一、Adsorption and Step Elution of Urokinase Using Affinity Chromatography-Comparison of Data with Rate Model Simulation（论文文献综述）
张轩[1]（2021）在《产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用》文中研究说明枯草芽孢杆菌广泛存在于传统发酵食品内,可产生多种对人体有益的生物活性物质。枯草芽孢杆菌发酵的纳豆因其富含具有抗血栓功能的纳豆激酶（Nattokinase）,作为一种风味食品受到部分消费者的青睐。枯草芽孢杆菌液体发酵生产的纳豆激酶也已被用于抗血栓功能食品或药品的制备。另外,也有报道,口服枯草芽孢杆菌可调节机体肠道菌群和免疫功能,发挥抗炎、抗肿瘤以及延缓衰老等作用。目前,纳豆激酶口服产品的剂型单一,且耐胃酸和肠道缓释能力较差;枯草芽孢杆菌益生菌制剂主要为冻干菌粉,食用人群局限。上述产品的局限性,限制了其应用范围。本研究针对上述产品的不足,利用筛选的同时产生纳豆激酶和凝乳酶的枯草芽孢杆菌菌株,研制了一种新型的枯草芽孢杆菌功能发酵乳和一种纳豆激酶口服缓释制剂,对其制备工艺和相关功能进行了系统研究。主要研究内容和结果如下:首先,用从自然界采集的稻草作为发酵菌种的来源制作纳豆,从自制纳豆浸出液中分离、筛选出产双酶（纤维蛋白溶解酶和凝乳酶）的菌株。通过对菌株形态观察和生化特性检测,结合16S rDNA基因序列测定结果,确定此菌株为枯草芽孢杆菌,命名为B.subtilis JNFE0126。在优化后的培养条件下,该菌株产纳豆激酶活性最高达14512.4IU/mL,产凝乳酶活性最高达875.5 SU/mL,可以满足中性条件下制备凝固型发酵乳的要求。酶抑制剂试验结果表明,发酵液纤溶活性来源于丝氨酸蛋白酶,凝乳活性来源于金属蛋白酶。提取该菌株的DNA,根据基因库中已经报道的纳豆激酶和凝乳酶（金属蛋白酶M4）的基因序列设计引物进行PCR基因调取扩增后测序,结果表明该菌株具有上述两种酶的基因,其序列分别与已经报道的纳豆激酶和金属蛋白酶M4具有高度相似性（同源性分别为99.1%和97.6%）。其次,分别收集B.subtilis JNFE0126纳豆激酶和凝乳酶最高产酶期的发酵液,采用硫酸铵沉淀、离子交换色谱及凝胶过滤色谱分别对纳豆激酶和凝乳酶进行分离纯化,然后用SDS-PAGE检验样品纯度及测定其相对分子质量。结果表明,纯化的纳豆激酶和凝乳酶的相对分子质量分别为27 KD和42 KD左右。纳豆激酶最适温度为40℃,最适pH为7.0,pH 6.0-9.0条件下具有较高的酶活和较好的稳定性。凝乳酶的最适作用温度为55℃,最适pH值为6.5,在pH 6.0-8.0条件下具有较高的酶活,在pH 5-10条件下有较好的的稳定性。在此基础上,研究并优化了B.subtilis JNFE0126发酵鲜牛乳制作凝固型发酵乳的配方和发酵条件,评价了所得产品的品质特性和抗血栓功能。优化的配方和发酵条件为:鲜牛乳,大豆蛋白2%,蔗糖4%,羟丙基二淀粉磷酸酯1.5%,果胶0.1%,藻酸丙二醇酯（PGA）0.1%,发酵温度41℃,发酵时间8 h。得到发酵乳为软嫩的乳白色凝乳块,奶香浓郁,口感爽滑,无明显不良风味。扫描电镜观察表明,凝乳块内部呈现海绵状微观结构,酪蛋白胶束及亚胶束相互交联形成整体的三维结构,胶束间仍然存在大量微细孔隙,这些孔隙起着保持水分的作用。发酵乳的纤溶活性达215.1 U/mL,4℃储藏14天酶活性可保留66%,储藏60天活性仍保留43%;小鼠黑尾试验表明,口服该发酵乳具有显着的体内抗血栓效果。应用Dextran sulfate sodium salt（DSS）诱导性炎症性肠病动物模型评价了上述发酵乳对肠道菌群的调节作用和对炎症性肠病的防治效果,并探讨了其作用机制和实际应用前景。动物疾病症状观察和肠道组织病理分析结果表明,口服B.subtilis JNFE0126发酵乳可明显减轻DSS诱导性炎症性肠病动物的疾病严重程度,减轻动物的肠道粘膜的出血、炎症和溃疡等病理损伤;动物肠道菌群的检测分析和和肠粘膜内炎症相关因子和上皮再生相关蛋白表达水平的测定结果表明,口服B.subtilis JNFE0126菌株发酵乳可调节动物的肠道菌群,增加菌群的多样性,抑制有害菌生长;该发酵乳可抑制肠道粘膜内炎症因子表达水平,提高炎症抑制因子表达水平,因而减轻肠粘膜的炎症性损伤。与此同时,B.subtilis JNFE0126发酵乳可促进肠粘膜上皮干细胞的增殖分化,促进粘膜细胞的粘液蛋白和上皮连接蛋白的表达,加速肠粘膜屏障和上皮屏障的修复,从而抵御有害菌和炎症因子的侵入。最后,研制了一种具有双层壳-核结构（壳聚糖核-纳豆激酶-酪蛋白）的纳豆激酶口服缓释颗粒,并通过动物试验评价其在体内抗血栓作用。采用壳聚糖为核心,京尼平为壳聚糖核-纳豆激酶交联剂,牛乳酪蛋白为颗粒外层保护材料,TG酶为保护层的交联剂,按照分步交联的程序制备纳豆激酶缓释颗粒。用扫描电子显微镜对获得的缓释颗粒进行形态学分析,并使用纳米金交联的IgG作为模型药物验证了酪蛋白保护层的包埋效果,确定其形成了双层壳-核结构。通过体外模拟胃、肠液消化试验测定了该缓释颗粒的释放动力学特征,结果表明该颗粒在胃酸中能有效保护纳豆激酶活性,并在肠液中缓释达12小时。最终对该缓释颗粒进行动物口服试验,动态观察颗粒内纳豆激酶的体内缓释过程及其抗血栓效果。结果表明,上述纳豆激酶口服缓释颗粒具有很强的抗胃酸能力,并在肠道内可缓慢释放出纳豆激酶及其不同大小相对分子质量的具有纤维蛋白溶解活性的降解产物,缓释过程超过12小时。小鼠黑尾模型动物口服该颗粒,可明显抑制小鼠尾部血管内的血栓形成并促进血栓溶解,效果显着优于口服游离纳豆激酶。综上所述,本研究利用筛选的B.subtilis JNFE0126制备的发酵乳具有抗血栓和调节肠道功能的作用,有良好的应用前景。本研究开发的纳豆激酶口服缓释颗粒具有耐胃酸能力和肠道缓释功能,可提高纳豆激酶的口服利用度,有望作为功能食品添加剂用于研制抗血栓功能食品。
史策[2]（2021）在《模型辅助的连续流层析过程开发和抗体分离应用研究》文中研究说明单克隆抗体（单抗）是最重要的生物技术药物,传统的批次生产方式投资大,风险高,能耗、物耗和废液量大。改变传统工艺,实现连续化制造,是国际发展趋势,可以提高产品质量和过程效率,促进设备小型化,拓展过程的灵活性,减少废物排放,降低生产成本。连续生物制造的关键难点在于连续分离过程,特别是连续流层析,过程复杂,参数较多,优化设计难度大。本文针对连续流层析的复杂性和特殊性,引入机理模型和人工智能方法,构建模型辅助的连续流层析过程设计新方法,探讨关键因素影响,建立过程优化方法,为连续流层析过程开发和应用提供指导。首先,针对抗体亲和捕获,构建层析机理模型,表征不同模式的连续捕获过程（包括双柱CaptureSMB、三柱3C-PCC以及多柱连续流层析）。采用考虑平行扩散的通用速率模型,对不同操作条件的穿透曲线进行预测;结合过程模型,计算连续流层析的性能参数,分析不同操作参数对过程产率和介质利用率的交互影响。结果表明,过程产率随关键操作参数变化呈现三个阶段的变化特征,且不同连续捕获模式表现出不同规律,提出了相应的优化方法。经模型辅助优化,MabSelect SuRe介质的CaputreSMB最大过程产率达33.3 g/L/h,介质利用率为94.3%。MabSelect SuRe LX介质的3C-PCC最大过程产率达34.5 g/L/h,介质利用率为97.6%,结果得到实验验证。在此基础上,提出了模型辅助连续流层析过程优化的基本策略,并开发了软件包,应用于单抗药物连续捕获的工艺开发。其次,针对机理模型计算速度较慢的问题,引入人工神经网络算法,建立机理模型和人工神经网络的混合模型,应用于抗体连续捕获过程分析。对人工神经网络的结构和数据耦合方法进行了优化,相比于机理模型,混合模型计算速度提高了2000倍,达到毫秒级,适用于多参数和复杂状况的过程分析和比较。针对不同模式连续捕获过程,采用混合模型系统分析了介质主要性能参数对最大产率和操作空间的影响,发现不同上样浓度体现不同规律,从而得到不同上样浓度下的连续流层析介质选择和优化策略。为了便于混合模型的应用,开发了集成软件包,已在实际连续流层析过程开发中得到应用。针对抗体精制分离的迎头层析,以单抗单体和聚集体分离为目标,探讨了双柱连续迎头层析Flow2新方法。结合集总动力学模型、DLVO理论和Flow2过程模型,建立基于过程认知的Design Procedure方法,对Flow2过程性能进行表征,实现多参数和多目标优化。结果表明,Flow2相比于单柱迎头层析具有明显优势,在较低上样流速下过程产率为单柱迎头层析的3倍;Flow2可在较高盐浓度下实现更高的过程产率和收率,当收率为99%时,Flow2过程产率可以达到130 g/L/h以上,较单柱迎头层析提高36.5%。参数敏感性分析表明,Flow2过程鲁棒性更高。最后,采用过程模拟软件SuperPro Deisgner,对单抗批次和连续生产进行全流程模拟,比较不同生产模式的投资和成本差异。结果表明,随着批次生产规模扩大,成本下降显着,经济热点从设备转移到关键原材料和消耗品;对于全流程优化,三个主反应器配置一条下游过程,可有效提高过程的整体效率。进一步构建了年产1000kg单抗规模的上游连续、下游连续和上下游整合连续的单抗生产流程,并与批次过程进行比较。结果显示,上游灌流培养可以显着减少上游和下游设备相关成本,简化菌种放大培养过程;下游使用连续流层析进行抗体捕获,可以减小10倍层析柱体积,减少33%蛋白A介质消耗,从而降低11%单抗生产成本;上下游连续化整合,组合两方面优势,生产成本比批次过程下降30%。综上所述,本文利用机理模型、人工智能方法和过程模拟工具,辅助连续流层析过程分析和优化,探讨关键参数的影响,确定最佳操作空间,实现连续流层析的理性设计。本文建立的模型辅助连续流层析过程设计新方法,具有通用性,可以推广到其它分离过程,为连续生物过程的合理开发和应用提供指导。
陈世化[3]（2020）在《Bacillus cereus MH19基因组分析及胶原酶分离纯化与重组表达》文中研究表明胶原酶是特异性作用于胶原蛋白、明胶的一类蛋白水解酶,它能够水解胶原蛋白的三维螺旋结构而不破坏其他蛋白与组织。微生物胶原酶来源主要是梭菌属、芽孢杆菌属和弧菌属菌株。商品化的胶原酶就是从溶组织梭状芽孢杆菌提取制备的。梭菌胶原酶Col G、Col H和产气荚膜菌胶原酶Col A的结构性质已得到充分表征,这三种胶原酶常作为研究酶学性质的模式酶。随着研究的深入,越来越多的产胶原酶菌株被分离筛选出来,不同来源的胶原酶结构与性质差异性大,表明胶原酶的结构和功能具有多样性。蜡状芽孢杆菌具有丰富的产酶系统,是产胶原酶优良菌株。本文围绕胶原酶进行研究,鉴定了一株产胶原酶菌株Bacillus ceueus MH19,通过测序获得了全基因组序列,从基因组挖掘胶原酶基因Col B用于大肠杆菌重组表达,通过常规的微生物培养、提取分离也获得了天然的胶原酶,并分别进行了酶活测定与评估,主要研究结果如下:（1）对分离自屠宰厂的产胶原酶菌株进行鉴定,用于后续全基因组测序及胶原酶基因筛选。通过据菌株培养观察、镜检、MYP培养和部分生理生化试验,结合16S r DNA序列比对分析,筛选鉴定出蜡样芽孢杆菌Bacillus ceueus MH19。（2）采用二代结合三代测序技术对Bacillus cereus MH19进行全基因组测序,基因组大小为5,534,899bp,GC含量为35.28%,由一条5,247,580bp的环状染色体和一条287,319 bp的环状质粒组成。预测染色体基因有5,335个,质粒基因253个,绘制了染色体圈图和质粒圈图。对基因组进行功能注释,GO功能注释主要有代谢过程、细胞过程和单组织过程,参与基因分别有1615、1465、1259个。