一、噬菌体表面表达抗汉坦病毒衣壳蛋白单链抗体的研究（论文文献综述）
李卓[1]（2017）在《人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定》文中研究表明肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是一种以发热、出血、急性肾功能损害为特征的急性传染病,通常由汉坦病毒（Hantaviruses,HTV）感染引起,在世界范围内广泛分布,中国是世界上发病人数最多的国家,而陕西省为我国HFRS的高发地区之一。长期以来,我国通过对重点疫区人群进行疫苗接种预防HFRS的发生,因此需要对HFRS疫苗的免疫效果进行定期评价。抗汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）抗体特别是中和抗体（neutralizing antibody,NAb）可直接与HTNV结合,参与机体对病毒的免疫清除。鼠源性抗体因为异源性反应很难应用于人体,目前很少有人源性抗体用于HFRS的紧急预防和治疗,因此,制备具有潜在中和活性的人源性抗体十分必要。本研究在评价了HFRS抗体检测试剂盒和疫苗接种者免疫接种效果的基础上,建立了疫苗接种者的B淋巴母细胞系（Blymphoblastoid cell lines,BLCLs）。将NAb阳性的疫苗接种者和HFRS患者的BLCLs抗体基因重组到噬菌体载体上,建立噬菌体Fab抗体库,筛选HTNV特异性抗体和中和活性抗体,经表达、纯化和鉴定获得了具有潜在中和活性的人源性抗HTNV Fab抗体,为HFRS的紧急预防、治疗以及疾病的诊断提供新的途径。为此,我们进行了以下实验:第一部分:HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化首先,基于HTNV抗体检测的需要,评价了国产与进口HFRS IgG抗体ELISA试剂盒的性能,结果表明国产试剂盒敏感性高,进口试剂盒特异性强。然后,采集疫苗接种者的血液标本,应用EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）转化技术建立了70株疫苗接种者BLCLs,检测了疫苗接种者的血清标本和BLCLs培养上清中HTNV特异性抗体,评价了咸阳地区HFRS疫苗接种的免疫效果。疫苗接种人群血清中HTNV核蛋白（nucleocapsid protein,NP）特异的IgM、IgG抗体以及HTNV NAb的水平和阳性率明显升高,三者具有较好的相关性;最强烈的抗体分泌反应发生在接种疫苗后3个月,与血清检测结果一致,表明针对HFRS的疫苗免疫接种计划在中国西北地区人群中可以有效地诱导体液免疫应答。最后,明确了NAb阳性的BLCLs（占44%）并对BLCLs进行了克隆化,NAb阳性的35株BLCLs（HFRS疫苗接种者与科室保存的患者BLCLs）为构建具有潜在中和活性的噬菌体抗体库提供基因资源;BLCLs的成功克隆化有望为单克隆抗体制备开辟新的途径。第二部分:抗HTNV噬菌体Fab抗体库的构建和筛选提取NAb阳性BLCLs的mRNA并合成cDNA,应用噬菌体展示技术建立了库容量为1.3×109的抗HTNV噬菌体Fab抗体库,Fab的阳性插入率为95%,抗体序列正确率为68%。以HTNV全抗原为靶分子,用固相筛选法经过4轮“吸附-洗脱-扩增”,对洗脱的噬菌体滴度进行测定,结果显示回收率明显增加。筛选前随机克隆测序正确率为68%,第4轮筛选后随机克隆测序正确率为81%;筛选前多样性为95%,第4轮筛选后多样性为31%。经Phage-ELISA检测,最终从第3、4轮筛选的50个克隆中选出了15个序列正确的特异性强的HTNV噬菌体Fab抗体。通过此部分实验,我们成功构建了抗HTNV噬菌体Fab抗体库并对其进行了筛选。第三部分:人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达和中和活性检测将第二部分筛选获得的特异性HTNV Fab噬菌体转染Ecoli.HB2151,诱导表达制备可溶性HTNV Fab抗体,并应用亲和层析法进行纯化。表达及纯化产物经还原电泳检测分析,发现在约25kDa处出现明显目的条带,与Fab的预期大小相符。间接ELISA表明这些可溶性HTNV Fab抗体均能与HTNV特异性结合。病毒中和实验结果显示3个Fab抗体具有中和活性。测序分析了15个Fab抗体轻链和重链可变区氨基酸序列,结果表明这些Fab抗体分属于6个抗体家族,大多数轻链和重链属于V3和V4家族,以IGKV3-20*01、IGHV4-59*01家族为主。同源性分析显示,3个具有中和活性的Fab抗体基因序列来自人胚系基因,未发现与其完全相同的抗体基因序列。第四部分:HTNV感染巨噬样人急性单核细胞白血病细胞系（differentiated THP-1,dTHP-1）诱导内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）反应HTV感染机体后可诱导强烈的免疫应答,但其致病机制尚未明确,我们从ER stress的角度,初步观测了HTNV感染对dTHP-1内质网应激的影响。检测结果显示HTNV感染dTHP-1细胞后,其内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白（78kDa glucose-regulated protein,GRP78）的mRNA和蛋白水平、X盒结合蛋白1（X box-binding protein 1,XBP-1）的mRNA水平均明显升高,表明HTNV感染可以诱导dTHP-1启动ER Stress。而在病毒感染后2h,C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）的mRNA水平在病毒感染组与未感染组无明显差异;凋亡检测结果显示,HTNV感染dTHP-1 12h后细胞未发生明显凋亡;这些结果提示HTNV诱导的ER Stress在病毒感染早期（12h内）并未直接导致dTHP-1凋亡。
杨栋强,白雪帆[2]（2012）在《噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用》文中指出噬菌体展示技术是近年发展起来的新技术,在研究蛋白质与蛋白质之间、抗原抗体之间的相互作用、新药开发、疾病诊断、疫苗研制以及病毒研究等方面具有广泛应用。文中就噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用现状作一综述。
