一、原核生物和酵母基因组中起始密码的特征分析（论文文献综述）
韩帅波[1]（2021）在《盐环境来源微生物多相分类及嗜盐古菌基因组适应性与演化研究》文中提出盐环境中的微生物因其独特的生理代谢类型和特殊的生命演化地位,受到人们的广泛关注。新疆阿尔金山无人区由于高山阻隔,气候恶劣,人迹罕至,其中古老而原始的微生物资源一直以来鲜有报道。本文以新疆阿尔金山高海拔盐湖为重点,以包括其在内的8个盐湖（阿牙克库木湖、卡尔敦湖、龙尾错、销库尔咸湖、玛纳斯湖、巴里坤湖、运城盐湖和吉林碱湖）为研究对象,研究盐湖中的微生物群落结构并挖掘其中嗜盐微生物资源,对分离到的6株嗜盐微生物进行了多相分类学研究。此外,对38株嗜盐古菌模式菌株进行了全基因组测序,并对其中一株的基因组环境适应性和基因演化进行了深入探讨。本论文运用非培养的宏基因组方法,对阿牙克库木湖和玛纳斯湖的微生物群落结构进行分析,发现在阿牙克库木湖中,细菌是优势类群,红杆菌目在目水平丰度最高,而在玛纳斯湖中,嗜盐古菌是优势类群,盐红菌属在属水平丰度最高。运用可培养的方法,共分离纯化得到403株嗜盐微生物,包括191株嗜盐古菌和212株嗜盐细菌,其中嗜盐古菌疑似新分类单元8个,嗜盐细菌疑似新分类单元17个。在群落分析中,发现玛纳斯湖和运城盐湖,销库尔咸湖与运城盐湖的嗜盐古菌群落结构较为类似;卡尔敦湖、阿牙克库木湖和龙尾错这三个高海拔盐湖的细菌群落结构相似,优势类群均为海杆菌属菌株,而海杆菌属的物种大部分直接或间接来自海洋,在远离海洋、人迹罕至的高原盐湖中发现如此之多的海杆菌属菌株,可能是继喜马拉雅山脉发现海洋鱼类化石后,青藏高原海洋起源假说的又一力证,在地球物种演化研究上具有一定的科学意义。对分离自不同盐环境的6株嗜盐微生物进行了多相分类学研究,建立了2个新属（Salilacivita gen.nov.和Ayaqqumibacter gen.nov.）和6个新种（Salilacivita planktonica、Ayaqqumibacter halotolerans、Wenzhouxiangella salilacus、Rhodohalobacter barkolensis、Marinobacterium zhoushanense和Terasakiella brassicae）。在属和种的水平增加了新的分类单元,丰富了嗜盐微生物资源,为后续的研究提供物种材料和参考信息。对38株嗜盐古菌模式菌株进行了全基因组测序,共获得9个高质量基因组完成图和29个草图,极大地丰富了嗜盐古菌模式菌株的基因组数据资源,并对其中Salinigranum rubrum GX10T基因组的环境适应性与基因演化进行了深入分析。菌株GX10T的基因组由一个环状染色体和5个环状质粒组成。在其基因组中存在大量K+和Na+转运蛋白编码基因以及相容性溶质的吸收和合成相关的基因,使其能够保持细胞内外的渗透压平衡。偏酸性的蛋白质等电点使得其细胞内的生物大分子在高盐环境下依旧能够保持稳定的结构。该菌株拥有光修复、切除修复、错配修复和重组修复等完善的DNA修复系统,可以对紫外辐射导致的受损DNA进行修复。该菌株基因组中含有大量重金属抗性和代谢相关的基因,可能有助于降低重金属对菌体的毒害作用。其基因组中含有多个CRISPR位点和多种类型的Cas蛋白编码基因,共同组成CRISPR-Cas系统,来降解侵入细胞内的噬菌体和外源DNA,维持基因组的稳定。运用基于系统发育树的方法,对该菌株中的新基因进行注释和分析,发现大部分新基因形成于热原菌纲和嗜盐菌纲的物种分化过程中。此外,该菌株基因组也还存在有编码丝氨酸蛋白酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脂肪酶、酯酶、内切葡聚糖酶等工业用酶和PHA合成途径的全部基因,表明菌株GX10T还具有较大的生物技术应用潜力。新疆高海拔盐湖嗜盐微生物资源的研究鲜有报道,本研究通过非培养和可培养方法揭示了其微生物群落组成以及特有的群落类型,加深了对特殊环境下微生物分布的认识。对6株疑似新分类单元进行了多相分类学研究,丰富了嗜盐微生物物种资源。对38株嗜盐古菌模式菌株进行全基因组测序,为后续分类学、比较基因组学和生物技术利用奠定数据基础。对菌株S.rubrum GX10T的环境适应性和基因演化分析,则进一步加深了对生命在极端环境下生存机制和演化历史的理解。
郝荣增[2]（2021）在《基于遗传密码扩展技术构建复制可控的重组口蹄疫病毒的研究》文中认为遗传密码子扩展技术是利用正交性氨酰t RNA合成酶/t RNA分子对（aa RS/t RNA）识别m RNA上的无义密码子（终止密码子或四联体密码子）,将非天然氨基酸通过核糖体插入目标肽或蛋白质中的策略统称。在蛋白翻译过程中由仅识别并通读无义密码子,将特定非天然氨基酸以编码形式插入蛋白质肽链特定位置的正交性aa RS/t RNA对,构成了非天然氨基酸的正交翻译系统。目前,利用遗传密码子扩展技术,已将超过200种不同的非天然氨基酸遗传编码插入细胞和动物体内合成的蛋白质,广泛应用于蛋白质标记和修饰等多种生物学研究领域;特别是将非天然氨基酸定点引入病毒蛋白的特定氨基酸位点,实现对病毒颗粒的表面修饰以及对病毒复制过程的控制,可直接将野生型病毒转化为安全高效的病毒疫苗,成为病毒疫苗研究中一项重要突破性进展。本研究以口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）为模型,结合遗传密码子扩展技术和病毒反向遗传学技术,在包含生物正交翻译系统的稳定细胞系中,扩展了FMDV的基因组,探索产生含有提前成熟终止密码子（PTC）的重组病毒（PTC-FMDV）的可行性,并进一步评估了重组PTC-FMDV的包装效率和遗传稳定性。主要研究内容及结果如下:1.重组PTC-FMDV的产生及遗传稳定性分析本研究首先利用Piggy Bac转座子系统介导的转座技术将Pyl RS/Pyl T正交翻译元件整合到细胞基因组中,成功构建了能有效解码琥珀终止密码子的正交翻译细胞系BHK-21-t RNA/pyl RS/m Cherry-TAG-e GFP。为了探究基于遗传密码子扩展技术构建复制可控制的重组FMDV的可行性,本研究根据对病毒蛋白的三级结构分析和氨基酸保守性分析,在FMDV的结构蛋白（VP1和VP4）和非结构蛋白（L和3D）中选择了129个氨基酸位点,将其密码子定点突变为琥珀终止密码子,分别构建了129种重组PTC-FMDV单点突变体和4种dual-PTC-FMDV双点突变体的拯救质粒,转染正交翻译细胞系进行重组病毒的包装和拯救,未添加非天然氨基酸的细胞转染组作为对照,根据细胞病变效应（CPE）和RT-PCR扩增分析病毒的包装和基因复制,并评估重组病毒的包装效率,结果表明这些PTC-FMDV的包装效率与野生型病毒相比均有降低;病毒拯救结果显示3D蛋白中27/48、L蛋白10/26、VP4蛋白11/16和VP1蛋白10/39的PTCFMDV突变体可以成功包装出病毒;然而基因测序结果显示,这些引入的琥珀终止密码子高度缺乏遗传稳定性,在PTC病毒的包装或传代复制过程中,存在几乎全部突变为有义密码子的可能;并且琥珀密码子的突变与特定氨基酸或蛋白的保守性没有明显的相关性。进一步构建包含两个琥珀密码子的双点PTC-FMDV突变体的研究发现,增加琥珀密码子的个数可降低重组PTC病毒的包装效率,但其在病毒传代过程中也存在发生突变的可能性。2.重组TAGA-FMDV的产生及遗传稳定性分析本研究为了解决PTC-FMDV的回复突变问题,并探究基于四联体密码子解码策略控制FMDV复制的可行性,首先构建了能有效解码TAGA四联体密码子的稳定转基因细胞系,进一步在前期试验的基础上,分别选择FMDV的VP1-N46、VP4-F76、L-Y42、3D-H14和3D-M16氨基酸位点,分别将这5个氨基酸密码子定点突变为TAGA密码子,构建了5种重组TAGA-FMDV突变体拯救质粒,在添加特定非天然氨基酸的条件下,进行重组TAGA-FMDV的包装和拯救,以探索重组病毒产生的可行性,并以未添加非天然氨基酸的细胞作为对照组。根据CPE和RT-PCR扩增分析病毒的包装和基因复制,实时荧光定量PCR（q PCR）分析病毒RNA的转录,细胞间接免疫荧光实验（IFA）分析病毒蛋白的表达。结果表明,重组病毒拯救质粒转染细胞后在第一代均可以观察到细胞局部的CPE,q PCR和IFA检测结果表明细胞内存在重组病毒的RNA转录和蛋白表达;但进一步通过基因测序对重组FMDV基因组中引入的TAGA四联体密码子的遗传稳定性分析发现,VP4-F76、3D-H14和3D-M16突变体在第一代和第二代样品测序结果表明,其基因组中保持了TAGA四联体密码子的存在;L-Y42突变体在两次转染细胞后均在第一代即发生了突变,VP1-N46突变体在转染后第一代也发生了突变;而在第三代样品的测序结果发现,这些TAGAFMDV基因组中的四联体密码子在病毒复制过程中均发生了突变或回复,该研究结果表明在FMDV基因组中引入的TAGA四联体密码子,病毒传代过程中也存在突变或回复的可能性。综上所述,本研究分别成功构建了能有效解码三联体琥珀终止密码子和TAGA四联体密码子的正交翻译稳定细胞系;利用遗传密码子扩展技术和病毒反向遗传技术扩展了FMDV基因组,系统的筛选并构建了133种携带PTC三联体终止密码子的重组病毒突变体,并在正交翻译细胞系中成功拯救了PTC-FMDV,证明了利用遗传密码子扩展技术产生PTC-FMDV这一概念的可行性,但将该技术应用于口蹄疫PTC疫苗仍具有一定挑战性;进一步利用四联体密码子解码策略构建重组TAGA-FMDV,初步探索了这种重组病毒包装的可行性与遗传稳定性,结果显示,重组TAGA病毒在传代过程也存在一定的遗传不稳定性。总之,本研究为成功制备重组复制可控的FMDV建立了一个新的、稳定的技术平台,同时也强调了将该项新技术应用于其他小RNA病毒科成员的研究中存在的风险和挑战。
