一、RTP-CR和nested-PCR技术在猪瘟病毒检测中的应用（论文文献综述）
苗春,李伟,杨思成,邵军军,常惠芸[1]（2022）在《非洲猪瘟诊断技术研究进展》文中进行了进一步梳理非洲猪瘟防控目前暂无安全有效疫苗可用,因此快速、可靠的检测方法对其防控至关重要。目前应用的非洲猪瘟诊断技术主要表现在病原、核酸、抗原与抗体四个方面:病原检测主要有红细胞吸附和病毒分离方法,核酸检测目前已开发出实时荧光定量PCR（qPCR）、多重PCR（mPCR）、微滴数字PCR（ddPCR）、巢氏PCR（nested-PCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）、交叉引物扩增技术（CPA）、原位杂交技术（ISH）以及生物传感器技术等,抗原检测常用荧光抗体试验（FAT）、抗原ELISA、侧向流动免疫色谱分析（LFA）等,而抗体检测主要通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光抗体试验（IFA）、胶体金快速免疫层析法（GICA）、免疫印迹法（IBT）等方法。每种诊断技术都有其特点,从而为不同情况下的ASFV诊断提供了多种选择。未来,其他技术如CRISPR等与上述技术的结合应用,以及不同诊断技术的联合应用,将成为非洲猪瘟诊断技术发展的趋势。
钱程[2]（2021）在《荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究》文中研究表明核酸检测技术是以生物体内的核酸为靶标进行分析的检测手段。该技术目前已经被广泛应用于食品安全检测、环境污染物监控、临床诊断、遗传分析等众多领域。从样本获取到结果输出,核酸检测技术一般包含提取、扩增和检测三个基本环节。目前,已知的核酸检测技术或是需要复杂的样本提取操作、或是需要耗时冗长的扩增环节、或是需要毒性较大的凝胶电泳鉴定等,都存在着许多的缺陷。为了能够将该技术更好的在实际使用场合中进行推广,本论文从该技术的三个基本环节入手,针对其中的不足之处进行了相应的优化和改进,建立了集荧光可视化、便携性、低成本等优点的核酸分析平台。论文中选取了三种重要的感染于常见农副产品的动植物病菌作为应用对象,将所建立的分析平台用于对这些病菌的快速检测以评估其实际性能。本论文主要研究内容及相关结论如下:（1）论文建立了集核酸快速提取、快速PCR扩增、终点肉眼检测于一体的高效核酸分析平台,并将其应用于对虾传染性皮下组织及造血器官坏死病病毒（IHHNV）的检测。为了尽可能简化核酸检测的流程,提高检测效率,本论文分别从提取、扩增、检测的三个环节进行了相应的优化。首先,论文中引入了碱裂解法用以快速获取核酸样本,将繁琐的核酸提纯环节缩短到仅需3 min即可完成;其次,引入了快速PCR体系,通过对“平衡范例方程”的理解和探索,将传统的三温区PCR循环简化为动态双温区进行,成功地将本需要2 h的PCR扩增环节缩短到10 min以内;接着,引入了分子信标技术,通过对其结构的研究,设计了具有较高特异性的探针体系,实现了在常温下对靶标核酸的肉眼荧光可视化结果判读。此外,通过改变分子信标末端的荧光标记,实现了在同一反应管内对两种不同靶标核酸的高灵敏度双重检测。该分析平台具有较高的特异性和灵敏度,可以充分用于虾苗的IHHNV感染情况的初筛和周期性复检,其低成本、易操作的特性也十分适宜现场检测的应用,该病毒在对虾养殖产业中危害巨大,连年造成不小的经济损失。基于该分析平台的方法可以实现在15 min内对虾苗样本中的IHHNV靶标进行快速可视化分析,检测限达到每反应1000拷贝。与现行国标方案相比,将检测时间从3 h缩短到仅需15 min,并且减少了对大型仪器设备的需求,大大提高了检测效率和实用性。（2）论文建立了集防止核酸污染、恒温扩增、荧光可视化终点检测为一体的分析平台,并将其应用于对柑橘黄龙病病菌的快速检测。论文中引入了基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术通过对CRISPR/Cas系统的探索,验证了Cas12a效应蛋白尚未被报道的新PAM序列“UUUN”。基于此新PAM序列,论文中进一步引入了利用尿嘧啶糖基化酶（UracilDNA Glycosylase,UDG）体系来实现防止核酸扩增子气溶胶污染的方案,解决了核酸检测领域的这一痛点。此外,用更为便携和快捷的环介导等温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）代替国标采用的PCR方法,可以进一步缩短整个检测流程的时间并减少对复杂温控仪器的需求。利用CRISPR/Cas体系的高特异性,当特殊设计的cr RNA与靶标黄龙病病菌的核酸配对后会与Cas12a效应蛋白形成复合体,从而激活该蛋白的旁路切割活性,使得体系中带有荧光标记的单链寡核苷酸探针被切割降解,进而导致荧光信号的释放,实现荧光可视化的高灵敏度检测。该分析平台可以实现对柑橘养殖产业影响颇大的的柑橘黄龙病的致病菌——黄龙病病菌（Cirtus huanglongbing,HLB）每反应10拷贝的高灵敏度检测,其检测限相较传统的嵌入式染料方法提高了约100倍。（3）论文建立了针对组分复杂样本的免核酸提纯分析方案,并结合玻璃化手段为热敏感的酶类试剂提供了一种更方便的储藏思路。为了进一步提高核酸检测技术的实际使用性能,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文以近些年在全球范围内疯狂肆虐的非洲猪瘟疫情的病原菌非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）为应用对象,建立了基于玻璃化CRISPR体系及免样本提取的荧光可视化核酸分析平台。基于对CRISPR体系在灵敏度和特异性方面的探索和相关研究结果,论文中进一步尝试省略样本提纯的繁琐步骤,对全血样本不进行任何预处理直接对其中的核酸靶标进行检测。通过对三种常用的具有链置换功能的Bst DNA聚合酶的实验探究,筛选出了最适宜的酶种,用以对未经处理的原始全血样本进行直接扩增,并进行后续的可视化检测。此外,为了更好地将LAMP扩增体系与热敏感的CRISPR体系兼容于同一反应管中,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文探索了以普鲁兰糖和海藻糖作为保护剂,通过玻璃化的方法,将液态的CRISPR试剂脱水成膜的手段来实现其较长时间的稳定储存。基于该方法,经过老化加速试验的测试,原本需要低温储存环境的CRISPR体系可以在室温下稳定储藏180天。该方案可以很好地解决此类热敏感的酶类试剂对于储存环境的超低温要求,并且可以大大节省其远距离冷链运输的成本。该平台可以实现对家猪全血样本中的非洲猪瘟病毒每反应100拷贝级别的检测灵敏度,并且整个检测过程都可以在便携的装置上完成,实现“从样本到结果”的直观输出。
张丽,罗玉子,王涛,孙元,仇华吉[3]（2019）在《非洲猪瘟诊断技术发展现状与需求分析》文中认为非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASF virus,ASFV）引起猪的一种出血性、高度接触性传染病,其临床症状与猪瘟极其相似。该病于2018年8月在我国辽宁省沈阳市首次发生,随后在31个省份爆发,造成直接经济损失达数百亿元。由于目前尚无有效的商品化疫苗,快速、灵敏、简便的诊断技术对于防控和根除该病至关重要。总结了目前应用的ASFV检测技术,比较分析了他们的性能,同时探讨了ASFV诊断技术未来的发展方向及趋势,旨在为我国ASF检测及综合防控提供技术参考。
