一、PCR扩增石蜡包埋小鼠组织p53基因突变热点片段（论文文献综述）
龙向淑[1]（2021）在《HOXC6对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内皮细胞凋亡的影响》文中研究说明研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、冠状动脉腔内成形术/支架植入术后再狭窄及脑卒中等动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）发病率和病死率在多数发展中国家仍呈逐年升高的趋势,是中国乃至全球范围内非感染性疾病死亡的首要原因。动脉粥样硬化（AS）是ASCVD的主要病理基础。在多种导致AS的不良因素作用下,位于中膜层的血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移至内膜及内膜下层并异常增殖,而内膜层的血管内皮细胞（VECs）凋亡增多,是AS发生发展的主要细胞病理学基础。然而,血管壁细胞异质性生物学行为异常及其介导AS发生的分子机制尚未完全明了。同源框（HOX）是一类进化上高度保守并影响脊索动物形态发生的同源域转录因子。HOX基因家族包含39个同源基因。近期研究表明,HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXB1及HOXB9等多个HOX基因在猪主动脉壁的表达受剪切应力影响,但这些基因对血管生物学功能和AS的影响未知。同源框C6（HOXC6）属HOX基因家族C簇成员。研究显示,HOXC6在多器官系统恶性肿瘤组织中表达增高并影响肿瘤细胞增殖、迁移及凋亡等生物学行为。此外,HOXC6可调节血管壁多能干细胞分化为VSMCs、以及皮肤成纤维细胞分化为血管壁间充质细胞。但是,HOXC6对VSMCs和VECs的增殖、迁移及凋亡等生物学行为是否有影响迄今未见文献报道。研究目的了解Hoxc6等39个Hox基因在AS大鼠主动脉壁和正常主动脉壁的差异表达,然后进一步探讨HOXC6对VSMCs增殖及迁移和VECs凋亡的影响及其部分机制,为明确HOXC6能否成为ASCVD分子治疗新靶点奠定理论基础。研究方法采用苏木素和伊红（H&E）染色法对大鼠主动脉染色验证AS大鼠建模是否成功。应用免疫组织化学法检测Hoxc6、Bcl-2和Bax蛋白在大鼠主动脉的原位表达。采用免疫荧光染色法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在VSMCs和CD31在VECs中的表达。采用反转录实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测39个Hox基因、p53、增殖细胞核抗原（PCNA）、磷脂酶C beta（PLCβ）和血小板活化因子受体（PTAFR）mRNAs表达。用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测大鼠主动脉或心脏组织中和大鼠VSMCs（RVSMCs）中Hoxc6、p53及PCNA蛋白表达,检测VECs中HOXC6、BCL-2、BAX、Caspase-3、Cleaved caspase-3、Caspase-9、PTAFR、PLCβ及IL-18蛋白表达,以及检测VECs中蛋白激酶C zeta（PKCζ）、NF-κBp65磷酸化和PKCζ膜转位水平变化。应用Cell counting kit-8（CCK-8）和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（Ed U）实验检测VSMCs增殖。用细胞划痕法和Transwell实验检测VSMCs迁移。用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）和流式细胞技术检测VECs凋亡。采用生物信息学分析方法挖掘并分析GEO数据库中冠心病相关基因表达及其可能参与的信号通路。应用双荧光素酶报告基因实验检测HOXC6与PTAFR启动子DNA序列结合。采用染色质免疫共沉淀（Ch IP）结合qPCR（Ch IP-qPCR）验证HOXC6与PTAFR启动子DNA结合的特定靶序列。结果1.在AS大鼠主动脉壁异常表达的Hox基因H&E染色结果显示,AS大鼠主动脉内膜/中膜比值较正常主动脉明显增加（P<0.01）。采用qRT-PCR对39个Hox基因mRNA检测结果显示,AS大鼠主动脉壁较正常大鼠主动脉壁表达上调或下调（表达增加或减少倍数的均数绝对值≥2）的Hox基因为17个,其中Hoxa1、Hoxa3、Hoxa9、Hoxb7、Hoxc5、Hoxc6、Hoxc8、Hoxc9及Hoxc10共9个基因表达上调（均P<0.01）,而Hoxa2、Hoxa4、Hoxa5、Hoxa6、Hoxb2、Hoxb3、Hoxb4及Hoxb6共8个基因下调（均P<0.01）。在上调的9个Hox基因中,其中Hoxc6表达升高了10余倍,较之升高倍数更大的Hoxc9或Hoxc10,Hoxc6在大鼠主动脉壁的基础表达丰度最高,而且重复性最好,因此首选Hoxc6作进一步验证。