戴阳雪[3]（2021）在《解旋酶Pif1二聚化的结构机理研究》文中认为解旋酶普遍存在于真核生物、原核生物以及病毒体内,其功能涉及核酸代谢的各个途径,并参与介导多种细胞应激反应,其中包括细胞凋亡、衰老和自噬等,帮助细胞应对复制错误和内源性或外源性诱导的DNA损伤。此外,解旋酶途径出现缺陷将导致机体和组织的衰老以及神经系统缺陷等一系列问题。Pif1作为ATP依赖性的SF1B解旋酶,由于其在酵母中维持线粒体DNA稳定性所发挥的重要作用而被首次发现,目前所有真核生物和某些细菌中均存在Pif1解旋酶。已有多项研究报道,Pif1解旋酶参与各种重要的细胞生理活动,包括冈崎片段的成熟,核糖体和线粒体DNA的复制以及端粒调节等。此外,在富含鸟嘌呤序列的染色体区极易形成G-四链体（G4）结构,而G4结构的高度稳定性使其成为复制阻碍及DNA断裂损伤的关键因素,有研究表明,Pif1可与G4结构紧密结合,并且相比于其他解旋酶,Pif1具有更高的特异性识别和解旋G4的能力,因此针对G4结构的Pif1解旋酶将在细胞中扮演着重要角色。多项研究表明,Pif1解旋酶可由DNA诱导形成二聚体,但是二聚体结构信息的缺失导致我们无法明确二聚化对于Pif1解旋活性的调节机制。因此,本文选择原核生物中的嗜热菌Pif1（Themus oshimai Pif1,简称ToPif1）进行结构和生化的研究,旨在通过单晶衍射、小角散射技术由原子水平揭示ToPif1解旋酶二聚化的结构和机理基础,同时结合空间排阻色谱法、基于动态激光的散射技术对溶液状态下蛋白的聚集状态进行表征,进一步利用基于共振荧光能量传递机理的快速停流追踪检测技术以及单分子荧光共振能量转移方法对二聚化Pif1解旋酶动力学机制进行系统性的阐释,目前已获得了以下几项研究结果:1.首次解析了ToPif1单蛋白的结构、与粘性末端双链DNA复合的单体结构,以及与单链DNA复合的二聚体结构,从而得到了不同状态下的ToPif1蛋白结构信息。2.从结构域的组成和整体折叠方式而言,ToPif1蛋白的单体结构与Bs Pif1（PDB号:5FTD）、Ba Pif1（PDB号:5FHG）以及h Pif1（PDB号:6HPU）高度相似,并且其结构域2B与1A、2A之间的相互作用使得ToPif1蛋白处于闭合状态,从而封闭了单链DNA结合位点,我们通过分子内交联实验进一步证明了闭合状态的ToPif1蛋白无解旋活性。3.粘性末端双链DNA的结合导致ToPif1蛋白的结构域2B由闭合转至开放构象,但是由于双链部分的电子密度较弱,导致未能解析出双链DNA的结构,因此我们结合小角散射数据补充了双链DNA的完整模型,并进一步采用荧光标记蛋白从单分子水平上揭示了ToPif1潜在的双链解旋机制:与其他SF1A解旋酶利用闭合或开放构象进行解旋的机制不同,ToPif1的解旋机制依赖于其结构域2B在闭合与开放构象之间的来回摆动。4.通过晶体结构的对比分析,发现单链DNA的结合不仅使ToPif1蛋白的构象进一步打开,且分子之间形成的二聚体相互作用也将蛋白锁定在该状态中。为此,我们提出二聚化对于蛋白解旋活性的负调控机制,并证明了溶液状态下由DNA诱导的ToPif1二聚体的存在及其对于解旋酶活力的抑制作用。总之,本论文从结构和活性这两方面详细揭示了ToPif1的解旋机理和二聚化的负调控机制,并由结构分析和突变体的结果表明,2B结构域的构象变化对于Pif1解旋酶的酶促活性至关重要。本论文提出的结构机理可以作为研究二聚化如何影响/调节DNA复制,重组和修复的新方向,为了解二聚体调控的潜在生理学意义提供结构基础和新的启示,从而有助于人们更深入地研究SF1B解旋酶的功能。
杨振华[4]（2021）在《基因组序列k-mer频谱的内在规律和基因组序列的进化机制》文中指出基因组序列的k-mer频谱包含了序列组成和序列进化的重要信息,研究基因组序列k-mer频谱组成的内在规律,是揭示基因组序列的组成规律和进化规律的重要途径。在前期研究的基础之上,我们分析和比较了从灵长类到原核生物920个基因组序列上各种k-mer子集频谱的特征。探讨了基因组序列的组成和进化规律,推测了物种早期的演化规律。主要研究内容如下:1.将920个基因组分成动物（灵长类、啮齿类、其它哺乳类、其它脊椎类、非脊椎类）、植物（双子叶、单子叶、蕨类和绿藻类）、真菌（伞菌、子囊菌和酵母）、原核生物（古菌和真细菌）四界14个物种类。研究了每个物种基因组序列在XY二核苷分类下16种XY子集8-mer/6-mer频谱分布的内在规律。发现只有CG类和TA类k-mer频谱分布存在独立选择现象,其它14种XY类kmer频谱分布均不存在独立选择现象,即基因组序列存在两种独立选择模式。一种是CG独立选择模式,另一种是TA独立选择模式。通过分析CG2/CG1/CG0和TA2/TA1/TA0子集k-mer频谱的分布特征,发现两种独立的选择规律具有3个性质:进化独立性,进化选择性和进化保守性。2.依据CG类和TA类子集和全体k-mer频谱分布的平均值和标准差,给出两种独立选择强度的定量表征参量:分离度和保守度。发现CG1/CG2子集,TA1/TA2子集频谱的分离度和保守度特征量之间呈正相关关系。该现象称为进化相关性,是独立选择现象的第4个性质。CG2和CG1子集、TA2和TA1子集k-mer的进化特征相同,它们与CG0子集k-mer的进化趋势相反。该现象称为进化趋同性,是独立选择现象的第5个性质。3.分析了各类基因组CG和TA独立选择强度的分布。发现每个基因组序列中CG独立选择强度和TA独立选强度各不相同,且两种独立选择强度之间存在相互抑制关系。动物和植物基因组中,CG独立选择强度与基因组进化水平呈正相关,TA独立选择强度与基因组进化水平呈负相关。真菌和细菌基因组中,两种独立选择强度分布表示了物种的进化状态。由此我们提出了基因组序列进化机制,即物种基因组的进化状态是由CG和TA独立选择强度以及它们之间相互抑制关系所决定。还发现,脊椎动物基因组序列TA独立选择现象随着物种进化水平的提高而逐步消失,就是说脊椎动物中TA独立选择和CG独立选择之间的相互抑制关系逐步消失。4.研究了基因组序列的独立选择模式与基因组序列的G+C含量和Cp G抑制强度的关系。发现TA独立选择强度与基因组序列的G+C含量呈正相关,CG独立选择强度与基因组序列的G+C含量呈负相关,CG独立选择强度与Cp G抑制强度之间呈正相关。我们认为独立选择现象是反映基因组序列组成和进化的根本规律,而Cp G抑制强度和基因组序列的G+C含量是CG和TA独立选择模式以及它们之间的相互抑制规律的表现形式。5.根据基因组序列的独立选择规律和基因组序列进化机制,我们推测了生命进化早期地球在无氧环境下原核生物基因组在温和和两种极端环境下的进化模式,以及原核生物在有氧环境下基因组的进化过程。推测CG和TA独立选择现象是生物应对有氧和极端环境而进化的根本原因。比较动物、植物和真菌与古菌基因组的进化模式,依据进化的连续性和相似性,我们推测动物和酵母的祖先起源于高CG古菌,植物、伞菌和子囊菌的祖先起源于高TA古菌。通过研究了物种基因组序列的独立选择模式与物种生活习性的关系。发现TA独立选择强度明显同时CG独立选择被强烈抑制的真菌和原核生物容易与植物共生或侵染植物,而CG独立选择强度明显同时TA独立选择被强烈抑制的真菌和原核生物更容易与动物共生或侵染动物。6.根据我们提出的基因组序列的进化机制,进一步印证了腔棘鱼进化的特殊性。许多生化证据表明,腔棘鱼和四爪动物亲缘关系比较近,而跟其它鱼类关系较远。我们比较了腔棘鱼、其它鱼类和四爪动物基因组序列的CG独立选择模式和Cp G抑制强度。发现腔棘鱼的CG独立选择强度和Cp G抑制强度与四爪动物非常接近,而与其它鱼类相差很远。另外,我们认为独立选择现象不仅体现在基因组层面上,也必定体现在任何一段DNA序列上。为此我们分析了腔棘鱼甲基化基因和去甲基化基因的氨基酸序列,通过相似性比对来考察腔棘鱼进化的特殊性。结果均表明腔棘鱼和四爪动物进化距离很相近,而跟其它鱼类较远。我们从基因组尺度和基因尺度分别印证了腔棘鱼和四足动物具有共同祖先的猜想。
刘硕[5]（2021）在《基因组中关键基因的理论识别研究》文中进行了进一步梳理关键基因指的是对生物的生命活动至关重要的基因,其包括影响某种生命活动的重要基因,这部分基因可以决定生物体的特定表型或者对于特定环境的适应性。关键基因也涵盖直接影响细胞或个体生长发育的必需基因,本文涉及的必需基因都是指细胞优化条件下生长所必需的基因。本论文围绕原核生物和真核生物的两类关键基因,进行了一系列创新性研究。本论文首先对原核生物中好氧微生物和厌氧微生物进行比较基因组学研究。通过基因组、转录组、系统发育等多个层次的研究,对比分析了147个好氧细菌和147个厌氧细菌中的同源蛋白簇（COG）,并结合KEGG中酶注释后的相关信息,以及采用文献挖掘的方法,进一步定位到了27个可能影响氧气偏好性的同源蛋白簇（COG）,蛋白质互作和代谢网络步长比较分析均支持它们可能与氧气偏好性相关的结论。最后结合进化树和物种之间的分化时间,验证了地球上氧气及生物体氧气利用基因的出现时间。其次是对于必需基因识别方面的研究。必需基因是关键基因的一个类别,它得名于其对生物体维持生命活动的重要性和必需性,缺失就会导致个体的死亡或细胞生长的停滞。本部分工作对本课题组开发过的一个原核生物通用必需基因预测软件Geptop进行了升级,增加了参考物种的数目,改进了原有的计算公式,并引入了多线程以提升该预测软件的运行速度,改进之后的Geptop对不同物种的预测的AUC均有了显着的提升,特别对大肠杆菌预测时AUC（Area Under Curve）达到了0.956,并且新版本对基因组之间的进化距离表现出了一定的稳定性。再次是对于多个物种必需基因团簇数据库的研究。必需基因一般都是以单个基因的方式来分析,而具有同源性的必需基因可以被归入到相同的团簇中,这些团簇是基于功能和进化保守性进行划分的。本论文升级了必需基因团簇数据库CEG（database of cluster of essential gene）。新版本补充了13种原核生物,尤其是添加了原核生物“必需基因--药靶”互作相关信息。对于新增的真核生物的必需基因进行了团簇归类,特别针对人类的对应多个细胞系的必需基因进行了团簇归类。CEG升级版还增加了预测真核生物必需基因的工具CEG＿Match 2.0,可以实现通过输入序列和基因名称两种方式预测必需性的功能。最后一部分是关于人类癌细胞系的必需基因的理论预测和实验验证,本部分研究采用特征集成的方法进行理论预测,一共采用958个特征,AUC达到了0.96。并且通过CRISPR-Cas9技术对新增预测得的181个必需基因进行了实验验证,选用的细胞系为包含Hela细胞系的7个细胞系。Hela细胞系的实验结果证实了预测结果的可靠性。综上所述,本论文对多种生物细胞的关键基因进行了研究分析。识别了微生物氧环境适应的关键基因,升级更新了必需基因识别软件Geoptop和必需基因团簇数据库CEG,并针对人类癌细胞进行了必需基因的理论识别。我们的一系列研究有可能促进对于生物体遗传构成、环境适应性的理解和药物靶标基因的筛选。