肖璐[4]（2017）在《7种猪病毒性疫病QIAxcel及Bio-Plex检测方法的建立与初步应用》文中研究说明为实现猪伪狂犬病毒（Pseudorabies,PRV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、猪流行性日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪圆环病毒 2 型（Porcinecircovirustype2,PCV-2）、非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）7 种猪繁殖与呼吸系统病毒性病原的同时检测,促进毛细管凝胶电泳及液相芯片高通量检测技术在动物疫病诊断中的应用。首先,针对 PRV-gB、JEV-NS5、CSFV-5’URT、PCV-2-ORF1、PRRSV-ORF6、PPV-VP1及ASFV-P72基因序列,分别设计7对特异引物,在特异性引物的上、下游5’端均添加一段非同源性的标签序列,形成特异性复合引物,并根据标签序列合成一对用于识别标签的通用引物,下游通用引物5’端添加生物素标记;根据各扩增序列分别设计7条特异性的探针,并在各探针的5’端修饰氨基与12个碳臂,用于与羧基磁性微球的共价偶联。其次,依据PCR扩增产物条带大小,将其分成两组,采用普通凝胶电泳技术,对多重扩增反应体系进行初步探讨。再利用毛细管凝胶电泳的高分辨率优势,对7重反应的条件的两个阶段退火温度,特异性引物浓度和通用引物浓度进行直接同步优化,确立PRRSV、CSFV、JEV、PCV、PRV、PPV与ASFV7重PCR的最优扩增条件,从而建立多重PCR与毛细管凝胶电泳分析系统（PCR-QIAxcel）的联用;基于7重PCR扩增体系,应用Bio-Plex液相芯片分析系统,通过杂交反应条件的优化,构建了 7种猪病毒性疫病Bio-Plex液相芯片检测平台（PCR-Bio-Plex）,并对两种方法的交叉特异性、灵敏性及反应的重复性进行探讨。最后,将本文所建立的两种检测方法在临床样本的检测中进行应用,并对其进行综合评估分析。结果显示最终确立PCR扩增中最优特异性引物终浓度为0.056 μmol/L/条,通用引物的终浓度为0.64 μmol/L/条,两个阶段的退火温度分别为56 ℃、51 ℃,Bio-Plex杂交体系的最优杂交程序为57 ℃杂交30 min,采用最优的反应条件,PCR-QIAxcel 对 PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、ASFV、PPV 的最低检测量分别为:4.56×103、6.35×103、1.98×103、1.32×104、3.21×103、4.51×103、3.37×103拷贝/μL,PCR-Bio-Plex对上述7种病毒最低的检测限度分别为:2.81×102、2.34×102、2.98×102、2.31×102、2.22×103、2.54×103、2.33×103拷贝/μL。特异性试验结果显示,PCR-QIAxcel及PCR-Bio-Plex的特异性均较高,且与其他病毒无交叉反应。65份临床样本的检测结果显示PCR-QIAxcel共检出47份阳性样本,检出率为88.7%（47/53）,PCR-Bio-Plex共检出49份阳性样本,检出率为92.5%（49/53）。PCR-QIAxcel 与 PCR-Bio-Plex 检测结果符合率为 95.9%（47/49）。本文通过反应条件优化,成功建立了 PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 7种病毒PCR-QIAxcel毛细管凝胶电泳及PCR-Bio-Plex液相芯片的检测方法,并对两种方法进行了评估和分析。PCR-QIAxcel与PCR-Bio-Plex检测方法高效、灵活、准确、特异较强、灵敏度较高,Bio-Plex的灵敏度高于QIAxcel约1-2个量级。本文为混合感染的检测方法提供新手段,为对抗外来疫病的检疫、监控提供新思路,对临床样品的快速、准确诊断提供参考,同时,促进高通量检测技术在动物疫病监控的应用与发展,为动物疫病高通量检测技术提供新方向。
张韧[5]（2013）在《猪瘟病毒荧光抗体的制备及初步应用》文中指出猪瘟（classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）引起猪的一类具有高度危害性的传染病,具有高度接触性、传播快速的临床特点。在当前的养殖过程中,由于疫苗的不恰当使用和病毒自身变异等因素,猪瘟的流行发生了改变,在猪群中该病从大规模的流行转变为地方性散发,在个体猪只中该病多以非典型性、慢性及隐性形式出现,这种非典型性、慢性及隐性带毒常常会出现在母猪群中,造成妊娠母猪流产,产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍,同时也会造成母猪的垂直传播及猪群中水平传播,从而给养猪业带来极大的危害。本研究通过制备抗猪瘟病毒单克隆荧光抗体,旨在为猪瘟病毒的检测提供一种快速而又敏感的检测试剂。具体研究内容如下：1.猪瘟病毒单克隆荧光抗体的制备复苏和扩大培养由本实验室研制的猪瘟主要保护性抗原E2囊膜蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞AH9株,通过Babl/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,大量制备了猪瘟单克隆抗体,运用辛酸-硫酸铵法与Sephadex G-25快速蛋白纯化系统进行纯化,得到浓度较高的猪瘟单克隆抗体（蛋白浓度为11.491mg/mL）。经SDS-PAGE电泳检测,在25kDa和50kDa处可以看到两条清晰的条带,证明纯化后的猪瘟单克隆抗体纯度高。运用ELISA法对该单克隆抗体的效价进行测定,效价为1：51200。以异硫氰酸荧光素（FITC）为标记物,采用透析法进行标记,成功制备了免疫荧光猪瘟病毒单克隆抗体检测试剂。2.猪瘟病毒单克隆荧光抗体最佳试验条件的摸索通过对固定剂及固定时间的确定、抗体工作浓度的确定、抗体孵育时间的确定、特异性实验、敏感性实验、符合对比性实验、重复性实验、保存期实验等试验条件摸索。最终我们确定最佳实验条件为：固定条件为60%丙酮+40%乙醇在-20℃下固定30min;抗体最佳工作浓度为1：300；最佳抗体孵育时间为60min;与猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪乙脑病毒等其它常见病原无交叉反应,特异性好；该方法与Real-time PCR样品检出率敏感性相差2个数量级,与RT-Nested PCR样品检出敏感性相差1个数量级,表明用此荧光抗体作为检测试剂具有较高的敏感性；对已知背景的95份样品分别采用直接免疫荧光和RT-Nested试验进行检测,以评定其符合率,结果显示两种检测方法的总符合率达到88.42%,方法间符合率较高；重复性实验结果显示该方法的重复性较好；保存期实验显示,将该荧光抗体于-20℃保存6个月后体依然具有很高的特异性和敏感性。3.猪瘟荧光抗体的临床应用运用冰冻切片技术对2012年9月至11月猪场送检的463份组织病料（肾脏、淋巴结、扁桃体）进行处理,按照已摸索的最佳猪瘟病毒荧光抗体工作条件进行检测,检测结果显示猪瘟病毒抗原呈阳性的病料共62份,送检样品阳性率为13.39%。