杨栋强[3]（2012）在《汉坦病毒β3整合素受体拮抗剂的筛选及其特性的初步鉴定》文中进行了进一步梳理肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome, HPS）均是由汉坦病毒属病毒（hantaviruses）引起的自然疫源性疾病，目前全世界每年仍有5～10万HFRS和HPS病例发生，病死率因感染的病毒型别而异，自0.1%～40%不等[1-3]。我国是当今世界上受HFRS危害最为严重的国家之一，自建国后至2010年年末，已累计发现上报出血热病例近160万，占到同期世界上总发病例数的83%以上[4]。由于HFRS多散在发生，且早期主要在农村和城镇周边中小医院救治，难以组织开展较大样本、随机、双盲和对照的临床研究，对各种治疗药物和治疗方案的评价仍缺乏高质量的循证医学的证据，远远落后于乙型和丙型病毒性肝炎等高发传染病。目前临床上抗汉坦病毒感染的治疗药物仍限于利巴韦林和干扰素α等少数品种。且时至今日，美国FDA仍未批准包括利巴韦林等在内的任何针对HFRS和HPS的特效治疗药物[5]。因此，深入探讨汉坦病毒致病的分子机理，进而寻找有效的治疗靶点和抗病毒药物仍是HFRS防治的重要任务。抗微生物肽是近些年发现的新型活性生物分子。短肽或寡肽类分子具有分子量小、抗原性弱、活性强、穿透力强、易于制备且比较容易与靶分子结合等优点，是当前治疗肿瘤和感染等疾病的有效靶向药剂。功能性多肽的筛选工作量十分浩大，需要高通量的筛选技术，而噬菌体展示技术恰好可满足该项工作的需要[6-8]。已知病毒感染靶细胞的第一步是病毒进入（entry）细胞质内，通常需要病毒吸附蛋白或表位与靶细胞的特定受体结合[9]。近年研究表明β3整合素是汉坦病毒感染靶细胞的关键受体，并且可能参与了血管屏障功能的维持，封闭或阻断β3整合素已成为抗汉坦病毒治疗研究的重要策略之一[10-11]。本研究在既往对β3整合素和汉坦病毒感染的基础上，应用噬菌体展示技术，以β3整合素为靶分子，对噬菌体七肽展示库进行8轮亲和筛选，获得结合β3整合素的噬菌体蓝色克隆，挑取其中结合力比较强的克隆，测得插入其中的外源性DNA序列，并推导出各自对应的多肽序列，然后应用生物信息学软件分析多肽序列的特性，同时行同源性分析，从而找出特异性结合且与比对序列有相似生物学特性、较高同源性的多肽序列。继之请生物公司合成这些多肽序列，用病毒感染阻断实验对这些多肽的抗汉坦病毒的活性进行初步测试，为进一步设计和获取高活性的抗汉坦病毒短肽奠定了基础。本课题研究内容和结果如下：1.细菌生长的测定用标有不同时间的锥形瓶和摇菌管分别培育大肠埃希菌E.coliER2738，以用于噬菌体的扩增，培养相应的时间后用分光光度计测定600nm波长的OD值，最终找出最佳摇菌时间。结果发现扩增噬菌体时，最佳摇菌时间为2.5h；测滴度时，最佳摇菌时间为5.5h。2.噬菌体肽库的淘筛应用亲和富集法对噬菌体7肽库进行8轮筛选，β3整合素用量逐轮减少，并逐轮缩短结合时间，逐轮延长洗涤时间和不断增加洗涤液中Tween-20的浓度，以筛选得到高亲和力、特异性强的噬菌体克隆。结果显示每轮淘洗噬菌体数量都有较高的富集，淘筛过程中通过用不同梯度浓度的β3整合素靶分子来改变选择强度，在经过8轮淘筛后，我们筛选出与β3整合素具有较高亲和力和较高活性的短肽。3.融合基因的测序和序列分析比对随机挑取80个克隆，经过DNA测序，得到5条重复率较高结构不同的寡肽序列，分别为TGVKGPG、LPLTPLP、KLTSSPT、SPVGPLP和DHRNHLV。将上述多肽序列与汉滩型病毒囊膜糖蛋白氨基酸序列比对，发现5条短肽与汉滩病毒的囊膜糖蛋白具有较高的同源性。运用生物信息学手段分析这些短肽，发现他们具有与同源序列相似的等电点和典型的疏水性。结论：通过对噬菌体展示肽库的淘筛，获得若干与β3整合素结合并具有潜在抗汉滩病毒的多肽，为进一步设计和获取高活性的抗汉坦病毒短肽奠定了基础。
张晓晓[4]（2012）在《抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达》文中研究说明汉坦病毒（Hantavirus）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，根据其抗原性和基因结构的不同，可分为10多个型别。Hantavirus可引起两种类型的急性传染病，一类以高热、弥漫性肺部炎症和急性呼吸衰竭为主要表现，称为汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS），另一类以出血、高热、肾功能损害为主要表现，称为肾综合征出血热（hemorrhagic fever withrenal syndrome，HFRS）。迄今为止，在我国尚未发现HPS的报道，但我国是世界上受HFRS危害最严重的国家。该病在我国具有发病人数多、流行范围广、死亡率高等特点。此外，Hantavirus还是一种潜在的生物战剂，有被恐怖分子利用的可能。而且目前临床上尚未有能特异治疗HFRS的有效药物，因而更增加了HFRS的艰巨性和长期性。用疫苗进行主动免疫和用抗体进行被动免疫治疗是当前预防和治疗病毒性疾病的重要措施。近年来国内外已研制出Hantavirus的纯化细胞培养灭活疫苗和纯化乳鼠脑灭活疫苗，但这两类疫苗在试用过程中表现出明显不足。使用具有中和活性的单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）是在体内、外抑制或阻断病毒感染的有效的治疗方法之一。早在上世纪八十年代中期本实验室即研制出具有较高中和活性和保护性的抗Hantavirus mAb，并在国家863计划支持下研制注射用抗HFRS病毒单克隆抗体制剂，现已完成临床试验。由于鼠源性mAb对人有潜在的免疫原性，可能引起超敏反应等副作用，因此，本课题拟在此基础上对抗Hantavirus鼠源性mAb3G1进行人源化改造，应用基因重组技术，构建鼠/人嵌合抗体基因，在哺乳动物细胞中表达并筛选出稳定高效表达嵌合抗体的细胞系，纯化表达的嵌合抗体并鉴定其生物学特性，为进一步研制特异治疗HFRS的新型制剂奠定基础。1.构建抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的真核表达载体以pCI-neo-M和pCI-M载体为基础，用ease2.1-cmv5分别替换pCI-neo-M和pCI-M的启动子MARs-mCMV改建真核表达载体，改构后的载体命名为pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M；获得抗HTNV mAb3G1的鼠/人嵌合轻链、重链基因，并分别将其克隆到pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M真核表达载体中，经双酶切鉴定后分别获得阳性重组质粒pCI-neo-ease2.1-cmv5-vh-M和pCI-ease2.1-cmv5-vl-M，测序后证实载体构建成功。2.稳定表达抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体CHO-K1细胞系的建立与筛选将上述含抗Hantavirus mAb3G1鼠/人嵌合重链和轻链基因表达载体的JM-109扩大培养后提取质粒，用紫外分光光度计定量,用脂质体法按LipofectamineTM2000说明书转染野生型CHO-K1细胞，在氨甲喋呤（MTX）和G418双重筛选压力下筛选稳定、高效表达抗Hantavirus嵌合抗体的细胞株，ELISA方法测定重组蛋白的表达。3.抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的表达、鉴定及生物学活性检测扩大培养上述筛选出的稳定、高效表达嵌合抗体的细胞系，收集其培养上清，超滤浓缩、除盐后，用Protein A HP Spin Trap纯化试剂盒纯化。纯化后进行SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明成功表达了抗Hantavirus鼠/人嵌合抗体。通过体外中和实验检测其中和活性，结果显示该嵌合抗体具有良好的中和活性，其中和活性与亲本抗体的中和活性相近。本实验为抗Hantavirus鼠/人嵌合抗体的进一步研究和临床应用奠定了基础。