孙小雯[6]（2020）在《基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化》文中提出维生素K2是一类侧链长度不同的异戊烯基化甲萘醌产品的总称,属于衍生脂质。其中四烯甲萘醌（MK-4）在促进凝血和防治骨质疏松症方面具有良好的效果,在临床上具有较高的应用价值。大肠杆菌和毕赤酵母作为两种成熟高效的蛋白表达系统,已被成功地应用于多种异源蛋白的表达。本课题组已经在大肠杆菌中成功实现了 MK-1从无到有的生物合成,而侧链长度更长的MK-4的生物制造将是我们下一步要实现的目标。毕赤酵母表达系统具有繁殖迅速、易于高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后加工修饰,易获得可溶性活性重组蛋白等优点,尽管在毕赤酵母中尚未发现甲萘醌的生物合成途径,但这也可以在一定程度上避免复杂的分支途径和反馈调节机制对重构路径造成的不利影响。因此,为实现MK-4的高效生物制备,本研究运用合成生物学理念,基于多维度的信息整合,将高效的酶和生物合成途径整合到大肠杆菌和毕赤酵母底盘细胞中,构建以廉价的VK1或VK3为原料的MK-4高效生物制备的细胞工厂,并通过分析其优缺点以确定最佳的表达系统。研究工作有效拓展了 VK2生物合成的底盘细胞种类,为VK2等异戊烯基化产品的生物合成途径构建与优化提供了新的思路,具有重要的理论和应用价值。论文首先从物质和能量代谢角度出发在E.coli中重构MK-4代谢途径,通过MBP促溶标签实现古细菌来源的SaGGPPS催化的由IPP直接到GGPP的生物合成,在此基础上通过敲除pgi基因,调控EMP、PPP和EDP三条葡萄糖分解代谢途径的分配,强化胞内还原力NADPH的合成,使重组菌株胞内的MK-4含量达到0.78 mg/L。由于其合成能力未达预期,同时考虑到菌株稳定性和生物安全性等问题,将在毕赤酵母中开展后续的研究工作。通过对KEGG等数据库信息的整合,利用生物合成途径设计软件BioSynther,以VK3和IPP作为底物对MK-4的生物合成途径进行理性设计,并确定催化萘醌骨架与异戊烯基侧链聚合反应的关键酶HsUBIAD1。为了制定更好的蛋白表达策略,对该蛋白的理化性质、结构以及催化活性中心等进行了相关的生物信息学分析。利用生物信息学分析的结果,构建产HsUBIAD1蛋白的重组毕赤酵母,并结合多重筛选机制,获得高产重组毕赤酵母菌株GGU-23。然后在250 mL的摇瓶水平上,对筛选出的高产菌株GGU-23的基本发酵过程参数进行优化,并确定了24℃,初始pH 7.0,培养36h的摇瓶发酵工艺,优化后的GGU-23菌株的生物量达到31.0 g/L,较优化前提高了 6.9%,蛋白表达量提高了 4.8倍。为了表征HsUBIAD1的酶学性质,利用Ni-NTA亲和层析柱和重力型去盐柱从重组GGU-23菌株中获得纯化的HsUBIAD1蛋白,并进行初步的动力学分析,确定了体外的最佳酶促反应体系和条件:初始pH 7.0,31℃,当Mg2+参与的条件下,HsUBIAD1蛋白催化底物VK3异戊烯基化反应的活性最高,较优化前提高了 2.1倍,原因是Mg2+通过与蛋白的活性中心的关键氨基酸发生相互作用,改变其内部构象,使异戊烯基侧链与活性中心氨基酸残基的结合能力增强,进而促进酶促反应的进行。在GGU-23菌株全细胞催化的研究中,发现其具有催化外源VK1和VK3异戊烯基化反应合成MK-4的能力,当以VK3作为全细胞催化体系的底物时,胞内MK-4的含量达到2.03 mg/L,实现了初代重组毕赤酵母菌株从无到有合成MK-4的突破。为了获得新一代的细胞工厂,需要对初代细胞工厂的细胞性能进行优化,提高其MK-4的合成能力。通过构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体,将外源侧链合成途径的关键酶SaGGPPS整合到产MK-4的初代毕赤酵母细胞中,强化侧链合成前体GGPP的供给,使全细胞催化体系中MK-4的含量提高了 62.1%;再通过融合表达策略,将SaGGPPS与其上游的PpIDI蛋白进行融合表达,侧链合成途径得到了进一步的优化,MK-4的含量达到5.86 mg/L,较之前又提高了78.1%。实现了毕赤酵母菌株（GGU-GrIG）目标产物合成性能从低到高的优化。为了进一步挖掘优化后的毕赤酵母细胞工厂的应用潜力,继续对工程菌GGU-GrIG合成MK-4的全细胞催化工艺进行优化,摸索出最合适的工艺参数,即在30℃,250 rpm的条件下,从催化反应开始起每间隔6 h,向催化体系中添加40 mg/L VK3溶液,连续培养18 h最有利于MK-4的生物合成。工程菌经过优化,MK-4产量达到7.55 mg/L,较优化前提高了 28.8%,表现出良好的稳定性和应用潜力。
武晓乐[7]（2020）在《酿酒酵母中ARS对外源基因表达及DNA复制鲁棒性的影响》文中指出酿酒酵母作为真核模式微生物,广泛应用于合成生物学和代谢工程研究。外源基因在酵母中表达受到多因素的调控,在宿主中更好的表达外源基因得到了越来越多的关注。首先从酿酒酵母基因组位点效应出发,以红色荧光蛋白（RFP）作为报告基因,建立一套在全基因组范围内检测整合位置对外源基因表达影响的方法。通过对1044个整合位置的检测,结果显示重组菌株的相对荧光强度从0.98-12.98,最大差异达到13.2倍。极高组和极低组中的重组菌株数目仅仅占到总数的15.5%,并且发现近着丝粒和近端粒区域外源基因表达较低,同时证明染色体的构象也会影响外源基因表达。实验发现酿酒酵母中拷贝数不是引起位点效应的原因,报告基因转录后的翻译过程同样存在位点效应。分别研究了不同报告基因、启动子和碳源对基因表达位点效应的影响,结果发现位点效应基本不受上述因素影响,说明位点效应具有很好的鲁棒性。以类胡萝卜素代谢通路作为报告基因时,发现位点效应的适用范围存在局限性。对全基因组位点效应深入分析发现,自主复制序列（autonomously replicating sequence,ARS）会影响到外源基因的表达。将RFP作为报告基因整合在III号染色体不同活性ARS附近,RFP的相对荧光强度从1.79到10.27,将外源基因整合在强活性ARS附近时,基因表达显着高于整合在弱活性ARS附近。ARS305（强活性ARS）会促进弱活性ARS附近的RFP表达,但是强活性ARS之间没有协同作用。ARS活性对外源基因表达的影响与外源基因的引入形式无关,而且这一现象还会受到染色体的3D结构影响。实验中发现ARS的缺失并未影响到菌株的生长,为了探究ARS缺失后DNA复制鲁棒性的机制,在独立的合成型V号染色体左臂的基础上,将明确的ARS、疑似的ARS和可能的ARS进行敲除,重组菌株的生长并未受到影响。通过ACS模型预测潜在的ARS以及染色体区域化分析,在染色体上探寻到一些活性较弱的ARS,在染色体上将这些ARS迭代删除后,重组菌株依旧可以生长,但是ARS缺失菌株对于DNA复制压力更为敏感。另外,通过Ch IP-q PCR和质粒丢失率实验证明,酿酒酵母中当明确的ARS缺失或功能被抑制的时候,原本活性较弱ARS的DNA复制起始活性出现显着的增加,这一机制使得DNA复制和染色体的稳定更具有鲁棒性。
张凯月[8]（2020）在《细菌和酿酒酵母精简基因组设计》文中提出近年来,必需基因相关研究成果的迅速积累极大地推动了最小基因组的研究进程。必需基因与最小基因组作为合成生物学领域的研究热点之一,也是生物学家认识生命本质,解读遗传密码的必要手段。同时其相关研究成果极大地推动了代谢组学,发育遗传学等相关学科的发展,对发酵业,制药业等应用领域也产生了十分重要的影响。在课题组对必需基因与最小基因组原有的研究基础上,本文对原始数据进行了大幅度更新,并引入了序列结构设计,联合致死等新方法用于构建普适性更高的最小基因组。针对原核生物与真核生物,本文的最小基因组设计工作主要分为两个部分。首先本文使用最新CEG数据库中29个物种的必需基因团簇模型,通过半数保留法筛选出266个保守必需基因团簇。通过RAST SEED在线服务对其进行重注释后,利用MetaNetX代谢网络分析工具进行代谢通路分析,增补了78个相关基因以补全代谢通路,增加最小基因组的成活率。在底盘细胞的选择上,我们采用被广泛研究的模式生物大肠杆菌,以JCVI-syn3.0的设计思路为参考,在大肠杆菌基因组上进行基因的增补与删减。在最小基因组设计过程中,本文充分考虑了基因组结构,调控原件等问题。最小基因组共包含了405个基因,除344个蛋白编码必需基因外,还保留了39个tRNA基因,22个rRNA基因。在设计过程中,我们还发现了原核生物必需基因成簇分布的倾向性,并对其生物学意义进行了初步探究。在真核生物精简基因组设计方面,由于真核生物遗传物质以染色体的方式存在,且真核生物相较于原核生物有更加复杂的细胞结构,意味着真核生物所需的必需基因数目远远大于原核生物。本文从酿酒酵母XII号染色体左臂入手,结合必需基因实验数据,通过功能多拷贝,基因间相互作用,联合致死等分析,对XII号染色体左臂上的65个基因进行了必需性评级,为后续酵母及其他真核生物的精简基因组设计工作提供一定的借鉴思路与方法。
邢燕子[9]（2020）在《密码子偏好在翻译前水平对基因表达的影响研究》文中认为密码子偏好是普遍存在于真核生物和原核生物中的一种现象。编码同种氨基酸的不同密码子称为同义密码子,而同义密码子在各基因组中使用频率不同的现象称为密码子偏好。研究表明密码子偏好与蛋白翻译有着密切的联系,例如密码子偏好可以影响蛋白翻译效率、蛋白构象以及蛋白功能等。近年来有研究表明密码子偏好对基因转录也有着调控作用。在粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中,密码子偏好可以通过改变组蛋白修饰水平而调控基因的转录。然而,密码子偏好在其他基因组中是否有类似的功能,以及对基因表达的具体调控机制如何尚未有明确结论。因此本课题就密码子偏好如何在翻译前水平影响基因表达这一问题进行了探究。首先,本课题在大肠杆菌（Escherichiacoli）中,以淀粉酶基因amyA为研究对象,探究在原核生物中密码子偏好对基因转录的影响。我们首先确认了amyA的密码子优化序列具有更高的翻译效率,同时发现mRNA水平也随着密码子优化而降低。进一步分析mRNA水平降低的原因,我们认为部分是由于密码子优化后mRNA的稳定性降低,这属于转录后层面调控。同时密码子优化带来的序列改变大量增加了DNA胞嘧啶甲基化位点,我们确认了这些位点在细胞中确实都被甲基化。通过敲除Dcm甲基转移酶发现优化前和优化后基因的mRNA水平都有所下降,但是优化后基因下调的比例更大。因此胞嘧啶甲基化水平可能也是影响mRNA水平的因素之一,这属于转录层面调控。密码子优化可能改变DNA甲基化程度从而来影响mRNA的表达水平,但是还需要更多的后续研究验证其普适性和具体机制。其次,本课题在毕赤酵母（Pichiapastoris）中,以PAS chr2-20376基因为研究对象,研究密码子偏好对不同组蛋白修饰以及转录活跃性的影响。通过针对RNA聚合酶Ⅱ CTD结构域、组蛋白H3K36me3、组蛋白H3K9ac的染色质免疫共沉淀（ChIP）实验结合荧光定量PCR和二代测序发现,优化后基因上游的GAP启动子具有较高的RNA聚合酶Ⅱ富集程度,代表着较高的转录活性,同时也具有较高H3K36me3水平,二者可能存在关联。而基因ORF内部在密码子优化前后H3K9ac程度差异随着5’至3’端有着不同的趋势,H3K36me3水平基本相同。因此,ORF区域的密码子优化可能通过改变DNA结构等某种机制影响附近区域（尤其是启动子）的组蛋白修饰水平和转录起始功能。