2.Hoxc6和增殖、凋亡相关分子在AS大鼠主动脉壁异常表达qRT-PCR和Western blot结果显示,Hoxc6 mRNA和蛋白在AS大鼠主动脉壁的表达明显升高（P<0.01）,伴随p53 mRNA和蛋白在AS大鼠主动脉壁的表达显着减少,而PCNA表达显着增多（均P<0.01）。免疫组化染色结果显示,在AS大鼠主动脉壁的粥样斑块病变和迁移至内膜的VSMCs中,Hoxc6蛋白的表达较正常主动脉显着增多（P<0.01）,伴随抑凋亡分子Bcl-2蛋白在AS大鼠主动脉壁增厚的内膜组织和粥样斑块病变中的表达较正常主动脉明显减少,而促凋亡蛋白Bax表达显着增多（均P<0.01）。3.敲低Hoxc6表达抑制RVSMCs增殖与迁移免疫荧光染色实验结果显示,氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）处理的RVSMCs用α-SMA抗体染色后,阳性细胞/细胞总数的比率较正常RVSMCs下降（P<0.05）。Ed U、CCK-8、细胞划痕及Transwell实验结果显示,ox-LDL作用于细胞后,RVSMCs增殖明显增多,细胞迁移能力显着增强（均P<0.01）,伴随p53蛋白表达减少,PCNA表达增多（均P<0.01）。然而,下调ox-LDL处理或正常培养的RVSMCs中Hoxc6表达后,RVSMCs增殖显着减少,细胞迁移能力明显减弱（均P<0.01）,伴p53蛋白表达显着增多,而PCNA表达明显减少（均P<0.01）。此外,先后敲低RVSMCs中Hoxc6和p53表达后,RVSMCs的增殖和迁移能力较单独敲低Hoxc6组增强（均P<0.05）,但比正常对照组减弱（均P<0.05）。4.下调HOXC6表达抑制VECs凋亡TUNEL、流式细胞技术、qRT-PCR及Western blot结果显示,ox-LDL作用于大鼠主动脉内皮细胞（RAECs）或人脐静脉内皮细胞（HUVECs）后,细胞凋亡率较正常对照组均显着升高（均P<0.05）,伴随抑凋亡蛋白BCL-2表达显着减少（均P<0.01）,而促凋亡蛋白BAX、Caspase-3及其活化片段Cleaved caspase-3和Caspase-9表达增多（均P<0.05）。然而,下调ox-LDL处理或正常培养的RAECs或HUVECs中HOXC6表达后,细胞凋亡率较正常对照组或单独ox-LDL处理组下降（均P<0.05）,伴随抑凋亡蛋白BCL-2表达显着增多（均P<0.01）,而促凋亡蛋白BAX、Caspase-3及其活化片段Cleaved caspase-3和Caspase-9表达减少（均P<0.05）。此外,在HUVECs中过表达HOXC6之后,HUVECs凋亡率和凋亡相关蛋白变化的趋势与抑制HOXC6表达时相反（均P<0.05）。5.HOXC6靶向PTAFR经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径影响HUVECs凋亡GEO数据库中冠心病有关的三个数据集gse20681、gse40231和gse46560取交集结果显示,血小板活化因子受体（PTAFR）等68个基因存在交集。KEGG pathway分析显示,PTAFR可通过PLC/PKC途径影响细胞凋亡,进一步在JASPAR数据库预测结果显示,HOXC6与PTAFR启动子存在特异结合位点。鉴于HOXC6影响RAECs和HUVECs凋亡的一致性,选择HUVECs为靶细胞,探讨HOXC6影响VECs凋亡的机制。qRT-PCR、Western blot结果显示,ox-LDL处理HUVECs或促进HOXC6表达后,PTAFR表达增多（均P<0.05）,伴随下游信号分子PLCβ表达增多（均P<0.05）,PKCζ磷酸化和膜转位水平升高（均P<0.05）,NF-κBp65磷酸化和IL-18表达水平升高（均P<0.05）。然而,在ox-LDL处理或正常培养的HUVECs中敲低HOXC6表达之后,上述观察指标的变化趋势与促进HOXC6表达时相反（均P<0.05）。此外,分别用PTAFR激动剂血小板活化因子和PKCζ激动剂溶血磷脂酰胆碱作用于HUVECs,均可逆转下调HOXC6表达所致的抑制HUVECs凋亡及PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18信号通路活性的效应（均P<0.05）。而且,双荧光素酶报告基因实验结果显示,HUVECs中过表达HOXC6之后,HOXC6与PTAFR启动子结合的活性显着增高（P<0.01）。Ch IP-qPCR实验结果显示,HOXC6可与PTAFR启动子特定位点AGAGGAATAGATTAAA和（或）GAAGCAATCAACCAAG序列结合（P<0.01）。结论1.39个Hox基因中的17个在AS大鼠主动脉壁与正常大鼠主动脉壁之间差异表达,其中Hoxc6表达显着升高,伴随p53和Bcl-2与Hoxc6呈负向性、而PCNA和Bax与Hoxc6呈正向性表达异常。2.HOXC6一方面可负调控p53表达而促进VSMCs增殖与迁移,另一方面靶向PTAFR经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径促进VECs凋亡。由此提示HOXC6影响VSMCs增殖、迁移和VECs凋亡的异质性。
