一、鼻咽癌相关基因NGX6对鼻咽癌细胞周期的影响（论文文献综述）
蔡曌[1]（2021）在《1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义》文中研究说明这一博士学位课题由相对独立的两部分研究工作构成。第一章DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究膀胱癌的高复发率为患者带来了长期的身体和经济负担。目前对于膀胱癌的诊断已有多种基于不同技术平台的生物标志物,然而,对于患者复发风险的评估和预测还较少有相关标志物的报道。尽管在膀胱癌肿瘤的发生发展过程中存在大量基因组序列的改变,但目前对于膀胱癌肿瘤预后风险评估还尚未有获得广泛认可的生物标志物可供临床使用。本项研究旨在膀胱癌组织和尿液中探索与膀胱癌患者预后相关的分子标志物,评估其在患者预后评估中的临床应用价值。本实验室前期工作中对65例膀胱癌肿瘤组织DNA进行了基于芯片的比较基因组杂交实验,发现并通过real-time PCR验证了在膀胱癌组织中高频出现的5个高频拷贝数变异的基因CEP63、FOSL2、GHR、PAQR6、ZFAND3。本项研究对候选的5个拷贝数高频变异的基因在219例于中国医学科学院肿瘤医院初治的膀胱癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织样本和123例初治膀胱癌患者术前尿沉渣脱落细胞样本中的拷贝数变异与患者临床特征的相关性进行了进一步分析。为分析候选拷贝数变异与患者预后的相关性,研究中对所有入组患者均开展了术后随访,获得其无瘤生存期。研究应用Kaplan-Meier生存曲线、Cox风险比例回归、Logestic线性回归分析候选拷贝数变异与患者肿瘤复发风险的关系,并分别对非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌构建了预后预测模型。为提高在尿液中检测拷贝数变异的准确性,研究中采用了高灵敏的3D数字PCR技术,并运用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC 曲线）比较了 real-time PCR 与 3D 数字PCR在尿沉渣脱落细胞中对拷贝数变异基因的检测效能,建立了尿样本中膀胱癌的诊断模型。在5个候选拷贝数变异的基因中,CEP63（p<0.01）、FOSL2（p<0.01）、PAQR6（p<0.01）在219例肿瘤组织中相比于健康人外周血白细胞中的基因拷贝数显着增加。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p<0.01）的拷贝数在肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织中显着高于非肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p=0.047）的拷贝数在高级别肿瘤中显着高于低级别肿瘤。在发生淋巴结转移患者的肿瘤组织中CEP63的拷贝数显着增加（p<0.01）。研究中对所有病例进行了随访,随访时间为3个月至188个月,中位随访时间为61个月。所有入组患者的5年无瘤生存率为48.3%;10年无瘤生存率为22.7%。基于219例肿瘤组织中CEP63、FOSL2、PAQR6的拷贝数变异,分别对非肌层浸润性膀胱癌患者和肌层浸润性膀胱癌患者进行生存分析,发现CEP63和FOSL2的拷贝数增加是非肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。FOSL2和PAQR6的拷贝数增加是肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。基于CEP63、FOSL2的拷贝数变异构建非肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数（Prognostic Index,PI）,预测模型为PI=1.5095×CEP63+1.47123×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发风险是预后指数低的患者的3.434倍（p=0.0003）。基于FOSL2和PAQR6拷贝数变异,构建肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数,预测模型为PI=2.0440×FOSL2+2.2079×PAQR6,结果显示预后指数高的肌层浸润性膀胱癌患者发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的5.443倍（p=0.0001）。对于基于传统危险分层中的高风险非肌层浸润性膀胱癌患者,生存分析结果显示,预后指数高的患者无瘤生存期更短（p=0.00056）。在膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63（p=0.036）与FOSL2（p<0.01）的拷贝数相比于正常对照尿沉渣脱落细胞样本显着增加。应用3D数字PCR检测,发现肌层浸润性膀胱癌尿沉渣脱落细胞样本中CEP63（p<0.01）与FOSL2（p=0.046）的拷贝数显着高于非肌层浸润性膀胱癌样本,CEP63的拷贝数在发生淋巴结转移的膀胱癌患者中显着增加（p=0.042）。生存分析结果显示非肌层浸润性膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63的拷贝数增加（p<0.01）或FOSL2的拷贝数增加（p=0.018）预示着更大的肿瘤复发风险。基于尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数变异在训练集（n=41）中构建非肌层浸润性膀胱癌12个月内发生肿瘤复发的预测模型并在验证集（n=41）中进行验证,预测模型为PIL=-2.679+2.083×CEP63+1.827×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者12个月内发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的6.612倍（p=0.002）。ROC曲线分析结果显示3D数字PCR检测尿沉渣脱落细胞样本中CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.848和0.803,灵敏度分别为0.750和0.650,阴性预测值分别为0.786和0.708。而real-time PCR检测CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.601和0.685,灵敏度分别为0.475和0.425,阴性预测值分别为0.644和0.646。进一步基于3D数字PCR联合尿样本中CEP63与 FOSL2 的拷贝数变异构建膀胱癌患者诊断型:L=-1.817+2.267×CEP63+2.695×FOSL2,该模型的 ROC 曲线下面积为 0.858,灵敏度为85.0%,阴性预测值为83.8%。本项研究发现CEP63、FOSL2、PAQR6在膀胱癌中拷贝数增加,前两者与膀胱癌肿瘤的分期和病理分级显着相关。CEP63、FOSL2的拷贝数变异能够对非肌层浸润性膀胱癌患者的肿瘤复发风险进行评估和预测,FOSL2、PAQR6的拷贝数变异可应用于肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发的预测。在膀胱癌患者尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数显着增加,并与肿瘤分期相关。尿样本中CEP63和FOSL2拷贝数增加的非肌层浸润性膀胱癌患者1年内发生肿瘤复发风险更高。研究中应用的3D数字PCR相比于real-time PCR检测效能更高,基于3D数字PCR的尿样本诊断模型能够较好的区分膀胱癌与正常人,为未来膀胱癌尿液检测提供了新途径。第二章EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属于疱疹病毒科γ亚科,是双链DNA病毒。EB病毒是人类普遍且长期感染的病毒。在世界人口中大约有95%存在终生的无症状感染。EB病毒参与了人类多种恶性肿瘤的形成,包括Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、胃癌等。EB病毒的发现距今已有50余年,但病毒的致癌机制目前仍然尚未清楚。miRNA是基因表达转录后调控的重要因子,在多种复杂的细胞生物学进程,例如细胞发育和分化中扮演着十分重要的作用。越来越多的研究发现某些特定miRNA的负调控作用能够引起多种器官的癌变发生。EB病毒是第一个发现的能够编码miRNA的病毒,已有研究发现部分EB病毒编码的miRNA能够调控宿主基因的表达。但对于其他EB病毒编码的miRNA在癌变过程中的作用机制目前还尚未完全了解。本项研究旨在通过miRNA表达谱芯片和转录组测序分析,构建EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱,分析病毒miRNA在宿主细胞中对宿主基因表达的调控作用,进而探索病毒miRNA对宿主细胞生物学功能的影响,以及在癌变发生和发展过程中所起到的作用。EB病毒相关胃癌在亚洲胃癌患者中约占6%,需要通过EBER原位杂交检测证实肿瘤组织中存在EB病毒的感染,由于EBER原位杂交尚未作为胃癌患者的常规病理检测项目,受到样本收集难度的限制,以及RNA较容易降解的特性,目前国内还尚未有基于EB病毒相关胃癌新鲜组织的转录组测序分析研究。在本项研究中,我们对8例EB病毒相关胃癌新鲜冻存组织、2株EB病毒相关胃癌细胞系SNU719、YCCEL1和2株EB病毒阴性胃癌细胞系AGS、HGC27进行了miRNA表达谱芯片和转录组测序分析宿主基因、宿主miRNA和EB病毒miRNA的表达情况。通过生物信息学分析,联合公共数据库中38例EB病毒相关胃癌的基因表达数据,探索EB病毒miRNA与宿主miRNA以及宿主基因的关系。为验证数据分析结果,进一步对筛选出的病毒miRNA进行体外细胞功能实验,探索其对胃癌细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的影响。为了解筛选出的在EB病毒相关胃癌中能够显着影响细胞生物学功能的病毒miRNA在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即鼻咽癌中的作用。我们对33例鼻咽癌新鲜冻存组织进行了转录组测序。并通过体外细胞功能实验探索候选病毒miRNA在鼻咽癌细胞中对细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的调控作用。