COG共注释3879个基因,占全基因组序列的69.41%。COG功能注释主要有10.19%的基本功能预测、9.07%的转录、8.78%的氨基酸转运和代谢、6.80%的翻译,核糖体结构和生物合成,其次是5.55%的细胞壁/膜/包膜生物合成、5.68%的信号转导机制、6.30%的碳水化合物转运与代谢、5.24%的辅酶转运与代谢和5.61%的无机离子的运输与代谢。KEGG共注释2920个基因,占全基因组序列的52.25%。共线性、共有和特有基因、基因家族的比较基因组分析发现Bacillus cereus MH19的特异性主要体现在环境适应性,即适应环境能力得到了强化,其基因组含有特异基因家族18个及数量最多的特有基因944个。进化选择压力分析表明Bacillus cereus MH19基因组有36个正向选择基因,存在多个转录调节因子。这些调节因子对抗药性的产生、毒力基因的合成、DNA的复制和修复、细胞存活有积极调控作用。（3）B.cereus MH19基因组胶原酶基因的挖掘。通过GO、COG、KEGG、NR、SWISSPROT、IPR多重注释、比对,发现Bacillus cereus MH19基因组有5种不同的胶原酶基因,分子量分布范围35.7-110 k D。序列比对和系统发育树分析表明BCC000504、BCC003388胶原酶基因序列与典型胶原酶基因Col G、Col A、Col H更为接近,BCC003615次之。结构域与功能分析表明,胶原酶BCC000504、BCC003388与胶原酶Col G、Col A、Col H性质较为相似,BCC004271与BCC004272类似,BCC003615可能与其余胶原酶性质有较大差异。对胶原酶的结构进行分析并以溶组织梭菌胶原酶G晶体结构为模板对BCC000504三维结构进行建模,建立的BCC000504胶原酶三级结构模型是可接受的蛋白模型。三级结构模型的建立有助于从分子水平上了解胶原酶的作用机制。将BCC000504命名为Col B,用于大肠杆菌原核表达。（4）研究了Bacillus cereus MH19发酵液中天然胶原酶的分离纯化及酶学性质。采用分步纯化,经硫酸铵沉淀、离子交换柱层析及凝胶层析纯化得到胶原酶BCC,分子量为110 k D,酶活为257.20 U/mg,提纯倍数为6.07,得率为9%。BCC酶的最适温度为37℃,最适p H为7.5。Ca2+对酶活有促进作用,Mn2+、Fe2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+对酶活有抑制作用。EDTA、EGTA可抑制胶原酶的酶活性,表明BCC为一种金属蛋白酶。BCC对I型胶原有特异性,属于I型胶原酶。（5）研究了胶原酶Col B在大肠杆菌中的原核表达。从Bacillus cereus MH19基因组挖掘得到Col B基因序列,优化、改造后构建表达质粒p ET30a-Col B,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,Ni-IDA亲和层析柱纯化后获得了纯度较高的重组Col B,SDS-PAGE及Western Blot分析表明重组Col B分子量为110 k D。胶原酶谱法结果表明重组Col B具有胶原酶活性,能够水解Ⅰ型胶原,测得的胶原酶活性为200.76U/mg。重组胶原酶Col B与提取的天然胶原酶分子量均为110 k D,对I型胶原有特异性,两者可能为同一种酶。
廖一波[4]（2020）在《烟酰胺单核苷酸的生物酶法合成》文中研究指明烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide,NMN）是人体内合成NAD+的重要前体,通过转化为NAD+来发挥其生理功能,与多种疾病紧密相关,其中NMN用于治疗衰老性疾病及延缓衰老是其研究最为热门的领域之一。NMN已逐渐应用于保健食品和医学药物,用于预防与治疗代谢性疾病,心脑血管疾病,衰老性疾病等。但由于合成问题,目前以NMN为主要成分的产品价格仍十分昂贵。合成NMN的方法中,相比于化学法合成NMN,生物法因无有机溶剂残留也不存在手性问题,成为最环保无公害的合成方法。但仍然存在一些限制,例如高效率的酶制剂的缺乏,反应底物带来的高昂成本等问题。本研究旨在通过基于生物信息学的酶分子筛选方法,筛选高效合成NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt,EC 2.4.2.12）,该酶是催化烟酰胺（Nicotinamide,NAM）和磷酸核糖焦磷酸（Phosphoribosylpyrophosphate,PRPP）直接合成NMN的酶,在此基础上将该酶初步应用于单酶、多酶联用催化合成NMN。具体研究结果如下:（1）基于生物信息学的酶分子筛选方法挖掘Nampt迄今为止,已被KEGG酶数据库收录的Nampt超过600条,只有来源Homo sapiens,Mus musculus和Rattus norvegicus的Nampt被表征,难以满足合成NMN的需求。本研究以来源Meiothermus ruber和Methanobacterium sp.Pta U1.Bin097的Nampt的氨基酸序列出发,通过NCBI数据库的BLASTP功能筛选Nampt,并将这些来源的Nampt在SWISS-MODEL平台进行同源建模,再使用Discovery Studio软件,采用分子对接手段,通过模拟不同来源的Nampt与底物小分子NAM在结合口袋中的结合,选定对接结果中打分系统-CDOCKERENERGY值高的Nampt作为候选酶。在分子对接评分结果中,哺乳动物中-CDOCKERENERGY值最高的是来源Homo sapiens的Nampt（h Nampt）,细菌中-CDOCKERENERGY值最高的是来源Comamonadaceae bacterium的Nampt（c Nampt）和来源Meiothermus ruber的Nampt（c Nampt）。将这三个来源的Nampt作为候选酶。（2）烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达与酶学性质分析以上述三个来源的Nampt的基因为研究对象,在大肠杆菌中表达,纯化获得Nampt蛋白。对三个来源的Nampt酶学性质进行分析。以NAM为底物,h Nampt的Km为0.12μmol/L,Vmax为0.11μmo L/（min·mg）,kcat为0.05 1/s。m Nampt的Km为0.39μmol/L,Vmax为3.20μmo L/（min·mg）,kcat为1.39 1/s。c Nampt的Km为0.14μmol/L,Vmax为3.10μmo L/（min·mg）,kcat为1.38 1/s。与已表征的Nampt相比,本文表达的m Nampt和c Nampt的kcat/Km远高于其他来源的Nampt,更适用于工业酶法合成NMN。其中c Nampt的kcat/Km为9.86×106 1/s,是目前已表征的Nampt中最高的。将测定的动力学参数与上述酶分子筛选方法中分子对接结果进行探讨,三个来源的Nampt分子对接结果中-CDOCKERENERGY大小排序与测定的酶kcat/Km值的大小排序一致,拟合度高。说明本研究前期的酶分子筛选方法在筛选催化性质好的Nampt效果良好,验证了该筛选方法的可用性。（3）单酶、多酶联用催化合成NMN将来源Comamonadaceae bacterium的Nampt初步进行单酶催化合成NMN,结果显示,单酶法合成NMN中,通过补加一次底物PRPP,10min时NMN产量34mg/L,转化效率为204 mg/（L·h）。通过文献分析酶学性质较好的核糖磷酸焦磷酸激酶（Ribose phosphate pyrophosphokinase,Prs）,来源H.sapiens的Prs（h Prs）Km值远高于其他物种,来源Pyrobaculum calidifontis的Prs（pPrs）比酶活测定最高,将这两个来源的Prs在大肠杆菌中表达,纯化,作为双酶法合成NMN中与Nampt联用的酶。其中h Prs成功的可溶性形式表达,pPrs未能以可溶性形式表达。将h Prs和c Nampt联用催化合成NMN,180 min时NMN产量29 mg/L,转化效率为9.67 mg/（L·h）。通过文献分析酶学性质较好的核糖激酶（Ribokinase,Rbks）,来源Escherichia coli的Rbks（e Rbks）的底物亲和性是原核来源的Rbks中最好的,来源H.sapiens的Rbks（h Rbks）的底物亲和性是哺乳动物来源的Rbks中最好的,且kcat/Km值是目前表征的Rbks中最高,将这两个来源的Rbks在大肠杆菌中表达,纯化,作为三酶法合成NMN中与Nampt、Prs联用的酶。将e Rbks和h Prs、c Nampt联用催化合成NMN,240min时NMN产量24 mg/L,转化效率为6 mg/（L·h）。将h Rbks和h Prs、c Nampt联用催化合成NMN,180 min时NMN产量24 mg/L,转化效率为8 mg/（L·h）。从单酶到多酶来合成NMN,随着参与反应的酶个数增加,虽然产量有所降低,双酶法降至单酶法的85%,三酶法降至单酶法的71%。但底物总成本也得到大幅度降低,其中双酶法降至单酶法的1%,三酶法降至单酶法的0.4%。
薛莹莹[5]（2019）在《纳豆激酶高产菌株的选育及其分离纯化的研究》文中认为纳豆激酶（nattokinase,NK）来源于纳豆,是一种丝氨酸蛋白酶,具有良好的溶栓性能,安全无副作用,有着很好的临床用药应用前景。本实验室保藏的一株产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XZI125,为将其产酶能力提高到工业发酵生产菌株的要求,需要进一步提高菌株的产酶性能。本研究采用诱变育种和基因组改组的方法获得高产、稳定遗传的突变菌株,并通过制备磁性壳聚糖亲和吸附剂,实现了纳豆激酶从发酵粗酶液中的一步式分离纯化。1.通过对枯草芽孢杆菌XZI125进行紫外诱变和常温室压等离子体诱变（ARTP）诱变,选育高产纳豆激酶的突变菌株。通过计算致死率和正突变率,确定紫外诱变最佳条件:功率20 W,照射距离25 cm,诱变时间5min;ARTP诱变的最佳条件:功率为100 W,气流量10 SLM,载片与气流端口距离为2 mm,处理时间90s。通过2种诱变处理,并结合抗生素抗性筛选方法,共获得4株NK含量较原始菌株提高的突变菌株,平均提高24.3%。2.对枯草芽孢杆菌XZI125原生质体制备、再生、灭活及融合条件进行优化,并利用基因组改组技术（genomeshuffling）选育NK高产菌株。结果表明,原生质体制备最佳条件为:酶浓度1mg/mL,酶解时间30 min,菌体培养时间6 h;紫外灭活最佳条件为:功率20 W,照射距离25 cm,照射时间8 min;热灭活最佳条件为:100℃,水浴50s。原生质体融合最佳条件为:40%PEG6000,37℃水浴融合10 min。在上述原生质体处理条件下,通过对前期诱变筛选到的4株NK高产菌株进行基因组改组,共得到3株高产菌株G91、2G34、2G42,纳豆激酶酶活力分别达到3257IU/mL,3277 IU/mL,3304 IU/nmL,与原始菌株（2490IU/mL）相比酶活力分别提高了 30.8%,31.6%,32.7%。3.采用化学共沉淀法制备了磁性Fe3O4纳米粒子,乳化交联法制备了磁性壳聚糖微球（MCTS）,经环氧氯丙烷活化,以6-氨基己酸为间隔臂偶联配基对氨基苯甲脒,制得磁性壳聚糖微球,用于纳豆激酶粗酶液的分离纯化,并对其进行表征,研究其对纳豆激酶的吸附和解吸附动力学。通过优化磁性壳聚糖的制备条件,选取合适的配基接枝浓度,使得吸附剂在10 min内即可达到纳豆激酶的吸附平衡,20 min内即完成酶的解吸附,酶活回收率为62%,纯化倍数为10.6,纳豆激酶纯度经电泳分析为一条带。