刘兵,史俊岩,王舰,王美莲,王斯,郑兰艳,牟玲,罗恩杰[5]（2009）在《双单链抗体夹心法诊断汉坦病毒感染的初步研究》文中提出目的制备检测汉坦病毒感染的双单链抗体夹心ELISA诊断试剂,并予以评价。方法以抗汉坦病毒NP抗原单链抗体包被反应板,以辣根过氧化物酶（HRP）标记大肠埃希菌表达的抗NP抗原单链抗体,并制成双单链抗体夹心诊断试剂,检测56份早期肾综合征出血热（HFRS）患者血清及66份非HFRS对照血清。结果56份HFRS患者血清中,检测出29例阳性,阳性率为51.8%,对照组66例,检测结果均为阴性。结论研制的试剂特异性好,价格低廉。
刘兵,史俊岩,王舰,王美莲,王斯,郑兰艳,牟玲,罗恩杰[6]（2009）在《酶斑点杂交法与双抗体夹心法检测汉坦病毒感染的比较》文中指出目的将酶标抗汉坦病毒NP抗原单链抗体应用于酶斑点杂交法和双抗体夹心法,检测汉坦病毒感染,探索价格低廉早期HFRS诊断试剂。方法以戊二醛偶联辣根过氧化物酶和抗汉坦病毒NP抗原单链抗体,制备酶标单链抗体,并应用于酶斑点杂交法和双抗体夹心法中,检测56份早期HFRS患者血清及66份阴性对照血清。结果56份HFRS患者血清中,双抗体夹心法检测出29例阳性,阳性率为51.79%,酶斑点杂交法检测出28例阳性,阳性率为50.00%,两方法检测66例阴性对照血清,结果均为阴性。统计学处理,两方法差异不显着。结论以酶标抗汉坦病毒NP抗原单链抗体制备的酶斑点杂交和双抗体夹心诊断试剂,均为稳定性好、假阳性率低、造价低廉、诊断可靠的诊断试剂。
刘兵,史俊岩,王舰,王美莲,王斯,郑兰艳,牟玲,罗恩杰[7]（2009）在《抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆与鉴定》文中研究说明目的将已筛选出的抗汉坦病毒核衣壳蛋白（NP）抗原单链抗体基因克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-scFv。方法提取含抗NP抗原单链抗体基因的T7噬菌体DNA,此为模板,PCR扩增单链抗体基因,BamHⅠ和SalⅠ双酶切,经连接酶与BamHⅠ和SalⅠ双酶切的表达载体pGEX-6p-1连接;重组DNA转化入宿主菌E.coliBL-21（DE3）,琼脂糖凝胶电泳初筛选阳性重组质粒,并用PCR法、双酶切法及DNA测序鉴定。结果重组质粒pGEX-6P-1-scFv经BamHⅠ和SalⅠ双酶切,片段大小分别为5 000 bp和750 bp,与预期值一致;重组质粒PCR产物大小为750 bp,与预期值一致;测定重组质粒序列,并与scFv序列比较,结果相一致。抗NP单链抗体基因序列克隆入表达载体pGEX-6p-1。结论成功构建了含抗汉坦病毒NP抗原单链抗体基因的重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv。
刘兵,史俊岩,王舰,王美莲,王斯,郑兰艳,牟玲,罗恩杰[8]（2009）在《抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析》文中研究表明诱导已构建的重组质粒pGEX-6P-1-scFv原核表达抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体,并用酶免疫实验检测单链抗体生物活性。用IPTG诱导重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv表达抗汉坦病毒NP单链抗体融合蛋白,经亲和层析纯化,并应用SDS-PAGE电泳检测单链抗体融合蛋白,应用酶免疫实验检测抗NP单链抗体生物学活性。SDS-PAGE电泳检测显示,原核重组质粒pGEX-6P-1-scFv已表达分子量约为56ku的单链抗体融合蛋白;酶免疫实验检测显示,单链抗体具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合的生物学活性。结果表明,已构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-scFv,能够成功表达具有与汉坦病毒NP抗原特异性结合生物学活性的单链抗体。
李铁军[9]（2008）在《抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及单链抗体的表达与特性研究》文中研究指明甲胺磷（O,S-二甲基硫代磷酰胺）是一种剧毒的有机磷类农药,由于较好的杀虫效果往往被违禁使用,危害严重,有必要进一步对其加强监测。免疫分析法具有灵敏、简便、快速等特点,在农药残留检测中具有突出的优势。目前虽有制备甲胺磷多克隆抗体和单克隆抗体的报道,但其抗体制备需进行动物免疫及昂贵的细胞培养设备,周期长,成本高。第三代抗体—重组抗体的出现为快速、低成本制备小分子化学农药抗体提供了新的途径。为此,本论文开展了抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及抗甲胺磷单链抗体的表达与特性研究,主要研究内容及结果如下：1 Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析利用活泼酯法将合成的甲胺磷半抗原β-（O,S-二甲基磷酰）氨基丙酸（HM3）与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联分别制备免疫原HM3-BSA和包被原HM3-OVA。将HM3-BSA按高（H）、中（M）、低（L）3个不同剂量组分别免疫Balb/c小鼠。抗血清分析结果表明,经过8次近6个月时间的免疫在高（H）剂量组中获得了1只良好免疫效果的H3号Balb/c小鼠。2抗体可变区基因的获得及抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建取H3号Balb/c免疫小鼠的脾细胞提取信使RNA（mRNA）,通过反转录PCR （RT-PCR）扩增出了大小约340bp和320bp的抗体重（VH）、轻链（VL）可变区基因片段。纯化回收的VH与VL基因在接近等摩尔浓度下,首先采用含有Linker接头片段的引物利用重叠延伸拼接法（SOE-PCR）将VH与VL基因片段组装成单链抗体（ScFv）基因片段,再用带有限制性内切酶位点的引物（5’端SfiⅠ,3’端NotⅠ）扩增含内切酶位点的ScFv基因,获得了大小约750bp的目的片段,纯化回收并分别用SfiⅠ和NotⅠ酶切消化后,与经SfiⅠ、NotⅠ双酶切过的噬菌粒载体pCANTAB5E连接,电转化大肠杆菌E.coli TG1,建成了库容约9.8×105的抗甲胺磷噬菌体单链抗体库。经对随机转化子质粒的PCR及HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定,该抗体库重组率高。BstNⅠ酶切图谱显示该噬菌体单链抗体库具有良好的多样性。3抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的筛选和鉴定借助辅助噬菌体M13K07的超感染,扩建了滴度约1.75×1013pfu/mL的抗甲胺磷噬菌体-ScFv表面展示文库。通过降低抗原包被浓度和增强洗脱力度的方法,以包被原HM3-OVA对展示库进行了五轮“吸附、洗脱、扩增”的富集筛选,结果显示,从第三轮开始,噬菌体回收率、多克隆噬菌体ELISA的OD值及阳性率均呈现上升趋势。