在本项研究中,我们通过对miRNA表达谱芯片和转录组测序数据分析获得了 EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱,筛选出在肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中均高表达的4个病毒miRNA。对其进行靶基因预测,我们发现在EB病毒相关胃癌中高表达的4个病毒miRNA靶基因主要富集于细胞迁移、细胞周期调控、细胞间信号转导和DNA复制等重要生物学功能上。而对于肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析水平的分析发现,4个宿主miRNA在肿瘤组织与细胞系中的表达水平与EB病毒miRNA的表达成正相关关系,相关系数大于等于0.9。进一步分析这4个宿主miRNA与EB病毒miRNA的序列,发现 EB 病毒 miRNA miR-BARTl-3p 与宿主 miRNA hsa-miR-29a-3p 具有相同的5’端种子区序列;而miR-BART7-3p则与宿主miRNA hsa-miR-154-3p具有相同的5’端种子区序列。由此推测上述病毒miRNA与宿主miRNA的调控功能具有一定的相似性。为进一步探索“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA是否协同作用共同参与调控细胞生物学功能。首先联合TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中转录组数据和 GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中表达谱芯片数据,以及本项研究中的转录组测序数据,分析共计46例EB病毒相关胃癌中肿瘤与癌旁组织的差异宿主基因,结合在EB病毒相关胃癌相比于EB病毒阴性胃癌细胞中差异的宿主基因,以此对“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA的交集靶基因进行筛选,结果显示,在EB病毒相关胃癌肿瘤组织中差异表达,并与EB病毒感染相关的宿主靶基因,其信号通路主要富集于涉及细胞生长、迁移、分化等重要功能的2个信号通路。说明候选的病毒miRNA可能与其相关的宿主miRNA共同参与到对细胞生长、迁移等重要功能的调控中。进一步的体外细胞功能实验也表明了miR-BART1-3p和miR-BART7-3p能够抑制胃癌细胞的增殖和迁移,对细胞的生长起负向调控作用。此外,在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤,鼻咽癌中,我们也构建了 EB病毒miRNA的表达谱,与EB病毒相关胃癌不同的是,miR-BART1-3p在鼻咽癌中的表达水平较低而miR-BART7-3p在鼻咽癌中的表达水平也仅处于中等。但通过体外细胞功能实验,我们发现miR-BART7-3p在鼻咽癌细胞中,仍具有对细胞增殖和迁移功能的抑制作用。在上述研究中,我们构建了 EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱。通过生物信息学分析获得了具有相同种子区序列的病毒和宿主miRNA,两者共同参与了涉及细胞增殖、迁移、分化等重要生物学功能的信号通路调控。体外细胞实验结果表明了病毒miRNA对于胃癌和鼻咽癌细胞在增殖、细胞周期和细胞迁移能力的抑制作用。本项研究对病毒miRNA miR-BART1-3p和miR-BART7-3p在胃癌细胞中的作用及其可能的机制进行探索,发现了miR-BART7-3p在两种EB病毒相关恶性肿瘤中具有相似的生物学功能,研究从新的视角提供了 EB病毒影响肿瘤进展的可能机制,有助于促进对于上皮性恶性肿瘤中EB病毒感染在癌变中作用的理解。
屠德桢[2]（2019）在《白藜芦醇对鼻咽癌转移能力的影响及其机制研究》文中认为[目的]鼻咽癌是我国南方高发肿瘤之一,多数患者以颈部淋巴结转移为首发症状。鼻咽癌治疗以单纯放疗或者放、化疗同期治疗为主。经综合治疗,鼻咽癌5年存活率已升至70%左右,但仍有30%左右鼻咽癌患者治疗后出现局部复发、淋巴结转移或者远处转移。化疗耐药和放疗抵抗是治疗失败的主要原因之一。对放、化疗后复发和转移的患者,再次行放、化疗效果较差。靶向治疗和免疫治疗价格昂贵、副作用较大、疗效尚待观察。因此,寻找一种低毒、有效、经济的治疗药物成为目前鼻咽癌辅助治疗需解决的重要问题之一。研究发现,白藜芦醇能抑制多种肿瘤（包括鼻咽癌）细胞的增殖、诱导其凋亡,并能抑制部分肿瘤的转移,但对鼻咽癌转移的作用尚未见报道。本课题拟研究白藜芦醇对鼻咽癌转移的影响,并初步探讨其发挥抗鼻咽癌转移作用的相关分子机制。[方法]（1）体外培养高转移能力的人鼻咽癌CNE2细胞株,用CCK8实验检测在0、5、10、20、40、80、160、320μM 共 8 个浓度及 24、36、48h 共 3 个时间点,白藜芦醇对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用。（2）依据CCK8实验结果,选取0、10、20、40、80μM五个浓度进行后续实验,分别用不含基质胶和含基质胶的Transwell小室进行实验以检测不同浓度白藜芦醇对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响。（3）采用蛋白免疫印迹（Western Blot）实验检测0、10、20、40、80μM五个浓度的白藜芦醇对高转移能力鼻咽癌CNE2细胞株中E-cadherin、Vimentin、Hsp27、Ezrin 蛋白、基质金属蛋白酶 2（Matrix metalloproteinases-2,MMP2）及基质金属蛋白酶9（Matrixmetalloproteinases-9,MMP9）等相关蛋白表达的影响。（4）用免疫荧光实验检测0、10、20、40、80μM五个浓度的白藜芦醇处理下,鼻咽癌细胞CNE2中NF-κB/p65的核转位情况。（5）以鼻咽癌CNE2细胞注射裸鼠足掌皮下构建鼻咽癌原发灶模型,通过HE染色和免疫组化,检测不同剂量（Omg/kg、25 mg/kg、50mg/kg和100mg/kg）白藜芦醇灌胃对鼻咽癌细胞转移至腘淋巴结的影响。[结果]（1）CCK8实验发现,白藜芦醇对鼻咽癌细胞CNE2有一定的增殖抑制作用,并且这种抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。当白藜芦醇浓度为80μM以下,作用于CNE2细胞24小时,白藜芦醇对CNE2细胞的抑制率未超过50%。（2）Transwell实验检测发现,白藜芦醇能抑制鼻咽癌细胞CNE2的迁移侵袭能力。在0至80μM浓度范围内,随白藜芦醇浓度增高,对鼻咽癌细胞CNE2侵袭和迁移能力的抑制作用增强。（3）Western Blot检测发现,白藜芦醇能抑制基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达。白藜芦醇可增加EMT相关蛋白的E-cadherin表达水平,但对Vimentin表达水平无明显影响。随着白藜芦醇浓度增高,转移相关蛋白Ezrin、Hsp27的磷酸化水平明显下调,但对总Ezrin、Hsp27无明显影响。（4）免疫荧光实验发现,白藜芦醇能抑制NF-κB/p65的核转位,在0至80μM浓度范围内,这种抑制作用呈浓度依赖性。（5）动物实验发现,白藜芦醇灌胃治疗对荷瘤小鼠体重无明显影响,但明显减轻瘤侧腘淋巴结的肿大程度。组织学检测显示,白藜芦醇灌胃明显抑制了鼻咽癌细胞由足掌皮下成瘤部位向腘淋巴结的转移,在0至100mg/kg剂量范围内,这种抑制作用呈剂量依赖性。[结论]（1）白藜芦醇对高转移能力的鼻咽癌CNE2细胞有一定的增殖抑制作用,并且这种抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。（2）在体外,白藜芦醇明显抑制鼻咽癌CNE2细胞的侵袭迁移能力,抑制作用呈剂量依赖性。（3）白藜芦醇灌胃治疗能抑制鼻咽癌由裸鼠足掌皮下成瘤部位向腘淋巴结的转移,抑制作用呈剂量依赖性。（4）白藜芦醇可能通过抑制Ezrin、Hsp27的磷酸化,进而抑制NF-κB/p65核转位,最终下调MMP2、MMP9的表达,上调E-cadherin的水平,从而抑制鼻咽癌的侵袭迁移能力。
廖前进[3]（2012）在《LPLUNC1抑制NF-κB和Stat3信号通路的激活抵抗促炎因子IL-6促进的鼻咽癌发生发展》文中指出[研究背景]慢性炎症是肿瘤的第七大生物学特征,慢性炎症在触发肿瘤发生、促进肿瘤发展中起着非常重要的作用；炎症诱导的肿瘤称为炎症相关性肿瘤。鼻咽癌是一种具有明显地区差异的恶性肿瘤。鼻咽由于生理和解剖位置的特性,鼻咽上皮细胞时刻受到各种外源病原微生物如EBV和有毒化学物质等损害,使得鼻咽粘膜保护机制容易被破坏,极易导致鼻咽慢性炎症,因而有利于诱导鼻咽癌发生发展,因此鼻咽癌也是一种炎症相关性肿瘤。然而,鼻咽慢性炎症如何诱发鼻咽癌发生发展,尤其是在此过程中激活的免疫细胞如巨噬细胞、鼻咽上皮细胞充当何种角色,目前不是很清楚。LPLUNC1基因是我室克隆的鼻咽癌表达下调的基因。现有研究表明LPLUNC1基因编码的蛋白是一种分泌性蛋白,大量存在于鼻咽和呼吸道分泌物、灌洗液和痰液中；LPLUNC1蛋白可借助其BPI结构域行使宿主防御功能,具有杀菌抗炎的作用,而BPI结构域可以抑制肿瘤生长与转移。因此,我们对LPLUNC1基因在鼻咽慢性炎症促进鼻咽癌发生发展过程中的作用及其相关分子机制进行了探讨。[炎症因子刺激鼻咽癌上皮细胞参与炎症反应]为尽可能的获取炎症时各种促炎因子,我们用低浓度LPS（10ng/ml,近似于细菌脂多糖的生理浓度,如细菌感染时）刺激巨噬细胞,qRT-PCR检测发现低浓度LPS可明显上调促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8基因表达,ELISA检测显示在巨噬细胞上清培养液中含有大量的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8。因此,为能更好的在体外模拟炎症环境,反映慢性炎症时鼻咽癌细胞的状态,我们收集低浓度LPS刺激和未刺激巨噬细胞培养上清作为条件培养基（分别以D-THP-LPS, D-THP表示）处理鼻咽癌5-8F细胞,检测促炎因子对5-8F细胞的影响。结果显示,无论在mRNA水平还是蛋白水平,鼻咽癌5-8F细胞经D-THP-LPS条件培养基处理24小时后,细胞中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8表达明显增加,D-THP-LPS条件培养基可促进鼻咽癌5-8F细胞增殖,激活NF-κB和Stat3信号通路。说明炎症微环境下鼻咽癌上皮细胞可因炎性因子的刺激而激活NF-κB和Stat3信号通路,自分泌促炎因子,维持和扩大局部炎症反应,从而促进鼻咽癌发生发展。