一、血栓调节蛋白在成人及胎肺组织中的表达（论文文献综述）
陆甜甜[1]（2020）在《金属蛋白酶ADAMTS18在早期肺发育中的作用研究》文中研究表明鉴定影响早期肺发育的关键基因对于理解肺脏稳态平衡及肺再生医学治疗具有重要意义。ADAMTS（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs）是一类含I型血小板反应蛋白域的解整合素金属蛋白酶,在人类已发现19个家族成员,它们通过切割或修饰细胞外基质成分（Extracellular matrix,ECM）,在胚胎发育、组织形态发生、肿瘤等多种病生理过程中发挥重要作用。ADAMTS18是一种“孤儿ADAMTSs（orphan ADAMTSs）”,即不知功能或底物的ADAMTS家族成员。课题组长期致力于ADAMTS18生物学功能的研究,并成功构建了ADAMTS18基因敲除(Adamts18-/-)小鼠模型。在小鼠表型分析过程中,我们发现Adamts18-/-小鼠最为突出的改变是肺形态发育异常,Adamts18-/-小鼠肺脏边缘锐利,缺乏圆钝外形;病理学分析显示:大多数Adamts18-/-小鼠出生后肺部呈现出明显的肺泡扩张。通过原位杂交,我们发现Adamts18 mRNA主要表达于小鼠胚胎肺组织中。仅有的文献报道也显示ADAMTS18在人类胎肺中高表达。据此推测:ADAMTS18可能在早期肺发育过程中起关键作用。本研究利用实验室前期构建的Adamts18基因敲除小鼠,通过以下实验方法对ADAMTS18蛋白在肺发育中的作用进行了探讨。1)通过荧光定量聚合酶链式反应（Quantative real-time polymerasechain reaction,qRT-PCR）和RNA原位杂交技术（in situ hybridization,ISH）检测Adamts18 mRNA在小鼠肺组织中的时空分布特征;2)通过体外肺组织培养和气管铸型实验观察Adamts18-/-小鼠支气管发育各时期的形态;3)通过苏木素-伊红染色（hematoxylin and eosin,HE）染色、Hart’s染色、天狼星红染色、Masson染色、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）等方法对Adamts18+/+和Adamts18-/-小鼠的肺组织切片形态及蛋白的分布进行比较;4)通过小动物肺功能检测系统,检查Adamts18-/-小鼠的吸气时间、呼气时间、呼吸频率、最高气道压力、平均气道压力、潮气量、每分钟通气量和最高吸气/呼气流速的变化;5)腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）诱导急性肺损伤模型,气管滴注博来霉素诱导肺纤维化模型,制作石蜡切片后通过病理评分,评估小鼠在疾病模型中的肺损伤修复情况;6)通过非标记蛋白质组学,比较E14.5天Adamts18+/+和Adamts18-/-小鼠胎肺的差异蛋白,并利用metascape平台对差异蛋白进行基因功能（Geneontology,GO）和信号通路富集分析;7)通过蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）、透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）、qRT-PCR技术对组学筛选出的蛋白进行验证;8)通过体外蛋白表达、细胞免疫荧光、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）、酶联免疫吸附（Elisa）等方法验证ADAMTS18与靶蛋白的相互作用。实验结果:1)Adamts18 mRNA主要表达于肺发育的胚胎期（Embryonic,E9.5-E12.5）和假腺管期（E12.5-E16.5）,由气道远端上皮表达,胚胎期双侧肺尖的基质细胞中也可见Adamts18 mRNA的表达;到囊泡期（E17.5-P5）其在远端上皮的表达量明显降低,肺泡发育期（Postnatal,P5-P21）及成年后几乎检测不到Adamts18的表达。2)经解剖形态学比较,Adamts18-/-小鼠在E14.5天和12周龄时,双侧肺尖部位尖锐,明显区别于Adamts18+/+鼠肺的圆钝外观。3)E11.5的胎肺经体外培养后,与Adamts18+/+小鼠相比,Adamts18-/-小鼠肺支气管数目显着减少(Adamts18+/+vs.Adamts18-/-:48h,35.50±0.50 vs.25.00±2.08,P<0.05*;72h,56.50±2.50 vs.41.00±1.16,P<0.05*),支气管长度变短;成年后的Adamts18-/-小鼠支气管数目也比正常小鼠少。4)肺泡发育成熟后,Adamts18-/-小鼠的肺泡腔扩张,放射状肺泡数减少,弹性纤维在肺泡壁上大量沉积,而肺功能的压力、容积和流速各项指标均正常。5)在急性肺损伤模型中,Adamts18-/-小鼠损伤更严重,表现出更多的肺泡隔、肺泡腔充血;在肺纤维化模型中,与Adamts18+/+小鼠相比,Adamts18-/-小鼠的生存率显着降低,肺组织结构破坏更严重,并在组织切片上表现出大面积的胶原沉积及炎性细胞浸润;而在成年时期已经几乎不表达的Adamts18 mRNA在这两种损伤模型中也未见表达。6)与气道分支相关的主要分子包括Fgf10,Wnt2,Bmp4,Hhip,Ptch1和Ext1的表达在Adamts18-/-小鼠胎肺组织中未见显着改变,而Fgfr2,Shh的转录水平在Adamts18-/-小鼠中显着升高。7)蛋白质组学结果显示,在E14.5天的Adamts18-/-小鼠肺组织中,构成微纤维（microfibrils）的原纤蛋白1和2（fibrillin1,2）在Adamts18-/-小鼠中的表达水平均显着升高,多个与细胞骨架组装相关的蛋白也发生了显着改变;TEM结果显示Adamts18-/-小鼠上皮和间质之间可见microfibrils沉积。8)细胞免疫荧光结果证明ADAMTS18蛋白与fibrillin1蛋白共定位,Co-IP实验结果表明fibrillin1可以与ADAMTS18共沉淀,Elisa结果显示重组ADAMTS18-C901-1187片段与fibrillin1的N端结合力较强。9)在体外肺培养体系中,通过添加400 ng/ml的抗fibrillin1抗体减少fibrillin1的量,可以挽救在Adamts18-/-小鼠支气管发育不良的表型;10)信号通路研究发现,Adamts18-/-小鼠肺上皮细胞的局部粘着斑激酶（Focal adhesion kinase,FAK）磷酸化信号减弱,纤维型肌动蛋白（Filamentous actin,F-actin）细胞骨架组装异常,细胞迁移实验说明Adamts18缺失的小鼠胚胎成纤维细胞迁移能力降低。综上所述,ADAMTS18由气道上皮细胞分泌,通过作用于fibrillin1,影响microfibrils在细胞外基质的分布,ADAMTS18缺失导致fibrillin1和fibrillin2表达量升高,microfibrils在气道的上皮和间质之间异常沉积,抑制了上皮内FAK的磷酸化,导致细胞骨架无法正常组装,从而影响上皮细胞的迁移,最终导致支气管分支异常。本研究首次证实ADAMTS18蛋白可通过影响原纤蛋白代谢来调控早期肺脏支气管发育,这不仅有助于拓展肺脏发育的新机制,也有可能为早期肺发育异常相关性疾病的临床诊断治疗提供新视角和新的分子靶点。
姬晓彤[2]（2019）在《PM2.5吸入暴露诱导肺损伤及其分子机制》文中提出由于我国经济的高速发展以及城市化的加剧,发达国家所经历的不同工业发展阶段的大气污染问题在我国以压缩的方式同时集中显现。污染情况最为突出的便是近年来频发的雾霾事件,其强度高、持续时间长且涉及区域广。我国大气细颗粒物(PM2.5)来源与成因十分复杂,其毒性组分和毒理学机制尚不清楚,国外的研究模式与结果解析不能很好的适用于我国PM2.5的污染情况。因此,结合我国大气雾霾的特点,开展大气细颗粒物的健康危害与分子机制研究,将有助于理解我国雾霾对人群健康的危害,从而推动我国环境污染与健康研究的发展。为此本课题拟首先基于表观遗传调控探讨PM2.5与气态污染物SO2、NO2复合暴露对肺损伤的影响,在此基础上,针对PM2.5研究不同生命阶段小鼠对PM2.5的易感性,并针对易感性最强的小鼠探究PM2.5暴露后的恢复效应,最后,建立PM2.5孕期暴露模型,探讨PM2.5孕期暴露对子代小鼠肺发育的影响,综合评估大气污染诱发肺损伤的毒性效应及分子机制。1、大气污染物在慢性阻塞性肺疾病（COPD）的发生发展中起重要作用,且肺动脉高压（PH）是COPD常见的临床表征。然而,大量实验研究主要集中在单一污染物的健康危害效应而忽视了其复合污染的毒性效应。在本研究中,我们将C57BL/6小鼠随机分为三组:对照组（隔天吸入生理盐水,每天吸入洁净空气）,低浓度组(隔天吸入1 mg/kg体重PM2.5,每天动力学吸入0.5 mg/m3 SO2和0.2 mg/m3 NO2（6 h/d）)和高浓度组(隔天吸入3 mg/kg体重PM2.5,每天动力学吸入3.5 mg/m3 SO2和2 mg/m3NO2（6 h/d）)。4周暴露结束后,采用Anires2005系统检测子鼠肺功能（第0.1秒用力呼气肺活量（FEV0.1）/用力肺活量（FVC））,并通过苏木精-伊红（HE）染色以及透射电子显微镜（TEM）观察肺组织病理学以及超微改变。在此基础上,利用过免疫印迹技术检测肺动脉高压标志因子（内皮素-1（ET-1）和内皮一氧化氮合酶（eNOS））的表达。随后,利用microRNAs（miRNAs）芯片筛查以及实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术考察miRNA表达谱的变化,同时利用双荧光素酶报告基因考察差异miRNA对靶基因的调控。结果表明,PM2.5与SO2、NO2复合暴露能够引起小鼠呼吸道气流受限,组织病理学和超微结构改变,且能够改变ET-1和eNOS的表达,表明复合暴露能够引起小鼠肺动脉高压样损伤。