从第5轮筛选后得到的细菌集落中分批随机挑选大量单克隆,经单克隆噬菌体ELISA及竞争ELISA进一步筛选鉴定,获得了6个特异性较强的抗甲胺磷噬菌体单链抗体阳性克隆,基因序列分析及Blast数据库检索表明所得6个阳性克隆的序列互不相同,均符合鼠源单链可变区抗体基因的结构和特征。4抗甲胺磷单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定将6个甲胺磷噬菌体阳性克隆提取噬菌粒分别转化琥珀终止非抑制型大肠杆菌E.coli HB2151, IPTG诱导过夜小量制备各克隆的可溶性单链抗体。收集细菌沉淀及培养上清,采用渗透休克法提取菌体细胞周质中的可溶性单链抗体,并对培养上清进行超滤浓缩。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,周质腔提取物及浓缩上清在分子量约30KD处明显出现一增粗条带,与单链抗体的预期分子量相符,而阴性对照菌中没有该条带。间接ELISA结果显示,6个克隆的细菌培养上清和周质腔提取物中的抗体均能与包被抗原反应,说明分泌型单链抗体得到了正确的折叠和表达。间接竞争ELISA初步分析6个克隆新鲜制备的周质腔提取物对游离甲胺磷的竞争抑制性,结果显示,6个克隆的表达产物对游离甲胺磷均具有不同程度的抑制作用,其中克隆Met-93的周质腔提取物抑制中浓度I50值最高（887.66μg/mL）,克隆Met-28D4的周质腔提取物I50值最低（146.74μg/mL）。以抗体表达的最优化条件对Met-28D4阳性克隆株进行摇瓶发酵（1L）大量制备纯化单链抗体,抗体产量约0.98 mg/L培养基。以纯化单链抗体为免疫试剂,初步建立了甲胺磷竞争ELISA分析法。该ELISA标准曲线的线性范围为1～500μg/mL, I50为118.69μg/mL,检出限120为3.36μg/mL;在该线性范围内,标准曲线的批内和批间变异系数分别为2.3%和4.8%,稻谷和小白菜样品中添加甲胺磷后的平均回收率分别为83.8%和87.0%。交叉反应结果显示,本研究制备的纯化Met-28D4单链抗体仅与乙酰甲胺磷有部分交叉反应（4.9%）,而与供试的其它5种有机磷农药（敌敌畏、乐果、甲拌磷、甲基对硫磷和水胺硫磷）的交叉反应率均小于0.1%,表明所制备的纯化单链抗体对甲胺磷的识别是高度特异的。抗体稳定性试验结果表明,在蛋白保护剂存在条件下,4℃保存下的纯化单链抗体其结合活性可维持约6-7周的时间,基本能满足短期内单链抗体研究的需要,但在大规模生产、应用等方面,就显得稳定性不够。5抗甲胺磷单链抗体在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质鉴定在巴斯德毕赤酵母P. pastoris （X-33）中分泌表达Met-28D4-ScFv。设计引物从Met-28D4-pCANTAB5E-ScFv上扩增Met-28D4-ScFv,亚克隆至P. pastoris表达载体pPICZαC,获得酵母表达质粒pPICZαC-ScFv。表达质粒pPICZαC-ScFv线形化后,电转化P.pastoris （X-33）。随机挑选转化子菌落进行PCR鉴定,结果显示,转化子的酵母染色体中均整合有外源ScFv基因。在抗性梯度筛选多拷贝整合菌株试验中,共获得5个在2000μg/mL ZeocinTM的YPDS选择平板上正常生长的菌落,表型鉴定结果均为甲醇利用快速型（Mut+）。对5个多拷贝Mut+型转化菌进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE结果显示,各菌株诱导48 h后在约30KD处均可见明显条带,72 h处表达量最大,各菌株表达量之间无明显差异；间接ELISA结果显示,各菌株诱导72h的表达产物具有较好的抗原结合活性。选其中一个稳定高表达的X-33-Pp-Met-28D4-1菌株进行优化诱导表达试验,优化后的条件为：本实验室30℃、250 rpm的振荡培养条件下,菌体接种量OD600nm =1.5,培养基pH值6.5,每24 h补加甲醇至终浓度1.00%,诱导时间72 h。经过优化条件下的诱导表达,单链抗体的表达量达25 mg/L,比Invitrogen公司推荐的诱导表达条件下的表达量高5 mg/L。对优化条件下的诱导表达产物进行纯化并进行竞争ELISA初步试验,结果表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体与游离甲胺磷具有较好的抗原结合特异性,其I50为93.52μg/mL,与大肠杆菌表达的单链抗体的性质基本接近；交叉反应结果显示,酵母表达纯化单链抗体与乙酰甲胺磷的交叉反应率为3.8%,与其它农药的交叉反应率均小于0.1%。稳定性试验表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体的稳定性比大肠杆菌表达的单链抗体的稳定性有了一定的提高。本论文研究结果为甲胺磷特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础,对开发其它小分子化学农药的重组抗体具有重要的理论价值和实践意义。
杨洁[10]（2008）在《抗体介导的siRNA靶向运输并抑制汉坦病毒复制的研究》文中进行了进一步梳理汉坦病毒是脂质被膜包裹的RNA病毒,可以持续感染啮齿类动物却不使其致病,而人在吸入含有病毒的气溶胶状的啮齿动物排泄物后可以被感染,引起肾综合征出血热（HFRS）和肺综合征（HPS）。目前,还没有针对汉坦病毒感染治疗的抗病毒药物,临床只限于对症和支持治疗。因此,寻找有效和特异的治疗汉坦病毒的新方法显得十分重要而迫切。RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA诱导的序列特异性的基因沉默机制。以致病基因为靶点的RNAi技术,可用于治疗包括肿瘤、感染性疾病和遗传病在内的各种疾病。抗病毒RNAi策略作为治疗方法的应用研究正备受关注,有多种基于该策略的方案正在进行临床试验。然而,尽管针对病毒基因的RNAi能够特异性地抑制病毒的复制,但小RNA的组织或细胞特异性转运却绝非简单易行。治疗性小干扰RNAs（siRNAs）面临着如何在体内被特异和有效地转运到靶细胞的难题。研究结果提示,体内细胞类型特异性的基因沉默可以通过siRNA与细胞类型特异性亲和配体或单克隆抗体结合而得以实现,即抗体指导的siRNA复合物通过内吞作用进入靶细胞,随后释放到细胞浆,通过RNAi路径,特异性地沉默靶基因的表达。与小分子碱性核酸结合蛋白融合的抗体片段是一种体内转运的有效工具,体内基因沉默的特异性、不引发非特异性免疫激活和全身毒性等特点促进了以治疗性RNAi的细胞类型特异性转运为基础的治疗方法的开发。本研究针对汉坦病毒76-118株的编码基因,以随机序列siRNA为阴性对照,设计合成了4种siRNAs,筛选出抗病毒效果最强的siRNA-HV2（命名为siHV）用于下一步研究。为确定抗体介导的siRNA是否可以特异性地将siRNA转运入汉坦病毒感染的细胞,在原核表达载体pET32a中表达了一种融合蛋白3G1scFv-CK-tP,它由汉坦病毒抗原特异性单链抗体（3G1scFv）与鱼精蛋白片段（第8-29位氨基酸）通过人CK连接而形成。诱导表达的此融合蛋白以可溶性表达为主,此融合蛋白明显保留有抗原结合活性,可以特异地结合胞膜上的病毒抗原,与细胞表面的抗原结合后可以特异性地内化入感染细胞的胞浆,且与转铁蛋白有相似的内化路径,即通过网格蛋白介导的内吞来实现的。