王丹[10]（2020）在《酿酒酵母基因组复制起始点序列分析及预测》文中研究指明完整和精确的DNA复制过程对于每个生物来说都是至关重要的,发生DNA解旋和起始复制的特殊位点称为复制起始点（Origin of replication,ORI）。复制起始点的序列表征与预测对于进一步解析真核生物的DNA复制机制至关重要。随着测序技术的飞速发展,测序数据呈指数式增长,如何从海量数据中挖掘出有价值的信息、模型、规律或思路,逐步成为生物信息学研究的主要内容。本论文分别从酿酒酵母全基因组、酿酒酵母群体基因组以及酵母近缘种间基因组的角度,分别对复制起始点进行系统性序列特征分析。随后基于Z曲线理论和机器学习的方法,开发了能够在全基因组水平预测酿酒酵母基因组中潜在复制起始点的算法,并构建了用户友好型网上服务Ori-Finder 3及复制起始点数据库。文章第一部分分别从酿酒酵母全基因组角度以及酿酒酵母群体基因组角度对复制起始点的序列保守性展开分析。结果表明在参考基因组S.cerevisiae S288C中,94.32%的自主复制序列（Autonomously replicating sequence,ARS）是唯一的,而具有高序列相似度的ARSs则倾向位于染色体的亚端粒区域。随后通过对近百株高完整度的酿酒酵母基因组中的同源ARSs分析发现82.7%的ARSs不仅在序列水平具有保守性,而且在基因组的相对位置上也具有较高的保守性,而非保守的ARSs则倾向于分布在染色体的亚端粒区域。参照泛基因组分析方法对酿酒酵母群体基因组中的复制起始序列进行了泛复制起始点分析（Pan-ARS）,确定了酿酒酵母种群中的183个核心ARSs。通过提取酿酒酵母种群中复制起始点的临近基因,发现与DNA复制起始功能相关的基因,如orc3、mcm2、mcm4、mcm6和cdc45保守地分布于复制起始点周围。通过对保守ARSs的临近基因进行功能富集分析,结果表明这些基因显着富集在与DNA结合、酶活性、转运和能量传递等相关代谢通路中,而对于与非保守ARSs的临近基因则显着富集在与响应环境压力、代谢产物的合成和抗生素合成等相关的代谢通路中。文章第二部分分别从上千株酿酒酵母种内以及近缘酵母种间的复制起始序列的演化关系展开分析。研究发现在1011株酿酒酵母的26类分支的代表菌株中,与中国分支相关酿酒酵母菌株的复制起始区域展现出更多的遗传多样性。通过对上千株酿酒酵母复制起始区域的SNP（Single nucleotide polymorphism）信息进行主成分分析发现非中国来源的菌株聚为一类,该结果支持了酿酒酵母起源于中国（Out-ofChina origin）的学说。通过对上千株酿酒酵母的复制起始序列进行系统发育分析,发现这些来自于全球不同国家的不同分离环境的酿酒酵母菌株具有较明显的分支。随后利用比较基因组学的方法对近缘酵母基因组进行多序列比对,得到了较为准确的近缘酵母种间同源复制起始序列,结果表明与S.cerevisiae进化距离越远的酵母种,其同源复制起始序列含有的SNP越多,而这些SNP在复制起始序列中并不是均匀分布的。对于某些ARS序列来说,不同近缘酵母种中同源ACS序列中产生的突变可能是造成不同酵母种复制时间谱差异的原因。文章第三部分围绕预测酿酒酵母基因组中的复制起始序列展开研究。首先利用Z曲线理论对DNA序列中的AT-rich区域进行分割,生成同时具有ACS基序和AT-rich特征的候选ARSs,随后采用机器学习方法对候选ARSs进行筛选,从而开发出能够在酿酒酵母基因组水平预测潜在复制起始点的算法,并构建了用户友好型网上服务Ori-Finder 3,其访问地址为:http://tubic.tju.edu.cn/Ori-Finder3。此外,通过利用Ori-Finder 3对近百株高完整度的酿酒酵母基因组进行复制起始序列的预测,并以此构建复制起始序列数据库,为今后进一步挖掘及探究复制起始点序列特征提供数据基础。
二、原核生物和酵母基因组中起始密码的特征分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、原核生物和酵母基因组中起始密码的特征分析（论文提纲范文）
（1）盐环境来源微生物多相分类及嗜盐古菌基因组适应性与演化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 盐环境与微生物 |
| 1.1.1 盐环境的多样性 |
| 1.1.2 盐环境中微生物的多样性 |
| 1.1.3 微生物的耐盐或嗜盐机制 |
| 1.1.4 嗜盐微生物的应用 |
| 1.2 微生物多相分类学 |
| 1.2.1 微生物分类学的发展 |
| 1.2.2 微生物多相分类学的研究内容 |
| 1.2.3 组学时代微生物多相分类学的挑战 |
| 1.3 高通量测序技术 |
| 1.3.1 测序技术的发展历程 |
| 1.3.2 微生物基因组研究 |
| 1.3.4 宏基因组研究 |
| 1.4 嗜盐古菌 |
| 1.4.1 古菌——生命的第三域 |
| 1.4.2 嗜盐古菌概述 |
| 1.4.3 嗜盐古菌的基因组研究 |
| 1.4.4 基因组中新基因的起源与演化 |
| 1.5 本研究的目的、意义与内容概述 |
| 第二章 典型盐湖的微生物多样性和群落结构研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 环境和样品 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 菌株的分离与保藏 |
| 2.1.4 16S r RNA基因序列分析 |
| 2.1.5 多样性指数计算方法 |
| 2.1.6 宏基因组分析方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 阿牙克库木湖群落结构分析 |
| 2.2.2 玛纳斯湖群落结构分析 |
| 2.2.3 其他盐湖可培养微生物多样性 |
| 2.2.4 盐湖可培养微生物多样性指数分析 |
| 2.2.5 盐湖可培养微生物群落结构比较 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 6 株盐环境来源微生物多相分类学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株来源 |
| 3.1.2 菌株的培养与保藏 |
| 3.1.3 多相分类学研究方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 菌株WM3~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.2 菌株B3~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.3 菌株15181~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.4 菌株15182~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.5 菌株63075~T的多相分类学研究结果 |
| 3.2.6 菌株W635~T的多相分类学研究结果 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 嗜盐古菌基因组适应性与演化研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株来源 |
| 4.1.2 测序方案的选择 |
| 4.1.3 菌株Salinigranum rubrum GX10~T基本信息 |
| 4.1.4 菌株GX10~T培养基和培养条件 |
| 4.1.5 基因组DNA的提取和检测 |
| 4.1.6 测序和组装 |
| 4.1.7 基因组注释及分析 |
| 4.1.8 菌株GX10~T新基因注释与分析 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 测序所获得的基因组 |
| 4.2.2 菌株GX10~T基因组DNA提取结果 |
| 4.2.3 菌株GX10~T测序和组装结果 |
| 4.2.4 菌株GX10~T基因组基本特征 |
| 4.2.5 菌株GX10~T基因COG功能注释 |
| 4.2.6 菌株GX10~T对高盐环境的适应分析 |
| 4.2.7 菌株GX10~T对强辐射环境适应机制分析 |
| 4.2.8 菌株GX10~T CRISPR-Cas系统相关基因 |
| 4.2.9 菌株GX10~T基因组中重金属抗性与代谢相关的基因 |
| 4.2.10 菌株GX10~T新基因的起源与演化 |
| 4.2.11 菌株GX10~T基因组中嗜盐酶相关基因 |
| 4.2.12 菌株GX10~T基因组中PHA合成相关基因 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 细菌多相分类学鉴定方法 |
| 附录 Ⅱ 嗜盐古菌模式菌株基因组圈图 |
| 附录 Ⅲ 新基因注释用到的代码 |
| 攻读学位期间发表的学术论文(含待发表) |
| 致谢 |
（2）基于遗传密码扩展技术构建复制可控的重组口蹄疫病毒的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 遗传密码子扩展技术 |
| 1.1.1 遗传密码的扩展与非天然氨基酸 |
| 1.1.2 遗传密码子扩展技术原理 |
| 1.1.3 遗传密码子扩展技术的应用 |
| 1.1.4 遗传密码子扩展技术在病毒学领域的应用 |
| 1.1.5 小结 |
| 1.2 口蹄疫及其疫苗研究进展 |
| 1.2.1 口蹄疫概述 |
| 1.2.2 口蹄疫病毒的分子生物学特征 |
| 1.2.3 口蹄疫疫苗 |
| 1.2.4 小结 |
| 1.3 选题的目的和意义 |
| 1.4 研究的主要内容和基本思路 |
| 1.4.1 本研究的主要内容 |