王茁,赵福广[6]（2011）在《猪瘟的分子生物学检测技术研究进展》文中研究指明猪瘟是由猪瘟病毒引起的高致死率的烈性传染病。针对猪瘟近年来的发病特征,分子生物学检测技术在实验室诊断中发挥了重要作用。对几种主要的猪瘟分子生物学检测技术进行了综述,为快速、准确、高通量地检测猪瘟病毒提供参考。
杨德全,鞠厚斌,葛菲菲,刘健,王建,周锦萍,刘佩红[7]（2011）在《环介导等温扩增技术及其在动物疫病诊断中的应用》文中研究指明环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplifi cation,LAMP）技术是一门新兴的分子生物学检测技术,因其具有特异性强、敏感性高、简单、快捷及不需要昂贵的仪器设备等特点,受到了生物医学研究者的高度关注。目前,该方法已经被广泛应用于各种病原微生物检测。本文综述了近年来LAMP在动物疫病检测中的具体应用实例和目前的研究进展,并对LAMP方法在动物疫病诊断中的应用前景做了展望。
邓力[8]（2010）在《猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用》文中进行了进一步梳理猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起的一种急性、发热性、高度接触性的病毒性传染病。其在世界范围内流行并引起巨大的经济损失,发病率高,死亡率高,严重威胁着养猪业。我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗是国际公认的最安全有效的弱毒疫苗,在我国乃至全球得到广泛应用,为猪瘟的防控做出了巨大贡献。猪瘟兔化弱毒疫苗包括组织苗和细胞苗,然而不同厂家之间生产的疫苗的免疫效价以及产生的免疫效果均不一样。为了对猪瘟兔化病毒含量进行准确测定,本研究通过RT-PCR方法和体外转录方法,构建了体外转录RNA作为标准品;并通过对各种反应条件和反应体系进行优化,建立了一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR检测方法。同时,利用该方法对3个不同厂家生产的猪瘟兔化弱毒疫苗进行了猪瘟兔化弱毒含量的测定,以及猪瘟兔化弱毒在猪脐静脉血管内皮细胞和牛睾丸细胞中不同增殖情况的测定。本研究获得以下结果:（1）参照GenBank中公布的猪瘟兔化弱毒全长序列（登录号为AF091507）,在其5′端非翻译区设计一对引物,通过RT-PCR成功得到与预期大小相符且包含有T7启动子序列的DNA片段,回收纯化后在T7 RNA聚合酶作用下通过体外转录成功构建了猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法的RNA标准品。其纯度高,稳定性好,浓度高,一次体外转录得到的RNA标准品保存在-70℃下可供长期使用。（2）通过对退火温度、引物和探针浓度等反应条件和反应体系的优化,成功建立了能准确定量猪瘟兔化弱毒的一步法荧光定量PCR检测方法。该方法对猪瘟病毒有很好的特异性,检测灵敏度可达10拷贝/μL RNA,比RT-nPCR方法高出一个数量级,在较广的范围内（1.0×108～1.0×102拷贝/μL）具有很好的相关性（R2=0.999）。对高、中、低3种浓度的标准品RNA进行重复性试验,批内变异系数分别为0.54%、0.52%和0.39%;批间变异系数分别为1.47%、1.85%和1.01%,具有良好的可重复性。（3）对不同厂家生产的不同类型疫苗进行猪瘟兔化弱毒含量测定表明:同一厂家中每一头份脾淋苗中包含的病毒含量比细胞苗中要高出约1～2个数量级,而从不同厂家对比中可以看出,其生产的脾淋苗和细胞苗之间病毒含量有所差异,其中脾淋苗最高相差20.8倍,细胞苗最高相差30.3倍,但所检测疫苗都达到兔体定型热反应要求。（4）对猪瘟兔化病毒在猪脐静脉血管内皮细胞和牛睾丸细胞中增殖情况进行了初步测定,结果显示猪瘟兔化病毒在前者中含量高出在后者中7.1倍,为进一步探索猪瘟病毒在细胞中的增殖提供了有效的检测手段。
张兴娟[9]（2010）在《同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立》文中研究指明猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（HCV或CSFV）引起的一种高度接触性传染病,是危害养猪业最严重的传染病之一。世界动物卫生组织（OIE）将其列入OIE名录,我国将其列为一类传染病。其基因组为单股正链RNA,大小约为12.3 kb,含有1个大的开放阅读框（ORF）,两侧为高度保守的5′和3′非编码区（UTR）。牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和CSFV同为黄病毒科瘟病毒属成员,根据BVDV基因组的差异,我们将其分为两个基因型,即基因型1（BVDV-1）和基因型2（BVDV-2）。同属的成员还包括:绵羊边界病病毒（BDV）和长颈鹿瘟病毒（Pestivirus of Giraffe）。由于BVDV不仅可以感染牛还可以感染猪,引起与猪瘟相似的临床症状和病理变化,同时BVDV与CSFV存在血清学交叉反应,因此很容易被误诊为猪瘟。此外,猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）在我国的大规模应用,使猪瘟野毒感染、疫苗接种的区分变得非常困难和必要。因此,亟待建立一种可以准确区分猪瘟野毒感染、疫苗接种以及BVDV感染的快速、高效、敏感而特异的检测方法。本研究旨在建立一种能同时区分CSFV野毒、HCLV和BVDV-1的敏感、特异、重复性好的三重荧光定量RT-PCR鉴别检测方法。根据CSFV NS5B区域分别设计了针对CSFV野毒、HCLV的引物和TaqMan水解探针,依据BVDV 5′-UTR设计了一对针对BVDV-1的引物和TaqMan水解探针,在优化反应条件的基础上,建立了同时区分CSFV、HCLV和BVDV-1的三重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的CSFV野毒株、HCLV以及BVDV-1完全区分开来,而不与其它猪源病毒发生非特异反应,在107-101拷贝/μL范围内,对CSFV、HCLV和BVDV标准品模板的检测具有良好的线性关系,最低检测限分别为4.5 TCID50（CSFV野毒）、7.8个拷贝（HCLV）或3.2 TCID50（BVDV-1）。用本方法与实验室建立的RT-nPCR、鉴别猪瘟野毒和弱毒的荧光定量RT-PCR和检测BVDV-1的RT-PCR方法分别对176份临床样品72份HCLV疫苗进行检测,符合率均达到了97.0%以上。本方法可以同时定量检测和区分三种病毒,用于现地疑似猪瘟病料、商品化牛血清的检测,同时还可以对猪瘟疫苗的质量进行监控。