miRNA基因芯片结果显示有三个人源的MicroRNA（miR-338-5p、miR-450b-3p和miR-142-5p）发生显着变化,且功能,增加了BALF中总细胞和巨噬细胞的数目,且增加了巨噬细胞中颗粒物负载。另外,这些变化在暴露结束1周后逐渐恢复到了正常水平。然而,肺泡中的颗粒物负载在恢复2周后仍然存在。PM2.5暴露4周显着改变了H3K27ac以及调控其表达的相关酶（组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC））的水平。同时,ChIP-seq结果表明PM2.5暴露诱导的与H3K27ac结合发生改变的基因主要参与了免疫系统过程、趋化因子信号通路,其中信号转导和转录激活因子2（Stat2）和乳腺癌抗雌激素耐药基因（Bcar1）是其中两个重要的基因。另外,PM2.5暴露4周显着影响了促炎因子以及趋化因子的表达,而这些改变在暴露2周后恢复到正常水平。综上所述,目前的研究表明PM2.5暴露4周后引起的肺功能下降和由组蛋白修饰介导的炎性因子上升可以在2周内恢复。然而,肺泡中持续性颗粒负载可能是肺部疾病的长期潜在风险。4、前期建立的多种颗粒物暴露模型已经证实了颗粒物本体暴露与呼吸系统损伤的相关性。然而,颗粒物污染对呼吸系统健康的影响起始于胎儿期,孕期PM2.5暴露能够增加子代后期罹患呼吸系统疾病的风险,且关于孕期PM2.5暴露与子代肺发育的相关性研究还鲜有报道。本研究的目的为考察孕期PM2.5暴露是否会引起子代支气管肺发育不良（BPD）的症状,如果是,这些不良影响能否随着后期的发育逐渐恢复。本研究建立了PM2.5孕期暴露模型,即将妊娠期小鼠从妊娠期第一天开始隔天通过鼻腔闭气经口法吸入PM2.5（3 mg/kg体重）直到妊娠结束。在胚胎期18.5天（E18.5）,取母鼠胎盘和肺组织,分析胎盘重金属含量以及母鼠肺组织和胎盘组织中的炎性因子表达。在子代小鼠出生后,分别在1、7、14、21天处死子鼠,取肺组织通过HE染色分析其肺泡化,通过免疫荧光染色、western blot以及RT-PCR分析肺血管发育,通过免疫组化、TEM以及RT-PCR考察分泌功能发育,同时通过RT-PCR考察肺组织炎性的表达。最后,通过Anires2005系统检测子鼠肺功能（FEV0.1、FVC）。结果表明,孕期PM2.5暴露能够造成胎盘中Pb和Mn的含量升高,并引起母鼠肺组织和胎盘组织炎性反应。另外,孕期PM2.5暴露引起子代小鼠典型的BPD症状,包括低肺泡化,血管生成减少,分泌蛋白和表面活性蛋白的表达受到抑制,以及炎性因子水平升高,且雄性子鼠比雌性子鼠更为敏感。然而,这些改变随着子鼠发育逐渐恢复到正常水平。本论文首先基于miRNA表观调控,探讨了PM2.5与气态污染物复合暴露诱导肺损伤的分子机制;在此基础上,针对PM2.5建立不同生命阶段暴露模型,阐明不同生命阶段肺损伤易感性;随后,针对易感性最明显的中老年小鼠建立PM2.5暴露与恢复模型,从组蛋白修饰角度研究PM2.5暴露诱导中老年小鼠肺损伤的恢复效应与机制;最后,基于成人疾病胎源说,建立PM2.5孕期暴露模型,阐明其对子代小鼠肺发育的影响,从根源上明确成年后期疾病易感性增加的原因。本研究建立了多种暴露模型,利用了多种表观遗传机制,多角度多维度地研究了大气污染对呼吸系统的损伤效应及分子机制,为我国环境污染与健康领域研究的发展提供了科学依据。
王军,高琳琳,刘晓梅[3]（2018）在《血管生成因子对先天性食管闭锁大鼠肺发育的影响》文中提出目的研究血管生成因子Efnb2和Ephb4在先天性食管闭锁并食管气管瘘（esophageal atresia and tracheoesophageal fistula,EA-TEF）大鼠肺组织中的表达情况,探讨血管调控因子Efnb2及其受体Ephb4对EA-TEF大鼠肺组织发育的影响。方法 24只雌性Wistar大鼠随机分成实验组（EA-TEF组）和对照组（CON组）,每组各12只,妊娠第7～9天实验组给予阿霉素1.75 mg/kg腹腔灌注建立EA-TEF大鼠模型,分别在胚胎第15天（E15）、18天（E18）和21天（E21）剖宫产取胎鼠肺组织,采用Q-PCR和免疫组织化学检测Efnb2、Ephb4的表达情况。结果 （1）两组胎鼠肺发育过程中Efnb2 mRNA与Ephb4的变化趋势基本一致,小管期（E18）含量最高,囊泡期（E21）降低并恢复至假腺体期（E15）水平。胎肺小管期Efnb2 mRNA表达水平EA-TEF组（50.65±12.65）明显高于对照组（23.63±11.31）（P<0.05）,假腺体期和囊泡期两组比较无统计学意义;假腺体期Ephb4 mRNA表达水平EA-TEF组（4.32±2.88）明显高于对照组（1.01±0.19）（P<0.05）,小管期和囊泡期两组无统计学意义。（2）胎肺不同发育时期,Efnb2、Ephb4蛋白在血管上皮、肺泡及支气管上皮表面均有表达,分布模式无统计学意义。EA-TEF组小管期Efnb2（162.70±10.04）和Ephb4（152.20±12.32）蛋白表达量增多,而囊泡期回复至正常水平。结论血管生成因子Efnb2及其受体Ephb4可调控胎肺组织的分支发育,阿霉素诱导的EA-TEF模型鼠胎肺发育小管期两者同时升高可能是对肺发育不良的代偿机制。
李淑君[4]（2018）在《miR-431经TGF-β/SMAD4通路调节肺泡表面活性物质合成的机制研究》文中认为目的:1.筛选肺发育期大鼠胎肺组织差异表达的miRNA分子。2.探讨miR-431是否通过TGF-β/SMAD4信号通路参与调控人肺泡Ⅱ型上皮细胞合成肺泡表面活性物质。方法:1.采用miRNA微芯片技术,分析比较大鼠肺发育中的三个时间点孕16天（E16组）、19天（E19组）和21天（E21组）胎肺组织,筛选出差异表达的miRNA分子（miR-431）.2.利用miR-431-5p的类似物和抑制物转染细胞,采用qRT-PCR和WB检测miR-431-5p 对 SP-A、SP-B、SP-C 和 SP-D 表达的调控。3.通过TargetScan软件预测miR-431的靶基因,并利用miRBase和TargetScan软件,比较miRNA-431和SMAD4的序列在不同物种间的变化情况。4.运用双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和WB验证miR-431-5p下调SPs表达的靶基因。5.利用CCK8、流式细胞仪分别检测miR-431-5p对A549细胞的增殖和凋亡的影响。结果:1.miR-431在miRNA微芯片结果中下降显着通过miRNA芯片分析比较孕16、19、21天三组胎肺组织,发现miR-431的表达在三组间[E16→E19→E21]连续下降。同时,qRT-PCR验证了该结果。qRT-PCR结果显示在E16、E19、E21组间miR-431的表达持续下调,下降趋势均有统计学意义。2.miR-431-5p能够下调SPs的表达我们进一步通过miR-431-5p的类似物mimic和抑制物inhibitor转染A549细胞,qRT-PCR和WB结果表明,miR-431-5p过表达能够下调SP-A、SP-B、SP-C和SP-D的表达。由上述结果可见,miR-431-5p可能通过下调SPs的表达参与调控PS的代谢。3.miR-431通过结合SMAD4的3’-UTR抑制SMAD4的表达生物信息学分析软件结果显示,SMAD4序列中“CGUUCUG”碱基序列和miR-431上的“CGUUCUG”序列相匹配,miR-431和SMAD4在进化上高度保守。双荧光素酶报告基因、qRT-PCR和WB实验证实,miR-431-5p通过结合SMAD4 3’-UTR的结合位点,从而下调SMAD4的表达。并且miR-431-5p在转录水平和转录后水平均可调控SMAD4的表达。4.miR-431-5p促进A549的增殖,抑制其凋亡CCK8结果显示相比mimic NC组,miR-431-5p mimic组A549的增殖速度明显增快;相比inhibitor NC组,miR-431-5p inhibitor组细胞增殖速度显着减慢。流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示mimic组细胞总凋亡率均低于mimic NC组,而inhibitor组无明显差异。结论miR-431在发育期的胎肺组织中表达稳定下调。miR-431-5p作为内源性的调节因子作用于肺泡上皮,促进A549细胞的增殖,可能通过负性调控TGF-β/SMAD4信号通路,从而介导SPs的表达下调。miR-431-5p表达调控为肺发育、肺损伤性疾病提供新的干预靶点以及理论学说。
贡永健[5]（2018）在《miRNA-20a-5p对肺表面活性物质相关蛋白表达的调控作用及其机制研究》文中提出新生儿呼吸窘迫综合征（respiratory distress syndrome,RDS）是由于肺泡II型上皮细胞（alveolar type II cells,AT-II）合成肺表面活性物质（pulmonary surfactant,PS）不足所导致的早产儿特发疾病,表现为新生儿出生不久即出现的进行性呼吸窘迫和呼吸衰竭,具有很高的发病率和病死率,严重影响新生儿的生存质量及预后。本文主要目的是研究新生儿呼吸窘迫综合征的发生机制,探索PS的合成过程,并期望为该疾病的防治提供新的干预靶点。文献表明,PS的合成及分泌受到多种因素的影响与调节,其中,MicroRNAs（miRNAs）的作用越来越受到关注。miR-20a-5p是课题组前期通过基因芯片技术筛选出来的一条miRNA,芯片结果显示miR-20a-5p在胎鼠肺发育过程中随胎龄增加逐渐下调。另外,芯片结果也显示其在RDS患儿与对照患儿外周血中差异表达,RDS患儿的miR-20a-5p显着下调。因此我们推测miR-20a-5p可能在肺发育及RDS的发生发展过程中发挥一定作用。本研究分两个部分,第一部分通过实时定量PCR验证miR-20a-5p的差异表达,并对其进行生物信息学分析,了解其基本生物特征。第二部分在胎鼠肺泡II型上皮细胞中探讨miR-20a-5p对PS表达的调控作用及其机制。第一部分miR-20a-5p的差异表达及基本生物特征目的:了解miR-20a-5p在胎鼠肺发育过程及其RDS患儿血浆中的表达,对miR-20a-5p进行生物信息学分析,为探讨miR-20a-5p在肺发育中的生物学功能提供理论依据。