| 1.4.2 本研究的基本思路 |
| 第二章 携带琥珀密码子解码机制的正交翻译稳定细胞系的构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 试剂和耗材 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 基因设计与合成 |
| 2.2.2 质粒DNA的提取 |
| 2.2.3 质粒构建 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 细胞系的筛选 |
| 2.2.6 正交翻译功能的鉴定 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 Western Blot |
| 2.2.9 病毒包装 |
| 2.2.10 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.2.11 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.12 数据统计学分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 正交翻译元件表达质粒构建与鉴定 |
| 2.3.2 琥珀终止密码子解码功能的鉴定 |
| 2.3.3 非天然氨基酸插入效率的鉴定 |
| 2.3.4 正交翻译细胞克隆的筛选与鉴定 |
| 2.3.5 非天然氨基酸浓度对正交翻译的影响 |
| 2.3.6 转基因细胞系的遗传稳定性分析 |
| 2.3.7 转基因细胞系对病毒拯救系统的兼容性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 携带提前终止密码子的重组FMDV的构建与拯救 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 试剂和耗材 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 氨基酸突变位点的选择 |
| 3.2.2 氨基酸的保守性分析 |
| 3.2.3 PTC-FMDV的设计与构建 |
| 3.2.4 重组PTC-FMDV的拯救 |
| 3.2.5 病毒RNA的提取 |
| 3.2.6 重组PTC-FMDV的鉴定 |
| 3.2.7 病毒包装效率的评估 |
| 3.2.8 重组PTC-FMDV的遗传稳定性分析 |
| 3.2.9 病毒噬斑纯化 |
| 3.2.10 双点PTC-FMDV的设计与拯救 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 重组PTC-FMDV构建的可行性探索 |
| 3.3.2 FMDV蛋白的氨基酸保守性分析 |
| 3.3.3 PTC突变位点的筛选 |
| 3.3.4 重组PTC-FMDV包装效率的评估 |
| 3.3.5 重组PTC-FMDV遗传稳定性分析 |
| 3.3.6 病毒噬斑纯化结果 |
| 3.3.7 Dual-PTC-FMDV的构建与评估 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 携带四联体密码子的重组FMDV的构建与拯救 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 试剂和耗材 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 基因合成 |
| 4.2.2 质粒构建 |
| 4.2.3 细胞转染 |
| 4.2.4 四联体密码子解码功能的鉴定 |
| 4.2.5 非天然氨基酸的筛选 |
| 4.2.6 细胞系的筛选 |
| 4.2.7 细胞系的鉴定 |
| 4.2.8 重组TAGA-FMDV拯救质粒的构建 |
| 4.2.9 重组TAGA-FMDV的拯救 |
| 4.2.10 重组TAGA-FMDV突变体的鉴定 |
| 4.2.11 重组TAGA-FMDV的遗传稳定性分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 四联体密码子解码元件表达质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.2 四联体密码子解码功能的鉴定 |
| 4.3.3 非天然氨基酸的筛选 |
| 4.3.4 稳定细胞系的筛选与鉴定 |
| 4.3.5 重组TAGA-FMDV拯救质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.6 重组TAGA-FMDV的拯救 |
| 4.3.7 重组TAGA-FMDV的鉴定 |
| 4.3.8 重组TAGA-FMDV的遗传稳定性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 表A-1实时荧光定量PCR引物和探针序列表 |
| 附录B 表B-1PTC-FMDV构建引物序列表 |
| 附录C 表C-1TAGA-FMDV构建引物序列表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）解旋酶Pif1二聚化的结构机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 解旋酶 |
| 1.1.1 解旋酶的定义及其与核酸代谢的相关性 |
| 1.1.2 解旋酶的发现史及疾病相关性 |
| 1.1.3 解旋酶的催化方式 |
| 1.1.4 解旋酶的工作模型 |
| 1.1.5 解旋酶的基序 |
| 1.1.6 解旋酶的分类 |
| 1.2 G4 DNA结构 |
| 1.2.1 G4结构概述 |
| 1.2.2 G4结构分布区域 |
| 1.2.3 G4结构的生物学意义 |
| 1.3 Pif1 解旋酶 |
| 1.3.1 Pif1的功能及重要性 |
| 1.3.2 Pif1解旋酶的分类 |
| 1.3.3 Pif1的保守结构域 |
| 1.3.4 Pif1解旋G4 结构的重要性 |
| 1.3.5 Pif1解旋酶的研究进展 |
| 第二章 ToPif1解旋酶的表达纯化及生化特征 |
| 2.1 实验材料、缓冲液的配置以及使用的仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验设备 |
| 2.1.3 基因、菌株以及表达载体 |
| 2.1.4 蛋白提取液成分 |
| 2.1.5 酶学检测缓冲液组分 |
| 2.2 实验操作步骤 |
| 2.2.1 ToPif1及其突变体重组质粒构建 |
| 2.2.2 野生型ToPif1蛋白及其突变体的表达纯化 |
| 2.2.3 ToPif1基本酶学性质的测定 |
| 2.3 实验结果分析 |
| 2.3.1 全长ToPif1序列分析及二级结构预测 |
| 2.3.2 野生型ToPif1载体构建及蛋白表达纯化 |
| 2.3.3 ToPif1蛋白的DNA结合能力检测 |
| 2.3.4 ToPif1蛋白的DNA解链能力检测 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 第三章 ToPif1的晶体筛选实验 |
| 3.1 主要实验设备、试剂及材料 |
| 3.1.1 主要实验设备 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.2 实验步骤 |
| 3.2.1 ToPif1蛋白晶体筛选及优化 |
| 3.2.2 ToPif1-dsDNA-ADP·AlF_4的复合晶体筛选及优化 |
| 3.2.3 ToPif1-ssDNA-ATP analogs/ADP的复合晶体筛选及优化 |
| 3.2.4 ToPif1单蛋白及不同复合体的晶体衍射及结构解析 |
| 3.3 实验结果分析 |
| 3.3.1 ToPif1晶体筛选及结构解析 |
| 3.3.2 ToPif1蛋白整体结构的分析 |
| 3.3.3 ToPif1蛋白二硫键交联结构的分析 |
| 3.3.4 ToPif1与双链底物复合体的结构分析 |
| 3.3.5 ToPif1核苷酸结合位点的分析 |
| 3.3.6 ToPif1与单链DNA结合位点的分析 |
| 3.3.7 章节总结与讨论 |
| 第四章 ToPif1的构象变化与解旋活性的相关性 |
| 4.1 实验所用的设备、试剂及材料 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 实验设备 |
| 4.1.3 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 蛋白及核酸底物制备 |
| 4.2.2 单分子实验 |
| 4.2.2.1 单分子反应样品室的制作 |
| 4.2.2.2 单分子反应操作 |
| 4.2.2.3 单分子数据分析 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 突变体蛋白S69C/S405C的荧光标记结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 ToPif1 二聚化对解旋活性的调控机制 |
| 5.1 实验设备、试剂和材料 |
| 5.1.1 实验设备 |
| 5.1.2 本章节所用试剂 |
| 5.1.3 本章节所用材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 蛋白及核酸底物制备 |
| 5.2.2 ToPif1聚集状态及均一性检测 |
| 5.2.3 圆二色谱法分析蛋白二级结构 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 ToPif1不同晶型(I-V)的结构分析 |
| 5.3.2 ToPif1与dGR_(17)复合的晶体结构分析 |
| 5.3.3 溶液中的ToPif1蛋白可由DNA诱导形成二聚体 |
| 5.3.4 针对二聚界面的点突变体活性检测 |
| 5.3.5 突变体E409C-DNA复合物的光漂白实验 |
| 5.3.6 ToPif1蛋白的预稳态实验分析 |
| 5.3.7 小结与讨论 |