胡杰[10]（2009）在《广西种猪场猪瘟监控方法的建立及其应用》文中研究说明猪瘟（Hog Cholera,HC）又称古典猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）,是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种高度接触性传染病,也是世界范围内危害最严重的猪病之一,被国际兽疫局（OIE）列为必须通报的动物传染病,我国将其列为一类传染病。猪和野猪是其唯一宿主。目前CSF仍在我国持续流行,免疫失败现象时有发生,给CSF防控带来困难。本试验旨在建立一套适合广西猪群的CSF防控模式,为大面积控制和消灭该病提供科学依据。一、猪瘟病毒抗体检测用阻断ELISA方法从不同免疫剂量、母猪的不同胎次和母源抗体消长规律及抗体持续期4个方面对猪瘟病毒抗体进行检测,同时将正向IHA和阻断ELISA两种抗体检测方法在不同猪场应用并比较,结果如下：A.分别用CSF（脾淋源和细胞源）活疫苗（各一个批次）以1、1.5、2和3头份4种不同的剂量分别免疫同一个猪场的80只断奶仔猪,检测仔猪体内CSF抗体上升速度。结果显示,免疫剂量2头份的仔猪抗体上升速度最快,其次是剂量为3头份的仔猪,最慢是1头份和1.5头份的仔猪。CSF脾淋源活疫苗免疫效果略优于CSF细胞源活疫苗。B.对某个猪场的产后1个月的1-5胎次的母猪用CSF脾淋源活疫苗以2头份剂量各免疫6头,检测免疫前后各胎次母猪CSF抗体变化情况。结果5胎次母猪抗体上升最快,其次是4胎次母猪,3胎次母猪第三,1胎次母猪抗体上升最慢。C.通过对同一个猪场的1-5胎次母猪产后40d和其所产仔猪出生后40d内母源抗体消长情况作比较,得知母猪产后40d的抗体滴度平均比仔猪高6.02-11.2%,仔猪的抗体水平与母猪的抗体水平呈正相关。母猪和仔猪的抗体均随着哺乳期的推移逐渐下降,并且仔猪母源抗体衰减速度比母猪抗体衰减速度快。产后10d、20d、30d和40d的母猪的抗体阳性率分别为100%、96%、85%和76%,胎次越高,抗体水平也越高。仔猪在出生10d、20d、30d和40d的抗体阳性率分别82%、74%、66%和46%。抗体表现阴性的猪不能阻止CSF野毒的侵袭,且有排毒和散毒危险。在产后20d时有4%母猪不能阻止CSF野毒的侵袭,到产后40d时有24%的母猪不能阻止CSF野毒的侵袭；对仔猪来说,40d时CSF抗体阳性率仅为46%,需进行CSF疫苗免疫。D.用脾淋源CSF活疫苗以1头份的剂量免疫一个猪场25日龄的断奶仔猪20头,在免疫后4d,没有1份猪血清抗体达到阳性,免疫后10d～80d（间隔10d）的抗体阳性率平均分别是为43%、58%、76%、100%、85%、66%、48%和32%,免疫后40d抗体达到最高峰。E.用CSF正向IHA检测广西5个种猪场800份不同生长发育阶段的猪血清CSF抗体水平,用阻断ELISA方法检测对2个种猪场304份不同阶段的猪血清中CSF抗体水平,并比较两种方法在CSF抗体检测上的差异,结果显示,两种方法均可用于猪场常规CSF抗体监测,将这两种抗体滴度值之间进行平行比较,两者复合性不高,仅为62%左右,但ELISA的敏感性明显高于IHA。二、血清中猪瘟野毒感染调查及血清抗体与猪瘟病毒Erms之间的关系探讨用CSFV糖蛋白Erns ELISA试剂盒检测2006年6个种猪场1614份猪血清,发现广西种猪场CSF野毒感染情况严重,平均阳性率达25.22%（407/1614）；同时将CSF两种抗体（IHA和阻断ELISA）滴度值按高低分别糖蛋白Erms阳性率之间进行比较,将IHA和阻断ELISA抗体滴度值按高低,分别与糖蛋白Ems阳性率之间进行比较,发现在两种检测方法的任何一个抗体滴度均可出现糖蛋白Ems阳性,抗体滴度值与糖蛋白Ems阳性率没有直接的线性关系,在抗体滴度值偏低或偏高时,糖蛋白Ems的阳性率会高些。三、猪群猪瘟病毒（CSFV）检测分别用CSFV糖蛋白Ems （gp44/48）ELISA、CSF抗原ELISA、RT-PCR和荧光抗体染色法四种方法对广西种猪群进行CSFV检测和比较,结果如下：2006-2007年用CSF抗原ELISA共检测850份活种猪的全血样品,阳性76份,阳性率为8.94%（76/850）；2005-2007年用RT-PCR方法检测病死猪病料434份,阳性44份,阳性率为10.14%（44/434）,公猪精液1317份,阳性51份,阳性率为3.87%（51/1317）,检测母猪扁桃体867份,阳性23份,阳性率为2.65%（23/867）；2006年用荧光抗体染色法检测250份猪扁桃体,阳性43份,阳性率为17.2%（43/250）,2007检测250份猪扁桃体全部为阴性。四、几种检测活猪感染猪瘟病毒的方法比较分别用CSFV糖蛋白Ems （gp44/48）ELISA、CSF抗原ELISA、RT-PCR和荧光抗体染色法四种方法这四种方法对2个猪场的血清、扁桃体、全血样品进行一一对应CSFV检测和比较,结果显示,荧光抗体染色法检出率最高,RT-PCR方法的次之,CSF抗原ELISA方法第三,但重复性最好,CSFV糖蛋白Erms检出率最低,但仍可筛选出感染CSF野毒猪,与CSF抗原ELISA方法的符合性达75%；三种样品中用扁桃体检测重复性最好。通过淘汰CSFV阳性猪,CSF的发病率逐渐下降,病料中CSFV阳性率从2004年的27.45%下降到2007年的2.25%；母猪CSFV阳性率从2005年的8.11%下降到2007年的0.3%,种公猪精液中CSFV的阳性率从2005年的6.67%下降到2007年的O。
二、RTP-CR和nested-PCR技术在猪瘟病毒检测中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RTP-CR和nested-PCR技术在猪瘟病毒检测中的应用（论文提纲范文）
（1）非洲猪瘟诊断技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 ASF病原学检测 |
| 1.1 病原检测 |
| 1.1.1 病毒分离鉴定 |
| 1.1.2 红细胞吸附试验（haemadsorption test,HAD) |
| 1.2 核酸检测 |
| 1.2.1 PCR |
| 1.2.2 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR) |
| 1.2.3 多重PCR(multiplex polymerase chain reaction,m PCR) |
| 1.2.4 微滴数字PCR(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR) |
| 1.2.5 巢氏PCR(nested-PCR） |
| 1.2.6 环介导等温扩增技术（loop mediated isothermal amplification,LAMP) |
| 1.2.7 重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA) |
| 1.2.8 交叉引物扩增技术（cross priming amplification,CPA) |
| 1.2.9 原位杂交技术（in situ hybridization,ISH) |
| 1.2.1 0 生物传感器技术 |
| 2 血清学检测 |
| 2.1 抗体检测 |
| 2.1.1 酶联免疫吸附试验（ELISA) |