尤星力[6]（2019）在《禽白血病及鸡白痢检测用标准物质的纯化及稳定》文中进行了进一步梳理由禽白血病病毒和鸡白痢沙门氏菌感染引起的禽白血病和鸡白痢是两种严重的禽类传染病,不仅造成禽类大量死亡,产生巨大的经济损失,还可能感染人体,影响健康。由于缺乏有效的疫苗,目前主要通过诊断淘汰病鸡,净化鸡群来达到防控的目的。快速、准确的诊断检测对禽病的有效防控至关重要,但是由于缺乏标准物质,诊断试剂质量良莠不齐,导致检测结果的准确性难以判断。将诊断标志物研制成标准物质,对现有的诊断技术或诊断试剂盒等进行标定,使检测结果具有可溯源性、可比性和准确性,对禽病的防控具有重要意义。禽白血病病毒抗原蛋白P27和鸡白痢沙门氏菌感抗体是这两种疾病诊断检测的重要标志物。为此,本论文建立了针对该两种禽病诊断用标准物质的纯化及稳定工艺。主要研究结果如下:（1）针对用于禽白血检测的抗原蛋白P27,利用组氨酸标签建立了两步Ni亲和层析纯化工艺:首先通过吸附式Ni亲和层析纯化大肠杆菌重组表达带有His-tag的P27蛋白,经酶切去除标签后再次进行穿透式Ni亲和层析进行精制。最终P27纯度达到99%,ELISA活性回收率为30%。利用Tricine电泳及十二烷基硫酸钠毛细管电泳（CE-SDS）对纯化过程中P27的稳定性进行研究,发现-80℃保存能有效抑制原料液中P27末端His-tag的脱落,加入酶抑制剂和咪唑能有效抑制酶切过程中的蛋白裂解。最终精制得到的P27蛋白分子质量与理论分子量完全相符,可溯源性和纯度均能满足标准物质的制备要求。（2）针对用于鸡白痢沙门氏菌检测的抗体,构建了 Q-XL阴离子交换层析一步纯化鸡白痢沙门氏菌兔抗血清获得高纯度多抗IgG的方法。采用高效液相体积排阻色谱建立了 IgG的快速分析和定量方法,并利用多抗IgG与杂蛋白等电点的差异性指导阴、阳离子交换层析介质种类和pH条件的筛选。结果表明阴离子交换介质Q-XL在pH 5.5条件下,能够去除所有杂蛋白,纯度达99%,回收率为67.5%。进一步采用差示扫描荧光进行稳定剂快速筛选,其中20%（w/v）山梨醇稳定效果最佳,使裂解温度T71和Tm2分别提高5.52和8.84℃,在70℃加速稳定性中效果显着。最终制备的兔抗血清多抗IgG具有高纯度、高收率及高稳定性,且制备工艺简单,可作为标准物质,促进鸡白痢的防控。（3）考察了利用提取的鸡白痢沙门氏菌提取O-抗原多糖,制备超大孔亲和介质用于纯化特异性IgG,以及用于间接酶联免疫吸附诊断鸡白痢的可行性。经等温滴定量热仪检测,通过酸解法提取出的O-抗原与多抗IgG具有高度特异性的亲和作用。采用激光共聚焦显微镜观察O-抗原成功接枝到环氧活化的超大孔微球上,静态吸附结果表明所制备的亲和介质能特异性吸附IgG蛋白,载量为0.46 mg/g-介质。将O-抗原包被用于鸡白痢的间接酶联免疫吸附法诊断,结果表明检测具有特异性,最佳抗原包被浓度为40μg/mL,IgG最低检测限为46.92 ng/mL,从而为鸡白痢的准确诊断提供新的方法。
关东伟[7]（2019）在《肺内皮细胞靶向肽修饰的成纤维细胞生长因子对放射性肺损伤的修复》文中研究说明背景和目的:放射性肺损伤（Radiation-induced lung injury,RILI）是核事故幸存者的主要并发症,长期困扰着生存病人的生活质量。RILI也是胸部肿瘤放疗剂量的主要限制因素,影响肿瘤的控制效果。RILI的发生机制非常复杂,涉及到一系列细胞及分子的相互作用,病理上主要表现为炎症细胞的迁移与浸润、成纤维细胞的增生与分化、胶原蛋白的分泌与积聚、血管壁的增厚与闭塞、正常肺泡结构的破坏与重塑等。近年研究发现,在放射损伤后数个小时内发生的血管内皮细胞凋亡可能是导致上述病理表现的启动机制,阻断血管内皮细胞的凋亡可以缓解放射损伤的程度。成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）广泛参与胚胎发育、组织再生、血管生成等多种生物学过程,也在皮肤、骨、尿道、子宫、神经等组织器官的缺损或损伤模型中发挥促修复作用。研究发现,bFGF也在放射损伤中发挥保护作用,主要机制为抑制血管内皮细胞的凋亡。此外,微血管内皮细胞对辐照的敏感性明显高于大血管,可能与bFGF在微血管基底膜上的分布较少甚至缺乏有关。肺具有异常丰富的微血管系统,缺乏足够的bFGF提供保护可能是肺对射线较为敏感的原因之一,因此外源性给予bFGF可能是缓解与修复RILI的有效方法。但是,bFGF在应用中常面临着靶向性低、透膜能力差、半衰期短等问题,为了达到有效的治疗效应,需要提高bFGF的使用剂量,但是高剂量给药可能会对其他正常组织造成潜在危险。靶向给药是近年来的研究热点,可以提高病灶中的药物浓度,降低正常组织中的药物分布,从而在增强治疗效应的同时降低副作用。其中,靶向性多肽是一种具有良好应用前景的递送配体,具有渗透性好、合成方便、免疫原性低、成本低、易修饰等优点。CGSPGWVRC是通过噬菌体展示技术获得的肺血管内皮细胞靶向肽（Lung endothelial cell-targeted peptide,LET）,并经体外和体内实验证实了其较好的肺内皮细胞靶向能力。综上所述,我们准备用LET对bFGF进行修饰（LET-bFGF）,以提高bFGF重组蛋白对肺内皮细胞的靶向能力,从而增强bFGF对RILI的修复功能。方法:1.LET-bFGF的制备:在pET28a-bFGF质粒的基础上,将一段Linker序列（共15个氨基酸,即45个核苷酸）和LET序列（共9个氨基酸,即27个核苷酸）连接至bFGF的羧基端,通过PCR、酶切、连接、转化、筛选等方法构建pET28a-LET-bFGF质粒,然后通过大肠杆菌表达系统获得LET-bFGF重组蛋白,使用镍柱亲和层析法进行纯化,最后采用MTT试验检测生物学活性。2.LET-bFGF的肺靶向验证:27只SD大鼠随机分为3组:对照组、bFGF组、LET-bFGF组。bFGF组和LET-bFGF组分别尾静脉注射bFGF和LET-bFGF（25 nmol/kg）,对照组使用生理盐水作为对照。在注射后10 min、1 h和6 h时,Elisa检测肺组织和血清中bFGF的含量。24只SD大鼠随机分为4组:正常+bFGF组、放射+bFGF组、正常+LET-bFGF组、放射+LET-bFGF组。正常组使用正常大鼠,放射组使用RILI大鼠,bFGF组和LET-bFGF组在造模后分别尾静脉注射偶联了Cy7的bFGF（bFGF-Cy7）和偶联了Cy7的LET-bFGF（LET-bFGF-Cy7）（500μL,30μmol/L）。在注射后1 h时,小动物活体成像检测在体和离体器官的荧光强度。24只SD大鼠随机分为4组:正常+bFGF组、放射+bFGF组、正常+LET-bFGF组、放射+LET-bFGF组。正常组使用正常大鼠,放射组使用RILI大鼠,bFGF组和LET-bFGF组在造模后分别尾静脉注射bFGF和LET-bFGF（100 nmol/kg）。在注射后1h时,免疫荧光染色检测外源性bFGF在肺组织中的分布。3.LET-bFGF对RILI大鼠模型的修复作用:60只SD大鼠随机分为4组:对照组、放射组、放射+bFGF组、放射+LET-bFGF组。对照组使用正常大鼠,其余三组使用RILI大鼠,放射+bFGF组和放射+LET-bFGF组在造模后分别尾静脉注射bFGF和LET-bFGF（25 nmol/kg）,对照组和放射组使用生理盐水作为对照。在造模后早期（4 h）,取肺组织进行TUNEL与CD31的双重染色,以检测LET-bFGF对肺血管内皮细胞凋亡的保护作用;在造模后远期（2个月）,对大鼠进行肺部CT扫描,取肺组织进行HE染色、Masson染色和CD45的免疫组织化学染色,以检测LET-bFGF对肺炎和肺纤维化的治疗效应。结果:1.在pET28a-bFGF质粒的基础上,成功将一段45个核苷酸的Linker和27个核苷酸的LET序列连接于bFGF序列的羧基端,最终获得pET28a-LET-bFGF质粒,测序验证序列完全正确。2.通过大肠杆菌表达系统和镍柱亲和层析法获得纯化蛋白,经SDS-PAGE证实bFGF和LET-bFGF均符合理论分子量,分别为19.42 kD和21.50 kD,WB证实bFGF和LET-bFGF均可以与抗bFGF抗体特异性结合。3.bFGF与LET-bFGF均具有较好的生物学活性,而且LET靶向肽与Linker在bFGF羧基端的融合表达并未影响bFGF的生物学活性。4.LET-bFGF经尾静脉注射至大鼠体内后,可迅速表现出明显的肺靶向聚集效应,但是其体内代谢也较快,注射后6 h便恢复至肺组织本底水平,可能主要通过肾脏排泄。5.放射损伤对LET-bFGF具有一定的趋化作用,可以增强LET-bFGF的肺靶向能力。6.在辐照后4 h时,凋亡主要发生于肺血管内皮细胞,在辐照后2个月时,凋亡可广泛发生于各种类型的细胞中,包括血管内皮细胞、肺泡上皮细胞、间质细胞等,LET-bFGF可以抑制放射诱导的早期和远期肺血管内皮凋亡,其凋亡抑制效应优于bFGF。7.在辐照后2个月时,正常的肺泡结构被严重破坏,肺泡间隔明显增厚,大量的炎症细胞浸润,血管壁显着增厚,部分肺毛细血管可发生扩张和淤血,LET-bFGF可以降低肺血管壁的增生,缓解其他肺组织结构的紊乱,其保护效应优于bFGF。8.在辐照后2个月时,炎症细胞大量分布于肺间质与肺泡中,LET-bFGF可以降低放射诱导的肺部炎症,而bFGF则未观察到这种炎症抑制效应。9.在辐照后2个月时,肺部呈明显的纤维化,影像学表现为大量广泛分布的高密度影,肺平均密度显着升高,LET-bFGF可以减轻放射诱导的肺纤维化程度,而bFGF则未观察到这种纤维化抑制效应。结论:肺内皮细胞靶向肽LET修饰的bFGF具有较好的肺靶向能力,能够在RILI中发挥良好的修复作用。
王媚媚[8]（2019）在《激活PDGFRβ激酶的多种别构调节机理》文中指出血小板衍生生长因子受体β（Platelet-derived growth factor receptor beta,PDGFRβ）和集落刺激因子1受体（Colony-stimulating factor 1 receptor,CSF1R）,同属于第三类受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase,RTK）。它们都是由细胞外结构域,单次跨膜结构域、胞内近膜段、被激酶插入区分开的激酶结构域以及C端尾巴组成。这些受体调节重要的生物学过程,包括细胞的增殖、分化和迁移等。其中PDGFRβ的失调与心血管疾病、纤维化疾病有关,而CSF1R的突变涉及遗传性弥漫性白质脑病（Hereditary Diffuse Leukoencephalopathy with Spheroids,HDLS）中神经胶质细胞和神经元脱髓鞘的功能障碍。因此,了解这些激酶活性在生理条件下的精确调节至关重要。目前人们已从结构生物学和生物化学等多方面去研究PDGFRβ的调控机理,为进一步探究它的激活机制奠定基础。早期研究表明,这些激酶在其近膜段的作用下处于自抑制状态,依赖反式磷酸化被激活。然而,无论是在概念上还是实验上,关于这些受体调节机制的研究仍存在漏洞。在本文中,我们使用化学交联偶联质谱分析、基于结构诱变、Rosetta建模以及免疫印迹法来探究PDGFRβ激酶活性的调节机理。我们发现在激酶激活过程中存在多种调节机理,包括反式激活的二聚体,激酶插入区的抑制作用以及存在非活性二聚体。此外,我们也发现在HDLS中CSF1R突变与激酶调节受损之间存在一定的联系。