| 第六章 总结与创新 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）基因组序列k-mer频谱的内在规律和基因组序列的进化机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 k-mer研究进展 |
| 1.2 物种进化研究进展 |
| 1.2.1 序列比对算法 |
| 1.2.2 序列非比对算法 |
| 1.3 DNA甲基化 |
| 1.3.1 DNA甲基化酶 |
| 1.3.2 DNA去甲基化酶 |
| 1.4 DNA序列的特征参量 |
| 1.4.1 G+C含量 |
| 1.4.2 CG二核苷比率 |
| 1.5 进化争议物种介绍 |
| 1.6 论文结构 |
| 第二章 数据集与研究方法 |
| 2.1 数据集 |
| 2.1.1 物种全基因组序列的提取 |
| 2.1.2 氨基酸序列 |
| 2.2 k-mer频谱 |
| 2.3 随机分布中心频次 |
| 2.4 XY二核苷分类方法 |
| 2.5 XYZ三核苷分类方法 |
| 2.6 频谱的平均值和标准差 |
| 2.7 频谱分离度和保守度 |
| 2.8 CpG抑制强度 |
| 2.9 构建进化树方法 |
| 2.9.1 CG独立选择规律构建进化树 |
| 2.9.2 氨基酸序列构建进化树 |
| 2.10 统计分析方法 |
| 2.10.1 相关性分析 |
| 2.10.2 F检验 |
| 第三章 基因组序列独立选择规律 |
| 3.1 随机序列的k-mer频谱分布中心 |
| 3.2 基因组序列的k-mer频谱特征 |
| 3.3 基因组序列CG独立选择规律 |
| 3.4 基因组序列TA独立选择规律 |
| 3.5 CG和TA独立选择现象的定量表征 |
| 3.6 分离度和保守度的关系 |
| 3.7 XYZ三核苷分类下的k-mer频谱 |
| 3.8 总结与讨论 |
| 第四章 独立选择规律与基因组进化的关系 |
| 4.1 CG和TA独立选择特征的统计检验 |
| 4.2 独立选择规律的特征参数分析 |
| 4.3 物种基因组独立选择强度图谱 |
| 4.3.1 动物基因组 |
| 4.3.2 植物基因组 |
| 4.3.3 真菌基因组 |
| 4.3.4 细菌基因组 |
| 4.4 基因组序列的进化机制 |
| 4.5 基因组中各类序列的独立选择强度 |
| 4.6 总结与讨论 |
| 第五章 独立选择规律与基因组序列基本特征量的关系 |
| 5.1 独立选择规律与基因组G+C含量的关系 |
| 5.2 独立选择强度制约G+C含量的机制 |
| 5.3 独立选择规律与Cp G抑制强度的关系 |
| 5.4 CG独立选择规律制约Cp G抑制强度的机制 |
| 5.5 总结与讨论 |
| 第六章 早期生物基因组的进化模式 |
| 6.1 生命演化的基本过程 |
| 6.2 研究基因组演化的方法 |
| 6.3 早期原核生物进化状态和过程推测 |
| 6.4 不同真核生物起源的推测 |
| 6.5 总结与讨论 |
| 第七章 独立选择模式与物种的生活习性 |
| 7.1 三种真菌独立选择模式与其生活习性的关系 |
| 7.1.1 伞菌 |
| 7.1.2 子囊菌 |
| 7.1.3 酵母 |
| 7.2 古细菌独立选择模式与其生活习性的关系 |
| 7.3 真细菌独立选择模式与其生活习性的关系 |
| 7.4 总结和讨论 |
| 第八章 独立选择规律解释腔棘鱼进化的特殊性 |
| 8.1 腔棘鱼基因组序列的进化水平 |
| 8.2 腔棘鱼全基因组序列的Cp G抑制水平 |
| 8.3 腔棘鱼的进化位置 |
| 8.3.1 依据CG子集特征构建进化树 |
| 8.3.2 DNA甲基化酶 |
| 8.3.3 DNA去甲基化酶 |
| 8.4 总结与讨论 |
| 第九章 总结与展望 |
| 9.1 总结 |
| 9.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 1 |
| 附表 1 |
| 附表 2 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表和完成的学术论文 |
（5）基因组中关键基因的理论识别研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环境适应关键基因概述 |
| 1.1.1 环境适应性概述 |
| 1.1.2 环境适应性相关的基因 |
| 1.2 优化生长关键基因(必需基因)概述 |
| 1.2.1 必需基因的概念及研究进展 |
| 1.2.2 理论识别必需基因的研究进展 |
| 1.3 与本研究相关的在线资源与概念 |
| 1.3.1 NCBI中的注释信息和表达数据信息 |
| 1.3.2 蛋白同源簇数据库 |
| 1.3.3 KEGG数据库 |
| 1.4 论文整体设计及构造 |
| 1.4.1 研究目的及意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 原核生物中氧气的环境适应性关键基因的挖掘 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究采用的数据 |
| 2.2.2 不同类别微生物COG的比较及阈值的确定 |
| 2.2.3 结合表达数据来精简COG |
| 2.2.4 通过酶注释来进一步筛选COG |
| 2.2.5 进化树的绘制和进化分析 |
| 2.2.6 互作和代谢网络分析及统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 氧气利用相关的关键COG初筛 |
| 2.3.2 精简与氧气利用相关的关键COG |
| 2.3.3 通过酶注释来寻找与氧气相关的酶及对应的COG |
| 2.3.4 氧气利用相关的COG之间的互作 |
| 2.3.5 COG之间存在偶联反应且在代谢网络中更紧密地联系 |
| 2.3.6 eggNOG-mapper注释物种并获取门特异的COG |
| 2.3.7 27个好氧COG之间进化树的比较 |
| 2.3.8 地球上氧气出现时间及氧气利用基因出现时间的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 必需基因预测软件Geptop的升级 |
| 3.1 Geptop预测软件及预测原理 |
| 3.2 升级后数据 |
| 3.2.1 新增数据 |
| 3.2.2 新的改进 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 交叉验证证明Geptop2.0的性能要优于Geptop1.0 |
| 3.3.2 Geptop2.0比其余的必需基因预测模型要优越 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Geptop2.0性能的稳定性评估 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 必需基因团簇数据库(CEG)的升级更新 |
| 4.1 CEG1.0的概况 |
| 4.2 CEG V2的数据及服务 |
| 4.2.1 CEG V2增加的数据 |
| 4.2.2 CEG V2增加的药物相关信息 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 CEG V2收录内容的概况和页面设置 |
| 4.3.2 CEG V2的浏览页面 |
| 4.3.3 CEG V2的搜索页面 |
| 4.3.4 CEG V2的预测、帮助及下载页面 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 CEG V2可以帮助验证新的必需基因 |
| 4.4.2 CEG_Match2.0和其余预测软件的比较 |
| 4.4.3 进化距离可以辅助预测必需基因 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 人类癌症细胞系必需基因的预测及验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 预测选用的数据 |
| 5.2.2 序列组成相关特征的提取 |
| 5.2.3 保守性相关特征的提取 |
| 5.2.4 进化快慢特征的提取 |
| 5.2.5 蛋白质相互作用特征的提取 |
| 5.2.6 GO注释特征的提取 |
| 5.2.7 表达数据特征的提取 |
| 5.2.8 特征整合和建模预测 |
| 5.2.9 细胞系的选择和sgRNA的设计 |
| 5.2.10 CRISPR-Cas9文库的构建以及相应的敲除实验 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 单独特征的预测准确率和预测的必需性得分之间的关联性 |
| 5.3.2 holdout方法对不同比例的数据集预测的准确率和AUC的对比 |
| 5.3.3 使用精简数据集预测三种类型的基因的必需基因分数 |
| 5.3.4 五类基因的保守性和度的分布范围的比例对比 |
| 5.3.5 针对四类基因用t检验对两类特征进行差异显着性分析 |
| 5.3.6 采用CRISPR-Cas9方法对181个基因在7个细胞系中进行验证 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（6）基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 维生素K |
| 1.1.1 维生素K的发现历程 |
| 1.1.2 维生素K的性质 |
| 1.1.3 维生素K2的功能与应用 |
| 1.1.4 维生素K2的生物合成 |
| 1.2 合成生物学及其应用 |
| 1.2.1 合成生物学的概念 |
| 1.2.2 合成生物学的研究内容 |
| 1.2.3 合成生物学的应用 |
| 1.3 蛋白表达系统 |
| 1.3.1 重组蛋白表达系统 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4 本论文研究的内容与意义 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 大肠杆菌四烯甲萘醌生物合成途径的构建与优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 培养基和溶液 |
| 2.2.5 大肠杆菌MK-4生物合成途径的构建 |
| 2.2.6 利用Red重组系统无痕敲除大肠杆菌pgi基因 |