| 2.1.2 间接荧光抗体试验（indirect fluorescent anti-body test,IFA) |
| 2.1.3 胶体金快速免疫层析法（gold immunochromatography assay,GICA) |
| 2.1.4 免疫印迹法（immunoblotting test,IBT) |
| 2.2 抗原检测 |
| 2.2.1 荧光抗体试验（fluorescent antibody test,FAT) |
| 2.2.2抗原ELISA |
| 2.2.3 侧向流动免疫色谱分析（lateral flow assay,LFA) |
| 2.3 常用检测技术比较 |
| 3 展望 |
（2）荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题背景及意义 |
| 1.1.1 核酸检测技术在分子诊断方面的应用 |
| 1.1.2 农副产品中动植物病菌快速检测的重要性 |
| 1.1.3 本节小结 |
| 1.2 核酸扩增检测技术的原理和基本流程 |
| 1.2.1 核酸提取 |
| 1.2.2 核酸扩增 |
| 1.2.3 核酸扩增子检测 |
| 1.2.4 本节小结 |
| 1.3 新型核酸检测分析方法的研究进展 |
| 1.3.1 核酸气溶胶污染防止办法 |
| 1.3.2 快速PCR技术的应用 |
| 1.3.3 免扩增的核酸分析方法 |
| 1.3.4 新型探针技术的应用 |
| 1.3.5 基因编辑技术的应用 |
| 1.3.6 本节小结 |
| 1.4 核酸检测技术目前面临的问题 |
| 1.5 研究目的、内容和技术路线 |
| 1.5.1 研究目的和内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 基于分子信标和快速PCR的双重荧光可视化检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 对虾IHHNV病毒标准PCR检测方法建立 |
| 2.3.2 快速PCR体系循环时间参数探索 |
| 2.3.3 分子信标用于可视化检测条件探索 |
| 2.3.4 可视化检测平台灵敏度与特异性评估 |
| 2.3.5 可视化检测平台应用于双重检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于基因编辑技术的防污染核酸荧光可视化检测方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 针对柑橘黄龙病菌的LAMP扩增体系 |
| 3.3.2 Cas12a效应蛋白新PAM序列可行性分析 |
| 3.3.3 基于Cas12a效应蛋白的荧光可视化检测体系 |
| 3.3.4 基于UDG酶消解的防污染核酸检测体系 |
| 3.3.5 防污染荧光可视化核酸分析平台的搭建 |
| 3.3.6 防污染荧光可视化核酸分析平台灵敏度评估 |
| 3.3.7 防污染荧光可视化核酸分析平台用于柑橘黄龙病菌检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于玻璃化CRISPR及免样本提取的荧光可视化核酸分析方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 针对非洲猪瘟病毒的LAMP扩增体系 |
| 4.3.2 免样本提取的恒温核酸扩增体系 |
| 4.3.3 针对非洲猪瘟病毒的CRISPR/Cas12a检测体系 |
| 4.3.4 普鲁兰糖和海藻糖用于对CRISPR体系的保护 |
| 4.3.5 玻璃化的CRISPR薄膜加速老化试验 |
| 4.3.6 免样本提取可视化核酸分析平台搭建 |
| 4.3.7 免样本提取可视化核酸分析平台用于非洲猪瘟病毒检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 进一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（3）非洲猪瘟诊断技术发展现状与需求分析（论文提纲范文）
| 1 ASF病原学检测技术 |
| 1.1 病毒检测 |
| 1.1.1 病毒分离 |
| 1.1.2 红细胞吸附试验 |
| 1.2 抗原检测 |
| 1.2.1 抗原ELISA |
| 1.2.2 荧光抗体试验 |
| 1.2.3 胶体金免疫层析试纸条 |
| 1.3 核酸检测 |
| 1.3.1 PCR |
| 1.3.2 多重PCR |
| 1.3.3 套式PCR |
| 1.3.4 实时荧光定量PCR |
| 1.3.5 等温扩增技术 |
| 2 ASF血清学检测技术 |
| 2.1 胶体金免疫层析 (GICA) 试纸条 |
| 2.2 ELISA |
| 2.3 间接免疫荧光试验 |
| 2.4 不同检测技术比较 |
| 3 现阶段检测技术需求分析 |
| 4 检测技术发展建议 |
| 5 结语 |
（4）7种猪病毒性疫病QIAxcel及Bio-Plex检测方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 主要中英文缩略词表 第一章 综述 |
| 1. 毛细管凝胶电泳技术的研究进展 |
| 1.2 QIAxcel毛细管凝胶电泳的原理 |
| 1.3 应用 |
| 1.3.1 细菌疾病诊断 |
| 1.3.2 病毒疾病诊断 |
| 1.3.3 遗传性疾病疾病诊断 |
| 1.3.4 植物遗传物质鉴定 |
| 1.3.5 其他 |
| 1.4 QIAxcel毛细管凝胶电泳分析系统的优势与缺点 |
| 1.4.1 优势 |
| 1.4.2 缺点与不足 |
| 1.5 展望与小结 |
| 2. 液相芯片检测平台的研究进展 |
| 2.1 液相芯片的发展过程 |
| 2.2 液相芯片的原理简介 |
| 2.3 液相芯片的应用 |
| 2.3.1 生命科学领域 |
| 2.3.1.1 蛋白表达谱 |
| 2.3.1.2 基因组研究 |
| 2.3.2 病原核酸检测 |
| 2.3.3 遗传性及免疫性疾病诊断 |
| 2.3.4 其他领域 |
| 2.4 展望与小结 |
| 3. 本文研究病原概述 |
| 3.1 猪伪狂犬病 |
| 3.2 猪流行性乙型脑炎病 |
| 3.3 猪圆环2型病 |
| 3.4 猪瘟病 |
| 3.5 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 3.6 猪细小病 |
| 3.7 非洲猪瘟病 |
| 4. 本文的目的与意义 第二章 多重PCR扩增方法的建立 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验的主要材料 |
| 2.1 本章主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 样本来源 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 引物设计 |
| 3.2 病毒核酸DNA/RNA的提取及c DNA的制备 |
| 3.2.1 DNA的提取 |
| 3.2.2 RNA的提取 |
| 3.2.3 c DNA的制备 |
| 3.3 重组质粒的构建 |
| 3.3.1 靶序列的扩增 |
| 3.3.2 靶序列的回收 |