方法:通过实时定量PCR检测miR-20a-5p在孕16、19、21天胎鼠肺组织,以及在RDS患儿和对照患儿血浆中的表达;采用miRBase检索miR-20a-5p的序列特征,分析其物种保守性;运用Targetscan等数据库进行其靶基因预测,并通过DAVID数据库对其靶基因进行GO（功能富集）及pathway分析（信号通路分析）。结果:miR-20a-5p在孕16、19、21天胎鼠肺组织中的表达水平逐渐下降;与对照患儿相比,miR-20a-5p在RDS患儿血浆中表达下调;miR-20a-5p的序列在多物种间高度保守,其靶基因存在于各个细胞组分中,其功能包括转录调控、蛋白质修饰、细胞增殖、凋亡、分化以及激酶活性调节等,信号通路显着富集于PI3K-Akt、MAPK、TGF-b等信号通路。结论:miR-20a-5p在肺发育过程中差异表达,并可能参与RDS的发生发展,为其在肺发育相关的生物学功能及调控机制的研究提供理论依据及实验基础。第二部分mi R-20a-5p对肺泡上皮细胞肺表面活性物质相关蛋白表达的调控作用与机制目的:Micro RNA（mi RNA）在许多生物过程中调控基因的表达,包括肺发育和肺表面活性物质的生物合成。本研究旨在探索mi R-20a-5p在肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar type II cells,AT-II）对肺表面活性物质表达的调控作用及机制。方法:从孕19天大鼠胎鼠的肺组织中分离、纯化AT-II进行培养,将构建的过表达、沉默mi R-20a-5p以及阴性对照的腺病毒转入原代细胞,通过荧光显微镜观察病毒载体携带的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的荧光判断转染效率,通过实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR,q PCR）检测mi R-20a-5p的表达水平。采用CCK-8试剂法检测AT-II的增殖情况,通过q PCR和Western blot检测肺表面活性物质相关蛋白（surfactant associated proteins,SPs）和同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog,PTEN）的表达情况。结果:转染过表达mi R-20a-5p腺病毒48h后,可见90%以上的AT-II表达GFP,过表达组mi R-20a-5p的表达水平较阴性对照组（NC）明显上调（P<0.05）。q PCR和Western blot的结果显示过表达组SPs（SP-A,SP-B,SP-C,SP-D）的m RNA和蛋白的表达均升高（P<0.05）,而PTEN的表达下降（P<0.05）。沉默mi R-20a-5p后,与NC组相比,沉默组SPs的表达下降（P<0.05）,PTEN的表达升高（P<0.05）。无论过表达组还是沉默组,细胞的增殖情况无明显变化（P>0.05）。结论:mi R-20a-5p在AT-Ⅱ细胞的增殖中不起作用,但对肺表面活性物质相关蛋白的基因表达具有调控作用,这种调控作用可能是通过调节靶基因PTEN的表达来实现的。
蒋琴[6]（2018）在《汉防己甲素对除草醚诱导膈疝大鼠模型胎肺中Krüppell样因子5及生存素表达的影响》文中研究表明目的:研究汉防己甲素（Tetrandrine,TET）对先天性膈疝（Congenital diaphragmatic hernia,CDH）大鼠模型胎仔肺内Krüppell样因子5（KLF5）和生存素（Survivin）表达的影响。方法:采用简单随机分组法,11只SD雌性大鼠配种成功后随机分为3组:正常空白组（NC,3只）、膈疝组（MC,4只）、膈疝TET干预组（MT,4只）。膈疝组和膈疝TET干预组在孕9.5 d给予除草醚（Nitrofen）125 mg/只（溶于2ml橄榄油中）灌胃,正常空白对照组给与2ml橄榄油灌胃;膈疝TET干预组在孕18.5、19.5、20.5 d连续3天给予30 mg/kg TET灌胃,正常空白组和膈疝组给与等量生理盐水灌胃;孕21.5 d对孕鼠剖宫产取胎鼠,观察三组胎鼠膈疝形成情况,记录肺重与体重比（Lw/Bw）,苏木精-伊红（HE）染色观察各组胎肺发育情况,行免疫组化染色定性分析各组胎肺中KLF5、Survivin的表达,Western blotting法定量检测各组胎肺中KLF5、Survivin蛋白的表达。单因素方差分析用于比较三组数据的组间差异,卡方检验用于比较组间致畸率的差异。结果:膈疝组和膈疝TET组膈疝致畸率分别为56.1%（37/66）、50.0%（28/56）,组间差异有统计学意义（χ2=122.00,P<0.05）。正常空白组、膈疝组、膈疝TET干预组三组Lw/Bw差异无统计学意义（F=0.98,P=0.376）。HE染色显示膈疝组肺血管及肺泡发育相关指标均较正常空白组差,膈疝TET干预组则介于正常空白与膈疝组之间。免疫组化显示KLF5在正常空白组、膈疝组、膈疝TET干预组三组的阳性颗粒平均光密度值分别为0.1948±0.0074、0.2121±0.0049、0.1927±0.0019,组间差异有统计学意义（F=14.53,P=0.002）;Survivin在三组的阳性颗粒平均光密度值分别为0.1852±0.0087、0.2092±0.0036、0.1928±0.0075,组间差异有统计学意义（F=12.31,P=0.003）。KLF5与Survivin阳性颗粒平均光密度间呈正相关（r=0.993,P=0.039）。Western blotting结果显示KLF5和Survivin在3组胎鼠肺组织中表达差异均有统计学意义（F=4.29、10.13,均P<0.05）。结论:Nitrofen诱导的大鼠CDH动物模型可模拟人膈疝发病过程,产前给予TET灌胃促进胎鼠肺实质和血管发育,可下调KLF5、Survivin在胎肺中的表达,这可能是TET改善CDH肺发育不良的机制。
覃君慧[7]（2017）在《肿瘤转移相关蛋白MTA1在肺泡毛细血管成熟中的作用研究》文中研究说明肿瘤转移相关蛋白（Metastasis-associated proteins,MTAs）是核小体重塑并脱乙酰化复合物（Nucleosome remodeling and histone deacetylase,NuRD）的重要组份。该家族主要成员包括MTA1、MTA2和MTA3,分别由三个定位于不同染色体的基因编码,并通过NuRD依赖或非依赖的方式来调节靶基因的表达,发挥生物学效应。MTA1是此家族中发现最早和研究最多的分子。近年来大量研究表明,MTA家族在多种人类恶性肿瘤中高表达,且参与肿瘤的发生、发展和转移,调控众多细胞内信号途径。然而,MTA家族成员在正常细胞和组织中也广泛表达,尤其在脑、肺、睾丸等组织中高表达,其表达水平影响细胞诸多基本生理功能。我们前期研究发现,MTA1敲除小鼠出生后一周内有超过1/3仔鼠死亡,死亡仔鼠肺泡间隔毛细血管发育表现出明显异常,提示MTA1在肺的发育成熟过程中具有重要作用,但具体机制仍不明确。低氧（Hypoxia）是所有实体瘤的重要模式,能够促进肿瘤血管生成、侵袭和转移。低氧诱导因子1（Hypoxia inducible factor-1,HIF-1）是一种低氧应答转录因子,由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成,在调节血管发育、正常肺泡的发育、防止肺泡损伤以及促进肺损伤后肺泡再生上发挥重要作用。HIF-1α的含量受氧分压调控,并在正常氧条件下迅速降解。氧分压和血管生成是肺发育的关键调控环节,而细胞内HIF-1α是血管生成过程中对有效氧分减少做出稳态应答的主要转录因子。肺部毛细血管发育是正常肺泡发育的先决条件,是一个复杂、多步骤、受一系列血管发育相关因子严格调控的过程。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在血管生成和血管通透性调控方面发挥关键性的作用,其主要作用于血管形成早期,促进原始血管网形成。VEGF在肺部高表达,且参与稳态的形成与调控,在胚胎发育过程中,肺VEGF的水平对肺部形成至关重要。既往研究显示,肺毛细血管发育障碍会导致微循环发生障碍,致肺血流阻力增加,促使肺动脉高压发生、发展,进而导致支气管肺发育不良（Bronchopulmonory dysplasia,BPD）、肺气肿和呼吸窘迫综合征（Respiratory distress syndrome,RDS）等不良肺部疾病发生。最近研究表明,MTA1与肿瘤血管形成（Angiogenesis）显着相关,且通过调控HIF-1α促进血管形成。MTA1通过HDAC1招募介导HIF-1α乙酰化,从而增强HIF-1α稳定性;MTA1还可通过增强HIF-1α转录活性提高VEGF表达,促进肿瘤血管生成;而VEGF转录受到HIF-1α的调控。这些结果提示MTA1是一种活跃的血管生成调节因子,通过与HIF-1α直接相互作用,使HIF-1α乙酰化,并在稳定HIF-1α方面发挥重要作用。因此,MTA1、HIF-1α、VEGF及其受体在血管发生和血管形成过程中发挥重要作用。研究目的:以MTA1敲除小鼠为研究对象,深入了解MTA1在肺毛细血管发育过程中的作用,并从组织和分子水平着力阐明MTA1敲除对小鼠肺部发育的具体影响和相关分子机制。研究方法:1.采用Western blot,定量PCR和免疫组化染色检测了MTA1在小鼠的组织分布和肺发育过程中动态变化;通过出生后死亡分析和体重监测等,确定MTA1敲除对小鼠出生后存活率,体重变化等发育情况的影响;通过对MTA1敲除小鼠肺组织发育形态学进行研究,确定MTA1缺失对小鼠存活情况以及肺发育的影响。2.分析2月龄野生型和MTA1敲除小鼠的心脏组织,以及心肌细胞横截面积;利用免疫组化分析肺动脉壁α-SMA的表达水平。