[IL-6促进鼻咽癌发生发展]促炎因子IL-6是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）分泌的主要促炎因子之一,在炎症促肿瘤发生发展过程中具有很重要的作用,而目前IL-6和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）对鼻咽癌发生发展的影响不是很清楚。因此我们检测分析了鼻咽癌组织中IL-6蛋白表达情况和TAMs浸润程度,IL-6对鼻咽癌细胞生长的影响。采用鼻咽癌组织芯片,免疫组化检测发现鼻咽癌组织中IL-6和CD68（TAMs分子标记物,表达强弱可以反映TAMs在肿瘤组织中浸润程度）均呈强阳性表达,IL-6蛋白表达与TAMs浸润密度正相关,Kaplan-Meier生存分析显示IL-6蛋白表达越高或者TAMs浸润密度越高,鼻咽癌患者预后越差；外源IL-6可促进鼻咽癌细胞增殖、加快细胞周期演进,同时免疫荧光、荧光素酶报告系统及Western blot检测显示IL-6可激活NF-κBp65和p-Stat3蛋白。由此说明鼻咽癌组织中TAMs浸润和IL-6蛋白表达与鼻咽癌发生发展密切相关,IL-6可通过激活NF-κB和Stat3蛋白促进鼻咽癌发生发展。[LPLUNC1基因抑制鼻咽癌细胞生长]前期研究显示LPLUNC1基因在鼻咽癌组织中低表达,可能是鼻咽癌潜在的抑瘤基因。应用鼻咽癌组织芯片,免疫组织化学检测我们发现LPLUNC1蛋白在正常鼻咽上皮和腺体中高表达,而在大多数鼻咽癌组织中低表达或阴性表达,LPLUNC1蛋白表达下调与鼻咽癌临床进展分期正相关,Kaplan-Meier生存显示LPLUNC1蛋白阳性表达的鼻咽癌患者临床预后明显好于阴性表达患者,生长曲线绘制、MTT及裸鼠成瘤等实验均显示LPLUNC1基因可明显抑制鼻咽癌细胞生长与增殖；流式细胞和凋亡检测发现LPLUNC1基因可引起鼻咽癌细胞G0/G1期阻滞和诱导凋亡；进一步研究显示,LPLUNC1基因可通过抑制鼻咽癌细胞NF-κB和Stat3信号传导通路,下调CDK4、cyclin D1、Bcl-2基因表达,上调p21、Bax基因表达。随后我们分别使用Jak2和NF-κB特异性抑制剂（AG490、BAY11-7082）分别阻断HNE2/Vector、 HNE2/LPLUNC1细胞中Stat3和NF-κB信号通路,结果发现AG490、BAY11-7082均能明显抑制鼻咽癌细胞增殖,而LPLUNC1基因与各抑制剂之间具有明显的协同作用。上述结果表明LPLUNC1基因可抑制NF-κB和Stat3信号通路的激活,引起G0/G1期阻滞和诱导凋亡,从而抑制鼻咽癌细胞生长。[LPLUNC1抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路的激活]我们研究显示IL-6可通过激活NF-κB和Stat3促进鼻咽癌细胞生长；组织芯片免疫组化结果分析发现鼻咽癌组织中LPLUNC1蛋白表达与IL-6蛋白表达和TAMs浸润密度明显负相关,同时应用激光捕获显微切割技术分离获得纯化鼻咽癌和正常鼻咽上皮组织,qRT-PCR检测也证实鼻咽癌组织中LPLUNC1mRNA表达与IL-6mRNA表达明显负相关,提示LPLUNC1可能参与炎症反应,具有抑制IL-6分泌和TAMs浸润的作用。因此,我们探讨了LPLUNC1对IL-6促进鼻咽癌细胞增殖的影响。首先我们确证了LPLUNC1可明显抑制LPS诱导的鼻咽癌细胞和巨噬细胞分泌促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1p和IL-8,参与抗炎反应；随后研究发现,LPLUNC1基因可明显抑制IL-6对鼻咽癌细胞的促增殖和加速细胞周期演进的作用,荧光素酶报告基因检测发现尽管HNE2细胞受到IL-6的刺激,LPLUNC1基因仍可明显抑制NF-κB和Stat3的转录活性,免疫荧光检测显示LPLUNC1基因可明显抑制IL-6诱导的NF-κBp65和Stat3舌化入核,Western blot检测也显示LPLUNC1基因可明显抑制IL-6诱导的NF-κBp65和p-Stat3蛋白表达,NF-κBp65蛋白表达减少的同时伴有IKKP蛋白表达减少和IκBα蛋白表达增加,p-Stat3蛋白表达减少的同时伴有p-Jak2蛋白表达减少,LPLUNC1基因还可通过抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路的激活,下调cyclin D1、Bcl-2基因表达,上调p21、Bax基因表达。因此,LPLUNC1基因可通过抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路的激活,抵抗促炎因子IL-6对鼻咽癌细胞增殖的促进作用。[LPLUNC1对鼻咽癌5-8F细胞蛋白质表达谱的影响]蛋白质是生命活动中生物学功能的真正执行者、生命现象的直接体现者,探讨生命活动中尤其是病理过程中发生改变的蛋白质分子具有重大意义。因此,为进一步了解LPLUNC1在鼻咽癌发生发展中的作用,我们采用荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）和质谱分析技术获得了鼻咽癌5-8F细胞过表达LPLUNC1基因前后的差异蛋白质变化。共鉴定出44个差异表达蛋白质,包括上调19个,下调25个。这些差异表达蛋白质按其功能分类主要是（1）分子伴侣蛋白；（2）细胞骨架蛋白；（3）参与细胞新陈代谢的酶类或蛋白；（4）信号转导分子；（5）其他蛋白。结果表明LPLUNC1基因可能通过调控上述蛋白分子表达参与细胞代谢、增殖、转录以及信号转导等生物学过程,从而影响鼻咽癌的生长。随后,我们对上调差异蛋白Prohibitin （PHB）、下调差异蛋白hypoxia up-regulated1precursor （HYOU1）和calreticulin precursor variant （CALR）进行了验证。结果显示,LPLUNC1基因转染5-8F细胞前后上述差异蛋白质表达确实存在差异,与质谱鉴定结果一致；对Prohibitin蛋白进一步研究发现,Prohibitin蛋白在正常鼻咽组织中呈高表达,而在绝大部分鼻咽癌组织中呈低表达,Prohibitin蛋白表达降低与鼻咽癌的临床进展分期和转移相关,Kaplan-Meier生存分析和多因素分析发现Prohibitin蛋白阴性表达与鼻咽癌患者预后差密切相关。提示Prohibitin可能是鼻咽癌的重要分子标志。
邓文婷,王双乐[4]（2011）在《鼻咽癌侵袭与转移相关基因的研究进展》文中研究指明0引言鼻咽癌是头颈部常见恶性肿瘤之一,其局部复发及远处转移一直是影响鼻咽癌患者长期存活的主要因素。而肿瘤的侵袭与转移是受多种因素调控的复杂过程,涉及肿瘤细胞增殖、肿瘤新血管形成、肿瘤细胞黏附、细胞凋亡以及肿瘤细胞迁移运动等一
杨波,张速勤,李兆基[5]（2010）在《抑癌基因NGX6研究进展》文中认为NGX6基因是一种新发现的肿瘤抑制基因,最初认为是鼻咽癌相关的抑癌基因,近年来研究显示,NGX6也具有抑制结肠癌、肝癌等肿瘤的作用。NGX6抑制肿瘤的具体功能及作用机制十分复杂,目前尚不清楚。文中综述鼻咽癌、大肠癌等肿瘤的NGX6基因研究进展。
王理[6]（2010）在《Ezrin介导NGX6a蛋白降解促进了鼻咽癌细胞侵袭转移的分子机制研究》文中研究表明近年来细胞和分子遗传学研究发现：鼻咽癌基因组存在高频率3p、9p、11q、13q和14q染色体的等位基因的杂合性丢失。我室阳剑波博士采用定位候选克隆的方法从9p区域克隆了一个新基因NGX6,Genbank登录号为AF188239,它的表达在鼻咽癌中明显下调,可能为一个与鼻咽癌相关的肿瘤抑制候选基因。生物信息学显示：NGX6基因cDNA全长2134bp,编码338aa,预测分子量37kDa,含有2个跨膜结构域,胞外区含有1个表皮生长因子样结构域（EGF-like domain）和3个糖基化位点,胞内区较短,含有1个酪氨酸激酶磷酸化位点。NGX6基因前期功能研究结果表明：NGX6在鼻咽癌活检组织和鼻咽癌上皮细胞株中表达下调甚至缺失,而在正常鼻咽组织中存在高表达；NGX6基因在结直肠癌中亦存在不同程度的表达下调,伴有淋巴结转移的结直肠癌样本中NGX6表达下调的比例（15／16）远高于无淋巴结转移的结直肠癌样本（25／34）（P<0.05）。利用高通量的组织芯片进行原位杂交实验发现,NGX6基因的表达在有转移的肿瘤组织下调更明显,且与临床分期相关。NGX6基因分别转染鼻咽癌和结肠癌细胞之后可使鼻咽癌和结肠癌细胞的恶性表型得到部分逆转；可通过Ras/Raf/MAPK途径负调控EGFR增殖信号通路；免疫共沉淀实验发现NGX6可与作为细胞运动和转移调节者的Ezrin发生交互作用,CYTO是NGX6和Ezrin发生交互作用发生交互作用的关键结构域。NGX6高表达使5-8F细胞体外侵袭能力减弱,细胞黏附率增加,恢复间隙连接细胞间通讯；成功建立了scid鼠体内自发转移模型,NGX6高表达能明显抑制鼻咽癌5-8F细胞在scid鼠体内的成瘤和肺转移灶形成。EGF和CYTO结构域是NGX6调节细胞黏附的重要功能域,缺失该区域的突变体细胞黏附能力较NGX6转染组降低；CYTO是调节细胞运动,迁移,细胞生长增殖的关键功能域。EGF能诱导鼻咽癌5-8F细胞发生运动和迁移,并发生一系列的分子水平事件如EGFR, PI3K, RhoA表达上调,RhoA由胞浆向胞膜移位,侵袭能力增强,细胞通讯能力减弱。NGX6能部分抑制EGF诱导的鼻咽癌5-8F细胞发生运动和迁移,侵袭能力减弱,而且使EGFR, PI3K, RhoA表达维持诱导前水平,RhoA由胞浆向胞膜移位减少,细胞通讯能力增强。综上所述,NGX6的生物信息学特征和初步研究结果提示NGX6基因可能在鼻咽癌的侵袭与转移中发挥抑制性的作用。抗体是基因功能研究重要的工具。为了制备NGX6多克隆抗体,采用pET原核表达系统表达并纯化NGX6△TM2蛋白（第二跨膜区缺失）。将重组蛋白免疫新西兰兔,制备获得抗NGX6蛋白多克隆抗体。该抗体特异性好,效价高,可应用于Western blot （1:3000）、免疫组化（1：1000）以及免疫荧光（1：500）检测。应用该抗体研究以及数据库比对发现,NGX6蛋白存在两个蛋白亚型a和b,分别来自3个不同的转录本。其NCBI参考序列号分别为：NM001042589（转录本1）,NM001042590（转录本2）,NM016446（转录本3）。其中,转录本1和2的ORF框一致,即编码完全一样的a蛋白亚型（NGX6a）。转录本3即NM 016446,也就是我们前期研究的NGX6基因序列,编码b蛋白亚型（NGX6b）。a蛋白亚型（NGX6a）是新发现的蛋白亚型,我们从人胎脑文库中克隆出了NGX6a的ORF序列。Western Blot和免疫组织化学检测显示：NGX6a普遍表达与多种组织和器官中,在神经系统、鼻咽、脂肪、膀胱表达很高,主要定位于上皮组织和神经元细胞；而NGX6b主要表达于神经系统中,心,肾,鼻咽,肺,脂肪组织有很弱的表达。NGX6a在正常组织中的表达远高于NGX6b,是占主要地位的蛋白亚型。