| 3.3.3 连接 |
| 3.3.4 连接产物的转化 |
| 3.3.5 克隆载体的鉴定 |
| 3.3.6 重组质粒的提取 |
| 3.3.7 重组质粒的鉴定 |
| 3.4 PCR扩增体系的建立 |
| 3.4.1 反应体条件的优化 |
| 3.4.2 单重PCR灵敏度的测定 |
| 3.4.3 特异性试验 |
| 4. 结果 |
| 4.1 靶基因及其质粒的鉴定 |
| 4.2 反应条件的优化结果 |
| 4.3 单重PCR灵敏度测定结果 |
| 4.4 特异性验证结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 本章小结 第三章 基于QIAxcel毛细管凝胶电泳系统7种猪病毒病检测方法的建立 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验的主要材料 |
| 2.1 本章主要试剂与仪器 |
| 2.2 样本来源 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 反应体系及程序 |
| 3.2 多重PCR反应条件的优化 |
| 3.3 QIAxcel毛细管凝胶电泳系统的基本操作 |
| 3.4 毛细管分析系统的特异性试验 |
| 3.5 毛细管分析系统灵敏度的测定 |
| 4 结果 |
| 4.1 反应条件优化结果 |
| 4.2 毛细管分析系统的特异性试验 |
| 4.3 毛细管分析系统灵敏度的测定 |
| 5. 讨论 |
| 6. 本章小结 第四章 基于Bio-Plex液相芯片系统7种猪病毒病检测方法的构建 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验的主要材料 |
| 2.1 样本来源 |
| 2.2 主要仪器与试剂 |
| 3. 方法 |
| 3.1 引物和探针的设计 |
| 3.2 Bio-Plex 200~(TM)的校正和验证 |
| 3.3 探针与微球的共价偶联 |
| 3.4 偶联探针的验证 |
| 3.5 杂交反应体系的优化和建立 |
| 3.6 杂交结果的判定标准 |
| 3.7 Bio-Plex液相芯片多重检测技术灵敏度试验 |
| 3.8 Bio-Plex液相芯片多重检测技术特异性试验 |
| 3.9 Bio-Plex液相芯片多重检测技术重复性试验 |
| 4. 结果 |
| 4.1 偶联微球的计数 |
| 4.2 Bio-Plex杂交探针偶联结果 |
| 4.3 Bio-Plex杂交体系的建立 |
| 4.4 Bio-Plex检测平台灵敏度试验结果 |
| 4.5 Bio-Plex检测平台交叉反应及特异性试验结果 |
| 4.6 Bio-Plex检测平台重复性性验结果 |
| 5. 讨论与分析 |
| 6. 本章小结 第五章 PCR-QIAxcel与PCR-Bio-Plex的临床应用 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验的主要材料 |
| 2.1 样本来源 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 样本核酸提提取 |
| 3.2 两种检测方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 本章小结 全文总结 参考文献 致谢 附录1 附录2 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（5）猪瘟病毒荧光抗体的制备及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 猪瘟概述 |
| 1.2 猪瘟病毒研究进展 |
| 1.2.1 猪瘟病毒粒子的结构 |
| 1.2.2 猪瘟病毒的生物学特性 |
| 1.2.3 猪瘟病毒基因组结构 |
| 1.2.5 猪瘟病毒所编码蛋白及其功能 |
| 1.3 猪瘟病毒的致病机制 |
| 1.4 猪瘟全球流行现状 |
| 1.5 猪瘟病毒诊断方法研究进展 |
| 1.5.1 猪瘟临床诊断 |
| 1.5.2 猪瘟抗体检测方法 |
| 1.5.3 猪瘟病毒检测方法 |
| 2. 目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质控毒株及阴性参考模板 |
| 3.1.2 待检样品 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂及酶 |
| 3.1.5 细胞株和实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 猪瘟病毒AH9株杂交瘤细胞的复苏和培养 |
| 3.2.2 猪瘟病毒单克隆抗体的制备及纯化 |
| 3.2.3 猪瘟病毒单克隆荧光抗体的制备与纯化 |
| 3.2.4 猪瘟病毒单克隆荧光抗体实验条件的优化 |
| 3.2.5 猪瘟直接免疫荧光检测方法的初步应用 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 猪瘟病毒AH9株杂交瘤细胞的复苏与鉴定 |
| 4.2 猪瘟病毒单克隆抗体的制备及纯化 |
| 4.2.1 猪瘟病毒单克隆抗体纯度的测定 |
| 4.2.2 猪瘟病毒单克隆抗体浓度的测定 |
| 4.2.3 猪瘟病毒单克隆抗体效价的测定 |
| 4.3 猪瘟病毒单克隆抗体荧光素的标记及纯化 |
| 4.4 猪瘟病毒单克隆荧光抗体实验条件的优化及2种检测方法的符合对比性实验 |
| 4.4.1 猪瘟病毒单克隆荧光抗体实验条件的优化 |
| 4.4.2 猪瘟单克隆荧光抗体与RT-Nested PCR样品检测符合对比性实验结果 |
| 4.5 猪瘟直接免疫荧光抗体的临床应用 |
| 4.5.1 组织样品检测 |
| 4.5.2 送检样品检测 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）猪瘟的分子生物学检测技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 聚合酶链式反应检测技术 |
| 1.1 定性检测技术 |
| 1.2 定量检测技术 |
| 1.2.1 荧光定量PCR技术(FQ-PCR) |
| 1.2.2 RT-PCR ELISA技术 |
| 2 反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP) |
| 3 基因芯片技术 |
| 4 展望 |
（7）环介导等温扩增技术及其在动物疫病诊断中的应用（论文提纲范文）
| 1 LAMP技术原理 |
| 2 LAMP方法在检测动物疫病中的应用 |
| 2.1 在细菌检测中的应用 |
| 2.2 在病毒检测中的应用 |
| 2.2.1 对RNA病毒的检测 |
| 2.2.2 对DNA病毒的检测 |
| 2.3 在寄生虫检测中的应用 |
| 2.3.1 对蠕虫的检测 |
| 2.3.2 对原虫的检测 |
| 2.4 在支原体检测中的应用 |
| 3 LAMP技术特点 |
| 4 结语 |
（8）猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪瘟及猪瘟病毒研究进展 |