梁超[9]（2018）在《白脊藤壶cp19k蛋白的界面附着机理及仿生多肽研究》文中研究指明在漫长的进化历程中,一些海洋生物演化出了水下牢固附着在几乎任何物体表面的独特本领。这一自然现象,虽然带来了长期困扰人类的海洋生物污损难题,但也为仿生设计水下胶粘剂提供了极佳的生物模板。本文以我国沿海常见的海洋污损生物―白脊藤壶为样本,对它分泌的生物胶蛋白Balcp19k开展理化性质、粘附功能和仿生应用研究。在前期成功表达携带硫氧还蛋白Trx的Trx-Balcp19k融合蛋白基础上,通过优化表达和纯化条件,切除了它的全部外源性标签,获得了与天然蛋白序列非常接近的胶蛋白rBalcp19k,为藤壶胶蛋白的结构、性能和机理研究提供了优质原材料。在上述过程中发现,Trx-Balcp19k融合蛋白在合适溶液条件下,能够自我聚集形成粘性极强的胶状物,而无需其它生物胶蛋白或辅助成员的配合。这种材料在空气中对金属表面的粘附强度可与一些商业化的胶水相匹敌。它的生物相容性很好,展示出在生物医学领域的应用前景。对rBalcp19k的结构、自组装性质和粘附功能进行了系统研究。首次发现,在酸性、低离子强度条件下,它具有时间依赖性的二级结构转变和自组装成非淀粉样纳米纤维的性质。这种rBalcp19k纳米纤维非常稳定,在海水中不会解组装,它们的粘性比未组装的蛋白单体更强,且能抵抗高pH和高离子强度的不利影响。由此推测,藤壶可能分泌预组装的胶蛋白cp19k纳米纤维加强水下附着,这是对传统藤壶水下粘附模型的有力补充。进一步发现分子内二硫键对维持Balcp19k的二级结构和粘性并不是必需的;相反,缺失分子内二硫键的突变体,其形成纳米纤维的条件范围更广;这一结论未见文献报道。最后,依据该胶蛋白的结构和性能特点,仿生设计了9条多肽。在酸性条件下,它们大都显示出自组装成纳米纤维的性质,且形成的纤维形态各异。特别是其中一条富含“Ser-Ala”重复序列的多肽,能够自组装成未见报道的独特线圈结构。这种微观结构的形成条件非常广泛,且其形貌表现出多肽浓度和溶液条件可调的性质。这些新发现,不仅印证了前述完整蛋白rBalcp19k的自组装能力,也为藤壶胶蛋白的仿生应用研究提供了一个明确的方向。
杨娟[10]（2018）在《CNBr-Papain-Sepharose 4B亲和法对草鱼鱼糜漂洗液中CPIs回收纯化及其性质鉴定》文中研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin protease inhibitor,CPIs）是一类能够抑制半胱氨酸内肽酶的天然蛋白酶抑制剂。广泛地存在于动植物及微生物中,在食品加工及医药等领域中拥有潜在的使用价值。本文以木瓜蛋白酶（Papain）为配基自制亲和填料（CNBr-Papain-Speharose 4B）并测试其稳定性,进而用于回收草鱼鱼糜漂洗液（Surimi wash water,SWW）中的CPIs,并对该CPIs的理化性质及生物学活性进行了较为系统的研究。该结果为探索漂洗液中CPIs高效快速回收纯化方法奠定了实验基础,同时为系统鉴定利用该方式回收的CPIs的性质提供了科学的参考方法。实验所得结果如下:首先草鱼鱼糜漂洗液CPIs经粗提取后,将粗提液经过用CNBr-Papain-Speharose 4B亲和层析回收CPIs,并结合抑制活性和反相酶谱法检测结果,确定纯化效率及比活性最高的峰III为目的峰。该峰在反相酶谱上呈现表观分子量为22kDa和20kDa的两条带。其在C18反相高效液相色谱（C18RP-HPLC）形成了两个尖锐峰Cystatin-I和Cystatin-II,分别纯化了21.57倍和12.16倍,收率分别为0.93%和0.51%。鱼糜漂洗液CPIs进TSK gel G2000 SWXL HPLC发现其各组分单一,并测定得分子量分别为22.0kDa和19.5kDa。同时,Cystatin-I和Cystatin-II均具较宽的酸碱稳定性和热稳定性范围;且均对木瓜蛋白酶（Papain）、组织蛋白酶B/L（Cathepsin B/L）均具有明显的抑制活性,均对胰凝乳蛋白酶（Chymotrpsin）有少量抑制作用,而对胰蛋白酶（Trypsin）不具有抑制活性。二者均属于竞争性抑制剂,其对Papain的抑制常数Ki分别为6.0nmol和16.25nmol。经双向电泳鉴定,Cystatin-I的分子量和等电点pI约为22kDa和8.6,Cystatin-II的为19.7kDa和8.6。通过RPLC-MS/MS质谱鉴定,这两种CPIs均含有Cystatins超级族的特征保守序列QVAAG,并结合该蛋白的性质分析,推断这两种CPIs有可能属于Cystatins（家族II）成员。制备亲和层析填料,用溴化氰（Cyperine Bromide,CNBr）活化的琼脂糖（Sepharose 4B）与木瓜蛋白酶（Papain）偶联制备CNBr-Papain-Speharose 4B,通过紫外光谱和红外光谱对其进行表征,出现明显的紫外吸收峰（280nm）及典型的酰胺峰(1672cm-1、1547cm-1、1249cm-1),从而确定了已将Papain偶联至CNBr-Sepharose 4B。利用重组鲢鱼Cystatin（家族II,20.9kDa）的吸附率为指标来筛选琼脂糖对Papain适宜的偶联密度,即CNBr-Speharose 4B和Papain最佳质量比为1:0.035（w/v）。以Cystatin吸附率为指标测定填料的热和pH稳定,发现该填料具有较好的耐热性和耐酸碱性、以及较好的二价金属耐受性和贮藏稳定性。
二、Adsorption and Step Elution of Urokinase Using Affinity Chromatography-Comparison of Data with Rate Model Simulation（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Adsorption and Step Elution of Urokinase Using Affinity Chromatography-Comparison of Data with Rate Model Simulation（论文提纲范文）
（1）产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 简写对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 枯草芽孢杆菌简介 |
| 1.2 纳豆激酶的研究进展 |
| 1.2.1 纳豆激酶的酶学性质 |
| 1.2.2 纳豆激酶的功能及其应用前景 |
| 1.2.3 纳豆激酶与其它溶栓药物的比较及其溶栓优势 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌凝乳酶的研究进展 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌在发酵食品及益生菌制剂中的应用 |
| 1.5 枯草芽孢杆菌对肠道菌群的调节作用和在医药保健领域的应用 |
| 1.5.1 肠道菌群及肠道菌群失调相关疾病 |
| 1.5.2 炎症性肠病的发病机制及治疗方法的研究进展 |
| 1.6 立题背景和研究意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌菌株的分离、筛选及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 主要试剂与材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基配方 |
| 2.3.2 纤维蛋白溶解酶纤溶活力测定方法 |
| 2.3.3 凝乳酶活力测定方法 |
| 2.3.4 产纳豆激酶和凝乳酶双酶菌株的筛选及鉴定 |
| 2.3.5 产双酶菌株菌株的鉴定 |
| 2.3.6 B.subtilis JNFE0126 菌株的生长特征检测 |
| 2.3.7 B.subtilis JNFE0126 株菌发酵液凝乳酶和纤溶酶活性的动态检测 |
| 2.3.8 B.subtilis JNFE0126 菌株产双酶能力的遗传稳定性测定 |
| 2.3.9 B.subtilis JNFE0126 菌株保藏 |
| 2.3.10 酶抑制剂抑制试验分析纤溶酶和凝乳酶的类型 |
| 2.3.11 B.subtilis JNFE0126 菌株的两种酶基因的PCR扩增和测序 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 产双酶(纳豆激酶和凝乳酶)菌株的筛选 |
| 2.4.2 B.subtilis nk1 菌株的鉴定 |
| 2.4.3 B.subtilis JNFE0126 菌株的生长和产酶特性 |
| 2.4.4 蛋白酶抑制剂实验分析纤溶酶和凝乳酶类型 |
| 2.4.5 B.subtilisJNFE0126 的纳豆激酶和M4 金属蛋白酶基因PCR扩增和测序结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 枯草芽孢杆菌产发酵液中纳豆激酶和凝乳酶的分离纯化及酶学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 主要试剂与材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基 |
| 3.3.2 B.subtilis JNFE0126 菌株的活化 |
| 3.3.3 纳豆激酶、凝乳酶粗酶液的制备 |
| 3.3.4 蛋白质浓度的测定—Bradford检测法 |
| 3.3.5 纳豆激酶的分离纯化 |
| 3.3.6 凝乳酶的分离纯化 |
| 3.3.7 纳豆激酶的酶学性质研究 |
| 3.3.8 凝乳酶的酶学性质研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 纳豆激酶的分离纯化 |
| 3.4.2 凝乳酶的分离纯化 |
| 3.4.3 纯化酶的SDS-PAGE电泳检测结果 |
| 3.4.4 纳豆激酶的酶学性质 |
| 3.4.5 凝乳酶的酶学性质研究 |
| 3.4.6 纯化凝乳酶的凝乳效果及其潜在应用价值 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 枯草芽孢杆菌发酵乳的研制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 主要试剂与材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 发酵乳制备方法 |
| 4.3.2 单因素实验和正交试验 |
| 4.3.3 发酵乳理化指标测定 |
| 4.3.4 发酵乳感官评定 |
| 4.3.5 发酵乳储藏过程中的品质变化观察 |
| 4.3.6 发酵乳的微观结构观察 |
| 4.3.7 发酵乳动物体内抗血栓作用 |
| 4.3.8 试验数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 单因素试验优化发酵乳配方和发酵条件 |
| 4.4.2 采用正交试验确定发酵乳最适发酵条件 |
| 4.4.3 正交试验确定稳定剂配方 |
| 4.4.4 发酵过程中菌量、p H和酶活的变化 |
| 4.4.5 发酵乳总蛋白和总糖含量 |
| 4.4.6 发酵乳感官评定结果 |
| 4.4.7 发酵乳的流变学特性 |
| 4.4.8 发酵乳的持水力和质构测定结果 |
| 4.4.9 发酵乳的微观凝胶结构 |
| 4.4.10 发酵乳储藏过程中的品质变化: |