生物信息学预测NGX6a蛋白全长476个氨基酸,和NGX6b蛋白（338AA）高度同源,两者之间前272个氨基酸完全一致。a蛋白亚型和b蛋白亚型一样具有一个共同的表皮生长因子样结构域（EGF-like domain）。不一样的是a蛋白亚型具有7个跨膜区。通过Western blot检测NGX6a在各种鼻咽癌细胞株中表达下调,免疫组织化学检测含有308例鼻咽癌样品的鼻咽癌组织芯片,NGX6a在鼻咽癌中表达下调,并且和转移相关。将NGX6a转染入鼻咽癌细胞5-8F、6-10B、HNE1,构建稳定转染细胞系。在这些细胞株中NGX6a的mRNA水平上调20倍以上；而在蛋白水平,利用Western Blot检测不出有目的蛋白表达。在使用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞后,在蛋白水平可以检测出NGX6a蛋白的表达,表达水平随着MG-132浓度的增高而增高。同时,利用免疫荧光技术检测到,在用10微摩尔以上浓度的MG-132处理细胞24小时以后可以看到细胞中有荧光出现,强度随MG-132浓度的增高而增高。将pCMV-myc-NGXa转染进5-8F细胞,瞬时表达NGXa蛋白,利用偶联了myc单克隆抗体的琼脂糖珠将NGXa蛋白免疫沉淀下来,用泛素抗体检测,却检测不到任何信号。结果表明：NGXa蛋白在鼻咽癌细胞内发生了降解,这种降解途径是不依赖于泛素化的,经蛋白酶体的降解。利用免疫荧光、免疫共沉淀证实了NGX6a和Ezrin具有交互作用。Ezrin在鼻咽癌细胞株中表达明显高于正常鼻咽上皮细胞株和鼻咽上皮组织,和NGX6a的表达相反。在鼻咽癌组织芯片中,免疫组织化学证明了Ezrin在鼻咽癌活检组织中表达上调,并且在有淋巴结转移的鼻咽癌组织中Ezrin表达水平高于没有淋巴结转移的癌组织,这种分布模式和NGX6a相反。同样的,Ezrin在正常人组织表达分布情况也和NGX6a相反。比如：在神经系统,NGX6a表达于神经元细胞,而Ezrin表达在一些胶质细胞中,在神经元中不表达。在小脑的切片中,Ezrin表达于小脑分子层浅层的星形细胞及其神经纤维,在分子层深层的神经纤维和蒲肯野细胞层没有表达；而NGX6a表达于分子层深层的神经纤维和蒲肯野细胞内。利用过表达和RNAi技术证明了Ezrin介导了NGX6a在细胞中的降解。通过构建NGX6a一系列突变体,证实了七次跨膜结构域是NGX6a被Ezrin降解的关键部位。划痕实验和基质胶侵袭实验证实了,NGX6a可以明显抑制鼻咽癌细胞5-8F的伤口愈合和侵袭运动能力。用RNAi技术抑制Ezrin表达后,鼻咽癌5-8F细胞的侵袭能力下降；而抑制Ezrin表达的同时进一步提高NGX6a的表达水平可以进一步抑制鼻咽癌5-8F细胞的侵袭能力,和单独抑制Ezrin表达相比具有统计学差异。使用SP1抑制剂光辉霉素处理鼻咽癌细胞5-8F,可以使转录因子SP1表达下调,并且下调Ezrin的表达,上调NGX6a的表达水平,从而抑制了5-8F细胞的侵袭转移能力。在使用光辉霉素抑制Ezrin表达的同时,加用蛋白酶体抑制剂MG132进一步抑制NGX6a的降解,可以明显抑制鼻咽细胞5-8F的侵袭转移能力,和分别单用两种药物相比具有统计学差异。这表明,NGX6a位于Ezrin的下游,被Ezrin降解,是Ezrin促进肿瘤转移的关键因素。综上所述,本研究通过制备NGX6的抗体,检测NGX6蛋白在组织中的分布情况,发现了NGX6a这个新的蛋白亚型,NGX6a主要分布在上皮组织和神经元细胞中。通过大样本鼻咽癌标本检测,NGX6a在鼻咽中表达下调并和转移相关。NGX6a在鼻咽细胞中发生降解；Ezrin在鼻咽癌组织中表达上调,有淋巴结转移的上调更为明显；Ezrin在组织内的分布情况和NGX6a相反；Ezrin在细胞内和NGX6a发生交互作用并且介导了NGX6a的降解；NGX6a七次跨膜结构域是其发生降解的关键部位；降低鼻咽癌细胞中Ezrin的表达水平,提高NGX6a的表达水平可以明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移能力。
吴静娴,张速勤,李兆基[7]（2009）在《抑癌基因NGX6与鼻咽癌》文中研究说明NGX6基因是一种新的与鼻咽癌相关的肿瘤抑制基因,被认为通过调节多种肿瘤相关基因表达及多条相关信号转导通路,从调控细胞周期、调节细胞黏附性、抑制肿瘤血管生成等多个方面在抑制鼻咽癌等肿瘤的增殖、侵袭与转移中发挥重要作用,但是其具体功能及作用机制复杂目前尚未完全阐明。本文就NGX6蛋白在结构、功能及其作用机制方面的研究进展进行综述,以期进一步探索NGX6蛋白抑制鼻咽癌恶性生物学行为的功能和作用机制。
吴静娴[8]（2009）在《NGX6蛋白在鼻咽癌中的表达及其与VEGF表达和LMVD的相关性研究》文中进行了进一步梳理第一部分鼻咽癌中NGX6蛋白的表达及其意义目的:研究鼻咽癌中鼻咽癌相关基因6（nasopharyngeal carcinoma associatedgene 6,NGX6）在蛋白水平的表达,及其与年龄、性别、淋巴结转移以及T、N和临床分期等因素的关系。方法:实验一采用EnVision二步法（Enhance Labelled Polymer System,ELPS法）进行免疫组化染色,检测20例鼻咽部非肿瘤性上皮组织（A组）、32例不伴颈部淋巴结转移的鼻咽癌组织（B组）及48例伴颈部淋巴结转移的鼻咽癌组织（C组）中NGX6蛋白的表达情况;结合患者年龄、性别、淋巴结转移、T、N分期和临床分期等多个因素,分析NGX6蛋白表达在鼻咽癌发生及发展进程中的意义。实验二采用Western Blot法,检测4例鼻咽部非肿瘤性上皮组织（A组）、6例不伴颈部淋巴结转移的鼻咽癌组织（B组）及10例伴颈部淋巴结转移的鼻咽癌组织（C组）中NGX6蛋白的表达情况;分析NGX6蛋白表达与鼻咽癌淋巴结转移的关系。结果:实验一中NGX6蛋白的免疫阳性产物为棕黄色颗粒,定位于鼻咽部上皮细胞和肿瘤细胞的细胞膜和细胞浆内。A、B、C三组中NGX6蛋白阳性表达率呈逐级下降趋势。非鼻咽癌组的NGX6蛋白阳性表达率为85%（17/20）,明显高于鼻咽癌组的NGX6蛋白阳性表达率52.5%（42/80）,差异有统计学意义（Χ2=6.9864,P<0.01）;非转移鼻咽癌组的NGX6蛋白阳性表达率为68.75%（22/32）,明显高于转移鼻咽癌组的NGX6蛋白阳性表达率41.67%（20/48）,差异有统计学意义（Χ2=5.6475,P<0.025）。实验一鼻咽癌组织中T2期和T3/4期的NGX6蛋白阳性表达率（45.24%、18.18%）均较T1期（77.78%）明显降低（P<0.01,P<0.005）;但是T2期和T3/4期鼻咽癌的NGX6蛋白阳性表达率无显着性差异（P>0.05）。N2/3期的NGX6蛋白阳性表达率（26.92%）较N0和N1期的NGX6蛋白阳性表达率（68.75%、59.09%）均明显降低（P<0.005,P<0.025）;但是N0期和N1期鼻咽癌的NGX6蛋白阳性表达率无显着性差异（P>0.05）。Ⅲ/Ⅳ期的NGX6蛋白阳性表达率（36.37%）较Ⅰ/Ⅱ期（72.22%）明显降低（P<0.005）。此外,鼻咽癌中NGX6蛋白阳性表达率在不同性别及年龄间无显着差异（P>0.05）。实验二A、B、C三组中NGX6蛋白的相对积分光密度值呈逐级下降趋势,三组间差异有显着性（F=38.02,Pr<0.0001）;非鼻咽癌组的NGX6蛋白的相对积分光密度值（0.9098±0.2673）高于非转移鼻咽癌组（0.3218±0.2003）（P<0.05）,而非转移鼻咽癌组的NGX6蛋白的相对积分光密度值（0.3218±0.2003）高于转移鼻咽癌组的NGX6蛋白的相对积分光密度值（0.0875±0.0432）（P<0.05）。结论:鼻咽癌中NGX6在蛋白水平存在表达下调,并且其下调程度与淋巴结转移相关,鼻咽癌中NGX6蛋白表达越低,预示着淋巴结转移的发生率越高;鼻咽癌中NGX6蛋白的表达与淋巴结转移、T分期、N分期及临床分期均显着相关,但是与患者年龄和性别无关。因此,NGX6蛋白的检测有可能有助于鼻咽癌淋巴结转移风险的预测,并有利于预后的判断。第二部分NGX6蛋白表达与LMVD的关系目的:研究鼻咽组织中NGX6蛋白表达与微淋巴管密度（lymphatic microvessel density ,LMVD）的相关性,探讨NGX6对肿瘤淋巴管生成可能存在的调节作用。方法:材料来源同第一部分实验一。采用EnVision二步法进行D2-40的免疫组化染色,计算各样本的淋巴管密度;分析LMVD与NGX6蛋白表达的相关性。结果: D2-40免疫阳性产物为棕黄色颗粒,定位于淋巴管内皮细胞的细胞浆中。A、B、C三组的LMVD值呈逐级上升趋势,非鼻咽癌组的LMVD值（3.45±1.94）低于非转移鼻咽癌组（6.02±2.96）,非转移鼻咽癌组的LMVD值低于转移鼻咽癌组（10.99±5.10）,三组间差异有显着性（F=29.98,Pr<0.0001）。NGX6蛋白表达与LMVD值存在明显的负相关（rs=-0.73221,P<0.0001）,NGX6蛋白表达水平越高,LMVD值越小。结论:鼻咽癌中LMVD增高,并且其增高程度与淋巴结转移相关,鼻咽癌中LMVD越高,预示着淋巴结转移的发生率越高;鼻咽癌中LMVD与NGX6蛋白表达呈显着负相关,提示NGX6的表达缺失和高LMVD在鼻咽癌的发展中起协同作用,且NGX6可能具有抑制肿瘤淋巴管生成的作用。第三部分NGX6蛋白表达与VEGF蛋白表达的关系目的:研究鼻咽组织中NGX6蛋白与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的相关性,探讨NGX6对鼻咽癌细胞中VEGF蛋白表达可能存在的调节作用。方法:实验一材料来源同第一部分实验一。采用EnVision二步法进行免疫组化染色,检测并分析各组鼻咽组织中VEGF蛋白的表达情况;分析VEGF蛋白表达与LMVD的相关性;分析VEGF蛋白表达与NGX6蛋白表达的相关性。实验二材料来源同第一部分实验二。采用Western Blot法,检测并分析各组鼻咽组织中VEGF蛋白的表达情况;分析VEGF蛋白表达与NGX6蛋白表达的相关性。结果:实验一中VEGF蛋白免疫阳性产物为棕黄色颗粒,定位于鼻咽部上皮细胞和肿瘤细胞的细胞浆内。A、B、C三组中VEGF蛋白阳性表达率呈逐级上升趋势。非非鼻咽癌组的VEGF蛋白阳性表达率为55%（11/20）,明显低于鼻咽癌组的阳性表达率86.25%（69/80）,差异有统计学意义（Χ2=9.7656,P<0.005）;非转移鼻咽癌组的VEGF蛋白阳性表达率为78.13%（25/32）,明显低于转移鼻咽癌组的阳性表达率91.67%（44/48）,但是差异无统计学意义（Χ2=2.9688,P>0.05）。VEGF蛋白表达与LMVD值存在明显的正相关（rs=0.73332,P<0.0001）,VEGF蛋白表达水平越高,LMVD值越大。VEGF蛋白表达与NGX6蛋白表达呈显着负相关（rs=-0.59988,P<0.0001）,NGX6蛋白表达水平越低,VEGF蛋白表达水平越高。实验二中A、B、C三组中VEGF蛋白的相对积分光密度值呈逐级增加趋势,三组间差异有显着性（F=20.13,Pr<0.0001）;非鼻咽癌组的VEGF蛋白的相对积分光密度值（0.5419±0.1993）低于非转移鼻咽癌组的相对积分光密度值（1.3748±0.366（P<0.05）,非转移鼻咽癌组的VEGF蛋白的相对积分光密度值（1.3748±0.3665）低于转移鼻咽癌组的相对积分光密度值（1.9939±0.4506）（P<0.05）。VEGF蛋白与NGX6蛋白的相对积分光密度值呈显着负相关（r5）s=-0.80902,P<0.0001）,随着NGX6蛋白相对积分光密度值越低,VEGF蛋白相对积分光密度值越高。结论:鼻咽癌中存在VEGF蛋白过度表达,并且其表达程度与淋巴结转移相关,鼻咽癌中VEGF蛋白表达越高,预示着淋巴结转移的发生率越高;鼻咽癌中VEGF蛋白表达与NGX6蛋白表达呈负相关,提示NGX6的表达缺失和VEGF的高表达在鼻咽癌的发展中起协同作用,VEGF表达可能受抑癌基因NGX6的负调控;鼻咽癌中LMVD值与VEGF蛋白表达呈正相关,进一步验证了VEGF对肿瘤淋巴管生成的促进作用。因此,联合检测NGX6蛋白、VEGF蛋白和LMVD可能更加有助于鼻咽癌淋巴结转移风险的预测,以及预后的判断。