此融合蛋白可以结合并转运siRNAs到汉坦病毒感染的细胞。先后用凝胶迁移阻滞实验和流式细胞仪进行检测,结果表明:3G1scFv-CK-tP具有与siRNA结合的能力,且这种结合能力存在着剂量依赖关系;DynabeadsTALON磁珠分析显示3G1scFv-CK-tP与siRNA之间量的结合关系为1分子3G1scFv-CK-tP可以结合约10分子siRNA;3G1scFv-CK-tP可以将FITC-siRNA特异性地运送到病毒感染的细胞。采用MTT方法测定细胞生长曲线,表明3G1scFv-CK-tP/siRNA对细胞生长没有毒性作用。在感染细胞中,此融合蛋白靶向转运siHV能够有效地抑制病毒的复制。结果表明:3G1scFv-CK-tP/siHV降低了病毒RNA和病毒抗原的水平,而且下降程度与siRNA呈剂量依赖性。在乳鼠颅内注射汉坦病毒76-118株以制备动物模型,然后腹腔注射3G1scFv-CK-tP/FITC-siRNA混合物,证实此融合蛋白能够特异地将siRNA转运入汉坦病毒感染的脑细胞。流式细胞仪检测显示3G1scFv-CK-tP可以特异性的将FITC-siRNA转运到汉坦病毒感染的脑组织,且荧光显微镜下可见荧光阳性细胞、高倍镜下观察到荧光弥散分布在汉坦病毒感染细胞的细胞膜和细胞浆。腹腔注射3G1scFv-CK-tP/siHV可以用于汉坦病毒感染性脑炎的保护。结果显示3G1scFv-CK-tP/siHV治疗组中病毒RNA和病毒抗原的水平明显降低;将脑组织和其它组织分别进行免疫组织化学染色,观察到3G1scFv-CK-tP/siHV使汉坦病毒的感染和复制受到了明显抑制;对动物的生存率进行评估,发现3G1scFv-CK-tP转运的siHV对动物有明显的保护作用;检测乳鼠体内IFN水平,显示3G1scFv-CK-tP/siHV并未诱导IFN的产生,证明在动物体内产生的保护作用是由针对病毒RNA的特异性RNAi所介导。总之,实验结果显示:3G1scFv-CK-tP可以特异性转运siRNA,并沉默靶基因的表达,因此可以用于汉坦病毒感染的保护。
二、噬菌体表面表达抗汉坦病毒衣壳蛋白单链抗体的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、噬菌体表面表达抗汉坦病毒衣壳蛋白单链抗体的研究（论文提纲范文）
（1）人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 汉坦病毒概述 |
| 2 汉坦病毒人工制备抗体研究进展 |
| 3 病毒感染与内质网应激 |
| 第一部分 HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化 |
| 实验一 国产与进口人HFRS IgG抗体ELISA检测试剂盒的性能比较 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 利用EBV转化技术建立HFRS疫苗接种者BLCLs |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 中国西部地区人群HFRS疫苗接种后的抗体反应 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 具有潜在中和活性的HTNV噬菌体抗体库的构建及筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达及中和活性的检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 HTNV感染巨噬样人急性单核白血病细胞（dTHP-1）诱导内质网应激（ER stress）反应的初步探讨 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（2）噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用（论文提纲范文）
| 0 引 言 |
| 1 噬菌体展示技术的原理和特点 |
| 1.1 噬菌体展示技术原理 |
| 1.2 噬茵体展示技术的特点 |
| 2 噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用 |
| 2.1 抗原表位检测 |
| 2.2 汉坦病毒抗体的研究 |
| 2.3 筛选抗汉坦病毒多肽 |
| 3 结 语 |
（3）汉坦病毒β3整合素受体拮抗剂的筛选及其特性的初步鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、汉坦病毒致病的多样性及其治疗现状 |
| 二、噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用 |
| 实验一 利用噬菌体展示技术筛选与汉坦病毒β3 整合素结合的高亲和力肽 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 实验二 噬菌体DNA 的序列测定及生物信息学分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 实验二 用 CHO 细胞表达抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体及表达产物的纯化和鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3 结果 |
| 实验三 抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的中和活性检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3. 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）酶斑点杂交法与双抗体夹心法检测汉坦病毒感染的比较（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 标本来源 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 单链抗体SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.2 酶标抗体的制备 |
| 1.2.3 酶标抗体纯化 |
| 1.2.4 可溶性抗NP单链抗体包被酶标板 |
| 1.2.5 双抗体夹心法检测血清NP抗原 |
| 1.2.5.1 加样 |
| 1.2.5.2 孵育 |
| 1.2.5.3 洗涤 |
| 1.2.5.4 加酶标抗体 |
| 1.2.5.5 孵育 |
| 1.2.5.6 洗涤 |
| 1.2.5.7 显色 |
| 1.2.5.8 终止 |
| 1.2.5.9 结果判定 |
| 1.2.6 酶斑点杂交法检测血清NP抗原 |
| 2 结 果 |
| 2.1 单链抗体SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.2 双抗体夹心法与酶斑点杂交法检测血清标本的结果 |
| 2.3 两种方法检测患者血清结果的统计学分析比较 |
| 3 讨 论 |
（7）抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆与鉴定（论文提纲范文）