| 4.4.11 小鼠黑尾模型验证发酵乳体内抗血栓效果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 枯草芽孢杆菌发酵乳预防和治疗炎症性肠病 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 主要试剂与材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 枯草芽孢杆菌发酵乳的制备及其CFU计数和革兰氏染色 |
| 5.3.2 DSS诱导性炎症性肠病动物模型的建立和动物分组 |
| 5.3.3 模型小鼠疾病活动指数(DAI)的测定 |
| 5.3.4 小肠和结肠的组织学切片观察和组织学评分 |
| 5.3.5 免疫组织化学染色 |
| 5.3.6 Western blotting检测蛋白表达水平 |
| 5.3.7 肠道菌群分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 枯草芽孢杆菌发酵乳的外观、CFU计数及其Gram’s染色 |
| 5.4.2 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对DSS诱导性炎症性肠病动物DAI的影响 |
| 5.4.3 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对小肠和结肠病理变化的影响 |
| 5.4.4 枯草芽孢杆菌发酵乳对白细胞浸润和炎症因子、抗炎因子表达的影响 |
| 5.4.5 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对Lgr-5,CDX-2,Mucin-2 表达水平的影响 |
| 5.4.6 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对ZO1和Villin表达水平的影响 |
| 5.4.7 口服发酵乳对DSS诱导的IBD模型小鼠肠道菌群的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 纳豆激酶缓释颗粒的研制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和设备 |
| 6.2.1 主要试剂与材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 缓释颗粒原材料的各种反应体系内纳豆激酶纤溶活性测定 |
| 6.3.2 双层壳-核结构的纳豆激酶缓释颗粒的设计和构建 |
| 6.3.3 纳豆激酶缓释颗粒的粒径和zeta电位测定 |
| 6.3.4 装载纳豆激酶和模型药物的缓释颗粒微观结构的显微镜观察 |
| 6.3.5 纳豆激酶缓释颗粒在储藏过程中的纤溶活性的动态测定 |
| 6.3.6 模拟消化液对缓释颗粒纤溶活性的影响 |
| 6.3.7 模拟消化液对缓释颗粒粒径、ζ-电位和表面结构的影响 |
| 6.3.8 荧光标记模拟药物(Ig G)缓释颗粒口服后在小鼠消化道内分布情况分析 |
| 6.3.9 口服纳豆激酶缓释颗粒后小鼠肠道内的活性酶的释放和吸收试验 |
| 6.3.10 口服纳豆激酶缓释颗粒对模型小鼠血栓治疗效果的评价 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 纳豆激酶缓释颗粒的设计与构建 |
| 6.4.2 颗粒双层壳-核结构的鉴定与验证 |
| 6.4.3 纳豆激酶缓释颗粒保藏过程中酶活的变化 |
| 6.4.4 缓释颗粒中纳豆激酶的体外释放特性 |
| 6.4.5 双层壳-核结构缓释颗粒所装载模型药物口服后在体内的释放 |
| 6.4.6 口服纳豆激酶缓释颗粒对黑尾模型小鼠的血栓治疗效果 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文的主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（2）模型辅助的连续流层析过程开发和抗体分离应用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 符号表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 单抗药物生产流程 |
| 1.2.1 单抗批次生产流程 |
| 1.2.2 单抗连续生产流程 |
| (1) 上游连续生产 |
| (2) 下游连续生产 |
| (3) 上下游整合连续生产 |
| 1.3 连续流层析及抗体分离应用 |
| 1.3.1 双柱连续流层析CaptureSMB |
| 1.3.2 三柱/四柱连续流层析 |
| 1.3.3 3～16柱连续流层析BioSMB |
| 1.3.4 双柱连续迎头层析Flow2 |
| 1.4 层析模型及连续流层析应用 |
| 1.4.1 层析模型 |
| 1.4.2 模型求解方法 |
| 1.4.3 层析模型在连续流层析中的应用 |
| 1.5 人工智能方法及其在层析领域的应用 |
| 1.5.1 人工智能方法 |
| 1.5.2 人工智能方法在层析领域的应用 |
| 1.6 过程模拟软件及生物过程评价 |
| 1.6.1 生物过程模拟软件 |
| 1.6.2 过程模拟软件用于生物过程评价 |
| 1.7 本文研究思路 |
| 第二章 连续亲和捕获模型构建及双柱连续流层析过程优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 亲和捕获及双柱连续流层析模型 |
| 2.2.1 通用速率模型 |
| 2.2.2 模型无因次化 |
| 2.2.3 正交配置法求解 |
| 2.2.4 平行扩散理论 |
| 2.2.5 模型参数及拟合方法 |
| 2.2.6 双柱连续流层析模型 |
| 2.2.7 双柱连续流层析过程评价 |
| 2.3 材料和方法 |
| 2.3.1 主要试剂与仪器 |
| 2.3.2 蛋白穿透曲线测定 |
| 2.3.3 双柱连续流层析实验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 双柱连续流层析模型参数拟合和模型验证 |
| 2.4.2 连续流层析操作参数分析和优化 |
| 2.4.3 模型辅助的连续流层析过程优化策略 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 三柱及多柱通用连续流层析模型构建及过程优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 三柱及以上连续流层析模型构建 |
| 3.2.1 通用速率模型 |
| 3.2.2 三柱连续流层析蛋白捕获模式 |
| 3.2.3 四柱连续流层析蛋白捕获模式 |
| 3.2.4 四柱以上通用连续流层析蛋白捕获模式 |
| 3.2.5 三柱及以上连续流层析模型 |
| 3.2.6 连续流层析蛋白捕获过程评价 |
| 3.3 材料和方法 |
| 3.3.1 主要试剂与仪器 |
| 3.3.2 蛋白穿透曲线测定 |
| 3.3.3 三柱连续流层析实验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 蛋白穿透曲线拟合和模型验证 |
| 3.4.2 3C-PCC过程设计和实验验证 |
| 3.4.3 3C-PCC操作参数分析和优化 |
| 3.4.4 连续流层析操作参数优化的简化方法 |
| 3.4.5 不同连续流层析模式比较及适用条件分析 |
| 3.5 连续流层析过程分析软件包 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 引入人工神经网络的连续流层析过程分析和优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 引入人工神经网络的混合模型 |
| 4.2.1 混合模型基本结构 |
| 4.2.2 人工神经网络拓扑结构 |
| 4.2.3 人工神经网络构建与训练 |
| 4.2.4 ANN和GRM模型参数耦合 |
| 4.2.5 ANN和连续流层析过程参数耦合 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 ANN训练和优化 |
| 4.3.2 ANN和GRM模型参数耦合 |
| 4.3.3 ANN预测连续流层析过程参数 |
| 4.3.4 ANN辅助连续流层析过程优化 |
| 4.3.5 基于ANN混合模型的介质性能参数分析 |
| 4.4 基于混合模型的连续流层析过程分析软件包 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 双柱连续迎头层析模型构建及过程优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 迎头层析模型构建 |
| 5.2.1 集总动力学模型 |
| 5.2.2 单柱迎头层析和双柱连续迎头层析 |
| 5.2.3 连续迎头层析过程评价 |
| 5.3 模型参数及优化方法 |
| 5.3.1 迎头层析模型参数 |
| 5.3.2 迎头层析的过程优化 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 两种优化方法比较 |
| 5.4.2 迎头层析分离的参数分析和过程优化 |
| 5.4.3 敏感性分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 单抗批次和连续生产的过程模拟和经济性分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 单抗批次生产流程构建 |
| 6.2.1 上游细胞培养流程 |
| 6.2.2 下游分离纯化流程 |
| 6.3 单抗批次生产的过程分析和经济性评价 |
| 6.3.1 不同生产规模的经济性分析 |
| 6.3.2 瓶颈分析和过程评价 |
| 6.4 单抗连续生产流程构建 |
| 6.4.1 上游连续细胞培养 |
| 6.4.2 下游连续分离 |
| 6.5 单抗连续生产的过程分析和经济性评价 |
| 6.5.1 投资分析 |
| 6.5.2 生产成本分析 |
| 6.5.3 设备相关成本和劳动力成本的制约关系 |
| 6.6 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 作者简介 |
（3）Bacillus cereus MH19基因组分析及胶原酶分离纯化与重组表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 微生物胶原酶 |
| 1.1 微生物胶原酶的种类 |
| 1.2 胶原酶的分子生物学特征 |
| 1.3 胶原酶的多样性 |
| 1.4 胶原酶与明胶酶及其他胶原蛋白降解酶的区别 |
| 1.5 胶原酶的应用 |
| 2 研究目的与主要内容 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 第二章 产胶原酶蜡样芽孢杆菌的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株培养形态 |
| 2.2 菌株培养显微镜观察 |
| 2.3 菌株产胶原酶活性 |
| 2.4 菌株16SrDNA序列鉴定 |
| 2.5 MYP培养鉴定 |
| 2.6 菌株生理生化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胶原酶活性的测定 |
| 3.2 芽孢杆菌属内菌种的鉴定 |