| 2.2.7 胞内产物的提取和检测 |
| 2.2.8 胞内NADPH含量的检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 大肠杆菌MK-4生物合成途径的构建 |
| 2.3.2 大肠杆菌pgi基因缺失菌株的构建 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 毕赤酵母四烯甲萘醌生物合成途径的理性设计 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 理性设计以VK3和IPP为底物的MK-4生物合成途径 |
| 3.2.2 MK-4生物合成途径中关键酶HsUBIAD1的生物信息学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 毕赤酵母MK-4生物合成途径的理性设计 |
| 3.3.2 MK-4生物合成途径中关键酶HsUBIAD1的生物信息学分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 毕赤酵母四烯甲萘醌生物合成途径的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种和质粒 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 培养基和溶液 |
| 4.2.5 HsUBIAD1蛋白表达载体的构建 |
| 4.2.6 构建产HsUBIAD1重组毕赤酵母 |
| 4.2.7 高产HsUBIAD1重组毕赤酵母的筛选 |
| 4.2.8 高产菌株蛋白表达条件的优化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 重组HsUBIAD1表达载体的构建 |
| 4.3.2 高产HsUBIAD1重组毕赤酵母的筛选 |
| 4.3.3 重组HsUBIAD1蛋白表达条件优化 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 重组HsUBIAD1蛋白的纯化和鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种和质粒 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.2.4 培养基和溶液 |
| 5.2.5 重组HsUBIAD1蛋白的纯化 |
| 5.2.6 重组HsUBIAD1蛋白的酶学分析 |
| 5.2.7 重组GGU-23菌株全细胞催化反应 |
| 5.2.8 异戊烯基化产物的提取与检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 重组HsUBIAD1蛋白的纯化 |
| 5.3.2 重组HsUBIAD1蛋白的催化活性 |
| 5.3.3 异戊烯基化产物的鉴定 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 毕赤酵母四烯甲萘醌侧链生物合成途径的优化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌种和质粒 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器设备 |
| 6.2.4 培养基和溶液 |
| 6.2.5 构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体 |
| 6.2.6 构建PpIDI和SaGGPPS融合表达载体 |
| 6.2.7 构建GGU-GrG和GGU-GrIG重组毕赤酵母 |
| 6.2.8 筛选GGU-GrG和GGU-GrIG重组毕赤酵母 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体 |
| 6.3.2 融合表达SaGGPPS和PpIDI强化侧链前体的供给 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 工程菌全细胞催化合成四烯甲萘醌的工艺优化 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 菌种和质粒 |
| 7.2.2 主要试剂 |
| 7.2.3 培养基和溶液 |
| 7.2.4 全细胞催化工艺的优化 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 全细胞催化工艺的优化 |
| 7.3.2 工程菌的传代稳定性 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（7）酿酒酵母中ARS对外源基因表达及DNA复制鲁棒性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 外源基因的表达 |
| 1.1.1 酿酒酵母中外源基因的表达及引入方式 |
| 1.1.2 外源基因表达的影响因素 |
| 1.2 位点效应 |
| 1.2.1 位点效应对原核生物基因表达的影响 |
| 1.2.2 位点效应对高等真核生物基因表达的影响 |
| 1.2.3 位点效应对酵母基因表达的影响 |
| 1.3 DNA复制起始位点的功能性 |
| 1.3.1 不同生物的复制起始位点 |
| 1.3.2 复制起始位点对基因表达的影响 |
| 1.4 潜在ARS的探寻 |
| 1.4.1 ARS的预测方法 |
| 1.4.2 ARS的缺失 |
| 1.5 本课题的研究意义和研究内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 酵母菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 培养基配方 |
| 2.1.4 溶液 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 实验试剂和材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子生物学方法 |
| 2.2.2 分析检测方法 |
| 第3章 酿酒酵母基因组位点效应全景 |
| 3.1 表达盒的构建和筛选 |
| 3.1.1 表达盒的构建 |
| 3.1.2 重组菌中表达盒的筛选 |
| 3.2 表达盒在全基因组范围的整合 |
| 3.2.1 整合位点的选择及酵母重组菌株的构建 |
| 3.2.2 重组菌相对荧光强度的检测 |
| 3.3 位点效应在基因组中的分布规律 |
| 3.3.1 近端粒和近着丝粒区域分析 |
| 3.3.2 极高组和极低组位点分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 位点效应的鲁棒性研究 |
| 4.1 拷贝数和转录对位点效应的影响 |
| 4.1.1 拷贝数的检测与分析 |
| 4.1.2 转录水平的检测与分析 |
| 4.2 启动子和报告基因对位点效应的影响 |
| 4.2.1 启动子强度对位点效应的影响 |
| 4.2.2 报告基因对位点效应的影响 |
| 4.3 缺失基因和筛选标记对位点效应的影响 |
| 4.3.1 基因缺失对位点效应的影响 |
| 4.3.2 筛选标记对位点效应的影响 |
| 4.4 碳源对位点效应的影响 |
| 4.5 位点效应对代谢通路的影响 |
| 4.5.1 类胡萝卜素代谢通路的构建及整合 |
| 4.5.2 位点效应对类胡萝卜素产量的影响 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 ARS活性与基因表达 |
| 5.1 ARS活性对基因表达的影响 |
| 5.1.1 表达盒和重组菌株的构建 |
| 5.1.2 不同活性ARS对基因表达的影响 |
| 5.2 强活性ARS的整合对基因表达的影响 |
| 5.2.1 强活性ARS表达盒的构建及整合 |
| 5.2.2 强活性ARS的引入对基因表达的影响 |
| 5.3 ARS的敲除对基因表达的影响 |
| 5.3.1 相关质粒和重组菌株的构建 |
| 5.3.2 强活性ARS敲除对基因表达的影响 |
| 5.4 染色体结构对基因表达的影响 |
| 5.4.1 表达质粒的构建及导入 |
| 5.4.2 染色体结构与ARS共同对基因表达的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 合成型V号染色体潜在ARS的探究 |
| 6.1 ARS序列的敲除 |
| 6.1.1 明确ARS的敲除 |
| 6.1.2 CRISPR/Cas9介导的合成型V号染色体的断裂 |
| 6.1.3 疑似和可能ARS的删除 |
| 6.2 合成型V号染色体潜在ARS的探究 |
| 6.2.1 明确的ARS两侧序列功能的探究 |
| 6.2.2 基于ACS预测潜在ARS |
| 6.2.3 区域化分析合成型V号染色体左臂 |
| 6.3 小结 |
| 第7章 ARS缺失与染色体稳定性的探究 |
| 7.1 ARS缺失菌株的表征 |
| 7.1.1 ARS缺失菌株的生长表征 |
| 7.1.2 ARS缺失对于DNA复制的影响 |
| 7.2 ARS缺失染色体的鲁棒性 |
| 7.2.1 ARS缺失对于相关基因表达的影响 |
| 7.2.2 潜在复制起始位点对于染色体稳定的影响 |
| 7.3 小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（8）细菌和酿酒酵母精简基因组设计（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 必需基因研究进展 |
| 1.3 最小基因组研究进展 |
| 1.4 本文结构 |
| 第二章 细菌必需基因筛选与最小基因集构建 |
| 2.1 先前工作 |
| 2.2 CEG数据库更新 |
| 2.2.1 物种数目更新 |
| 2.2.2 物种进化关系 |
| 2.3 半数保留法 |
| 2.3.1 半数保留法原理 |
| 2.3.2 样本数据 |
| 2.3.3 结果分析 |
| 2.4 代谢网络分析 |
| 2.5 细菌最小必需基因集 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 细菌最小基因组设计 |