刘金晶[2]（2021）在《假基因RPL34-PS1促进B细胞淋巴瘤生长的机制研究》文中研究指明淋巴瘤是一类血液恶性疾病,其中B细胞淋巴瘤是最常见的一类淋巴瘤,其异质性强,发病机制复杂,且临床疗效不稳定,预后较差。原癌基因的激活和抑癌基因功能的丧失是导致B细胞淋巴瘤发生发展的重要因素。p53基因是一个关键的肿瘤抑制基因,与肿瘤细胞凋亡、周期阻滞及DNA修复等都有不可缺少的联系。LNK（SH2B3）是重要的酪氨酸激酶信号传导抑制因子,可抑制B淋巴细胞恶性疾病的发生发展。小分子RNA（microRNA）也在B细胞淋巴瘤的发生发展中发挥作用。实验室已有的研究证明miR-144/451的丢失会导致小鼠B细胞淋巴瘤的发生,即miR-144/451是一种抑癌基因,但作用甚微。因此,为了探索miR-144/451与其他抑癌基因是否有协同作用,课题组前期分别利用p53敲入鼠、LNK敲除鼠和miR-144/451敲除鼠进行杂交,构建了三基因突变的小鼠模型,与其他各对照组相比,发现该小鼠很快死于急性B细胞性白血病/淋巴瘤（类似人类 Precursor B-cellleukemia/lymphoma）,说明 miR-144/451与其他抑癌基因有协同抑制B细胞发生肿瘤的作用。为了探索其协同作用的机制,我们取三基因突变小鼠的脾脏B细胞进行RNA-Seq,结果发现其中假基因RPL34-PS1特异性高表达。然而假基因RPL34-PS1与B细胞恶性疾病的关系尚不清楚。长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200个核苷酸的非编码RNA,参与众多疾病的发生发展,与肿瘤细胞分化、凋亡等过程关系密切。假基因虽是失去编码蛋白功能的基因组序列,但其衍生出的长链非编码RNA可以在转录或转录后水平对其他基因发挥重要调控作用。课题组前期实验证明,假基因RPL34-PS1的亲本基因RPL34促进B细胞淋巴瘤的生长,因此,我们假设假基因RPL34-PS1可能与B细胞淋巴瘤的生长密切相关。本研究拟通过体内外功能实验以及RNA测序技术,探讨假基因RPL34-PS1与B细胞淋巴瘤之间的关系及相关机制,为B细胞淋巴瘤的临床诊断和治疗提供新的理论依据。方法:1.构建稳定过表达RPL34-PS1的B淋巴瘤细胞系在基因库中,查询假基因RPL34-PS1的基因序列,设计克隆引物。利用基因克隆技术将片段插入逆转录病毒载体MSCV-PIG中,通过转染和感染,经嘌呤霉素筛选后即得到稳定表达RPL34-PS1的B淋巴瘤细胞系。空载体细胞系38B9-MSCV-PIG作为阴性对照。利用qRT-PCR检测假基因RPL34-PS1在B淋巴瘤细胞中的表达情况,并且通过测序,区分其与亲本基因RPL34的表达差异。2.假基因RPL34-PS1的体内外功能实验将嘌呤霉素筛选后的38B9-RPL34-PS1细胞及对照组细胞于相同条件下进行培养,分别取处于对数生长期的细胞进行计数,利用流式细胞术进行周期及凋亡检测。以相同数量的细胞对Balb/C小鼠进行皮下荷瘤,观察小鼠的成瘤速度,并解剖小鼠取肿瘤进行质量称重。3.假基因RPL34-PS1功能的机制研究取嘌呤霉素筛选后的体外培养的细胞,及其荷瘤后形成的肿瘤组织,分别提取RNA并进行RNA测序。分析测序结果,寻找特异性表达的基因,并进行相关的流式、Western Blot实验。同时,利用流式细胞仪检测肿瘤组织中CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例。取部分组织制成石蜡块样本,切片后分别进行HE染色和CD36免疫组化实验,观察两组样本中血管生成情况。结果:1.通过显微镜观察,感染病毒后的38B9细胞均有GFP,且流式检测显示,嘌呤霉素筛选后的细胞GFP阳性率接近100%,实时荧光定量PCR及测序结果验证假基因RPL34-PS1在38B9细胞中过表达。2.细胞增殖结果显示,38B9-RPL34-PS1细胞在体外与对照组细胞的增殖无差异。细胞周期实验结果显示,两组细胞的生长周期中,G1期、G2期及S期都无差异。凋亡实验结果显示,两组细胞体外生长的早期凋亡无差异。荷瘤实验结果显示,38B9-RPL34-PS1的肿瘤体积和质量均大于对照组。3.通过对RNA测序结果的初步分析,38B9-RPL34-PS1细胞中促肿瘤生长的CD71基因表达水平上调,qRT-PCR验证结果与测序结果一致。Western Blot结果显示,38B9-RPL34-PS1肿瘤组织中CD71的蛋白水平高于对照组。另外流式细胞仪检测结果显示,38B9-RPL34-PS1肿瘤组织中CD8阳性和CD4阳性的T细胞数量均少于对照组。HE染色和CD36免疫组化结果显示,38B9-RPL34-PS1肿瘤组织与对照组肿瘤组织中的血管生成情况无差异。结论:1.假基因RPL34-PS1对体外细胞生长无显着影响,但在体内能显着提高38B9细胞的成瘤能力。2.假基因RPL34-PS1可能通过降低机体细胞免疫,促进B细胞淋巴瘤的生长,同时假基因RPL34-PS1功能的发挥可能与促进CD71基因表达有一定关系。