分别采用Heme染色和电镜等方法和技术,确定MTA1缺失对小鼠肺泡壁毛细血管发育和成熟的影响;通过免疫组织化学染色、定量PCR和Western blot等方法,分析CD31、CD34、ERG、HIF-1α和VEGF等在野生型和MTA1敲除胎鼠（E18.5）和2月龄成年小鼠肺组织中的表达情况,明确MTA1在小鼠肺毛细血管形成和成熟过程中的作用。3.用携带过表达MTA1或MTA1特异性si RNA重组质粒转染细胞,采用Real-time PCR和Western blot等方法检测MTA1和HIF-1α、VEGF表达变化,进一步探讨MTA1对肺部毛细血管床发育调控的分子机制。研究结果:1.MTA1缺失导致小鼠生存率降低且发育迟缓。Western blot结果显示,MTA1在成年小鼠睾丸、卵巢、肾脏、肺、肝和乳腺组织中表达水平均较高;同时免疫组化、Real-time PCR和Western blot结果显示,MTA1在各个发育阶段的小鼠肺组织中均有表达,且在E16.5小鼠肺组织中表达最丰富,出生后肺部MTA1表达水平逐渐降低,2月龄小鼠肺组织中表达最少。对E18.5和出生后7天小鼠生存情况分析显示,MTA1敲除小鼠出生后7天内有超过1/3仔鼠死亡,死亡仔鼠肺泡间隔毛细血管发育有明显异常。此外,存活的MTA1敲除小鼠体重增加速度明显降低。这些结果表明,MTA1缺失能够增加小鼠出生后死亡率和减缓发育速度。组织学分析的结果显示,MTA1敲除小鼠的肺在E18.5天、出生后1天和出生后2月均具有明显的发育异常,表现为肺泡壁增厚,细胞数量增加等。这些结果提示,MTA1可能参与小鼠肺发育和成熟过程。2.MTA1缺失导致小鼠肺泡间隔毛细血管发育阻滞和肺动脉高压。对2月龄MTA1敲除小鼠的研究发现,与野生型组小鼠对比,MTA1敲除小鼠心脏体积明显增加,且心脏重量与体重之比（HW/BW）明显升高。对心肌细胞横截面积进行分析,结果显示MTA1敲除小鼠右心室壁细胞的横截面积显着高于野生型小鼠（P<0.05）,表明MTA1缺失导致小鼠右心心肌肥大。通过HE染色、Heme染色以及透射电镜等技术,观察不同发育阶段MTA1敲除小鼠肺泡间隔毛细血管的形态学变化。免疫组化结果显示,MTA1敲除并未明显影响肺泡壁CD31和CD34阳性细胞的数量,但ERG阳性细胞数量明显增多,且Heme染色和电镜结果显示MTA1缺失小鼠肺泡壁中开放的毛细血管数量和血管内红细胞的数量均显着减少。这些结果表明,MTA1缺失导致小鼠肺泡间隔成熟的毛细血管数量明显减少,提示MTA1参与肺泡间隔毛细血管床发育和成熟进程。3.MTA1通过稳定HIF-1α调控肺部毛细血管发育。为了进一步证实MTA1缺失对肺泡毛细血管发育的主要机制,我们先采用免疫组化染色、Real-time PCR和Western blot方法检测了E18.5天野生型和MTA1敲除小鼠肺组织中HIF-1α和VEGF的表达情况。结果显示,在E18.5天MTA1敲除小鼠肺组织中HIF-1α和VEGF的表达均显着低于野生型小鼠。在此基础上,我们在293T细胞和小鼠MLE-12细胞中过表达MTA1和在293T细胞中沉默MTA1,观察对血管生成相关因子的影响。Real-time PCR和Western blot结果显示,过表达MTA1能够提高细胞内HIF-1α和VEGF的蛋白和mRNA水平,而沉默MTA1能够显着下调HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白水平。这些结果提示MTA1能够稳定细胞内HIF-1α水平,参与调控肺泡毛细血管的成熟。结论:MTA1通过稳定细胞内HIF-1α,影响VEGF等关键分子表达,参与调控小鼠肺泡毛细血管床的发育成熟过程。MTA1缺失导致小鼠肺泡毛细血管成熟异常,造成肺动脉高压和心肌肥厚,导致出生后死亡。本研究结果为认识MTA1的生理功能提供了实验依据,也为认识肺泡毛细血管的发育和成熟提供研究基础。
周志涛[8]（2012）在《VCC-1蛋白在肝癌中的表达及其影响肝癌细胞凋亡的研究》文中研究说明趋化因子是具有多种生物学功能的小分子生物活性肽家族,相对分子量为8～10KD,由组织细胞的生长因子,炎性细胞的细胞因子和致病刺激物诱导产生。趋化因子能够引起细胞的定向迁移,在肿瘤的发生、发展中起重要作用。趋化因子能够引起肿瘤细胞的扩散,淋巴细胞对肿瘤的浸润和肿瘤的血管发生。趋化因子的命名是由趋化性细胞因子衍生的。这些机能相关的小分泌蛋白构成的大家族迄今发现的成员已逾60个,都具有高度保守的氨基端半胱氨酸（Cysteine,C）残基。趋化因子在结构特征上具有保守的蛋白结构,称为趋化因子支架（Chemokine Scaffold）,由两个保守的二硫键链接的半胱氨酸残基组成。依其分子结构中靠近氨基端的最初两个半胱氨酸残基排列顺序,趋化因子蛋白被分为4个高保守的亚家族：CXC族、CC族、C族、CX3C族,其中以CXC和CC族趋化因子种类居多。VCC-1是新发现的趋化因子,位于染色体的19q13.2,属于趋化因子家族,能够对肿瘤演进的未知领域进行预测。这一基因的蛋白产物编码119个氨基酸,前22个氨基酸构成信号肽,蛋白含有6个半胱氨酸残基,其中4个残基分别位于2个CXC结构域中,目前列为CXCL趋化因子17。研究发现在乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌中VEGF的表达上调与这一基因密切相关。在内皮细胞的血管形成时期该基因的表达上调。高表达该基因的NIH3T3细胞移植到裸鼠中的能迅速成瘤,而注射接种空载体的NIH3T3细胞的对照组没有瘤形成。Northen Blot方法研究发现该基因的表达水平在乳腺癌、结肠癌中升高。VCC-1基因编码的蛋白具有IL-8样趋化因子的蛋白折叠结构,与趋化因子CXCL8和CXCL14的结构和功能类似,能够诱导单核细胞和未成熟树突状细胞迁移。该蛋白的免疫组化研究表明VCC-1在肺组织中有组成型表达,提示VCC-1蛋白的潜在作用是诱导单核细胞和树突状细胞从血液进入肺实质。肿瘤的生长和转移是一个复杂的、连续的、多阶段的过程,并表现出高度的组织特异性,非任意性和器官选择性。能够生长和转移到特定器官的恶性肿瘤细胞均具有多种机制促进它们侵袭组织和增强生长繁殖能力,包括增强它们粘附到器官微血管内皮细胞的能力、对靶器官释放的趋化因子呈高反应状态等,而靶器官必须拥有适当的趋化因子才能使肿瘤细胞成功地进入,并生长繁殖。在早期研究中发现,许多恶性肿瘤,如结肠癌、肺癌、乳癌和肾癌等,都有宿主免疫细胞的侵润,主要是单个核细胞系细胞,进一步研究发现了能特异性诱导单个核细胞定向迁移的“肿瘤源性趋化因子”,并发现肿瘤源性趋化因子的产生与肿瘤组织中巨噬细胞的含量有关。趋化因子及趋化因子受体是引起细胞致瘤转化的遗传突变作用的下游；趋化因子及其受体也参与组成慢性炎症,这类慢性炎症容易转化为癌。趋化因子及趋化因子受体组成的趋化因子系统,会影响一个细胞的自发的或非自发的进行性肿瘤的多重通路。临床研究显示趋化因子系统是有效的标靶是新的治疗策略的标靶。趋化因子及其受体构成一个信号因子超家族,能够对肿瘤演进的未知领域进行预测。肝癌IL-8表达水平与肝癌血管侵袭相关。IL-8.MCP-1、MIP-1α与恶性肿瘤的病程进展、预后相关,是反映恶性肿瘤发生发展、生物学行为和预后的重要标记物。肿瘤细胞的凋亡、细胞周期的进展与其生长、化学治疗的敏感性存在着密切联系。肿瘤的体外实验是进行肿瘤基础研究的一种重要方法,在肿瘤的分子生物学和分子病理学研究方面发挥不可替代的作用。尽管体外环境和体内环境不完全相同,但由于肿瘤细胞株具有体内肿瘤细胞的大部分生理病理特征,因而体外细胞实验与人体肿瘤有很好的相关性,可以动态观察肿瘤细胞的生长、侵袭、转移等过程；长期传代可以观察肿瘤的遗传学行为；可以进行抗癌药物的快速筛选,便于进行抗癌剂、致癌剂和诱变剂等多方面研究。VCC-1作为一个与VEGF相关的趋化因子,研究显示其在血管形成中扮演了重要角色,而且可能在一些组织的肿瘤发生及免疫调节中具有重要作用。目前国内外对于这个新基因的相关研究报道还很少,还有很多疑问没有解决。比如,能否将它命名为癌基因；它在肿瘤中发挥什么作用以及怎么样作用；能否作为肿瘤的诊断、预后指标等等。真核细胞可以提供重组的哺乳动物基因一个仿真的环境,使得基因产物更接近自然状态,更有利于研究其生理功能,一些源于真核细胞的基因只有在真核细胞中的表达产物才有特定的生理活性,基于此,我们以该基因对肝癌细胞系生物学影响为切入点,将VCC-1片段克隆入真核表达载体,转染肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721细胞,观察这一基因对肿瘤细胞增殖、侵袭及凋亡的影响,并且利用siRNA技术,在癌细胞中抑制VCC-1蛋白的表达,观察干涉后细胞生物学特性的改变,从多个角度对假设的功能进行进一步了解和验证。最终了解本基因编码蛋白的生物学功能,并初步探讨其发挥作用的机制,从而为全面研究VCC-1的功能及在肿瘤中的分子作用机制提供新的思路和重要实验依据,探讨该蛋白可否对肝癌的诊断、治疗及预后提供一定的信息,可否成为新的靶标。本课题在上述研究框架内,重点阐述癌组织中VCC-1表达及其与临床病理特性的相关性；VCC-1表达改变对肝癌细胞细胞增殖、迁移和凋亡的影响；探索VCC-1表达在肝癌凋亡改变的分子机制。研究内容及方法1.肝细胞癌患者癌组织、癌旁组织中VCC-1表达检测采用免疫组化技术检测临床诊断明确的肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织中VCC-1蛋白表达水平的差异,并检测不同病理学分期肝细胞癌患者癌组织中VCC-1蛋白表达差异。同时检测临床常见恶性肿瘤患者癌组织和癌旁组织中VCC-1蛋白表达水平的差异。采用商品化的VCC-1单克隆抗体对肿瘤进行免疫组化染色,实验设置无关抗体对照和PBS对照,染色结果经有经验的病理科医生在不知随访结果条件下分别对各项指标进行光镜下观察,对免疫组织化学染色结果进行评价。2.上调VCC-1基因对肝癌细胞凋亡的影响。2.1采用用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-VCC-1分别转染入肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721,采用RT-PCR、Western Blot及免疫荧光染色,对VCC-1基因的表达改变进行分析以及VCC-1蛋白在细胞内表达定位。