张文玲[9]（2009）在《鼻咽癌发病不同阶段分子标志物的鉴定及差异表达基因相互作用网络的构建》文中提出【鼻咽癌差异基因表达谱分析】本研究室曾利用上海博芯公司H80s高密度基因芯片构建了鼻咽癌基因组表达谱,利用监督聚类和Weighted Voting算法筛选到6个基因,包括鼻咽癌上调基因RB1、STMN1、DSP和下调基因SERPINB6、AGTRL1和SYTL2。该6个基因代表的分类预测模型能将鼻咽癌和鼻咽慢性炎症上皮很好的区分开来,可能是鼻咽癌的候选分子标志物。为充分挖掘所构建的鼻咽癌差异基因表达谱中所隐藏的表达规律,提炼出更有价值的生物学信息,本文利用微阵列显着性分析（significance analysis of microarray,SAM）软件再次分析了鼻咽癌差异基因表达谱数据,共有显着差异表达基因758个,其中鼻咽癌表达上调基因270个,表达下调基因488个,从而构建了鼻咽癌差异基因表达谱。用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）在线通路分析软件、Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）软件和DAVID软件等分析发现cell cycle pathway和TGFβpathway相关分子的变化与鼻咽癌发生密切相关。【鼻咽癌发病不同阶段分子标志物的鉴定】为进一步研究上述鼻咽癌差异表达基因、cell cycle pathway和TGFβpathway相关分子与鼻咽癌发生发展的关系及在鼻咽癌发生中的作用,评估这些差异表达基因是否可作为鼻咽癌的分子靶标,本研究制作了高密度点阵的鼻咽癌发病不同阶段的组织微阵列以验证这些差异表达基因相关分子的表达变化。筛选和鉴定鼻咽癌发病不同阶段生物靶点基因、寻找鼻咽癌早期诊断、侵袭转移、预后复发相关的分子标志物。具体如下:1.鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列的构建利用本室已获得发明专利的组织芯片制备技术（专利授权号:ZL200410022818X）制备了包含正常鼻咽上皮、慢性炎症鼻咽上皮、不典型增生鼻咽上皮、鼻咽癌（含不同组织学类型、不同临床分期、有无淋巴结转移、放疗后正常及复发鼻咽癌组织）及癌旁组织的鼻咽癌发病不同阶段的含825个点阵的组织微阵列,包括淋巴瘤和喉癌标本及缺失组织,该微阵列共有896个点。其中正常和鼻咽炎性上皮141例、不典型增生鼻咽上皮98例、癌旁上皮88例、鼻咽癌（WHOⅠ型15例、WHOⅡ型402例、WHOⅢ型17例;临床分期Ⅰ期32例、Ⅱ期155例、Ⅲ期1 56例、Ⅳ期91例;有淋巴结转移283例、无淋巴结转移151例）、放疗后正常和复发的标本64例、淋巴瘤和喉癌标本57例。2.鼻咽癌差异表达基因的验证鼻咽癌发病不同阶段的组织微阵列证实在488个鼻咽癌表达下调基因中,SPLUNC1是鼻咽癌早期患病风险筛查的易感因子,NGX6、LTF与鼻咽癌侵袭转移密切相关,SPLUNC1、ClORF102、AGTRL1和SERPINB6与鼻咽癌临床进展密切相关,LTF、BRD7和C1ORF102能预测鼻咽癌患者预后。其中LTF、C1ORF102、SPLUNC1、BRD7、NAG7、NGX6是我室克隆的鼻咽癌候选抑瘤基因,AGTRL1和SERPINB6是我们前期用监督聚类和weighted voting算法筛选到的鼻咽癌候选分子标志物。结合鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列和real-time quantitativeRT-PCR证实cell cycle pathway中p27、p16、CDK4、RB1、CDK8等分子与cDNA microarray结果变化一致。利用鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列证实TGFβpathway中TGFβⅡR、ACVRL1、INHBB、Axin2和p300/CBP分子在鼻咽癌中异常活化,说明cell cycle pathway和TGFβpathway在鼻咽癌发生发展过程中可能起到重要的作用。并且证实了EBV感染是鼻咽癌的一主要特征,鼻咽癌中cell cycle pathway和TGFβpathway的活化与EBV的感染密切相关。3.构建鼻咽癌发病不同阶段的分子标志物系统通过运用转录组学和组织微阵列等高通量技术,在大样本的基础上筛查并鉴定了SAM软件分析得到的鼻咽癌差异表达基因及我室克隆的鼻咽癌候选抑瘤基因SPLUNC1、C1ORF102、BRD7、NAG7、NGX6基因以及cell cycle pathway、TGFβpathway相关分子的表达,构建了鼻咽癌发病不同阶段的分子标志物系统:①证实SPLUNC1、p27、p16、p19是鼻咽癌早期诊断的理想分子标志物;②LTF、NAG7、SPLUNC1、ClORF102、CDK4、AGTRL1、INHBB和SERPINB6是与鼻咽癌临床进展相关的候选分子标志物;③NGX6、LTF、AGTRL1、INHBB和ACVRL1是与鼻咽癌淋巴结转移相关的候选分子标志物;④证实LTF、BRD7、CDK4、cyclin D1、RB1、EBER-1和ACVRL1是预测鼻咽癌放疗敏感与否的候选分子标志物;⑤LTF、BRD7、C1ORF102、ACVRL1、INHBB、cyclin D1是与鼻咽癌预后相关的候选分子标志物。鼻咽癌发病不同阶段的分子标志物的证实为鼻咽癌分子分型研究奠定了坚实的工作基础。【鼻咽癌差异表达基因相互作用网络的构建】将SAM软件筛选到的758个鼻咽癌差异表达基因输入IngenuityPathway Analysis（IPA）在线软件分析基因生物学功能和相互作用网络,137个基因在其基因网络数据库中,127个基因有功能/通路数据。变化最显着的有9个network,这些基因网络主要涉及DNA复制与修复、细胞周期、肿瘤发生、基因表达、细胞信号等方面。其中SPLUNC1参与了基因表达和肿瘤发生等生物学过程,并受维甲酸（retinoic acid,RA）调控,RA可能通过调控SPLUNC1的表达而抑制鼻咽癌细胞生长;SERPINB6参与了细胞运动和免疫应答等生物学过程。
邓坦[10]（2009）在《SPLUNC1相关差异miRNA的功能及分子网络调控机制分析》文中进行了进一步梳理鼻咽癌是一种在中国南部和东南亚地区高发的多基因遗传性恶性肿瘤。SPLUNC1基因是我室克隆的鼻咽癌候选抑瘤基因,它在鼻咽正常组织中高表达,而在鼻咽癌细胞系和组织中低表达。我室前期研究发现SPLUNC1蛋白是一种细胞表面的分泌性蛋白,它不仅能够通过结合细菌脂多糖与革兰氏阴性菌相结合,还能够抑制EB病毒。说明SPLUNC1可能是一种天然免疫保护分子。我室还克隆了多个候选鼻咽癌抑瘤基因,比如BRD7,NGX6,UBAP1,LPLUNC1,NAG7等,长期以来,我们都是用单基因转染的方法来研究它们抑制鼻咽癌的机制,但这些抑瘤基因是如何共同作用来阻止多基因遗传性肿瘤发生发展的机制还不为人知。miRNA是近年来生命科学的热点,它是一种内源性调控转录后信使RNA的小分子RNA,由于miRNA对其数以百计的靶基因的调控使miRNA与信使RNA之间组成了复杂的调控网络。正是miRNA调控多基因的这一特点,也许能帮助解决我们多个抑瘤基因共同作用机制的疑问。为了了解SPLUNC1与miRNA在鼻咽癌中调控的分子机制,我们进行了如下研究,并取得了相应的结果:[has-mir-141与has-mir-205在SPLUNC1转染细胞系中表达下调]我们将含有全长的SPLUNC1基因的载体转染至高侵袭,高转移性鼻咽癌细胞系5-8f中,并建立了稳定转染的细胞系。我们利用博奥生物有限公司开发的针对435个人（包含Nature杂志预测的有122个miRNA）、196个大鼠、261个小鼠成熟miRNA的哺乳动物miRNA芯片分析了转染SPLUNC1与其空白对照组的miRNA的差别。结果转基因组和对照组相比,共有25种miRNA表达明显上调,（fold change>3）29种miRNA表达明显下调。（fold change>3）.其中两种强烈下调的miRNA（fold change>10）,has-mir-141与has-mir-205通过northernblot和Q-PCR验证,确定确实在在SPLUNC1转染细胞系中表达下调。随后通过显微切割10例鼻咽癌组织和10例正常对照鼻咽组织进行Q-PCR验证,我们发现hsa-mir-141在鼻咽癌组织中的表达略强于鼻咽组织对照,两者之间的差异存在统计学意义,而has-mir-205表达则没有差别。[通过细胞生物学实验证实has-mir-141和has-mir-205在鼻咽癌细胞系中起着瘤基因的作用]对特定miRNA的相关细胞生物学功能的研究通常是通过脂质体转染它的成熟体（mimics）与抑制子（inhibitors）进入相应细胞,人为改变细胞内相应miRNA的含量,达到上调和下调细胞内miRNA的表达的作用进而研究这一系列改变对细胞生长,运动功能,穿膜能力,凋亡,细胞周期等功能的影响。MTT实验显示通过转染hsa-mr-141与hsa-mir-205的成熟体（mimics）与抑制子（inhibitors）及其相对应的成熟体对照（NC）抑制子对照（INC）,在实验的前三天各转染组之间没有明显差别,第四天以后,hsa-mir-141抑制子组（inhibitors）较其他对照组生长速度减慢了30%左右,而hsa-mir-205成熟体（mimics）组较其他各对照组生长速度提高了40%左右。由于5-8f细胞是一种高侵袭,高转移性肿瘤细胞,我们想知道miRNA对细胞这一特性的影响。