洪帆[3]（2021）在《假基因UBDP1竞争性结合microRNA调控胶质母细胞瘤恶性增殖侵袭的机制研究》文中提出研究目的胶质母细胞瘤是恶性程度最高的脑肿瘤之一,同时也是最常见的脑肿瘤之一,目前胶质母细瘤的标准化治疗方案仍无法得到满意的预后。假基因是一种广泛表达的非编码基因,由编码基因突变而来,突变前的编码基因被称为真基因。多项研究已经证实假基因在人类癌症进展中起到了至关重要的作用。本研究旨在寻找影响胶质母细胞瘤恶性进展的假基因,并深入探索其影响胶质母细胞瘤恶性进展的关键分子机制,为胶质母细胞瘤的靶向治疗提供新的可能。研究方法首先,通过对我们团队前期工作中已完成的胶质母细胞瘤和正常脑组织基因表达谱芯片测序数据（GEO dataset:GSE51146）进行进一步分析,最终筛选出差异表达的假基因UBDP1,其真基因UBD已被证实与胶质瘤患者预后相关;我们通过临床收集的30例胶质母细胞瘤样本和15例正常脑组织样本的QPCR实验验证UBDP1及其真基因UBD在胶质母细胞瘤中的异常表达,并对UBDP1和UBD的QPCR相对表达量和30例胶质母细胞瘤样本对应的患者临床信息进行Kaplan-Meier单因素生存分析以及Cox单因素和多因素生存分析。接下来,我们通过胶质母细胞瘤细胞系U87和U251的FISH+蛋白免疫荧光实验来探索UBDP1和UBD在胶质母细胞瘤细胞中的分布;通过构建UBDP1、UBD过表达/干扰稳转的U87、U251细胞系并进行CCK-8细胞增殖实验和transwell细胞迁移、侵袭实验来探索UBDP1和UBD对胶质母细胞瘤细胞功能的调控作用;通过构建裸鼠原位成瘤模型并进行荷瘤裸鼠的生存分析和裸鼠脑内肿瘤样本的免疫组化实验来探索UBDP1和UBD在体内对胶质母细胞瘤恶性进展的调控作用。最后,我们通过生信分析寻找与UBDP1和UBD相同结合位点的micro RNA,并进一步通过micro RNA过表达/干扰瞬转的U87、U251细胞系的western blot实验筛选出miR-6072;通过荧光素酶报告基因实验来探索UBDP1、UBD与miR-6072在细胞中的结合情况,并进行UBDP1、miR-6072、UBD的rescue实验和UBDP1、miR-6072表型回复实验来探索三者的作用机制。研究结果30例胶质母细胞瘤样本和15例正常脑组织样本的QPCR实验结果显示,UBDP1和UBD在胶质母细胞瘤中的表达较正常脑组织均显着升高;30例胶质母细胞瘤样本的UBDP1、UBD的QPCR相对表达量和对应患者临床信息的Kaplan-Meier生存分析以及Cox生存分析结果显示,UBDP1、UBD在胶质母细胞瘤中的表达均是胶质母细胞瘤患者预后的独立影响因素;U87和U251的FISH+蛋白免疫荧光实验结果显示,UBDP1和UBD主要分布于胶质母细胞瘤细胞的胞浆中;UBDP1、UBD过表达/干扰稳转的U87、U251细胞系的CCK-8细胞增殖实验和transwell细胞迁移、侵袭实验的结果显示,UBDP1和UBD均促进胶质母细胞瘤的细胞增殖、迁移和侵袭;脑内荷瘤裸鼠的生存分析结果显示,UBDP1、UBD过表达的脑内荷瘤裸鼠的生存时间显着低于对照组;裸鼠脑内脑内肿瘤样本的免疫组化结果显示,UBDP1、UBD过表达的肿瘤样本中的ki-67比例显着高于对照组。miR-6072过表达/干扰瞬转的U87、U251细胞系的western blot实验结果显示,miR-6072抑制UBD的表达;荧光素酶报告基因实验的结果显示,UBDP1、UBD均能和miR-6072在细胞中结合;UBDP1、miR-6072、UBD的rescue实验显示,在UBDP1过表达稳转U87、U251细胞中UBD表达量显着升高,进一步在UBDP1过表达稳转U87、U251细胞中过表达miR-6072后,UBD的表达量显着降低;UBDP1、miR-6072表型回复实验结果显示,在UBDP1过表达稳转U87、U251细胞中过表达miR-6072后,原本显着增加的细胞增殖、迁移和侵袭能力出现了显着的降低。研究结论假基因UBDP1通过竞争性结合miR-6072促进UBD的表达,从而促进胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭。