2.2采用MTT法检测转染过表达载体后细胞的增殖情况,绘制生长曲线,未转染的细胞及转染相应空载体的细胞做为对照；采用transwell小室法观察上调VCC-1基因对肝癌细胞侵袭的影响。2.3采用流式细胞术检测不同浓度顺铂作用下的细胞凋亡,计算细胞凋亡率,与未转染的细胞及转染相应空载体的细胞相比较；在形态水平鉴定各组细胞的凋亡改变。2.4采用Western Blotting技术观察上调VCC-1基因对人肝癌细胞在顺铂诱导条件下,凋亡相关蛋白表达水平的差异性。3.下调VCC-1基因的相关实验3.1采用脂质体法将重组质粒pGPU6/GFP/Neo-shVCC-1转染人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721,采用RT-PCR、Western Blot及免疫荧光染色,对VCC-1基因的表达改变进行分析。3.2采用MTT法检测转染过表达载体后细胞的增殖情况,绘制生长曲线,未转染的细胞及转染相应空载体的细胞做为对照；采用transwell小室法观察VCC-1在肝癌细胞转移方面的效应。3.3采用流式细胞术检测不同浓度顺铂作用下的细胞凋亡,计算细胞凋亡率,与未转染的细胞及转染相应空载体的细胞相比较；在形态水平鉴定各组细胞的凋亡改变。3.4采用Western Blotting技术观察下调VCC-1基因的人肝癌细胞在顺铂诱导条件下,凋亡相关蛋白表达水平的差异性。结果：1.VCC-1蛋白在肿瘤组织肿瘤组织中的表达1.1肝癌组织、肝癌癌旁组织VCC-1表达差异免疫组化分析结果显示,在Ⅰ期肝细胞癌患者组织样本中,有100%（5/5）癌组织VCC-1蛋白表达水平高于其癌旁组织（n＝3,下同）；Ⅰ-Ⅱ期有100%（5/5）患者癌组织VCC-1蛋白表达水平高于其癌旁组织；在Ⅱ期有85%（73/86）患者癌组织VCC-1水平高于其癌旁组织；Ⅱ-Ⅲ期有68%（15/22）患者癌组织VCC-1水平高于其癌旁组织；Ⅲ期有87%（26/30）患者癌组织VCC-1水平高于其癌旁组织。1.2其他肿瘤组织中VCC-1表达差异免疫组化分析结果显示,在结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌患者组织样本中VCC-1水平高于其癌旁组织,在淋巴瘤患者组织样本中VCC-1不表达。2.过表达VCC-1蛋白对肝癌细胞凋亡的影响2.1过表达载体转入细胞株后的RT-PCR检测肝癌细胞的RT-PCR检测显示pcDNA3.1-VCC-1表达载体成功转入细胞内。以GAPDH为参照对电泳图进行灰度分析,发现转染VCC-1表达载体的HepG2细胞灰度值显着升高（F=10.958, P=0.032）和SMMC-7721细胞灰度值显着升高（F=119.828,P=0.000）；2.2表达载体转入细胞株后的Western-Blot检测肝癌细胞在转染pcDNA3.1-VCC-1表达载体后,以GAPDH为参照,显示HepG2细胞内VCC-1蛋白表达量比空白细胞显着升高（t=2.871,P=0.045）, SMMC-7721细胞内VCC-1蛋白表达量比空白细胞显着升高（t=8.046,P=0.001）。2.3免疫荧光检测VCC-1蛋白表达免疫荧光结果显示,肝癌细胞中VCC-1蛋白均呈胞浆表达,并有向细胞膜富集的趋势,分析荧光强度显示转染VCC-1表达载体的HepG2和SMMC-7721细胞荧光强度显着高于空白对照组（P<0.05）。2.4VCC-1促进肝癌细胞生长及转移的效应MTT增殖实验研究结果表明,肝癌细胞转染pcDNA3.1-VCC-1表达载体后,统计学分析显示过表达VCC-1可以促进肝癌细胞生长（P<0.05）。Transwell小室研究结果表明,上调VCC-1具有促进肝癌细胞转移的作用。2.5VCC-1抗肝癌细胞凋亡的效应及机理性研究采用顺铂诱导人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721凋亡,使用流式细胞术和DAPI荧光染色及电镜形态学观察检测细胞凋亡,结果显示转染过表达质粒的肝癌细胞与对照组相比,不同药物浓度下的细胞凋亡率明显下降（P<0.05）。在凋亡过程中PARP, Bcl-xL, Mcl-1,表达下降。3.下调VCC-1基因对肝癌细胞凋亡的影响3.1细胞株下调VCC-1基因的RT-PCR检测肝癌细胞的RT-PCR检测显示pGPU6/GFP/Neo-shVCC-1干扰载体成功转入细胞内。以GAPDH为参照对电泳图进行灰度分析,发现转染VCC-1表达载体细胞的灰度值下降,具有显着差异（P<0.001）。3.2干扰载体转入细胞株后的Western-Blot检测和免疫荧光检测肝癌细胞在转染pGPU6/GFP/Neo-shVCC-1干扰载体后,以GAPDH为参照,显示细胞内VCC-1蛋白表达量比空白细胞下降,具有显着差异（P<0.05）。共聚焦显微镜观察肝癌细胞中VCC-1蛋白免疫荧光染色,结果显示转染干扰载体的肝癌细胞荧光强度明显低于空白对照组,显示细胞内VCC-1蛋白表达下降,具有显着差异（P<0.05）。3.3VCC-1促进肝癌细胞生长及转移的效应MTT增殖实验研究结果表明,肝癌细胞转染干扰载体后,可以促使肝癌细胞生长率下降,数据有统计学差异（P<0.05）。Transwell小室研究结果表明,下调VCC-1具有降低肝癌细胞转移的作用,数据有统计学差异（P<0.05）。3.4VCC-1抗肝癌细胞凋亡的效应及机理性研究采用顺铂诱导人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721凋亡,使用流式细胞术和DAPI荧光染色及电镜形态学观察检测细胞凋亡,结果显示转染过表达质粒的肝癌细胞与对照组相比,凋亡率明显升高,数据有统计学差异（P<0.05）。在凋亡过程中PARP, Bcl-xL, Mcl-1,表达升高。结论：明确VCC-1蛋白在肝细胞癌患者癌组织及癌旁组织中的差异表达及不同病理学分期肝细胞癌患者癌组织中VCC-1蛋白表达水平的差异性：一定比例的患者其癌组织中VCC-1蛋白水平高于癌旁组织,癌组织中VCC-1蛋白水平随病理学分期的严重性呈现一定相关性。明确VCC-1蛋白在常见恶性肿瘤患者癌组织及癌旁组织中的差异表达,除淋巴瘤组织外,本研究使用的结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌和宫颈癌组织样本的VCC-1蛋白均呈阳性表达。明确肝癌细胞过表达VCC-1蛋白有助于肿瘤细胞生长并具有保护肿瘤细胞使其免于受到凋亡诱导剂对其产生的凋亡诱导作用,过表达VCC-1蛋白可促进肝癌细胞迁移。成功利用RNA干扰技术构建VCC-1蛋白低表达肝癌细胞,明确细胞内VCC-1蛋白对肿瘤细胞的生长起到一定的调节作用并影响肿瘤细胞在体外的侵袭转移。明确对于肝细胞癌发生具有重要生物学作用的VCC-1蛋白主要定位于细胞浆,VCC-1基因是一个与肿瘤形成相关的趋化因子,过表达这一基因能够增强肝癌细胞耐受化疗药物诱导的凋亡；干扰VCC-1基因表达能够促进顺铂引起的肝癌细胞凋亡。从而为肿瘤的防治提供了新的思路和干预靶点,为更深入的机制研究奠定了良好基础。
杜悦[9]（2011）在《MAPEG在胚胎干细胞衍生肝组织及胚胎器官发育中的表征》文中指出第一部分MAPEG在小鼠胚胎干细胞体外衍生肝组织发育依赖性表征目的：探索MAPEG在mES细胞体外衍生肝组织模型表征,旨在为揭示其在肝脏体外发育过程生命现象本质提供有价值的实验依据并探讨潜在的应用前景。方法：1.采用mES细胞分化技术,构建mES细胞衍生肝组织模型。RT-PCR法检测mES细胞未分化基因OCT4、心肌细胞特异性基因（MLC-2V）、肝细胞发育依赖性基因（AFP、HNF3β、ALB、CYP7al、G6P）、内皮细胞标记物血小板-内皮细胞黏附因子（PECAM-1）表达情况；细胞免疫化学鉴定肝细胞特异性标记物白蛋白（ALB）,心肌特异性标记物肌钙蛋白（Troponin T）,内皮细胞特征性蛋白（PECAM-1）; ELISA法考察衍生肝组织白蛋白合成分泌功能。2. RT-PCR测定该模型中MAPEG家族mRNA表达；Western blot和免疫细胞化学方法考察MAPEG家族蛋白表达；采用MGST1与底物GSH和CDNB的催化实验来测定衍生肝组织MGST1的催化活性；采用过氧化亚硝基阴离子（ONOO-）与衍生肝组织MGST1共孵育,后用Western blot检测MGST1是否以蛋白二聚体形式被修饰激活。结果：1.mES细胞体外衍生肝组织鉴定：（1）细胞形态学：呈双核成熟肝细胞表型区域附近伴有节律性收缩心肌细胞共存；（2）基因转录层面：发育依赖性表达特征如下：多潜能基因OCT4逐渐减弱,心肌细胞特异性基因MLC-2V、内皮细胞特异性基因PECAM-1依此增强,肝细胞特异性基因AFP先上升后消失、HNF3β、ALB、CYP7al、G6P发育依赖性表达增强；（3）蛋白翻译层面：该衍生肝组织发育依赖性表达肝、心肌、内皮细胞特征性蛋白ALB、Troponin T和PECAM-1。（4）白蛋白分泌功能：该衍生肝组织细胞培养液中白蛋白分泌量在分化过程中逐渐增加,至D18开始达峰值并趋于平缓。较原代培养肝细胞维持时间长且处于较高水平。2.MAPEG家族基因转录层面表征：除MGST3在分化过程中维持恒定表达,MAPEG家族其他5个成员均在mRNA水平随着mES细胞体外衍生肝组织分化成熟呈发育依赖性增强。3.MAPEG家族蛋白翻译层面表征：6个蛋白存在不同表达模式,MGST1蛋白在分化D14出现,随着分化进行逐渐增强；LTC4S和mPGES-1在整个分化过程中呈发育依赖性递减,而FLAP蛋白在分化过程中维持恒定表达；MGST2和MGST3均未检测到蛋白表达。4.MGST催化功能和修饰激活特征：分化D18衍生肝组织MGST1的催化活性为7.65 nmol/min/mg；但此时衍生肝组织MGST1和胎鼠E18肝（见阴栓之日记为E0）MGST1一样,均不能被活性氮如ONOO-以蛋白二聚体的形式修饰激活。结论：1. MAPEG在mES细胞体外衍生肝组织中均具有基因转录基础；蛋白表达未完全相一致的现象,既可能与肝组织功能尚未完善相关,也可能与该类蛋白为功能蛋白,仅在需要时瞬时表达相关。