| 3.3 产胶原酶菌株的筛选 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 Bacillus cereus MH19全基因组测序及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因组DNA质量 |
| 2.2 测序及基因组基本特征 |
| 2.3 GC-Depth分析 |
| 2.4 基因组注释与基因功能分析 |
| 2.5 比较基因组学分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 Bacillus cereus MH19胶原酶结构与功能分析 |
| 1 方法 |
| 1.1 基因功能注释查找胶原酶基因 |
| 1.2 胶原酶基因系统发育分析 |
| 1.3 胶原酶氨基酸组成和物理化学特性分析 |
| 1.4 胶原酶结构域分析 |
| 1.5 胶原酶二级结构的预测 |
| 1.6 胶原酶三维模型预测和评估 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因功能注释查找胶原酶基因 |
| 2.2 胶原酶基因系统发育分类分析 |
| 2.3 理化性质 |
| 2.4 胶原酶结构域及功能分析 |
| 2.5 胶原酶二级结构分析 |
| 2.6 胶原酶三级结构预测和评估 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 胶原酶的分离纯化及性质研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bacillu cereus MH19菌株生长曲线与酶活曲线 |
| 2.2 胶原酶的分离纯化 |
| 2.3 胶原酶的酶学性质分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BCC与其他微生物胶原酶的性质比较 |
| 3.2 胶原酶的应用 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 ColB胶原酶基因在大肠杆菌中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ColB序列分析及预处理 |
| 2.2 密码子优化设计 |
| 2.3 ColB的全基因合成 |
| 2.4 重组表达载体pET30a-ColB构建 |
| 2.5 重组质粒菌落PCR鉴定 |
| 2.6 重组质粒提取及双酶切鉴定 |
| 2.7 重组质粒pET30a-ColB测序分析 |
| 2.8 重组ColB蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.9 重组ColB蛋白的纯化及可溶性分析 |
| 2.10 重组ColB蛋白质量检测 |
| 2.11 重组蛋白ColB胶原酶活性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组蛋白表达系统的选择 |
| 3.2 提高重组蛋白的可溶性表达 |
| 4 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 本研究存在的问题及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）烟酰胺单核苷酸的生物酶法合成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 烟酰胺单核苷酸 |
| 1.1.1 烟酰胺单核苷酸代谢与功能 |
| 1.1.2 烟酰胺单核苷酸与疾病 |
| 1.1.3 烟酰胺单核苷酸的应用 |
| 1.2 生物法合成烟酰胺单核苷酸 |
| 1.2.1 生物酶法合成NMN |
| 1.2.2 边发酵边合成烟酰胺单核苷酸 |
| 1.3 基于生物信息学的酶元件挖掘 |
| 1.3.1 蛋白数据库 |
| 1.3.2 蛋白质三维结构预测方法 |
| 1.3.3 分子对接技术 |
| 1.4 研究意义和主要内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 烟酰胺磷酸核糖转移酶的挖掘 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 主要数据库 |
| 2.2.2 软件与工具 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 烟酰胺磷酸核糖转移酶的数据库分析 |
| 2.3.2 BLASTP挖掘同源相似的烟酰胺磷酸核糖转移酶 |
| 2.3.3 同源建模 |
| 2.3.4 分子对接 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 烟酰胺磷酸核糖转移酶的数据库挖掘及序列分析 |
| 2.4.2 烟酰胺磷酸核糖转移酶的同源建模 |
| 2.4.3 烟酰胺磷酸核糖转移酶的底物分子对接及分子虚拟筛选 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达与酶学性质 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 菌株与材料 |
| 3.2.2 试剂与耗材 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 主要溶液的配制 |
| 3.2.5 实验仪器 |
| 3.3 实验内容与方法 |
| 3.3.1 pET30a-nampt重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.3.2 BL21/pET30a-nampt的制备及转化 |
| 3.3.3 重组Nampt在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 3.3.4 重组Nampt的酶学性质分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 pET30a-nampt重组质粒及表达菌株的构建 |
| 3.4.2 重组Nampt在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 3.4.3 重组Nampt的酶学性质分析与比较 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 单酶、多酶法催化合成烟酰胺单核苷酸 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 菌株与材料 |
| 4.2.2 试剂与耗材 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 主要溶液的配制 |
| 4.2.5 实验仪器 |
| 4.3 实验内容与方法 |
| 4.3.1 单酶法合成烟酰胺单核苷酸 |
| 4.3.2 多酶法合成烟酰胺单核苷酸 |
| 4.3.2.1 核糖激酶与核糖磷酸焦磷酸激酶数据库及文献分析 |
| 4.3.2.2 基因合成 |
| 4.3.2.3 pET30a-prs与pET30a-rbks重组质粒的鉴定 |
| 4.3.2.4 BL21/p ET30a-rbks和 BL21/p ET30a-prs的制备及转化 |
| 4.3.2.5 重组Prs与重组Rbks在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 4.3.2.6 双酶、三酶联用催化合成烟酰胺单核苷酸 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 单酶法合成烟酰胺单核苷酸 |
| 4.4.2 多酶法合成烟酰胺单核苷酸 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 本论文创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）纳豆激酶高产菌株的选育及其分离纯化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究背景 |
| 2 纳豆激酶 |
| 2.1 纳豆激酶的结构 |
| 2.2 纳豆激酶的酶学特性 |
| 2.3 纳豆激酶的溶栓功能 |
| 2.4 纳豆激酶的药理功能 |
| 2.5 纳豆激酶的毒性评估 |
| 2.6 纳豆激酶的活性测定方法 |
| 2.7 纳豆激酶的分离纯化 |
| 2.8 NK研究的展望 |
| 3 微生物诱变技术 |
| 3.1 物理诱变 |
| 3.2 化学诱变 |
| 4 基因组改组技术 |
| 4.1 基因组改组技术概述 |
| 4.2 基因组改组的过程 |
| 5 研究目的及内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 诱变选育枯草芽孢杆菌高产纳豆激酶菌株 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 XZI125的生长曲线 |
| 2.2 尿激酶标准曲线 |
| 2.3 紫外诱变 |
| 2.4 ARTP诱变 |
| 2.5 高产突变株的遗传稳定性 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基因组改组选育枯草芽孢杆菌高产纳豆激酶菌株 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原生质体形成和再生条件的选择 |
| 2.2 原生质体灭活条件研究 |
| 2.3 融合条件研究 |
| 2.4 基因组改组 |
| 2.5 2G42的遗传稳定性 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 磁性壳聚糖微球亲和吸附剂对纳豆激酶分离纯化的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 影响MCTS制备的因素 |
| 2.2 MCTS的表征 |
| 2.3 吸附动力学 |
| 2.4 吸附等温线 |
| 2.5 离子强度对吸附作用的影响 |
| 2.6 解吸附动力学 |
| 2.7 磁性亲和吸附剂对NK分离结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）禽白血病及鸡白痢检测用标准物质的纯化及稳定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 鸡白痢和禽白血病流行及检测用标准物质 |
| 1.1.1 禽病现状及特点 |
| 1.1.2 鸡白痢的简述及流行病学 |
| 1.1.3 禽白血病的简述及流行病学 |
| 1.1.4 鸡白痢和禽白血病的防控 |
| 1.1.5 禽病的诊断方法及进展 |
| 1.1.5.1 鸡白痢的诊断方法和进展 |
| 1.1.5.2 禽白血病的诊断方法和进展 |
| 1.1.6 标准物质重要性 |
| 1.1.7 鸡白痢及禽白血病标准物质研发现状 |
| 1.2 蛋白质纯化方法 |
| 1.2.1 抗体的纯化策略 |
| 1.2.1.1 沉淀法 |
| 1.2.1.2 离子交换色谱 |
| 1.2.1.3 亲和色谱 |
| 1.2.1.4 疏水作用色谱 |
| 1.2.1.5 其他色谱方法 |
| 1.2.2 带标签重组蛋白的纯化策略 |
| 1.3 蛋白质稳定性研究 |
| 1.3.1 提高稳定性的方法及策略 |
| 1.3.1.1 赋形剂 |