陈媛媛[4]（2021）在《长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制》文中研究表明一、背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球第三大最常见的癌症,尽管早期诊断和干预方面的技术进步已经有效改善了结直肠癌的总体生存率,但鉴于结直肠癌高复发率、高转移性及抗癌治疗的耐受性,晚期结直肠癌患者的预后仍然较差。术前放疗是晚期结直肠癌的常规治疗方法之一,但是近三分之一的结直肠癌患者对放疗表现出低敏感性或者完全抵抗。因此,放疗抵抗仍是治疗结直肠癌面临的主要挑战。在“精准医疗”的时代,探索克服放疗抵抗的新靶点或新分子,是个体化治疗结直肠癌患者的重要工具,对于提高结直肠癌患者的总体生存率有十分重要的意义。DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是一种精确的信号级联系统,可以检测DNA损伤并决定受损细胞的命运,是肿瘤生物学研究的重要领域之一,尤其在肿瘤的放疗敏感性调控中起关键作用。肿瘤细胞产生放疗抗性的重要原因是,癌细胞可以识别电离辐射诱导的DNA损伤,并通过激活各种途径修复这些损伤,癌细胞对DNA损伤具有较高的修复活性,因此对放疗产生高度抵抗。结直肠癌的发生也与癌基因、抑癌基因和DNA修复相关基因突变有关,如KRAS、TP53和BRCA1/2突变等,这些突变会引起基因组不稳定性,促进癌变过程。研究显示,靶向DNA损伤修复可以有效提高结直肠癌对放疗的敏感性,但关于DNA损伤修复的调控机制仍不清楚,研究发现了很多新的调控分子在DDR中发挥关键作用。因此,进一步寻找肿瘤中DNA损伤修复异常激活的新靶点或新分子,对于克服放疗抵抗、提高癌症治愈率具有重要意义。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lnc RNA）可以调节多种生物学过程,如细胞周期、细胞分化、X染色体失活、m RNA选择性剪接、RNA转录和翻译等。多项研究表明,lnc RNA失调是结直肠癌发生的主要因素之一,它通过调控其靶基因的表达,影响结直肠癌中的信号通路、癌细胞转移以及对放疗的敏感性。lnc RNA在DNA损伤修复中具有重要作用,它可以通过直接或间接的转录方式与蛋白质、DNA或RNA相互作用,调控DNA损伤修复。因此lnc RNA通过DNA修复通路调控结直肠癌对放疗的敏感性已经成为临床研究的一个重要领域,探索能够通过DDR通路调节结直肠癌放疗抗性的候选lnc RNA及其分子机制,对于改善结直肠癌患者的临床疗效意义重大。但是,目前大多数lnc RNA在DDR中的功能在很大程度上尚未阐明。ATR是检查点信号通路的中心转导因子,它可被DNA损伤和复制应激激活,在DNA损伤修复、细胞周期调节和细胞凋亡中具有广泛的功能和重要的生理意义。基于我们前期发现DNA损伤修复关键分子ATR具有结合lnc RNA能力的认知前提,本课题以此为切入点,利用RNA免疫共沉淀与高通量测序（RIP-seq）筛选出与ATR结合的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR验证,筛选出与ATR结合丰度最高的SCARNA2,从DNA损伤修复角度,全面探索了它调控结直肠癌放疗敏感性的具体效应及分子机制,为开发潜在的、预测结直肠癌放疗敏感性的标志物和治疗靶点提供了新的科学依据。二、研究内容及方法（一）Lnc RNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨1、RIP-seq筛选ATR结合的lnc RNA首先选用ATR抗体通过RNA免疫共沉淀方法（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）富集与ATR结合的RNA,通过高通量二代测序筛选与ATR结合的lnc RNA,选取排名前30位的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR的方法验证它们与ATR的相互作用关系,发现SCARNA2与ATR的结合丰度最高,因此将目标靶分子确定为SCARNA2。通过探究SCARNA2在15种细胞系的基础表达量,确定研究细胞系为结肠癌细胞系HCT116和HT29。2、DNA损伤对SCARNA2表达水平的影响将HCT116和HT29细胞经电离辐射（Ionizing radiation,IR）、DNA损伤诱导剂喜树碱（Camptothecin,CPT）或依托泊苷（Etoposide,ETO）处理后,在不同时间点分别提取细胞的RNA,经反转录和RT-PCR检测SCARNA2转录水平的变化。将HCT116和HT29细胞分别与DDR通路抑制剂（DNA-PKcs抑制剂Nu7441、ATM抑制剂Ku-55933、ATR抑制剂VE-821）孵育后,再分别用IR、CPT或ETO处理细胞后,在SCARNA2响应DNA损伤最明显的时间点提取RNA,RT-PCR检测DDR通路抑制剂对SCARNA2转录水平的影响。3、SCARNA2对DNA损伤修复通路的影响通过慢病毒包装质粒系统构建SCARNA2敲低（sh-SCARNA2）、CRISPR Cas9敲除（sg-SCARNA2）和过表达（SCARNA2-OE）稳转细胞系,通过RT-PCR测定下调和过表达效率。通过彗星电泳检测SCARNA2下调细胞照后的DNA损伤程度;通过免疫荧光的方法检测SCARNA2干扰细胞在照后0、0.5、4、8、12和24 h形成γH2AX和53BP1 foci的动态变化情况。最后通过蛋白凝胶电泳（Western Blot,WB）的方法检测SCARNA2下调细胞经IR、CPT或ETO处理后,DDR通路相关蛋白分子的表达水平变化情况。