且提示该模型可望用于花生四烯酸相关的炎症通路研究。2.mES细胞体外衍生肝组织MGST1具有催化功能,但未能被活性氮以二聚体形式修饰激活,该特征与小鼠胚胎肝组织来源MGST1相一致。提示该衍生肝组织MGST1不具备在亲电子物质侵袭过程修饰激活而增强解毒功能的特性。3.mES细胞体外衍生肝组织模型具有成熟肝细胞和血管内皮细胞表型,发育依赖性表达肝细胞特征性基因,并具备白蛋白合成分泌功能。该模型可望用于体外肝脏发育学、肝脏生理病理学、肝组织代谢、药理毒理学评价,乃至再生医学细胞移植和组织工程等研究。第二部分MAPEG在大鼠胚胎器官形成过程中的表达特征目的：MAPEG广泛分布于肾、肺和脑等多种器官组织。因小鼠早期胚胎各器官体积过小而存在取材困难,大鼠和小鼠同属啮齿类动物,具有较好的类比性,本部分进一步探索MAPEG家族在大鼠胚胎发育过程中,脑、心、肺、肝和肾等主要组织表达特征,为揭示该家族的体内发育生物学本质和意义提供实验依据。方法：1.收集SD大鼠E14、E16、E18、E20、新生大鼠、成年大鼠脑、心、肺、肝、肾5个组织（阴道查得精子之日为E0）。2.RT-PCR测定各组织发育过程中MAPEG家族各成员mRNA表达。3. Western blot和免疫组织化学法考察MAPEG家族相应蛋白表达。4.MGST1与底物GSH和CDNB催化实验来测定MGST1催化活性；ONOO-与胚胎MGST1共孵育,后用Western blot检测MGST1是否在体外以蛋白二聚体形式被修饰激活。HPLC法分别检测白三烯合成酶系和mPGE-1催化功能。结果：1.MAPEG家族基因转录层面表达模式：除MGST2未在胎肺组织中检测到,其余5个成员均可在胎鼠脑、心、肝、肾组织中检测到,并呈不同程度发育依赖性表达特征。2.MAPEG家族蛋白翻译层面表达模式：MGST1在胎肝、肺组织中发育依赖性递增,在胎脑组织中则表达呈发育依赖性递减,而在胎心、肾组织中未见表达。除胎肺组织之外,MGST2在E18胎鼠其他4个组织均有表达。MGST3和LTC4S在各器官形成过程中呈发育依赖性增加。FLAP在胎脑、心、肾发育过程中表达逐渐增强,而在胎肝、肺组织中表达先增强后减少,分别在E16和E18达表达高峰后下调。mPGES-1在脑和肝组织中发育依赖性递减,而心脏组织中mPGES-1表达从E14至E18逐渐递增,后逐渐下降。但在肺和肾中呈发育依赖性递增。此外,MGST3、LTC4S、FLAP和mPGES-1在胚胎期表达均高于成年期。3.MGST1催化功能和修饰激活特征：胎肝MGST1催化活性发育依赖性增强,但弱于成年期。胎脑和胎肺MGST催化活性未呈发育依赖性变化,且活性均低于胎肝。胎肝MGST1能被ONOO-以蛋白二聚体形式修饰激活,而胎肺MGST1不能被修饰激活。4.白三烯合成酶系催化功能：5个组织中白三烯合成酶系均具有合成LTC4能力,且呈发育依赖性增强,但均弱于成年大鼠相应组织。除了胎肺,MGST2均参与了催化LTC4的合成。5.mPGES-1催化功能考察：在胚胎肝和脑发育过程中mPGES-1催化能力逐渐减弱,而其他组织中催化能力则逐渐增强。结论：1. MAPEG在大鼠胚胎器官形成过程中具有器官分布特异性和不同发育依赖性表征,可能与不同器官功能需求差异和形成完善相关,也可能与该类蛋白为功能蛋白,仅受特定条件下调控表达相关。且提示大鼠胚胎器官具备花生四烯酸相关炎症通路的物质基础。2.大鼠胎肝MGST1具备催化亲电子物质与谷胱甘肽结合功能,且可被活性氮以蛋白二聚体形式修饰激活。大鼠胎肺和小鼠胎肝MGST1则不能被活性氮修饰激活,提示MGST1修饰激活特性具有组织和种属专属性。3.LTC4合成酶系在大鼠胚胎5个组织中蛋白表达与催化活性均呈发育依赖性递增,且除胎肺外,其他组织MGST2均参与了催化LTC4合成。提示MGST2、LTC4可能与多种胚胎器官形成和功能完善相关,具有普遍发育生物学意义。4.胚胎组织中mPGES-1具备催化合成PGE2的能力,呈不同发育依赖性变化,提示胚胎期mPGES-1有多重生物学功能,催化能力与不同胚胎组织的需求和功能差异相关。
牛惠惠[10]（2010）在《水通道蛋白5在人胎肺发育中的表达及意义》文中提出目的:1.检测水通道蛋白5 （ AQP5 ）在不同孕周（孕27周孕37周）人胎肺组织中的表达及分布;2.比较正常胎肺组织和发育异常胎肺组织中AQP5的表达差异;3.探讨AQP5对胎肺发育的影响及其在肺液代谢中的作用。方法:1.应用逆转录聚合酶链技术（ RT– PCR ）检测AQP5 mRNA在人胎肺中的表达;2.应用实时荧光半定量PCR技术（ semi-quantitative real-time PCR ）比较AQP5 mRNA在正常胎肺和发育异常胎肺中的基因表达差异;3.应用免疫组织化学方法检测AQP5蛋白在人胎肺中的分布。结果:1. RT-PCR结果显示AQP5 mRNA在各孕周人胎肺中均有表达,最早在孕27周即有表达;2. real-time PCR结果显示发育异常胎肺组织（ n = 4 ）较正常胎肺组织（ n = 4） AQP5 mRNA （0.627±0.145 VS 1.019±0.069）表达减少,差异有统计学意义（ P值< 0.05 ）;3.正常胎肺组随孕周增加（孕28+2周孕37+4周） AQP5 mRNA表达量有上升趋势;异常胎肺组中局部肺不张组织（孕31+4周） AQP5 mRNA表达量最高,肺发育不全患儿（孕28+6周） AQP5 mRNA表达量最低,孕31周较孕27+2周的肺水肿胎肺AQP5 mRNA表达量高;4.免疫组织化学显示AQP5蛋白在人胎肺肺泡I型上皮细胞顶膜表达,肺水肿胎肺和发育不良胎肺中未见表达。结论:1.在人外周胎肺中AQP5 mRNA至少从孕27周开始有表达,AQP5蛋白在人胎肺肺泡I型上皮细胞顶膜表达;2.发育异常胎肺较正常胎肺AQP5基因和蛋白表达下降;3. AQP5在胎肺的正常发育和肺液代谢中可能有重要作用。
二、血栓调节蛋白在成人及胎肺组织中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血栓调节蛋白在成人及胎肺组织中的表达（论文提纲范文）
（1）金属蛋白酶ADAMTS18在早期肺发育中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肺发育与ECM |
| 1.1.1 肺发育 |
| 1.1.2 气道发育中的ECM |
| 1.1.3 肺发育缺陷 |
| 1.2 功能性微纤维的组成及其在早期胚胎肺发育中的作用 |
| 1.2.1 Fibrillin1和fibrillin2 |
| 1.2.2 Fibronectin |
| 1.2.3 Integrins |
| 1.2.4 硫酸乙酰肝素 |
| 1.2.5 LTBP |
| 1.2.6 与Microfibril作用的其他生长因子 |
| 1.3 ADAMTS家族与肺发育和疾病 |
| 1.3.1 ADAMTS家族 |
| 1.3.2 ADAMTS家族成员在肺中的表达 |
| 1.3.3 ADAMTS与肺相关疾病 |
| 1.3.4 ADAMTS与 Microfibril的关系 |
| 1.4 本研究的背景和意义 |
| 1.4.1 肺发育不良对长期生活的影响 |
| 1.4.2 ADAMTS18 的研究现状 |
| 1.4.3 本研究的主要内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.1.5 常用试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠的繁殖 |
| 2.2.2 小鼠基因型的鉴定 |
| 2.2.3 原位杂交 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 石蜡组织切片 |
| 2.2.6 苏木素-伊红染色 |
| 2.2.7 免疫组化 |
| 2.2.8 Hart’s染色 |
| 2.2.9 天狼星红胶原染色 |
| 2.2.10 Masson三染色 |
| 2.2.11 肺组织体外培养 |
| 2.2.12 成年小鼠气管铸型 |
| 2.2.13 放射状肺泡数计数 |
| 2.2.14 小鼠肺功能检测 |
| 2.2.15 急性肺损伤模型 |
| 2.2.16 肺纤维化模型 |
| 2.2.17 非标记(Label-free)蛋白质组学 |
| 2.2.18 透射电镜 |
| 2.2.19 蛋白抽提 |
| 2.2.20 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.21 蛋白的表达 |
| 2.2.22 免疫共沉淀 |
| 2.2.23 细胞免疫荧光 |
| 2.2.24 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Adamts18 m RNA主要表达在小鼠发育早期的肺组织 |
| 3.1.1 Adamts18 m RNA在小鼠肺组织中的时间表达谱 |
| 3.1.2 Adamts18 m RNA在小鼠肺组织中的空间表达谱 |
| 3.2 Adamts18 缺失对小鼠肺支气管树形成的影响 |
| 3.2.1 Adamts18 缺失对胚胎期肺形态的影响 |
| 3.2.2 Adamts18 缺失在胚胎期对支气管分支数目和形态的影响 |
| 3.2.3 Adamts18 缺失对成年小鼠支气管分支数目和形态的影响 |
| 3.3 Adamts18 缺失导致小鼠肺形态异常伴随严重肺泡发育不良 |
| 3.3.1 Adamts18 缺失小鼠的肺形态异常 |
| 3.3.2 Adamts18~(-/-)小鼠的肺体比正常 |
| 3.3.3 Adamts18~(-/-)小鼠的囊泡发育异常 |
| 3.3.4 Adamts18~(-/-)小鼠的肺泡发育异常 |
| 3.3.5 Adamts18~(-/-)小鼠肺泡壁上弹性纤维沉积 |
| 3.4 Adamts18 缺失对小鼠肺功能的影响 |
| 3.4.1 生理条件下Adamts18~(-/-)小鼠维持了正常的肺功能 |
| 3.4.2 Adamts18~(-/-)小鼠在急性肺损伤模型中损伤更严重 |