| 1.3.1.2 干燥法 |
| 1.3.1.3 定点突变 |
| 1.3.1.4 化学修饰 |
| 1.3.2 蛋白质稳定性研究技术 |
| 1.3.2.1 差示扫描荧光技术 |
| 1.3.2.2 差示扫描量热技术 |
| 1.3.2.3 尺寸分析技术 |
| 1.3.2.4 活性分析技术 |
| 1.4 本文研究及意义 |
| 第2章 禽白血病P27抗原蛋白的纯化制备与稳定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌株的培养及诱导表达 |
| 2.3.2 菌体破碎获取P27原料液 |
| 2.3.3 吸附式Ni亲和层析 |
| 2.3.4 酶切去除组氨酸标签 |
| 2.3.5 穿透式Ni亲和层析精制P27 |
| 2.3.6 纯度测定 |
| 2.3.7 活性测定 |
| 2.3.8 分子量测定 |
| 2.3.9 毛细管凝胶电泳分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 菌体发酵培养 |
| 2.4.2 原料液不同保存条件下的裂解行为 |
| 2.4.3 原料液保存条件对亲和层析的影响 |
| 2.4.4 酶切条件的优化和裂解机理分析 |
| 2.4.5 酶切后P27蛋白的精制 |
| 2.4.6 毛细管电泳鉴定 |
| 2.4.7 P27蛋白标准物质纯度和活性检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 鸡白痢沙门氏菌兔抗血清多抗IgG标准物质的纯化制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 多抗IgG高效液相色谱分析及定量 |
| 3.3.2 等电点及蛋白浓度测定 |
| 3.3.3 阳离子交换层析纯化血清中IgG |
| 3.3.4 阴离子交换层析纯化血清中IgG |
| 3.3.5 Protein A亲和层析 |
| 3.3.6 IgG纯度测定及Western Blot检测 |
| 3.3.7 抗体活性检测 |
| 3.3.8 稳定剂型快速筛选及加速稳定性试验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 多抗IgG的高效液相色谱检测及定量方法的建立 |
| 3.4.2 纯品分析鉴定 |
| 3.4.3 阳离子交换层析介质和pH的筛选 |
| 3.4.4 阴离子交换层析介质和pH的筛选 |
| 3.4.5 Q-XL一步纯化效率 |
| 3.4.6 IgG蛋白保存稳定剂研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 鸡白痢沙门氏菌O-抗原的提取及应用于在抗血清纯化与诊断的探索 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 O-抗原糖链的提取与纯化 |
| 4.3.2 LPS的提取与纯化 |
| 4.3.3 样品中糖、蛋白、核酸的浓度测定 |
| 4.3.4 ITC测定提取O-抗原及LPS与多抗IgG相互作用 |
| 4.3.5 GPC计算样品中多糖分子量 |
| 4.3.6 LPS的银染检测 |
| 4.3.7 O-抗原接枝到超大孔介质上 |
| 4.3.8 激光共聚焦显微镜检测接枝情况 |
| 4.3.9 特异性亲和介质静态吸附实验 |
| 4.3.10 制备ELISA包被板及IgG滴度检测 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 O-抗原提取与GPC测定分子量范围 |
| 4.4.2 ITC检测O-抗原与多抗IgG的相互作用 |
| 4.4.3 LPS提取及ITC测定 |
| 4.4.4 激光共聚焦检测O-抗原的有效接枝 |
| 4.4.5 静态吸附测定亲和介质特异性 |
| 4.4.6 O-抗原与LPS包被及ELISA检测 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 后期工作建议 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（7）肺内皮细胞靶向肽修饰的成纤维细胞生长因子对放射性肺损伤的修复（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 LET-bFGF重组蛋白的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 LET-bFGF重组蛋白的肺靶向验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 LET-bFGF重组蛋白对放射性肺损伤大鼠模型的修复作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 放射性肺损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文与研究成果 |
| 致谢 |
（8）激活PDGFRβ激酶的多种别构调节机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 受体酪氨酸激酶 |
| 1.2 血小板衍生生长因子受体 |
| 1.2.1 血小板衍生生长因子 |
| 1.2.2 PDGFRβ结构与功能 |
| 1.2.3 信号识别多样性 |
| 1.3 PDGFRβ的抑制机制 |
| 1.3.1 近膜段自抑制 |
| 1.3.2 活化环对激酶的抑制作用 |
| 1.3.3 激酶插入区对激酶抑制作用 |
| 1.3.4 C端尾巴对激酶的抑制作用 |
| 1.4 PDGFRβ的激活与疾病 |
| 1.4.1 配体介导的激活 |
| 1.4.2 不依赖于配体的激活 |
| 1.4.3 遗传损伤 |
| 1.5 PDGF-PDGFR靶向药物的分子机制 |
| 1.6 集落刺激因子1受体 |
| 1.6.1 CSF1R配体 |
| 1.6.2 CSF1R的结构与激活 |
| 1.6.3 与CSF-1/CSF1R有关的疾病和靶向药物 |
| 1.7 研究目标与意义 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体 |
| 2.1.2 基因 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 菌株和细胞 |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.1.6 实验仪器 |
| 2.2 实验材料配制 |
| 2.2.1 分子克隆 |
| 2.2.2 细胞培养及功能试验 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 质粒构建 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细胞水平蛋白活性检测 |
| 2.3.4 细胞水平蛋白交联实验 |
| 2.3.5 PDGFRβ蛋白大规模表达 |
| 2.3.6 蛋白的纯化 |
| 2.3.7 分子水平激酶活性的鉴定 |
| 2.3.8 化学交联和质谱分析 |
| 2.3.9 Rosetta建模 |
| 第3章 激活PDGFRβ激酶的多种别构调节机理研究 |
| 3.1 形成反式磷酸化复合物对于PDGFRβ激酶反式激活不是必需的 |
| 3.1.1 p EF-puro-PDGFRβ突变体的构建 |
| 3.1.2 p EF-puro-PDGFRβ突变体的表达及激酶活性 |
| 3.2 配体结合PDGFRβ受体后会形成一个对称激活的二聚体 |
| 3.2.1 PDGFRβ蛋白细胞水平交联实验 |
| 3.2.2 PDGFRβ蛋白纯化 |
| 3.2.3 PDGFRβ蛋白体外活性实验 |
| 3.2.4 PDGFRβ蛋白体外交联实验 |
| 3.2.5 CXMS和 Rosetta建模 |
| 3.3 对称激酶二聚体界面的破坏,干扰了配体刺激的PDGFRβ和 CSF1R的激活 |
| 3.3.1 对称激酶二聚体界面的破坏,干扰了配体刺激的PDGFRβ的激活 |
| 3.3.2 对称激酶二聚体界面的破坏,干扰了配体刺激的CSF1R的激活 |
| 3.3.3 PDGFR激酶激活需要多种调节机制 |
| 第4章 激酶插入区可以自我抑制配体诱导的激酶活化 |
| 4.1 利用CXMS与 Rosetta计算PDGFRβ激酶插入区的结构 |
| 4.2 PDGFRβ激酶插入区突变体的构建与激酶活性 |
| 第5章 研究结论与意义 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（9）白脊藤壶cp19k蛋白的界面附着机理及仿生多肽研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 藤壶 |
| 1.1.1 藤壶的进化地位 |
| 1.1.2 藤壶的生活周期 |
| 1.1.3 藤壶生活周期中的多个粘附事件 |
| 1.2 藤壶胶 |
| 1.2.1 藤壶胶的体内合成、储存与分泌 |
| 1.2.2 藤壶粘着界面的形貌与化学特征 |
| 1.2.3 藤壶胶蛋白的分离与表征 |
| 1.3 藤壶胶固化机理 |
| 1.3.1 藤壶胶蛋白在粘着点的空间定位 |
| 1.3.2 表面粘附:配位和物理相互作用 |
| 1.3.3 内在粘合:自组装与酶催化交联 |
| 1.3.4 界面蛋白与内在蛋白互作 |
| 1.3.5 藤壶胶水下粘附分子模型 |
| 1.4 本文选题依据及研究内容 |
| 第二章 基于融合蛋白Trx-Balcp19k的超强胶粘剂的研究 |
| 2.1 Balcp19k的基因克隆与异源表达 |
| 2.1.1 Balcp19k的克隆与表达载体的构建 |
| 2.1.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.2 Trx-Balcp19k gel超强胶粘剂的发现 |
| 2.3 Trx-Balcp19k gel的粘性表征 |
| 2.3.1 表面涂层分析 |
| 2.3.2 快速检测Trx-Balcp19k gel的宏观粘结能力 |
| 2.3.3 宏观剪切测试 |
| 2.4 Trx-Balcp19k gel的生化组成分析 |
| 2.4.1 SDS-PAGE检测Trx-Balcp19k gel的蛋白组分 |
| 2.4.2 比色法检测Trx-Balcp19k gel的总糖和总脂含量 |
| 2.5 Trx-Balcp19k gel的形成机理分析 |
| 2.6 Trx-Balcp19k gel的细胞毒性测试 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 无标签重组Balcp19k及其Cys缺失突变体的制备 |
| 3.1 新融合蛋白Trx-Balcp19k′的表达与纯化 |
| 3.1.1 新重组质粒的构建 |
| 3.1.2 Trx-Balcp19k′的诱导表达 |
| 3.1.3 结合亲和层析和离子交换层析纯化Trx-Balcp19k′ |
| 3.2 肠激酶切割反应 |
| 3.2.1 Trx-Balcp19k′的肠激酶切割反应初试 |
| 3.2.2 肠激酶切割反应条件的优化 |
| 3.2.3 利用优化后的条件切割Trx-Balcp19k′ |
| 3.3 无标签r Balcp19k的分离纯化 |
| 3.3.1 结合亲和层析与离子交换层析分离r Balcp19k |
| 3.3.2 结合离子交换层析与RP-HPLC分离r Balcp19k |