（二）Lnc RNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径的调控作用及机制1、下调SCARNA2对细胞照后基因转录组的影响取对照组和SCARNA2敲除组细胞,通过RNA-seq检测下调SCARNA2对照后基因转录组的影响。2、SCARNA2对非同源末端连接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）和同源重组（Homologous recombination,HR）修复方式的影响通过构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统测定SCARNA2下调细胞中NHEJ或HR的修复效率。通过免疫荧光检测下调SCARNA2对细胞核中形成RAD51和RPA2 foci的动态变化过程的影响。3、SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定通过RNA pull down实验筛选HCT116细胞中与SCARNA2结合的蛋白复合物,然后通过质谱检测,筛选与SCARNA2结合的蛋白。4、SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作情况的影响通过免疫共沉淀的方法探讨SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作及蛋白修饰的影响。（三）Lnc RNA SCARNA2促进DNA损伤修复调控结直肠癌放疗敏感性1、SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的影响采用SCARNA2下调和过表达细胞系,经IR、CPT、ETO等处理后,通过克隆形成率、CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术以及Western Blot检测SCARNA2对结肠癌细胞存活率、增殖能力和细胞活力、细胞凋亡率及细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响,进而探究SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的调控作用。通过流式细胞术和Western Blot检测结肠癌细胞经IR、CPT、ETO等处理后,SCARNA2对细胞周期进程以及周期通路相关蛋白水平变化的影响。2、SCARNA2对裸鼠荷瘤（CDX）模型放射敏感性的影响构建人源肿瘤细胞系裸鼠皮下荷瘤模型（Cell derived xenograft,CDX）,通过测量照后裸鼠皮下荷瘤肿瘤的体积,探究SCARNA2对瘤体细胞增殖能力的影响;通过对肿瘤组织进行TUNEL染色,检测SCARNA2肿瘤细胞的凋亡情况;通过对肿瘤组织进行免疫组化染色,探究SCARNA2对HR通路相关分子蛋白表达水平的影响。通过以上体内实验,探究SCARNA2对裸鼠皮下肿瘤放疗敏感性的调控作用。3、SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结肠癌组织中的表达差异通过组织芯片荧光原位杂交（Florescence In-Situ Hybridization,FISH）的方法分别检测临床结直肠癌病人放疗敏感和抵抗的肿瘤组织中,SCARNA2、ATR的表达以及二者共定位情况。具体研究内容及方法见技术路线图（图1）图1.技术路线图三、研究结果:（一）Lnc RNA SCARNA2可以促进结肠癌细胞的DNA损伤修复1、通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,它在结肠癌细胞中的基础表达量相对较高,并且以时间依赖性的方式响应由IR、CPT和ETO诱导的DNA损伤应答;当使用ATM和ATR抑制剂后,显着抑制了SCARNA2对DNA损伤的响应,说明DNA损伤诱导的SCARNA2上调受ATM/ATR激酶调控。2、下调SCARNA2会显着加重电离辐射导致的DNA损伤,同时延缓了DNA损伤的修复过程;并且抑制了由IR、CPT或ETO诱导的ATR-Chk1通路的激活。（二）Lnc RNA SCARNA2通过HR通路调控DNA损伤修复1、SCARNA2通过HR通路促进DNA损伤修复,下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2在损伤位点的募集,进而延缓了DNA损伤修复过程。2、SCARNA2结合蛋白主要富集在细胞周期、DNA损伤修复、DNA复制与合成、RNA转录及翻译等通路。SCARNA2的缺失会对细胞周期、细胞凋亡以及DNA损伤刺激反应的相关基因转录组产生影响。此外,下调SCARNA2可以抑制ATR与HR通路相关蛋白如Top BP1、NBS1、Mre11、Chk1等的相互作用。3、SCARNA2的缺失抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化,其机制可能与Chk1甲基化或泛素化的修饰方式有关。