| 3.1 底盘细胞 |
| 3.2 最小基因组设计 |
| 3.2.1 蛋白编码必需基因筛选 |
| 3.2.2 RNA必需基因筛选 |
| 3.2.3 基因组设计原则 |
| 3.3 最小基因组结果 |
| 3.4 必需基因成簇分布现象 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 酿酒酵母精简基因组设计 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 功能多拷贝 |
| 4.3 基因互作与联合致死 |
| 4.4 必需性评级 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 未来工作的展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（9）密码子偏好在翻译前水平对基因表达的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 密码子偏好 |
| 1.2 密码子偏好在翻译水平对蛋白质表达的影响 |
| 1.2.1 密码子偏好对蛋白翻译效率的影响 |
| 1.2.2 密码子偏好对蛋白功能和结构的影响 |
| 1.3 密码子偏好在翻译前水平对基因表达的影响 |
| 1.4 表观遗传修饰对基因表达的调控 |
| 1.4.1 DNA甲基化对基因表达的影响 |
| 1.4.2 组蛋白修饰对基因表达的影响 |
| 1.5 Lambda-Red重组系统介导的同源重组 |
| 1.6 ChIP-Seq技术简述 |
| 1.7 本课题研究的目的与意义 |
| 第2章 大肠杆菌中密码子偏好在转录和转录后层面对基因表达的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验菌株和质粒 |
| 2.2.2 培养基以及培养条件 |
| 2.2.3 主要分子生物试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因和引物设计 |
| 2.3.2 PCR反应和DNA纯化回收 |
| 2.3.3 质粒构建:无缝组装与酶切酶连 |
| 2.3.4 大肠杆菌DH5α钙转感受态制备与转化 |
| 2.3.5 大肠杆菌K-12 MG1655(pKD 46)电转感受态制备 |
| 2.3.6 大肠杆菌质粒抽提和测序验证 |
| 2.3.7 基因敲入与敲除 |
| 2.3.8 大肠杆菌的基因组抽提与重亚硫酸盐转化法 |
| 2.3.9 RNA抽提 |
| 2.3.10 RNA逆转录与实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.11 DNS试剂测定还原糖与淀粉酶酶活检测 |
| 2.3.12 mRNA稳定性测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 amyA基因的密码子优化策略 |
| 2.4.2 含有外源插入基因表达盒质粒的构建 |
| 2.4.3 构建基因组整合型淀粉酶表达菌株 |
| 2.4.4 引物扩增效率的测定 |
| 2.4.5 密码子偏好对amyA基因mRNA水平和蛋白水平的影响 |
| 2.4.6 密码子偏好对amyA的mRNA稳定性的影响 |
| 2.4.7 密码子偏好对胞嘧啶DNA甲基化的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 毕赤酵母中密码子偏好在转录层面对基因表达的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基以及培养条件 |
| 3.2.3 主要分子生物试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 基因和引物设计 |
| 3.3.2 ChIP-qPCR实验 |
| 3.3.3 Bradford蛋白定量 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 PAS_chr2-2_0376基因密码子优化策略 |
| 3.4.2 密码子优化对PAS_chr2-2_0376基因的表达影响 |
| 3.4.3 超声打断DNA最适条件探索 |
| 3.4.4 引物效率测定 |
| 3.4.5 密码子偏好对基因转录活性的影响 |
| 3.4.6 密码子偏好对组蛋白修饰的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 使用ChIP-seq技术研究密码子偏好与基因转录活性和组蛋白修饰的关联性 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验菌株 |
| 4.2.2 培养基以及培养条件 |
| 4.2.3 主要分子生物试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 二代测序 |
| 4.3.2 ChIP-Seq |
| 4.3.3 双链DNA高灵敏度定量 |
| 4.3.4 测序数据处理与分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 Illumia二代测序平台DNA文库构建 |
| 4.4.2 DNA文库测序前的质量控制 |
| 4.4.3 pGAP-0376ori和pGAP-0376opt位点的转录活性比较 |
| 4.4.4 pGAP-0376ori和pGAP-0376opt位点的组蛋白修饰情况比较 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 总结、创新点与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（10）酿酒酵母基因组复制起始点序列分析及预测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 酿酒酵母研究现状 |
| 1.2 生物复制起始点研究现状 |
| 1.3 生物复制起始点的生物信息学研究现状 |
| 1.4 论文主要研究工作及内容安排 |
| 第二章 酿酒酵母复制起始序列的保守性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌株及数据库 |
| 2.2.2 酿酒酵母基因组中ARSs序列相似性的评估 |
| 2.2.3 上百株酿酒酵母基因组中同源ARS序列分析 |
| 2.2.4 复制起始点临近基因的提取与注释 |
| 2.2.5 复制起始点临近基因富集分析 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 基于全基因组水平ARS序列保守性分析 |
| 2.3.2 基于酿酒酵母群体基因组水平的ARS序列保守性分析 |
| 2.3.3 复制起始点临近基因相关功能分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 酿酒酵母复制起始序列的演化分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验数据 |
| 3.2.2 酿酒酵母群体基因中复制起始区域变异信息的提取 |
| 3.2.3 酿酒酵母种内复制起始区域突变频率的计算 |
| 3.2.4 复制起始点系统发育树的构建 |
| 3.2.5 近缘酵母菌株比较基因组学分析 |
| 3.2.6 近缘酵母基因组中复制起始点序列演化分析 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 酿酒酵母种内复制起始点演化分析 |
| 3.3.2 酿酒酵母种间复制起始点演化分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于酿酒酵母全基因组水平预测复制起始序列 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 S.cerevisiae参考基因组及相关复制起始序列数据 |
| 4.2.2 Z曲线分割算法 |
| 4.2.3 酿酒酵母基因组中ACS基序的识别 |
| 4.2.4 基于机器学习方法过滤候选ARSs |
| 4.2.5 评估预测效果的ARSs数据集 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 酿酒酵母基因组中复制起始序列的预测流程 |
| 4.3.2 酿酒酵母基因组中候选ARSs的识别 |
| 4.3.3 基于机器学习方法筛选候选ARSs |
| 4.3.4 评估Ori-Finder3 的预测性能 |
| 4.3.5 网上服务及用户指南 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
四、原核生物和酵母基因组中起始密码的特征分析（论文参考文献）
- [1]盐环境来源微生物多相分类及嗜盐古菌基因组适应性与演化研究[D]. 韩帅波. 浙江大学, 2021(01)
- [2]基于遗传密码扩展技术构建复制可控的重组口蹄疫病毒的研究[D]. 郝荣增. 中国农业科学院, 2021
- [3]解旋酶Pif1二聚化的结构机理研究[D]. 戴阳雪. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]基因组序列k-mer频谱的内在规律和基因组序列的进化机制[D]. 杨振华. 内蒙古大学, 2021(11)
- [5]基因组中关键基因的理论识别研究[D]. 刘硕. 电子科技大学, 2021(01)
- [6]基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化[D]. 孙小雯. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [7]酿酒酵母中ARS对外源基因表达及DNA复制鲁棒性的影响[D]. 武晓乐. 天津大学, 2020(01)
- [8]细菌和酿酒酵母精简基因组设计[D]. 张凯月. 电子科技大学, 2020(08)
- [9]密码子偏好在翻译前水平对基因表达的影响研究[D]. 邢燕子. 华东理工大学, 2020(01)
- [10]酿酒酵母基因组复制起始点序列分析及预测[D]. 王丹. 天津大学, 2020(01)