| 3.3.3 验证纯化的r Balcp19k |
| 3.4 r Balcp19k的 Cys缺失突变体的制备 |
| 3.4.1 PCR定点突变 |
| 3.4.2 r Balcp19k突变体的表达与纯化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 重组Balcp19k的结构、自组装与粘附功能研究 |
| 4.1 r Balcp19k的二级结构研究 |
| 4.1.1 生物信息学预测r Balcp19k的二级结构 |
| 4.1.2 CD检测r Balcp19k的二级结构 |
| 4.1.3 检测Trx标签对Balcp19k二级结构的影响 |
| 4.2 AFM成像研究r Balcp19k的自组装 |
| 4.2.1 r Balcp19k在不同p H下的自组装研究 |
| 4.2.2 r Balcp19k在酸性p H下的自组装进程 |
| 4.2.3 检测预组装r Balcp19k纳米纤维在海水条件下的稳定性 |
| 4.3 r Balcp19k纳米纤维的Th T染色 |
| 4.4 r Balcp19k在云母上的附着功能研究 |
| 4.4.1 基于AFM的胶体探针技术简介 |
| 4.4.2 胶体探针的制备 |
| 4.4.3 检测组装前r Balcp19k在云母上的粘性 |
| 4.4.4 检测组装后r Balcp19k纳米纤维的粘性 |
| 4.5 检测二硫键对Balcp19k的结构、自组装和粘性的影响 |
| 4.5.1 CD检测r Balcp19k(C5-39S)的二级结构 |
| 4.5.2 r Balcp19k(C5-39S)的自组装研究 |
| 4.5.3 r Balcp19k(C5-39S)的粘性 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 藤壶cp19k仿生多肽的研究 |
| 5.1 Balcp19k仿生多肽的设计与合成 |
| 5.2 生物信息学分析Balcp19k仿生多肽的基本性质 |
| 5.3 仿生多肽在酸性条件下的结构和自组装研究 |
| 5.3.1 多肽样品的制备 |
| 5.3.2 CD分析P1~P9在酸性条件下的二级结构 |
| 5.3.3 AFM成像检测P1~P9在酸性条件下的自组装形貌 |
| 5.3.4 ThT染色 |
| 5.4 仿生多肽在PBS中的结构和自组装研究 |
| 5.4.1 多肽样品制备 |
| 5.4.2 CD分析P1~P9在PBS中的二级结构 |
| 5.4.3 AFM成像检测P1~P9在PBS中的自组装形貌 |
| 5.4.4 ThT染色 |
| 5.5 不同条件下P4的自组装性质研究 |
| 5.5.1 浓度对P4自组装的影响 |
| 5.5.2 离子强度对P4自组装的影响 |
| 5.5.3 pH对P4自组装的影响 |
| 5.6 探讨P4自组装的分子机理 |
| 5.6.1 预测P4多肽的二级结构 |
| 5.6.2 预测P4多肽的三维构象 |
| 5.6.3 假想的P4自组装分子机理 |
| 5.7 本章小结 |
| 第六章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附录A 常用英文缩写检索表 |
| 附录B 主要仪器设备信息 |
（10）CNBr-Papain-Sepharose 4B亲和法对草鱼鱼糜漂洗液中CPIs回收纯化及其性质鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.2 Cystatin超家族的概述 |
| 1.2.1 Cystatin超家族的发现 |
| 1.2.2 超家族的分类 |
| 1.3 鱼类Cystatins(家族II) |
| 1.3.1 .Cystatins(家族II)的来源 |
| 1.3.2 Cystatins(家族II)的结构 |
| 1.3.3 Cystatins(家族II)的抑制机制 |
| 1.3.4 Cystatins(家族II)的生理活性和功能 |
| 1.3.5 Cystatins(家族II)在食品领域的应用前景 |
| 1.3.6 天然鱼源Cystatins(家族II)的研究进展 |
| 1.4 亲和层析技术概述 |
| 1.4.1 亲和层析的原理 |
| 1.4.2 亲和层析的基质 |
| 1.4.3 亲和层析在Cystatins中的纯化应用 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的抑制活性测定 |
| 2.2.2 蛋白浓度测定 |
| 2.2.3 草鱼鱼糜漂洗液CPIs粗酶液制备 |
| 2.2.4 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的分离纯化 |
| 2.2.5 草鱼鱼糜漂洗液CPIs基本理化性质鉴定 |
| 2.2.6 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的明胶底物-SDS-反相酶谱法初步鉴定 |
| 2.2.7 C18RP-HPLC法鉴定CPIs的纯度 |
| 2.2.8 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的热稳定性和酸碱稳定性测定 |
| 2.2.9 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的抑制活性类型鉴定 |
| 2.2.10 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的抑制常数Ki测定 |
| 2.2.11 CNBr-Papain-Sepharose4B亲和填料的制备 |
| 2.2.12 CNBr-Papain-Sepharose4B亲和填料的性能分析 |
| 2.2.13 CNBr-Papain-Sepharose4B的装柱 |
| 2.2.14 数据处理与统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 草鱼鱼糜漂洗液CPIs粗提条件筛选 |
| 3.1.1 粗提过程中酸碱处理条件的筛选 |
| 3.1.2 粗提过程中硫酸铵分级沉淀浓度范围的筛选 |
| 3.2 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的粗提液制备 |
| 3.3 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的分离纯化及其鉴定 |
| 3.3.1 CNBr-Papain-Sepharose4B亲和层析 |
| 3.3.2 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的C18RP-HPLC分离纯化 |
| 3.3.3 C18RP-HPLC法鉴定CPIs的纯度与疏水性 |
| 3.3.4 TSKgelG2000SWXLHPLC色谱法测定草鱼鱼糜漂洗液CPIs的分子量 |
| 3.4 草鱼鱼糜漂洗液CPIs纯化表 |
| 3.5 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的理化性质鉴定 |
| 3.5.1 草鱼鱼糜漂洗液CPIs热稳定性测定 |
| 3.5.2 草鱼鱼糜漂洗液CPIs酸碱稳定性测定 |
| 3.5.3 草鱼鱼糜漂洗液中CPIs的抑制常数Ki的测定 |
| 3.5.4 草鱼鱼糜漂洗液CPIs对Papain的抑制活性 |
| 3.5.5 草鱼鱼糜漂洗液CPIs抑制活性类型的测定 |
| 3.5.6 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的双向电泳 |
| 3.5.7 草鱼鱼糜漂洗液CPIs的质谱鉴定 |
| 3.6 亲和填料CNBr-Papain-Sepharose4B的制备与性能分析 |
| 3.6.1 CNBr-Papain-Sepharose4B的紫外光谱分析 |
| 3.6.2 CNBr-Papain-Sepharose4B的红外光谱分析 |
| 3.6.3 CNBr-Papain-Sepharose4B的微球性状描述 |
| 3.6.4 Papain偶联密度及Cystatin吸附性能(亲和率)测定 |
| 3.6.5 CNBr-Papain-Sepharose4B热稳定测定 |
| 3.6.6 CNBr-Papain-Sepharose4B酸碱稳定性测定 |
| 3.6.7 CNBr-Papain-Sepharose4B对二价金属离子的耐受性 |
| 3.6.8 CNBr-Papain-Sepharose4B对金属螯合剂EDTA的耐受性 |
| 3.6.9 CNBr-Papain-Sepharose4B贮藏稳定性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CNBr-Papain-Sepharose4B纯化Cystatins(家族II)的应用 |
| 4.2 关于鱼Cystatins(家族II)的稳定性 |
| 4.3 关于鱼源Cystatins(家族II)活性特征与抑制常数Ki |
| 4.4 关于草鱼鱼糜漂洗液Cystatins家族的分类 |
| 4.5 Sepharose4B载体活化及Papain偶联过程中特性的分析 |
| 4.6 Cystatin的吸附率为指标来筛选Papian适宜偶联密度 |
| 4.7 关于Papain亲和填料的制备及其稳定性 |
| 4.8 关于亲和层析的吸附与洗脱 |
| 5 结论 |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 作者简历 |
四、Adsorption and Step Elution of Urokinase Using Affinity Chromatography-Comparison of Data with Rate Model Simulation（论文参考文献）
- [1]产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用[D]. 张轩. 江南大学, 2021(01)
- [2]模型辅助的连续流层析过程开发和抗体分离应用研究[D]. 史策. 浙江大学, 2021
- [3]Bacillus cereus MH19基因组分析及胶原酶分离纯化与重组表达[D]. 陈世化. 华中农业大学, 2020(02)
- [4]烟酰胺单核苷酸的生物酶法合成[D]. 廖一波. 华南理工大学, 2020(02)
- [5]纳豆激酶高产菌株的选育及其分离纯化的研究[D]. 薛莹莹. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]禽白血病及鸡白痢检测用标准物质的纯化及稳定[D]. 尤星力. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2019(08)
- [7]肺内皮细胞靶向肽修饰的成纤维细胞生长因子对放射性肺损伤的修复[D]. 关东伟. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]激活PDGFRβ激酶的多种别构调节机理[D]. 王媚媚. 天津大学, 2019(06)
- [9]白脊藤壶cp19k蛋白的界面附着机理及仿生多肽研究[D]. 梁超. 国防科技大学, 2018(01)
- [10]CNBr-Papain-Sepharose 4B亲和法对草鱼鱼糜漂洗液中CPIs回收纯化及其性质鉴定[D]. 杨娟. 四川农业大学, 2018(01)