| 1.1 猪瘟概述 |
| 1.2 猪瘟病毒概述 |
| 1.3 猪瘟诊断方法的研究进展 |
| 1.3.1 免疫荧光试验 |
| 1.3.2 免疫组化试验 |
| 1.3.3 RT-PCR 方法检测猪瘟 |
| 1.3.4 RT-nPCR 方法检测猪瘟 |
| 1.3.5 Real time RT-PCR 方法检测猪瘟 |
| 第二章 荧光定量PCR 技术及其研究进展 |
| 2.1 荧光定量PCR 技术概述 |
| 2.2 荧光定量PCR 技术在各个研究领域的研究进展 |
| 2.2.1 荧光定量PCR 技术在传染病诊断和病原体定量上的应用 |
| 2.2.2 荧光定量PCR 技术在基因表达研究中的应用 |
| 2.2.3 荧光定量PCR 技术在人类肿瘤研究上的应用 |
| 2.2.4 荧光定量PCR 技术在动物疾病诊断上的应用 |
| 2.2.5 荧光定量PCR 技术在转基因产品检测中的应用 |
| 2.2.6 荧光定量PCR 技术在疫苗效力检定上的应用前景 |
| 2.3 展望 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR 检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞株与病毒株 |
| 3.1.2 主要试剂和溶液配制 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物和探针的设计与合成 |
| 3.2.2 标准品体外转录RNA 的制备 |
| 3.2.3 荧光定量PCR 方法的建立 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 提取的猪瘟病毒总RNA 完整性的鉴定 |
| 3.3.2 标准品引物的扩增及其测序 |
| 3.3.3 标准品RNA 纯度及质量检测 |
| 3.3.4 退火温度的优化 |
| 3.3.5 引物和探针浓度的优化 |
| 3.3.6 标准曲线及灵敏性试验 |
| 3.3.7 特异性试验 |
| 3.3.8 准确性和重复性试验 |
| 3.3.9 与RT-nPCR 方法的比较 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 荧光定量PCR 方法对猪瘟病毒的检测 |
| 3.4.2 荧光定量PCR 方法中标准品的选择 |
| 3.4.3 一步法荧光定量PCR 方法的优劣 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR 检测方法的初步应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞株与病毒株 |
| 4.1.2 猪瘟兔化弱毒疫苗 |
| 4.1.3 主要试剂和溶液配制 |
| 4.1.4 主要仪器与设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量的测定 |
| 4.2.2 原代牛睾丸细胞的培养 |
| 4.2.3 猪瘟兔化弱毒在猪脐静脉血管内皮细胞和牛睾丸细胞中增殖含量的测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量的测定 |
| 4.3.2 猪瘟兔化弱毒在猪脐静脉血管内皮细胞和牛睾丸细胞中的增殖情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量的分析 |
| 4.4.2 不同细胞中猪瘟兔化弱毒增殖情况的分析 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 符号说明 第一章 引 言 |
| 1.1 瘟病毒概述 |
| 1.1.1 猪瘟及猪瘟病毒概述 |
| 1.1.2 猪瘟兔化弱毒疫苗概述 |
| 1.1.3 BVDV 概述 |
| 1.1.4 瘟病毒基因组结构及其功能 |
| 1.1.5 瘟病毒基因组编码的蛋白及其功能 |
| 1.1.6 猪瘟病毒的遗传分型 |
| 1.1.7 BVDV 的遗传分型 |
| 1.2 瘟病毒的诊断方法和研究现状 |
| 1.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.2.2 血清学诊断 |
| 1.2.3 免疫学诊断 |
| 1.2.4 分子生物学诊断技术 |
| 1.2.5 鉴别检测技术 |
| 1.3 荧光定量 PCR |
| 1.3.1 荧光定量PCR 原理 |
| 1.3.2 荧光定量PCR 的定量形式 |
| 1.3.3 荧光定量PCR 的分类 |
| 1.3.4 多重荧光定量 PCR 及其在病毒研究上的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 第二章 同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1 型的三重荧光定量 RT-PCR 方法的建立 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 2.1.3 引物和探针 |
| 2.1.4 病毒RNA 的提取和反转录 |
| 2.1.5 三重荧光定量RT-PCR 阳性标准品的制备 |
| 2.1.6 三重荧光定量RT-PCR 反应条件的优化 |
| 2.1.7 特异性试验 |
| 2.1.8 敏感性试验 |
| 2.1.9 重复性试验 |
| 2.1.10 三重荧光定量RT-PCR 与其它方法的符合率试验 |
| 2.1.11 病毒分离的验证 |
| 2.1.12 三重荧光定量 RT-PCR 对现地样品的检测和种系发生分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 三重荧光定量RT-PCR 标准曲线的建立 |
| 2.2.2 三重荧光定量RT-PCR 的特异性 |
| 2.2.3 三重荧光定量RT-PCR 的敏感性 |
| 2.2.4 三重荧光定量RT-PCR 的重复性 |
| 2.2.5 病毒分离的验证结果 |
| 2.2.6 三重荧光定量RT-PCR 与其它方法的符合率 |
| 2.2.7 种系发生分析 |
| 2.3 讨论 第三章 总结 参考文献 致谢 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（10）广西种猪场猪瘟监控方法的建立及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写释义 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪瘟的研究进展 |
| 1.1 猪瘟的概述 |
| 1.2 猪瘟的流行与分布情况 |
| 1.2.1 国际上猪瘟的流行与分布 |
| 1.2.2 国内猪瘟的流行与分布 |
| 1.3 猪瘟病毒基因分型 |
| 1.4 猪瘟病原(猪瘟病毒,CSFV) |
| 1.4.1 猪瘟病毒的特点 |
| 1.4.2 猪瘟病毒的基因组结构和功能 |
| 第二章 猪瘟的诊断技术 |
| 2.1 常规诊断方法 |
| 2.1.1 临床症状及剖检病理变化 |
| 2.1.2 病毒的分离 |
| 2.1.3 动物试验 |