| 3.4.3 Adamts18~(-/-)小鼠在肺纤维化模型中损伤更严重 |
| 3.4.4 Adamts18 m RNA在急性肺损伤和纤维化模型样本中的表达 |
| 3.5 .气管分支关键信号通路在Adamts18~(-/-)小鼠中改变 |
| 3.6 .非标记蛋白质组学比较Adamts18~(+/+)和Adamts18~(-/-)小鼠肺差异蛋白 |
| 3.6.1 Adamts18~(+/+)和Adamts18~(-/-)E14.5 鼠肺蛋白差异表达分析 |
| 3.6.2 Adamts18~(+/+)和Adamts18~(-/-)E14.5 鼠肺差异蛋白的GO富集分析 |
| 3.7 .ADAMTS18与Fibrillin1 的相互作用 |
| 3.7.1 Adamts18~(-/-)小鼠肺组织中fibrillin1和fibrillin2 蛋白的表达水平升高 |
| 3.7.2 Adamts18~(-/-)小鼠肺中两种fibrillin m RNA的表达 |
| 3.7.3 ADAMTS18 蛋白与fibrillin1 蛋白在体外共定位 |
| 3.7.4 免疫共沉淀验证ADAMTS18与fibrillin蛋白的相互作用 |
| 3.7.5 ADAMTS18 蛋白通过C端序列与fibrillin1的N端结合 |
| 3.7.6 ADAMTS18 在体外对fibrillin1 无切割作用 |
| 3.8 .在 Adamts18~(-/-)小鼠中减少fibrillin1 的量可以挽救其支气管发育不良的表型 |
| 3.9 .Adamts18~(-/-)小鼠肺上皮细胞的细胞骨架组装异常 |
| 3.9.1 Adamts18~(-/-)小鼠肺上皮中的黏着斑蛋白信号减弱 |
| 3.9.2 Adamts18~(-/-)小鼠肺上皮细胞的细胞骨架紊乱 |
| 3.9.3 Adamts18 缺失影响细胞的迁移能力 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 附表1.本研究中所用到的抗体 |
| 附表2.qRT-PCR中用到的引物 |
| 缩略词清单 |
| 研究生期间科研成果 |
| 致谢 |
（2）PM2.5吸入暴露诱导肺损伤及其分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大气污染的现状及健康危害 |
| 1.1.1 大气污染的现状 |
| 1.1.2 大气污染的健康危害 |
| 1.2 PM_(2.5) 的污染现状以及呼吸系统健康效应 |
| 1.2.1 PM_(2.5) 污染现状以及健康危害 |
| 1.2.2 PM_(2.5)对COPD的影响 |
| 1.2.3 PM_(2.5) 对哮喘的影响 |
| 1.2.4 PM_(2.5) 对肺癌的影响 |
| 1.3 PM_(2.5) 诱导呼吸系统疾病的分子机制 |
| 1.3.1 炎性机制 |
| 1.3.2 氧化应激 |
| 1.3.3 表观遗传机制 |
| 1.3.3.1 DNA甲基化修饰 |
| 1.3.3.2 非编码RNA调控 |
| 1.3.3.3 组蛋白修饰 |
| 1.4 孕期PM_(2.5) 暴露对子代呼吸系统的影响 |
| 1.4.1 PM_(2.5) 的跨胎盘效应 |
| 1.4.2 孕期PM_(2.5) 暴露与胎儿发育 |
| 1.4.3 PM_(2.5) 孕期暴露与子代呼吸系统发育 |
| 1.5 本研究课题的提出及科学意义 |
| 第二章 PM_(2.5)与SO_2、NO_2 复合暴露诱导小鼠肺动脉高压样损伤的分子机制 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料、试剂与仪器 |
| 2.2.2 PM_(2.5) 样品的收集 |
| 2.2.3 实验动物的处理方法 |
| 2.2.4 miRNA芯片分析 |
| 2.2.5 生物信息学分析 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR分析(RT-PCR) |
| 2.2.7 免疫印迹分析(Western blot) |
| 2.2.8 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.2.9 苏木精–伊红(HE)染色及透射电镜(TEM)观察 |
| 2.2.10 肺功能检测 |
| 2.2.11 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PM_(2.5)和SO_2、NO_2 复合暴露引起气道气流受限 |
| 2.3.2 PM_(2.5)和SO_2、NO_2 复合暴露导致肺动脉高压样损伤 |
| 2.3.3 PM_(2.5)和SO_2、NO_2 复合暴露对小鼠肺组织miRNAs表达的影响.. |
| 2.3.4 miR-338-5p在 PM_(2.5)和SO_2、NO_2 复合暴露诱导肺动脉高压的调控机制 |
| 2.4 讨论与结论 |
| 第三章 PM_(2.5) 暴露对不同生命阶段小鼠肺损伤的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料、试剂与仪器 |
| 3.2.2 PM_(2.5) 样品收集 |
| 3.2.3 动物处理方法 |
| 3.2.4 肺功能检测 |
| 3.2.5 HE染色 |
| 3.2.6 ROS水平检测 |
| 3.2.7 抗氧化酶SOD和 GSH-Px活力检测 |
| 3.2.8 RT-PCR分析 |
| 3.2.9 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PM_(2.5) 的特征 |
| 3.3.2 PM_(2.5) 暴露对不同生命阶段小鼠肺功能的影响 |
| 3.3.3 PM_(2.5) 暴露对不同生命阶段小鼠肺组织病理学结构的影响 |
| 3.3.4 PM_(2.5) 暴露对不同生命阶段小鼠肺部氧化应激效应的影响 |
| 3.3.5 PM_(2.5) 暴露对不同生命阶段小鼠肺部炎性反应的影响 |
| 3.4 讨论与结论 |
| 第四章 组蛋白修饰在PM_(2.5) 暴露诱导肺损伤及恢复过程中的调控机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料、试剂与仪器 |
| 4.2.2 PM_(2.5) 样品收集 |
| 4.2.3 动物处理 |
| 4.2.4 染色质免疫共沉淀分析(ChIP) |
| 4.2.5 ChIP-测序(ChIP-seq)分析 |
| 4.2.6 肺功能检测 |
| 4.2.7 ELISA分析 |
| 4.2.8 支气管肺泡灌洗液(BALF)和细胞分类计数 |
| 4.2.9 RT-PCR分析 |
| 4.2.10 核蛋白提取和Western blot分析 |
| 4.2.11 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PM_(2.5) 暴露对小鼠肺功能的不良影响及恢复效应 |
| 4.3.2 PM_(2.5) 暴露对BALF细胞学的不良影响及恢复效应 |
| 4.3.3 PM_(2.5) 暴露对组蛋白修饰的不良影响及恢复效应 |
| 4.3.4 PM_(2.5) 暴露对H3K27ac相关肺部炎症的不良影响以及恢复作用 |
| 4.4 讨论与结论 |
| 第五章 孕期PM_(2.5) 暴露与子代小鼠支气管肺发育不良 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料、试剂与仪器 |
| 5.2.2 PM_(2.5) 样品的收集 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.2.4 PM_(2.5) 暴露 |
| 5.2.5 HE染色 |
| 5.2.6 肺组织形态学测量 |
| 5.2.7 免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF) |
| 5.2.8 TEM观察 |
| 5.2.9 Western blot分析 |
| 5.2.10 RT-PCR分析 |
| 5.2.11 肺功能检测 |
| 5.2.12 组织中重金属含量测定 |
| 5.2.13 数据统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PM_(2.5) 暴露直接或间接影响胎儿发育 |
| 5.3.2 孕期PM_(2.5) 暴露和子鼠出生体重 |
| 5.3.3 孕期PM_(2.5) 暴露和子鼠肺泡化 |
| 5.3.4 孕期PM_(2.5) 暴露和子鼠肺组织血管生成 |
| 5.3.5 孕期PM_(2.5) 暴露和子鼠气道分泌功能 |
| 5.3.6 孕期PM_(2.5) 暴露和子鼠气道炎性 |
| 5.3.7 孕期PM_(2.5) 暴露和子鼠肺功能 |
| 5.4 讨论与结论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 缩略词 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 参与科研项目 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（4）miR-431经TGF-β/SMAD4通路调节肺泡表面活性物质合成的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）miRNA-20a-5p对肺表面活性物质相关蛋白表达的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-20a-5p的差异表达及基本生物特征 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 miR-20a-5p对肺泡上皮细胞肺表面活性物质相关蛋白表达的调控作用与机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 :英文缩略词 |