| 【通讯作者】 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 T7噬菌体、质粒和菌株 |
| 2 方法 |
| 2.1 T7噬菌体DNA的提取 |
| 2.2 PCR扩增scFv单链抗体基因 |
| 2.3 scFv基因的酶切与回收 |
| 2.4 pGEX-6p-1载体的酶切与回收 |
| 2.5 DNA连接及质粒转化 |
| 2.6 初步筛选重组质粒 |
| 2.7 双酶切及PCR鉴定重组质粒 |
| 2.8 序列分析 |
| 结 果 |
| 1 T7噬菌体DNA的提取 |
| 2 PCR扩增scFv单链抗体基因 |
| 3 scFv基因和pGEX-6p-1载体的酶切与回收 |
| 4 DNA连接及质粒转化 |
| 5 重组质粒的初筛选 |
| 6 重组质粒双酶切鉴定 |
| 7 重组质粒PCR鉴定 |
| 8 重组质粒序列分析 |
| 讨 论 |
（9）抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及单链抗体的表达与特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 噬菌体抗体库技术研究进展 |
| 1 噬菌体抗体库技术的基本原理 |
| 2 噬菌体展示技术载体系统的发展 |
| 2.1 丝状噬菌体展示系统 |
| 2.2 λ噬菌体展示系统 |
| 2.3 T4噬菌体展示系统 |
| 2.4 T7噬菌体展示系统 |
| 3 噬菌体抗体库的构建 |
| 3.1 抗体可变区基因的获得 |
| 3.2 噬菌体抗体库载体的构建 |
| 3.3 抗体可变区基因的表达 |
| 4 噬菌体抗体库的筛选 |
| 4.1 固相化或液相抗原筛选法 |
| 4.2 交替筛选法 |
| 4.3 双层膜筛选法 |
| 4.4 选择性感染噬菌体筛选系统 |
| 5 噬菌体抗体库的类型 |
| 5.1 天然抗体库 |
| 5.2 免疫抗体库 |
| 5.3 化学合成抗体库 |
| 6 噬菌体抗体库技术的特点与优势 |
| 7 噬菌体抗体库技术的应用 |
| 7.1 噬菌体抗体库技术在生物学、医学等领域的应用 |
| 7.2 噬菌体抗体库技术在农兽药等小分子化合物残留检测中的应用 |
| 8 噬菌体抗体库技术的应用前景及存在的问题 |
| 第二章 单链抗体及其表达系统研究进展 |
| 1 单链抗体的结构及特点 |
| 2 单链抗体的构建 |
| 3 单链抗体的应用 |
| 3.1 应用于基础理论研究 |
| 3.2 应用于放射性影像分析 |
| 3.3 构建免疫毒素应用于肿瘤治疗 |
| 3.4 应用于细胞内免疫 |
| 3.5 应用于构建双特异性抗体等其它基因工程抗体 |
| 3.6 应用于有害物质残留的检测 |
| 4 单链抗体表达系统 |
| 4.1 原核表达系统 |
| 4.2 真核表达系统 |
| 4.2.1 酵母表达系统 |
| 4.2.2 昆虫表达系统 |
| 4.2.3 植物表达系统 |
| 4.2.4 哺乳动物表达系统 |
| 4.3 噬菌体展示系统 |
| 5 单链抗体表达策略 |
| 6 单链抗体存在问题及改进方法 |
| 7 展望 |
| 第三章 农药小分子抗体制备及其免疫分析技术应用研究进展 |
| 1 农药多克隆抗体制备技术研究进展 |
| 2 农药单克隆抗体制备技术研究进展 |
| 3 农药重组抗体制备技术研究进展 |
| 3.1 从杂交瘤细胞系制备农药重组抗体 |
| 3.2 从抗体库中制备农药重组抗体 |
| 3.3 抗体特性体外改造制备农药重组抗体 |
| 3.4 农药重组抗体制备技术发展动态 |
| 4 人工模拟抗体制备农药抗体技术研究进展 |
| 4.1 传统抗体以外的蛋白来源抗体 |
| 4.2 核酸来源抗体 |
| 4.3 小分子物聚合材料抗体 |
| 5 农药免疫分析技术应用研究进展 |
| 5.1 酶免疫分析法 |
| 5.2 免疫分析芯片的应用 |
| 5.3 免疫试纸条的应用 |
| 6 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 技术路线图 |
| 第一章 Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要溶液 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗原合成 |
| 1.2.2 免疫原的紫外可见光谱鉴定 |
| 1.2.3 小鼠免疫 |
| 1.2.4 间接非竞争ELISA测定抗血清效价 |
| 1.2.5 间接非竞争ELISA测定抗血清交叉吸附情况 |
| 1.2.6 抗原抗体工作浓度的初步确定 |
| 1.2.7 间接竞争ELISA初步测定抗血清识别甲胺磷的能力 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 免疫原的合成和鉴定 |
| 2.2 抗血清效价测定 |
| 2.3 交叉识别 |
| 2.4 间接竞争ELISA的抗原抗体工作浓度 |
| 2.5 间接竞争ELISA初步测定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及噬菌粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 培养基及溶液 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 脾细胞的制备 |
| 1.2.2 总细胞RNA的提取 |
| 1.2.3 mRNA的纯化 |
| 1.2.4 第一链cDNA的合成 |
| 1.2.5 VH、VL基因的扩增 |
| 1.2.6 VH、VL基因的纯化回收及定量 |
| 1.2.7 ScFv基因的组装及扩增 |
| 1.2.8 ScFv基因的纯化回收及定量 |
| 1.2.9 ScFv的SfiⅠ和Not Ⅰ双酶切 |
| 1.2.10 与噬菌粒pCANTAB5E的连接 |
| 1.2.11 E.coli TG1电转感受态细胞的制备 |
| 1.2.12 大肠杆菌的电转化及库容量的测定 |
| 1.2.13 噬菌粒DNA的提取 |
| 1.2.14 转化子PCR及双酶切鉴定 |
| 1.2.15 抗体库多样性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA的提取及鉴定 |
| 2.2 目的基因的扩增及鉴定 |
| 2.3 ScFv基因的连接与扩增 |
| 2.4 ScFv基因的克隆转化及库容量 |
| 2.5 转化子的PCR鉴定 |
| 2.6 转化子的双酶切鉴定 |
| 2.7 抗体库多样性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的筛选和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株、辅助噬菌体及单链抗体库 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 培养基和溶液 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 辅助噬菌体M13K07的大量制备 |
| 1.2.1.1 对数生长期E.coli TG1的制备 |