（三）Lnc RNA SCARNA2通过促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌的放疗敏感性1、照射和DNA损伤剂处理后,下调SCARNA2可以降低结肠癌细胞的存活能力、增殖能力和细胞活力;促进细胞凋亡,抑制G2/M周期阻滞。2、通过移植瘤内多点注射sg-SCARNA2慢病毒载体,成功下调了瘤体细胞内SCARNA2的表达水平,发现下调SCARNA2可以抑制照后肿瘤的生长速度、促进肿瘤细胞的凋亡,并抑制照后肿瘤细胞的HR修复通路。3、相较放疗敏感的结直肠癌组织,SCARNA2在放疗抵抗的结直肠癌组织中的表达水平高了80%左右（p<0.00001）。四、结论:本研究通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,通过一系列的体内外生物学实验发现SCARNA2与结肠癌细胞的DNA损伤修复和放射敏感性密切相关,SCARNA2的缺失可以抑制结肠癌细胞的DNA损伤修复能力。与DNA损伤诱导剂或IR联合使用,可以促进肿瘤细胞凋亡,增加了结肠癌细胞对放射的敏感性。通过对其具体机制的探讨,发现SCARNA2通过HR修复方式参与DNA损伤修复。缺失SCARNA2抑制了ATR下游靶点Chk1的磷酸化,其机制可能与Chk1发生了甲基化或泛素化修饰有关。同时,下调SCARNA2抑制了CDC25C的磷酸酶活性和Wee1的激活,进而通过影响Cyclin B/CDC2复合物的活性抑制G2/M期阻滞,由此明确SCARNA2通过激活ATR-Chk1-CDC25C/Wee1通路调控细胞周期进程。综上所述,SCARNA2有潜力成为结直肠癌的放疗增敏新靶点。此外,SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着,也有望作为潜在的结直肠癌放疗预后生物标志物。
龚雪[5]（2021）在《CircEsyt2调控血管重塑及GRK4加重梗死后心肌损伤的相关研究；内质网应激在孕期糖尿病所致子代成年后高血压中的作用研究》文中研究指明心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）在全球范围内具有较高的患病率和死亡率,已成为影响各国社会发展的重大公共卫生问题。最新统计资料表明,我国至少有3.3亿公民面临着CVD的威胁。CVD死亡约占居民总死亡原因的40%,远超肿瘤或其他疾病。而动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）导致的动脉粥样硬化性心血管病（ASCVD）,如冠心病、心肌梗死、脑卒中,是导致CVD最主要的病因。AS及其并发症已成为严重影响我国国民健康的主要因素,为国家经济社会发展带来了沉重的负担。AS引起的血管管腔狭窄主要累及全身大、中动脉,导致相应器官长期缺血进而引发系统性的功能障碍或器质性损伤。脂代谢紊乱是直接导致AS发病的独立危险因素。其中,氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）诱发血管内皮细胞损伤和炎症因子等生物活性分子的释放,刺激血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）过度增殖、迁移以及表型转换相关的血管重塑过程,最终促进动脉壁硬化和粥样斑块形成。目前,以降脂药物为基础的主流疗法虽然起到了延缓病情的效果,但并未完全阻止AS的病变进展,提示既往机制研究存在局限性。AS作为受“环境-遗传”交互作用高度影响的疾病,从表观遗传学入手探究AS相关的病理机制将会成为对经典遗传学的重要补充。非编码RNA（noncodingRNA,ncRNA）是一类重要的表观遗传调控分子,其中研究最多的微小RNA（microRNA,miRNA）和长链非编码RNA（long noncodingRNA,lncRNA）已被证明与AS发病的关系密切。近年兴起的环状RNA（circularRNA,circRNA）研究发现该分子具有独特的分子特点和广泛的生物学功能,其与心血管系统发育和疾病的关系也逐渐成为研究热点。因此,我们力图寻找AS疾病相关的circRNA,并对病理机制进行深入探讨,旨在扩展当前对circRNA作用分子机制的有限认识,同时为实现有效抑制AS发生发展的目标提供新的线索。第一部分环状RNA circEsyt2调控血管重塑在动脉粥样硬化中的作用及机制研究方法:1.环状RNA circEsyt2的鉴定及在AS中的生物学作用研究1.1高脂饮食喂养Apo E敲除（Apo E-/-）小鼠建立AS动物模型,对主动脉斑块组织进行高通量测序及circRNA表达谱分析,筛选出10个显着高表达的候选circRNA。通过qRT-PCR实验进行组织表达验证,锁定AS斑块中上调幅度最大的circRNA为目标分子继续后续研究,并根据其宿主基因命名为circEsyt2。