通过细胞划痕实验,我们发现hsa-mir-141和hsa-mir-205的成熟体组（mimics）均能显着促进5-8f细胞划痕伤口的愈合,而hsa-mir-141的抑制子组（inhibitors）则明显能减缓5-8f细胞划痕伤口的愈合;而通过transwell实验我们发现hsa-mir-141与hsa-mir-205的抑制子组（inhibitors）能明显降低5-8f细胞穿膜能力。流式细胞术分析发现抑制hsa-mir-141和hsa-mir-205能促进细胞凋亡,并能将5-8f细胞阻滞于G1到S期之间。通过western blot对细胞周期相关的一些分子进行检测,我们发现显示hsa-mir-205与141抑制子（inhibitors）均能促进caspase8与caspase3的表达达到促进凋亡的目的,同时它们同时具有促进JNK2及NF-κB P65表达,并抑制Iκα的表达。这些结果说明hsa-mir-205与141抑制子能够通过影响MAPK通路和TNFR通路的相关分子达到阻滞细胞周期的作用。[has-mir-141与has-mir-205所预测的靶基因与SPLUNC1转染影响的差异mRNA基因多位于相同的肿瘤调控通路]我们对转染SPLUNC1的差异miRNA has-mir-141和has-mir-205进行了靶基因预测,分别通过在线软件pictar,targetscan4.0进行预测。随后我们运用在线基因功能分析软件DAVID 2008 FunctionalAnnotation Bioinformatics Microassay Analysis Tools对hsa-mir-141与hsa-mir-205所预测的靶基因进行功能归类和信号通路分析,发现它们的靶基因涉及到MAPK,JAK-STAT,Cell cycle,wnt,tightjunction,Adherens junction等多条与肿瘤调控细胞凋亡等功能相关通路。由于hsa-mir-141与hsa-mir-205在鼻咽癌细胞相对低表达,所以我们考虑它们在通路中主要影响抑瘤基因,我们发现了其中一些具有研究价值的抑瘤基因:MAP2K4,MAP3K3,DLC1,TP53BP2等。更让我们感兴趣的是,我们在has-mir-141的靶基因中发现了同属我室克隆的抑瘤基因UBAP1。随后通过安捷伦全基因组芯片The WholeHuman Genome Oligo Microarray分析SPLUNC1转染对鼻咽癌细胞系mRNA水平的影响,我们发现转基因组与空白组比较上调明显（FOLDchange>2）的有1698个基因,转基因组与空白组比较下调明显（FOLDchange>2）的有2135个基因。通过对转染SPLUNC1的差异miRNA的预测靶基因和全基因组芯片上下调的差异基因进行比较对接,我们发现它们之间完全意义的一对一重合几乎没有。但运用安捷伦的差异基因通路分析软件,我们对SPLUNC1转染的差异基因对涉及到的细胞通路进行了归类和分析。我们发现SPLUNC1转染差异基因的通路分布状况和hsa-mir-141与hsa-mir-205所预测靶基因的通路分布极为相似,比如其中的MAPK,JAK-STAT,Cell cycle,wnt通路等。提示我们SPLUNC1基因影响这些肿瘤相关通路不仅可以自身直接调控,也可以通过调控miRNA来间接实现。[has-mir-141能通过直接作用UBAP1基因3’非编码区调控UBAP1蛋白的表达]我们将构建好的质粒与相应miRNA mimics或inhibitors共同转染至5-8f细胞内,通过荧光素酶检测,我们发现has-mir-141 mimics对UBAP1空白报告质粒组及UBAP1突变体组无明显影响,但对插入了UBAP13‘UTR片段的报告质粒组荧光素酶强度下降了50%,（图3-606）说明UBAP1实受hsa-mir-141直接影响,即UBAP1为hsa-mir-141的靶基因。通过western blot验证,结果表明UBAP1在5-8f及对照中低表达,在抑制hsa-mir-141和SPLUNC1转染细胞系中表达明显增强。这一结果不仅表明has-mir-141能影响UBAP1蛋白,而且说明SPLUNC1能通过下调has-mir-141来达到上调UBAP1共同发挥抑制鼻咽癌肿瘤的作用。[总结]前期研究表明SPLUNC1转染不仅影响MAPK通路中关键分子如JNK2,NF-κB等,也影响TNFR通路中的caspase3和caspase8进而导致细胞的凋亡和细胞周期的改变。我们通过western blot发现抑制hsa-mir-141有着同样的功能和作用,SPLUNC1转染引起hsa-mir-141与hsa-mir-205下调,而hsa-mir-141不仅可以影响MAPK通路的关键分子,也可以通过上调鼻咽癌候选抑瘤基因呢UBAP1,通过其对肿瘤发生的关键蛋白的抑制作用,共同扭转鼻咽癌的恶性表型。在整个假想调控通路中,差异miRNA的作用是最为关键的。SPLUNC1与has-mir-141是否确实存在共同对MAPK通路的调控作用,还需要更多的后期实验来加以证实。
二、鼻咽癌相关基因NGX6对鼻咽癌细胞周期的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼻咽癌相关基因NGX6对鼻咽癌细胞周期的影响（论文提纲范文）
（1）1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 |
| 导论 |
| 1. 膀胱癌概述 |
| 2. 基因拷贝数变异的生物学意义 |
| 3. 基因拷贝数变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. 膀胱癌中的基因拷贝数异常 |
| 5. 问题与展望 |
| 6. 本项研究的目的和基本策略 |
| 结果 |
| 第一节 本研究入组病例及其临床病理特征 |
| 1. 膀胱癌肿瘤组织病例 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织病例的临床病理特征 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织病例随访情况 |
| 2. 膀胱癌尿样本 |
| 2.1 膀胱癌尿样本病例的临床病理特征 |
| 2.2 膀胱癌尿样本病例随访情况 |
| 第二节 膀胱癌组织中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织中的DNA拷贝数异常 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. DNA拷贝数异常与患者预后的相关性分析 |
| 2.1 DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 2.2 DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3. 基于临床病理风险因素与DNA拷贝数异常的预后预测模型 |
| 3.1 Cox风险比例回归分析影响膀胱癌患者无瘤生存期的独立预后因素 |
| 3.2 基于膀胱癌独立预后因素构建预后预测模型 |
| 3.2.1 构建非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.2 构建肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.3 高风险非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测 |
| 第三节 基于Real-time PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 2.1 术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的关系 |
| 2.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发的相关性 |
| 2.3 构建非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发预测模型 |
| 第四节 基于3D数字PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 3D数字PCR与real-time PCR对尿液中拷贝数变异分子的检测效能比较 |
| 2.1 受试者工作曲线分析比较两者检测效能 |
| 2.2 构建基于3D数字PCR的术前尿样本诊断模型 |
| 3. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 3.1 尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3.2 尿样本中DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 讨论 |
| 1. 膀胱癌相关分子标志物研究的策略 |
| 2. 组织中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 3. 尿液中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 4. 3D数字PCR在膀胱癌患者尿液检测中的应用 |
| 5. CEP63、FOSL2及PAQR6的异常改变与肿瘤的关系 |
| 6. 本项研究的局限性 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、研究病例和实验材料 |
| 1. 膀胱癌患者及其生物学样品 |
| 2. 生物样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 3. 实时荧光定量PCR |
| 4. 3D数字PCR |
| 5. 引物序列 |
| 6. 主要仪器和设备 |
| 7. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 尿沉渣DNA提取 |
| 2. 实时荧光定量PCR |
| 3. 扩增产物质量检测 |
| 4. 引物扩增标准曲线 |
| 5. 3D数字PCR |
| 6. 统计学方法 |
| 第二章 EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义 |
| 导论 |
| 1. EB病毒概述 |
| 2. EB病毒相关的上皮性恶性肿瘤 |
| 3. EB病毒编码基因及其变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. EB病毒编码的小RNA与恶性肿瘤的关系 |
| 5. 本项研究的目的和策略 |
| 结果 |
| 第一节 EB病毒编码的miRNA在胃癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、EB病毒相关胃癌中病毒及宿主miRNA的表达 |