| 2.1.4 荧光抗体试验(FAT) |
| 2.1.5 琼脂扩散试验(AGP) |
| 2.1.6 间接血凝试验(IHA) |
| 2.1.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.1.8 中和试验 |
| 2.1.9 新城疫病毒强化试验(END) |
| 2.1.10 免疫组化试验 |
| 2.2 分子生物学方法 |
| 2.2.1 RT-PCR |
| 2.2.2 巢式-PCR(nested-PCR) |
| 2.2.3 复合聚合酶链式反应 |
| 2.2.4 荧光定量聚合酶链式反应 |
| 2.3 核酸探针杂交试验 |
| 2.4 基因芯片检测技术 |
| 第三章 世界猪瘟防控状况、猪瘟疫苗的种类及我国的猪瘟免疫防控技术 |
| 3.1 世界猪瘟防控状况 |
| 3.2 猪瘟疫苗的种类 |
| 3.3 我国猪瘟疫苗种类及其免疫效果 |
| 3.4 免疫剂量与保护力之间关系 |
| 3.5 免疫程序与免疫日龄 |
| 3.6 我国猪瘟的综合防制措施 |
| 第四章 我国猪瘟反复发生的原因分析 |
| 4.1 疫苗质量 |
| 4.2 联苗免疫效果不确实 |
| 4.3 免疫程序不合理 |
| 4.4 防疫人员缺乏责任心 |
| 4.5 基层防疫基础设施严重滞后 |
| 4.6 防疫任务繁重,经费不足,防疫形式单一 |
| 4.7 基层兽医技术人员短缺,防疫队伍严重老化、不稳定 |
| 4.8 种猪(特别是母猪)的持续性带毒、排毒 |
| 4.9 免疫抑制病的影响 |
| 4.10 免疫抑制剂的使用 |
| 4.11 霉菌毒素的影响 |
| 4.12 弱毒苗的返强 |
| 4.13 应激及环境因素 |
| 参考文献 |
| 试验部分 |
| 第一章 猪瘟病毒抗体检测及应用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 疫苗来源 |
| 1.1.2 试验动物及试验方案 |
| 1.1.3 诊断试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.1.5 检测方法 |
| 1.1.6 样本差异度计算方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 猪瘟活疫苗对猪免疫效果分析 |
| 1.2.2 1～5胎次母猪产后40天内抗体和其所产仔猪出生后40天母源抗体消长规律 |
| 1.2.3 CSF脾淋活疫苗对断奶仔猪免疫持续期的研究 |
| 1.2.4 IHA与ELISA抗体检测方法在不同猪场应用及比较 |
| 1.2.5 正向间接血凝(IHA)与阻断ELISA在检测CSF抗体方面的探讨 |
| 1.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 第二章 血清中猪瘟野毒感染情况调查及血清抗体与猪瘟病毒E~(rns)之间的关系探讨 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 检测方法 |
| 2.1.3 试验步骤 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 CSF病毒糖蛋白E~(rns)感染情况汇总 |
| 2.2.2 6个种猪场CSF IHA抗体与CSFV糖蛋白E~(rns)感染情况比较 |
| 2.2.3 CSF正向IHA抗体滴度与CSFV E~(rns)阳性率之间的比较 |
| 2.2.4 CSFV抗体ELISA阻断率与CSFV糖蛋白(E~(rns))阳性率的比较 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 第三章 广西种猪场中猪瘟病毒感染情况调查 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CSF荧光抗体染色法 |
| 3.2.2 CSF抗原ELISA结果 |
| 3.2.3 RT-PCR检测结果 |
| 3.2.4 兔体交互免疫结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 第四章 几种检测活猪感染猪瘟病毒的方法比较 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 对照毒株来源 |
| 4.1.4 检测方法 |
| 4.1.5 检测步骤 |
| 4.1.6 实施方案 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 广西贵港某猪场的检测结果 |
| 4.2.2 广西横县某猪场的检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 第五章 综合防控策略 |
| 5.1 改变CSF防控的传统观念 |
| 5.2 行全封闭饲养管理,采用小区"全进全出"的生产方式,保证猪群健康 |
| 5.3 坚持自繁自养的原则,严格把好留种关 |
| 5.4 建立CSF免疫抗体定期监测制度,制定科学合理的免疫程序 |
| 5.5 证饲料营养、控制饲料的霉变,减少应激 |
| 5.6 消除免疫抑制病及部分药物对CSF疫苗免疫效果影响 |
| 5.7 做好种猪的CSF预防,清除CSF阳性猪,建立无CSF健康种猪群 |
| 5.8 开展环境保护,定期防鼠灭蝇和驱虫,做好环境清洁、消毒工作 |
| 5.9 强对病弱猪的护理与淘汰机制 |
| 5.10 建立工作档案 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文目录 |
四、RTP-CR和nested-PCR技术在猪瘟病毒检测中的应用（论文参考文献）
- [1]非洲猪瘟诊断技术研究进展[J]. 苗春,李伟,杨思成,邵军军,常惠芸. 中国动物检疫, 2022(01)
- [2]荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究[D]. 钱程. 浙江大学, 2021(01)
- [3]非洲猪瘟诊断技术发展现状与需求分析[J]. 张丽,罗玉子,王涛,孙元,仇华吉. 中国农业科技导报, 2019(09)
- [4]7种猪病毒性疫病QIAxcel及Bio-Plex检测方法的建立与初步应用[D]. 肖璐. 四川农业大学, 2017(01)
- [5]猪瘟病毒荧光抗体的制备及初步应用[D]. 张韧. 华中农业大学, 2013(02)
- [6]猪瘟的分子生物学检测技术研究进展[J]. 王茁,赵福广. 贵州农业科学, 2011(04)
- [7]环介导等温扩增技术及其在动物疫病诊断中的应用[J]. 杨德全,鞠厚斌,葛菲菲,刘健,王建,周锦萍,刘佩红. 中国动物传染病学报, 2011(02)
- [8]猪瘟兔化弱毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 邓力. 西北农林科技大学, 2010(11)
- [9]同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 张兴娟. 扬州大学, 2010(02)
- [10]广西种猪场猪瘟监控方法的建立及其应用[D]. 胡杰. 南京农业大学, 2009(06)