| 附录二 :硕士在读期间科研工作小结 |
| 致谢 |
（6）汉防己甲素对除草醚诱导膈疝大鼠模型胎肺中Krüppell样因子5及生存素表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 先天性膈疝研究背景与意义 |
| 1.1.1 先天性膈疝定义简单介绍 |
| 1.1.2 膈肌发育和膈疝病因、产前检查与治疗、产后诊断与治疗相关研究 |
| 1.1.2.1 膈发育过程简介 |
| 1.1.2.2 膈疝病因相关研究学说 |
| 1.1.2.3 先天性膈疝产前相关检查 |
| 1.1.2.4 先天性膈疝患儿产后检查 |
| 1.1.2.5 先天性膈疝治疗进展 |
| 1.2 先天性膈疝国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 先天性膈疝动物模型 |
| 1.2.2 先天性膈疝产前药物干预的研究 |
| 1.2.3 先天性膈疝发病机制的研究 |
| 1.3 本次实验主要方法、目的及意义 |
| 1.3.1 实验主要方法 |
| 1.3.2 实验目的 |
| 1.3.3 实验意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验设备与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 先天性膈疝动物模型建立及分组 |
| 2.2.2 动物饲养及模型干预 |
| 2.2.3 实验标本采集及膈疝确定 |
| 2.2.4 胎鼠肺组织切片及HE染色、形态学观察 |
| 2.2.5 行胎鼠肺组织免疫组化染色 |
| 2.2.6 Western-blotting法测胎肺KLF5、Survivin蛋白 |
| 2.2.6.1 试剂配置 |
| 2.2.6.2 组织蛋白提取 |
| 2.2.7 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 实验动物膈疝统计情况 |
| 3.2 实验各组胎鼠胎肺组织肺重与体重比 |
| 3.3 三组胎肺组织HE染色形态学观察 |
| 3.4 各组胎肺组织免疫组化染色 |
| 3.4.1 Krüppell样因子5(Krüppel-likefactors5,KLF5) |
| 3.4.2 生存素(Survivin) |
| 3.4.3 KLF5与Survivin免疫组化染色光密度相关性分析 |
| 3.4.4 KLF5、Survivin与肺微小血管相关性分析 |
| 3.5 Western-blotting定量检测KLF5、Survivin的表达情况 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻硕期间的研究成果 |
（7）肿瘤转移相关蛋白MTA1在肺泡毛细血管成熟中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 MTA1缺失导致小鼠出生后死亡率增加和延缓发育 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 MTA1缺失导致小鼠毛细血管成熟障碍 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 MTA1能够稳定细胞内HIF-1α |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）VCC-1蛋白在肝癌中的表达及其影响肝癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 VCC-1蛋白在肝癌组织中表达及其意义 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 过表达VCC-1对肝癌细胞增殖、凋亡的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 下调VCC-1基因对肝癌细胞增殖、凋亡影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语词汇表 |
| 成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（9）MAPEG在胚胎干细胞衍生肝组织及胚胎器官发育中的表征（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1. MAPEG在小鼠胚胎干细胞体外衍生肝组织发育依赖性表征 |
| 引言 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.1.1 仪器 |
| 1.1.2 主要试剂及配制 |
| 1.1.3 细胞系 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 mES细胞衍生肝组织构建 |
| 1.2.2 mES细胞衍生肝组织鉴定 |
| 1.2.3 MAPEG发育依赖性表达特征考察 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 mES细胞衍生肝组织鉴定 |
| 1.3.2 MAPEG家族发育依赖性表征 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 2. MAPEG在大鼠胚胎器官形成过程中发育依赖性表达特征 |
| 引言 |
| 2.1 仪器和试剂 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂及配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物饲养 |
| 2.2.2 样本收集 |
| 2.2.3 RT-PCR法检测组织内mRNA表达 |
| 2.2.4 Western blot法检测组织内蛋白表达 |
| 2.2.5 免疫组织化学 |
| 2.2.6 MGST1催化功能考察 |
| 2.2.7 活性氮对胎肝和胎肺总蛋白中MGST1修饰激活考察 |
| 2.2.8 白三烯合成酶系催化能力考察 |
| 2.2.9 mPGES-1催化能力考察 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 MGST1基因及蛋白表达谱 |
| 2.3.2 MGST2基因及蛋白表达谱 |
| 2.3.3 MGST3基因及蛋白表达谱 |
| 2.3.4 LTC4S基因及蛋白表达谱 |
| 2.3.5 FLAP基因及蛋白表达谱 |
| 2.3.6 mPGES-1基因及蛋白表达谱 |
| 2.3.7 MGST1催化功能考察 |
| 2.3.8 活性氮对胎肝、胎肺总蛋白中MGST1修饰激活考察 |
| 2.3.9 白三烯合成酶系催化功能考察 |
| 2.3.10 mPGES-1催化功能考察 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3.LPS处理孕大鼠诱发胎脑MAPEG表达特征 |
| 引言 |
| 3.1 仪器和试剂 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂及配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物饲养 |
| 3.2.2 样本收集和胚胎存活率统计 |
| 3.2.3 RT-PCR法检测胎脑组织内mRNA表达 |
| 3.2.4 Western blot法检测胎脑组织内蛋白表达 |
| 3.2.5 ELISA法检测胎脑组织CysLTs含量 |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 孕鼠LPS处理后给不同药物对胚胎存活影响 |
| 3.3.2 胎脑MAPEG基因变化 |
| 3.3.3 胎脑MAPEG蛋白变化 |
| 3.3.4 胎脑MAPEG产物变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述:MAPEG发育依赖性表达特征与功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（10）水通道蛋白5在人胎肺发育中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 公开发表文章目录 |
| 致谢 |
四、血栓调节蛋白在成人及胎肺组织中的表达（论文参考文献）
- [1]金属蛋白酶ADAMTS18在早期肺发育中的作用研究[D]. 陆甜甜. 华东师范大学, 2020(08)
- [2]PM2.5吸入暴露诱导肺损伤及其分子机制[D]. 姬晓彤. 山西大学, 2019
- [3]血管生成因子对先天性食管闭锁大鼠肺发育的影响[J]. 王军,高琳琳,刘晓梅. 国际儿科学杂志, 2018(05)
- [4]miR-431经TGF-β/SMAD4通路调节肺泡表面活性物质合成的机制研究[D]. 李淑君. 南京医科大学, 2018(01)
- [5]miRNA-20a-5p对肺表面活性物质相关蛋白表达的调控作用及其机制研究[D]. 贡永健. 南京医科大学, 2018(01)
- [6]汉防己甲素对除草醚诱导膈疝大鼠模型胎肺中Krüppell样因子5及生存素表达的影响[D]. 蒋琴. 电子科技大学, 2018(09)
- [7]肿瘤转移相关蛋白MTA1在肺泡毛细血管成熟中的作用研究[D]. 覃君慧. 第四军医大学, 2017(05)
- [8]VCC-1蛋白在肝癌中的表达及其影响肝癌细胞凋亡的研究[D]. 周志涛. 南方医科大学, 2012(07)
- [9]MAPEG在胚胎干细胞衍生肝组织及胚胎器官发育中的表征[D]. 杜悦. 浙江大学, 2011(07)
- [10]水通道蛋白5在人胎肺发育中的表达及意义[D]. 牛惠惠. 华中科技大学, 2010(02)