| 1. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.1 miRNA芯片质量控制 |
| 1.2 EB病毒相关胃癌肿瘤组织中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌细胞系中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.4 EB病毒相关胃癌中高表达的病毒miRNA |
| 1.5 探索EB病毒相关胃癌中高表达病毒miRNA的靶基因及其功能 |
| 2. EB病毒相关胃癌中宿主miRNA的表达 |
| 2.1 EB病毒相关胃癌组织中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.2 EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.3 EB病毒相关胃癌中与病毒有关的宿主miRNA |
| 3. EB病毒编码的miRNA与宿主miRNA的相关性分析 |
| 3.1 探索EB编码的miRNA与宿主细胞miRNA表达的相关性 |
| 3.2 探索与EB病毒miRNA与相关宿主miRNA结构的相关性 |
| 3.3 探索与EB病毒相关的宿主miRNA的靶基因及其功能 |
| 三、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA对宿主基因表达的影响 |
| 1. EB病毒相关胃癌中差异表达的宿主基因 |
| 1.1 转录组测序EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.2 公共数据库中EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌与EB病毒阴性胃癌中宿主基因的差异表达 |
| 2. 差异表达的宿主基因与病毒miRNA的相关性 |
| 2.1 从差异表达的宿主基因中筛选病毒与宿主miRNA的共同靶基因 |
| 2.2 病毒与宿主miRNA共同靶基因KEGG信号通路富集 |
| 四、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART1-3p和miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. EB病毒miRNA对胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞增殖能力的影响 |
| 3. EB病毒miRNA对胃癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞周期的影响 |
| 4. EB病毒miRNA对胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞迁移能力的影响 |
| 第二节 EB病毒编码的miRNA在鼻咽癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、鼻咽癌中EB病毒miRNA的表达 |
| 三、鼻咽癌中EB病毒miR-BART7-3p的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 3. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 4. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 讨论 |
| 1. 临床相关研究质量控制 |
| 2. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的研究 |
| 3. 本项研究中病毒miRNA在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义 |
| 4. 鼻咽癌中病毒miRNA的研究 |
| 5. 本项研究中病毒miRNA在鼻咽癌中的表达及其意义 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. EB病毒相关胃癌患者及其生物学样品 |
| 2. 鼻咽癌相关患者及其生物学样品 |
| 3. 临床样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 4. 主要试剂盒 |
| 5. 实时定量荧光PCR试剂 |
| 6. 细胞培养和miRNA转染 |
| 7. 常用试剂配制 |
| 8. 细胞培养用主要器皿 |
| 9. 主要仪器 |
| 10. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 基因表达谱芯片技术 |
| 2. 芯片数据读取 |
| 3. 芯片数据预处理和标准化 |
| 4. 第二代测序 |
| 5. miRNA实时定量荧光PCR |
| 6. 总RNA样品的提取、制备及质量鉴定 |
| 7. 细胞生物学实验方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（2）白藜芦醇对鼻咽癌转移能力的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）LPLUNC1抑制NF-κB和Stat3信号通路的激活抵抗促炎因子IL-6促进的鼻咽癌发生发展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 主要缩略词简表 |
| 第一章 前言 |
| 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 第三章 结果 |
| 第一部分 促炎因子诱导鼻咽癌上皮细胞参与炎症反应,促进鼻咽癌细胞生长 |
| 1.1 鼻咽癌组织中IL-6蛋白表达和TAMs浸润程度及临床意义 |
| 1.2 促炎因子刺激鼻咽癌上皮细胞自分泌炎性因子,参与炎症反应 |
| 1.2.1 低浓度LPS诱导巨噬细胞分泌促炎因子 |
| 1.2.2 条件培养基可诱导鼻咽癌细胞分泌促炎因子、促进鼻咽癌细胞增殖 |
| 1.2.3 条件培养基可激活NF-κB和Stat3信号通路诱导鼻咽癌细胞分泌促炎因子、促进鼻咽癌细胞增殖 |
| 1.3 IL-6可激活NF-κB和Stat3表达促进鼻咽癌细胞的生长与增殖 |
| 1.3.1 IL-6促进鼻咽癌细胞的生长与增殖 |
| 1.3.2 IL-6可激活NF-κB和Stat3表达 |
| 小结 |
| 第二部分 LPLUNC1抑制NF-κB和Stat3信号通路的激活抵抗促炎因子IL-6诱导的鼻咽癌发生发展 |
| 2.1 LPLUNC1抑制鼻咽癌的发生发展 |
| 2.1.1 鼻咽癌组织中LPLUNC1蛋白表达及临床意义 |
| 2.1.2 LPLUNC1抑制鼻咽癌细胞的生长 |
| 2.1.3 LPLUNC1对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 2.1.4 LPLUNC1对鼻咽癌细胞凋亡的影响 |
| 2.1.5 LPLUNC1对鼻咽癌细胞裸鼠成瘤的影响 |
| 2.1.6 LPLUNC1抑制鼻咽癌组织和细胞中NF-κB和Stat3信号通路的激活 |
| 2.1.7 LPLUNC1对细胞周期、凋亡调控分子表达的影响 |
| 2.2 LPLUNC1通过抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路激活抵抗IL-6促进的鼻咽癌发生发展 |
| 2.2.1 LPLUNC1抑制LPS诱导的鼻咽癌细胞和巨噬细胞分泌促炎因子 |
| 2.2.2 LPLUNC1抑制IL-6对鼻咽癌细胞的促增殖和加速细胞周期演进的作用 |
| 2.2.3 LPLUNC1在鼻咽癌细胞中抑制IL-6对NF-KB和Stat3信号通路的激活 |
| 小结 |
| 第三部分 LPLUNC1对鼻咽癌5-8F细胞蛋白质表达谱的影响 |
| 3.1 LPLUNC1转染5-8F细胞的差异蛋白质表达谱分析 |
| 3.2 差异表达蛋白质点的质谱鉴定 |
| 3.3 差异表达蛋白质功能分类 |
| 3.4 差异表达蛋白质的验证 |
| 3.4.1 差异表达蛋白质基因水平或蛋白水平验证 |
| 3.4.2 免疫组织化学检测Prohibitin在鼻咽癌组织中表达变化及分析其临床意义 |
| 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 促炎因子诱导鼻咽癌上皮细胞参与炎症反应 |
| 4.2 IL-6通过激活NF-κB和Stat3信号通路促进鼻咽癌细胞生长 |
| 4.3 LPLUNC1抑制鼻咽癌的发生发展 |
| 4.4 LPLUNC1抑制IL-6介导的NF-κB和Stat3信号通路的激活 |
| 4.5 鼻咽癌5-8F细胞过表达LPLUNC1前后差异蛋白质表达谱分析 |
| 4.6 Prohibitin基因低表达可能是鼻咽癌恶性进展和不良预后的重要分子标志 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要成果 |
（4）鼻咽癌侵袭与转移相关基因的研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 乙酰肝素酶 |
| 2 缺氧诱导因子-1 |
| 3 NGX6 |
| 4 LTF |
| 5 THY1 |
（5）抑癌基因NGX6研究进展（论文提纲范文）
| 0 引 言 |
| 1 鼻咽癌相关抑癌基因NGX6的发现及结构 |
| 2 NGX6与鼻咽癌 |
| 3 NGX6与大肠癌 |
| 4 结 语 |
（6）Ezrin介导NGX6a蛋白降解促进了鼻咽癌细胞侵袭转移的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩写词简表 |
| 第一章 前言 |
| 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 菌株和质粒载体 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pET28b-NGX6ΔTM2载体的构建 |
| 2.2 His-NGX6ΔTM2融合蛋白的诱导 |
| 2.3 NGX6多克隆抗体制备 |
| 2.4 兔抗NGX6多克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.5 胎儿组织标本的收集与免疫组化 |
| 2.6 组织及培养细胞总蛋白制备 |
| 2.7 NGX6a真核表达载体的构建 |
| 2.8 基因瞬时转染 |
| 2.9 免疫荧光实验 |
| 2.10 激光显微切割纯化组织 |