| 1.2.1.2 单个噬菌体原种M13K07病毒空斑的制备 |
| 1.2.1.3 辅助噬菌体M13K07的扩增 |
| 1.2.1.4 辅助噬菌体M13K07的滴度测定 |
| 1.2.2 原始scFv-噬菌体表面展示文库的扩建和滴度测定 |
| 1.2.3 噬菌体ScFv抗体库的富集筛选 |
| 1.2.3.1 第一轮富集筛选 |
| 1.2.3.2 次级噬菌体抗体库的制备和保存 |
| 1.2.3.3 次级ScFv-噬菌体表面展示文库的扩建和滴度测定 |
| 1.2.3.4 进一步富集筛选 |
| 1.2.4 富集筛选效果的鉴定 |
| 1.2.4.1 多克隆噬菌体ELISA的初步鉴定 |
| 1.2.4.2 筛选菌落的PCR鉴定 |
| 1.2.4.3 重组噬菌粒的双酶切验证 |
| 1.2.4.4 单克隆噬菌体单链抗体的制备 |
| 1.2.4.5 单克隆噬菌体ELISA鉴定筛选效率 |
| 1.2.5 高亲和力阳性噬菌体抗体克隆的筛选 |
| 1.2.5.1 单克隆噬菌体ELISA筛选试验 |
| 1.2.5.2 竞争抑制试验 |
| 1.2.6 高亲合力阳性克隆ScFv基因序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原始ScFv-噬菌体表面展示文库的扩建 |
| 2.2 噬菌体单链抗体库的富集 |
| 2.3 富集筛选效果的分析鉴定 |
| 2.3.1 多克隆噬菌体ELISA的初步分析 |
| 2.3.2 筛选菌落的PCR鉴定 |
| 2.3.3 重组噬菌粒的双酶切验证 |
| 2.3.4 筛选效率的比较 |
| 2.4 单克隆噬菌体ELISA筛选高亲和力克隆 |
| 2.5 阳性噬菌体抗体克隆竞争抑制试验结果 |
| 2.6 阳性克隆单链抗体基因的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 抗甲胺磷单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及阳性噬菌体单链抗体克隆 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 培养基和缓冲液 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 可溶性单链抗体的小量制备及鉴定 |
| 1.2.1.1 对数生长期E.coli HB2151的制备 |
| 1.2.1.2 阳性克隆重组噬菌体的制备 |
| 1.2.1.3 阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染 |
| 1.2.1.4 ScFv的可溶性表达 |
| 1.2.1.5 不同表达部位产物的提取和浓缩 |
| 1.2.1.6 可溶性ScFv的SDS-PAGE检测 |
| 1.2.1.7 可溶性ScFv的间接ELISA检测 |
| 1.2.1.8 间接竞争ELISA初步分析 |
| 1.2.2 可溶性单链抗体的大量制备和纯化 |
| 1.2.2.1 可溶性单链抗体的大量制备 |
| 1.2.2.2 纯化 |
| 1.2.3 竞争ELISA分析方法的初步建立 |
| 1.2.3.1 纯化抗体的效价测定 |
| 1.2.3.2 抗原抗体工作浓度的测定 |
| 1.2.3.3 ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价 |
| 1.2.3.4 抗体特异性考察 |
| 1.2.3.5 精确度试验 |
| 1.2.3.6 添加回收试验 |
| 1.2.4 单链抗体稳定性试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 可溶性单链抗体的小量制备及鉴定 |
| 2.1.1 阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染 |
| 2.1.2 ScFv的可溶性表达及检测 |
| 2.1.2.1 SDS-PAGE检测 |
| 2.1.2.2 间接ELISA检测 |
| 2.1.2.3 间接竞争ELISA分析 |
| 2.2 可溶性单链抗体的大量制备和纯化 |
| 2.3 纯化抗体ELISA标准曲线的建立及评价 |
| 2.3.1 纯化抗体的效价 |
| 2.3.2 抗原和抗体的工作浓度 |
| 2.3.3 ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价 |
| 2.3.4 抗体特异性考察 |
| 2.3.5 精确度试验 |
| 2.3.6 准确度试验(添加回收) |
| 2.4 单链抗体的稳定性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于Met-ScFv可溶性抗体的表达 |
| 3.2 关于单链抗体的纯化 |
| 3.3 关于本研究中单链抗体结合特性的分析 |
| 3.4 关于Met-ScFv可溶性单链抗体的亲和性和特异性 |
| 3.5 关于单链抗体的稳定性 |
| 3.6 关于单链抗体在农药酶联免疫分析上的应用前景 |
| 4 小结 |
| 第五章 抗甲胺磷单链抗体在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种与质粒 |
| 1.1.2 PCR引物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 培养基和溶液 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 酵母表达质粒pPICZα C的制备 |
| 1.2.1.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.2.1.2 pPICZα C质粒的转化和质粒菌的扩增培养 |
| 1.2.1.3 pPICZα C质粒的提取和定量 |
| 1.2.1.4 pPICZα C质粒的单酶切鉴定 |
| 1.2.1.5 pPICZα C质粒菌的保存 |
| 1.2.2 酵母表达载体pPICZα C-ScFv质粒的构建 |
| 1.2.2.1 阳性克隆菌的扩增培养 |
| 1.2.2.2 质粒PCANTAB5E-ScFv的提取 |
| 1.2.2.3 含内切酶位点的目的基因ScFv的扩增、回收及定量 |
| 1.2.2.4 目的片段的双酶切、回收及定量 |
| 1.2.2.5 pPICZα C质粒的双酶切、回收及定量 |
| 1.2.2.6 目的片段ScFv与pPICZα C的连接、转化 |
| 1.2.2.7 转化子的PCR鉴定及酶切验证 |
| 1.2.2.8 阳性克隆的保存 |
| 1.2.3 表达载体pPICZα C-ScFv与酵母基因的整合 |
| 1.2.3.1 重组表达质粒pPICZα C-ScFv的大量提取及定量 |
| 1.2.3.2 质粒pPICZα C的大量提取及定量 |
| 1.2.3.3 pPICZα C和重组质粒pPICZα C-ScFv的线形化与纯化浓缩 |
| 1.2.3.4 感受态酵母细胞的制备 |
| 1.2.3.5 酵母菌株的电转化 |
| 1.2.4 菌落PCR检测目的基因整合 |
| 1.2.5 多拷贝Mut~+型转化子的筛选 |
| 1.2.5.1 多拷贝转化子的筛选 |
| 1.2.5.2 多拷贝菌株生长表型的鉴定 |
