疆农业大学, 2015(06)
- [8]MSTN/Smad信号通路与阿勒泰羊肌肉生长发育、产肉性能关联性的研究[D]. 吐来力江·哈木太. 新疆农业大学, 2014(04)
- [9]MSTN/Smad信号通路与吐鲁番黑羊肌肉生长发育、产肉性能关联性的研究[D]. 安外尔·热合曼. 新疆农业大学, 2014(04)
- [10]利用基因剔除小鼠模型研究MrgF和Agk的生物学功能[D]. 陈燕. 上海交通大学, 2014