| 2.11 稳定转染5-8F细胞系的建立 |
| 2.12 细胞RNA制备 |
| 2.13 Realtime RT-PCR检测NGX6a在各种鼻咽癌细胞中的表达 |
| 2.14 免疫共沉淀 |
| 2.15 Ezrin相关载体的构建 |
| 2.16 NGX6a突变体的构建 |
| 2.17 划痕试验 |
| 2.18 基质胶侵袭试验 |
| 第三章 结果 |
| 第一部分 NGX6两个蛋白亚型的发现;NGX6蛋白在正常组织与癌组织的分布情况 |
| 3.1.1 原核表达载体pET28b-NGX6ΔTM2的构建 |
| 3.1.2 His-NGX6ΔTM2蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.1.3 NGX6多克隆抗体制备与鉴定:NGX6蛋白存在两个蛋白亚型 |
| 3.1.4 NGX6蛋白生物信息学分析 |
| 3.1.5 NGX6蛋白在正常组织的分布和定位 |
| 3.1.6 NGX6蛋白在鼻咽癌组织中的分布 |
| 第二部分 NGX6a蛋白在鼻咽癌细胞中降解 |
| 3.2.1 NGX6a在鼻咽癌细胞系中的表达 |
| 3.2.2 NGX6a在鼻咽癌细胞系中降解 |
| 第三部分 Ezrin介导了NGX6a在鼻咽癌细胞中降解 |
| 3.3.1 Ezrin和NGX6a发生交互作用 |
| 3.3.2 Ezrin和NGX6a在细胞系和正常组织内表达的差异 |
| 3.3.3 Ezrin在鼻咽癌中表达上调 |
| 3.3.4 Ezrin介导了NGX6a在细胞内的降解 |
| 3.3.5 七跨膜区是NGX6a在细胞内降解的关键部位 |
| 第四部分 Ezrin通过降解NGX6a促进鼻咽癌细胞侵袭转移 |
| 3.4.1 瞬时转染NGX6a可以抑制鼻咽癌细胞的运动和侵袭能力 |
| 3.4.2 NGX6a的降解对于Ezrin促进鼻咽癌细胞的侵袭转移具有关键作用 |
| 3.4.3 光辉霉素和MG132能抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移能力 |
| 第四章 讨论 |
| 第一部分 NGX6a的发现,NGX6a在鼻咽癌中下调 |
| 4.1.1 制备NGX6基因多克隆抗体,为NGX6蛋白的特性与功能鉴定打下基础 |
| 4.1.2 NGX6蛋白在人体组织和鼻咽癌组织的分布模式及其意义 |
| 第二部分 Ezrin介导了NGX6a在鼻咽癌中的降解的生物学意义 |
| 4.2.1 NGX6a蛋白在细胞中经蛋白酶体降解,但不能被泛素化 |
| 4.2.2 Ezrin介导了NGX6a在鼻咽癌细胞中的生物学意义 |
| 第三部分 抑制Ezrin,增加NGX6a的表达可以抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移能力 |
| 4.3.1 瞬时转染NGX6a可以抑制鼻咽癌细胞的运动和侵袭能力 |
| 4.3.2 NGX6a的降解对于Ezrin促进鼻咽癌细胞的侵袭转移具有关键作用 |
| 4.3.3 光辉霉素和MG132联合使用的临床意义 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）NGX6蛋白在鼻咽癌中的表达及其与VEGF表达和LMVD的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 鼻咽癌中NGX6 蛋白的表达及其意义 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二部分 NGX6 蛋白表达与LMVD的关系 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三部分 NGX6 蛋白表达与VEGF蛋白表达的关系 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（9）鼻咽癌发病不同阶段分子标志物的鉴定及差异表达基因相互作用网络的构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写词简表 |
| 实验技术路线 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 组织细胞标本 |
| 1.2 基因表达谱芯片和数据 |
| 1.3 软件及数据库 |
| 1.4 试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 组织微阵列的制作 |
| 2.3 免疫组织化学方法(immunohistochemistry,IHC) |
| 2.4 原位杂交(in situ hybridization,ISH) |
| 2.5 结果判断及标准 |
| 2.6 差异表达基因的Real-time RT-PCR验证 |
| 2.7 生存分析 |
| 2.8 分析和统计软件 |
| 第三章 结果 |
| 1.鼻咽癌差异基因表达谱的构建 |
| 2.鼻咽癌密切相关的信号传导通路 |
| 2.1 GSEA软件分析得到鼻咽癌密切相关的信号传导通路和gene set |
| 2.2 DAVID软件分析得到鼻咽癌密切相关的信号传导通路 |
| 3.鼻咽癌发病不同阶段分子标志物的鉴定 |
| 3.1 鼻咽癌发病不同阶段组织微阵列的构建 |
| 3.2 鼻咽癌差异表达基因的验证 |
| 3.3.Cell cycle pathway和TGFβ pathway相关分子的验证 |
| 3.4 检测EBER-1,LMP1的表达 |
| 3.5 构建鼻咽癌发病不同阶段的分子标志物系统 |
| 4.鼻咽癌差异表达基因相互作用网络的构建 |
| 第四章 讨论 |
| 1.显微切割纯化组织标本是基因表达谱结果可靠的前提 |
| 2.鼻咽癌差异表达基因的筛选 |
| 3.鼻咽癌发病不同阶段分子标志物的构建 |
| 3.1 Cell cycle pathway成员在鼻咽癌中的表达 |
| 3.2 TGFβ pathway成员在鼻咽癌中的表达 |
| 3.3 鼻咽癌中cell cycle pathway和TGFβ pathway活化与EBV的关系 |
| 3.4 鼻咽癌候选分子标志物系统的构建 |
| 4.鼻咽癌差异表达基因相互作用网络和生物学功能 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）SPLUNC1相关差异miRNA的功能及分子网络调控机制分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 缩写词简表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 SPLUNC1稳定转染细胞系的构建 |
| 3.2 转染SPLUNC1 miRNA芯片结果及验证 |
| 3.2.1 转染SPLUNC1 miRNA芯片分析结果 |
| 3.2.2 miRNA芯片分析结果在原细胞系中的验证 |
| 3.2.3 miRNA芯片分析结果在鼻咽组织中的验证 |
| 3.3 miRNA相关生物信息学分析及靶基因预测 |
| 3.3.1 hsa-mir-141与hsa-mir-205基本信息 |
| 3.3.2 Hsa-mir-141与hsa-mir-205靶基因的预测分析 |
| 3.3.3 对靶基因进行DAVID功能分析 |
| 3.4 转染SPLUNC1全基因组芯片的分析及验证 |
| 3.4.1 转染SPLUNC1全基因组芯片的分析结果 |
| 3.4.2 对全基因组芯片RT-PCR验证结果 |
| 3.5 Hsa-mir-141与hsa-mir-205对鼻咽癌细胞系5-8f细胞生物学功能的影响 |
| 3.5.1 转染miRNA的成熟体与抑制子后的Q-PCR验证 |
| 3.5.2 MTT检测miRNA对细胞生长的影响 |
| 3.5.3 划痕实验检测miRNA对细胞运动能力影响 |
| 3.5.4 Transwell实验检测miRNA对细胞穿膜能力的影响 |
| 3.5.5 流式细胞分析miRNA对细胞凋亡率和细胞周期的影响 |
| 3.5.6 miRNA对部分MAPK通路和TNF-βR通路关键分子的影响 |
| 3.5.7 Hsa-mir-141与hsa-mir-205细胞生物学功能小结 |
| 3.6 hsa-mir-141与hsa-mir-205的靶基因验证 |
| 3.6.1 构建与hsa-mir-141与hsa-mir-205结合的靶基因质粒 |
| 3.6.2 荧光素酶检测验证相关靶基因 |
| 3.6.3 Western blot验证hsa-mir-141对UBAP1的作用 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 SPLUNC1与鼻咽癌易感基因群的关系 |
| 4.2 SPLUNC1转染的差异miRNA与肿瘤的关系 |
| 4.3 SPLUNC1基因,差异miRNA及相关信号通路的关系 |
| 4.4 转染SPLUNC1能通过下调hsa-mir-141来拯救鼻咽癌抑瘤基因UBAP1的表达,共同达到抑制鼻咽癌的作用 |
| 4.5 尚需继续研究的课题 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、鼻咽癌相关基因NGX6对鼻咽癌细胞周期的影响（论文参考文献）
- [1]1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义[D]. 蔡曌. 北京协和医学院, 2021
- [2]白藜芦醇对鼻咽癌转移能力的影响及其机制研究[D]. 屠德桢. 昆明医科大学, 2019(06)
- [3]LPLUNC1抑制NF-κB和Stat3信号通路的激活抵抗促炎因子IL-6促进的鼻咽癌发生发展[D]. 廖前进. 中南大学, 2012(02)
- [4]鼻咽癌侵袭与转移相关基因的研究进展[J]. 邓文婷,王双乐. 肿瘤防治研究, 2011(02)
- [5]抑癌基因NGX6研究进展[J]. 杨波,张速勤,李兆基. 医学研究生学报, 2010(03)
- [6]Ezrin介导NGX6a蛋白降解促进了鼻咽癌细胞侵袭转移的分子机制研究[D]. 王理. 中南大学, 2010(11)
- [7]抑癌基因NGX6与鼻咽癌[J]. 吴静娴,张速勤,李兆基. 国际耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2009(03)
- [8]NGX6蛋白在鼻咽癌中的表达及其与VEGF表达和LMVD的相关性研究[D]. 吴静娴. 第二军医大学, 2009(10)
- [9]鼻咽癌发病不同阶段分子标志物的鉴定及差异表达基因相互作用网络的构建[D]. 张文玲. 中南大学, 2009(02)
- [10]SPLUNC1相关差异miRNA的功能及分子网络调控机制分析[D]. 邓坦. 中南大学, 2009(02)