| 1.2.6 高表达阳性克隆的筛选 |
| 1.2.6.1 阳性克隆菌的诱导表达 |
| 1.2.6.2 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.6.3 表达产物的ELISA分析 |
| 1.2.7 酵母表达条件的初步优化 |
| 1.2.7.1 诱导表达时间优化 |
| 1.2.7.2 不同菌体密度的诱导表达 |
| 1.2.7.3 不同pH培养液的诱导表达 |
| 1.2.7.4 不同剂量甲醇的诱导表达 |
| 1.2.8 优化条件下的大量表达 |
| 1.2.9 目的蛋白浓缩纯化 |
| 1.2.10 酵母表达单链抗体免疫特性初步分析 |
| 1.2.10.1 抗原抗体工作浓度确定 |
| 1.2.10.2 间接竞争抑制试验 |
| 1.2.10.3 抗体特异性测定 |
| 1.2.11 酵母表达单链抗体稳定性试验 |
| 1.2.11.1 表达产物4℃保存条件下的稳定性试验 |
| 1.2.11.2 遗传稳定性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组质粒pPICZα C-ScFv的构建及鉴定 |
| 2.2 重组质粒转化毕赤酵母菌X-33及鉴定 |
| 2.3 多拷贝Mut~+型转化子的筛选结果 |
| 2.4 多拷贝Mut~+型转化子的原始诱导表达及鉴定 |
| 2.4.1 表达产物的SDS-PAGE鉴定 |
| 2.4.2 表达产物的ELISA鉴定及最佳诱导时间 |
| 2.5 酵母表达条件的初步优化 |
| 2.5.1 最佳诱导菌体密度 |
| 2.5.2 最佳诱导pH值 |
| 2.5.3 最佳诱导甲醇剂量 |
| 2.6 抗体的优化表达及纯化 |
| 2.7 酵母表达单链抗体化学免疫特性初步分析 |
| 2.7.1 抗原和抗体的工作浓度 |
| 2.7.2 酵母表达抗甲胺磷单链抗体抑制曲线 |
| 2.7.3 抗体特异性考察 |
| 2.8 酵母表达单链抗体的稳定性 |
| 2.8.1 4℃保存条件下的稳定性 |
| 2.8.2 遗传稳定性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 总结、创新点及展望 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
（10）抗体介导的siRNA靶向运输并抑制汉坦病毒复制的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 质粒与菌种 |
| 1.3 病毒 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 主要试剂 |
| 1.6 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 siRNA的设计 |
| 2.2 病毒感染和细胞转染 |
| 2.3 siRNA抗病毒效果的检测 |
| 2.4 细胞总RNA提取 |
| 2.5 RT-PCR |
| 2.6 实时定量PCR |
| 2.7 Western blot检测细胞中病毒抗原量 |
| 2.8 间接ELISA检测培养物上清中病毒抗原量 |
| 2.9 间接免疫荧光检测细胞内病毒抗原 |
| 2.10 流式细胞术(FCM)分析 |
| 2.11 3G1scFv与3G1scFv-C_k-tP表达载体的构建 |
| 2.12 单链抗体及其融合蛋白的表达、纯化与浓缩 |
| 2.13 BCA法蛋白定量 |
| 2.14 单链抗体与及其融合蛋白的功能检测 |
| 2.15 3G1scFv-C_k-tP结合以及体外靶向转运siRNA能力的检测 |
| 2.16 MTT测定细胞生长 |
| 2.17 3G1scFv-C_k-tP体外靶向转运siRNA的抗病毒效果的检测 |
| 2.18 汉坦病毒致病动物模型的建立 |
| 2.19 3G1scFv-C_k-tP体内靶向转运siRNA能力的检测 |
| 2.20 动物标本的收集和处理 |
| 2.21 小鼠血清IFN-α水平的检测 |
| 2.22 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 siRNAs对病毒RNA水平的影响 |
| 3.2 siRNAs对病毒抗原量的影响 |
| 3.3 3G1scFv与3G1scFv-C_k-tP表达载体的构建 |
| 3.4 单链抗体及其融合蛋白的表达、纯化和鉴定 |
| 3.5 单链抗体及其融合蛋白的抗原结合活性分析 |
| 3.6 单链抗体及其融合蛋白的内化活性分析 |
| 3.7 3G1scFv-C_k-tP对siRNA的结合与转运 |
| 3.8 3G1scFv-C_k-tP/siRNA对细胞生长的影响 |
| 3.9 3G1scFv-C_k-tP靶向转运siRNA在体外的抗病毒效果 |
| 3.10 siRNAs在HV感染鼠脑内的靶向运送 |
| 3.11 3G1scFv-C_k-tP靶向转运siRNA在体内的抗病毒效果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 汉坦病毒感染与RNAi治疗 |
| 4.2 单链抗体-鱼精蛋白片段融合蛋白靶向转运治疗性RNAi |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、噬菌体表面表达抗汉坦病毒衣壳蛋白单链抗体的研究（论文参考文献）
- [1]人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D]. 李卓. 第四军医大学, 2017(05)
- [2]噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用[J]. 杨栋强,白雪帆. 医学研究生学报, 2012(07)
- [3]汉坦病毒β3整合素受体拮抗剂的筛选及其特性的初步鉴定[D]. 杨栋强. 第四军医大学, 2012(02)
- [4]抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达[D]. 张晓晓. 第四军医大学, 2012(02)
- [5]双单链抗体夹心法诊断汉坦病毒感染的初步研究[J]. 刘兵,史俊岩,王舰,王美莲,王斯,郑兰艳,牟玲,罗恩杰. 临床检验杂志, 2009(04)
- [6]酶斑点杂交法与双抗体夹心法检测汉坦病毒感染的比较[J]. 刘兵,史俊岩,王舰,王美莲,王斯,郑兰艳,牟玲,罗恩杰. 中国人兽共患病学报, 2009(06)
- [7]抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆与鉴定[J]. 刘兵,史俊岩,王舰,王美莲,王斯,郑兰艳,牟玲,罗恩杰. 中国病原生物学杂志, 2009(05)
- [8]抗汉坦病毒NP scFv基因表达及生物活性分析[J]. 刘兵,史俊岩,王舰,王美莲,王斯,郑兰艳,牟玲,罗恩杰. 微生物学杂志, 2009(02)
- [9]抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及单链抗体的表达与特性研究[D]. 李铁军. 南京农业大学, 2008(05)
- [10]抗体介导的siRNA靶向运输并抑制汉坦病毒复制的研究[D]. 杨洁. 第四军医大学, 2008(03)