1.2评估circEsyt2的分子特性,检测核酸酶RNase R消化和放线菌素D转录抑制处理对circEsyt2以及线性RNA（GAPDH,Esyt2）表达量的影响,比较环状和线性RNA分子结构稳定性的差异。检测circEsyt2在小鼠全身主要脏器中的分布情况,以及通过核质分离和荧光原位杂交（FISH）实验观察circEsyt2在小鼠VSMC中的亚细胞定位。评估小鼠和人属circEsyt2的序列相似程度,进行物种间保守性分析。1.3 FISH实验结合免疫荧光染色（IF）分析circEsyt2在血管壁中的细胞定位,以及检测circEsyt2在AS动物（小鼠主动脉）和临床血管样本（人冠状动脉）中的表达,比较其在正常（或轻度CAD）与AS（或重度CAD）样本间的表达差异,明确circEsyt2在发挥AS相关的生物学作用中可能涉及到的血管组成细胞类型。1.4通过qRT-PCR实验检测circEsyt2在C57BL/6J小鼠颈动脉线损伤模型中的表达变化,并利用FISH实验在血管平滑肌谱系示踪小鼠损伤颈动脉中进行验证,评估circEsyt2与损伤后血管重塑的关系。1.5分别构建特异敲降和过表达circEsyt2的AAV2/8腺相关病毒,在C57BL/6J小鼠颈动脉线损伤模型中进行转染,在经qRT-PCR和FISH-IF实验证明干预手段的有效性和特异性的基础上,通过苏木素-伊红（HE）染色观察损伤处颈动脉内膜新生的情况,以及细胞增殖指标Ki-67染色检测细胞增殖改变,利用免疫印迹实验（Western blot）和IF实验定量血管平滑肌表型转换标志物的表达变化。1.6细胞层面上采用siRNA特异性沉默circEsyt2表达,观察人主动脉平滑肌细胞（HASMC）和小鼠VSMC增殖（CCK-8、Ed U掺入实验）、迁移（划痕和细胞小室实验）、凋亡（细胞流式实验）以及表型转换标志物（α-SMA、Calponin、Myh11）表达的改变（Western blot）,明确circEsyt2对VSMC生物学行为的调控作用。2.CircEsyt2直接结合PCBP1蛋白并调控其在胞质胞核内分布的关系研究2.1利用生物信息学工具cat RAPID基于circEsyt2核酸序列预测结合蛋白,选择综合评分最高的蛋白即多聚胞嘧啶结合蛋白1（PCBP1）进行后续研究。2.2为证明circEsyt2与PCBP1的直接结合,我们采用生物素标记的circEsyt2探针在细胞水平上捕获实际结合蛋白（RNA pulldown实验）,经Western blot实验和蛋白质谱分析发现结合蛋白中含有PCBP1。通过RNA-蛋白质免疫共沉淀（RIP）实验用PCBP1特异性抗体反向捕获结合RNA,经qRT-PCR检测捕获下的RNA中存在circEsyt2。沉默circEsyt2后再次检测与PCBP1结合的circEsyt2量的变化,以说明两者结合具有特异性。利用FISH-IF实验观察circEsyt2与PCBP1在VSMC中的共定位.2.3通过IF实验分别在细胞以及损伤后颈动脉上敲降circEsyt2后观察PCBP1在胞内分布的改变,Western Blot检测PCBP1在胞质/胞核内表达量的变化。3.CircEsyt2通过影响p53β的生成调控VSMC增殖的机制研究3.1通过对circEsyt2沉默后的VSMC进行转录组高通量测序和基因表达谱分析,以及细胞实验验证,鉴定出受circEsyt2调控的细胞增殖相关的差异表达靶基因-PUMA和NOXA,因均属于p53信号通路,故提示circEsyt2对p53通路的调控作用。3.2通过qRT-PCR、Western blot实验检测沉默circEsyt2对p53总蛋白、乙酰化（赖氨酸382位点）水平以及可变剪接的影响,发现circEsyt2不影响p53基因转录、翻译和乙酰化修饰,但可调控p53剪接异构体p53β的生成。3.3细胞水平上观察干预p53β表达后circEsyt2对VSMC增殖调控的影响,目前p53β发挥的关键作用。4.CircEsyt2-PCBP1相互作用在剪接体p53β生成过程中的机制研究4.1利用生物信息学工具cat RAPID评估PCBP1与p53前体RNA（pre-mRNA p53）的结合可能性,通过RIP、FISH-IF实验在细胞上验证。4.2在已知PCBP1可招募剪接小体辅助因子U2AF65到前体RNA上促进基因剪接的基础上,单独或同时干预circEsyt2、PCBP1表达,RIP实验检测与U2AF65结合的pre-mRNA p53量的变化,明确circEsyt2对p53基因的可变剪接有调控作用,该作用的发挥依赖于PCBP1。4.3 RIP实验检测沉默circEsyt2后与PCBP1结合的与pre-mRNA p53量的改变,进一步明确circEsyt2与PCBP1的相互作用对p53基因可变剪接的影响。4.4通过qRT-PCR、Western blot实验检测干预PCBP1表达后circEsyt2对p53β生成调控的影响,证明PCBP1是介导circEsyt2发挥调控作用的关键调控因素。结果:1.经circRNA表达谱分析以及组织验证,我们发现并鉴定了一个在小鼠主动脉斑块组织中表达显着升高的circRNA,并根据宿主基因将其命名为circEsyt2。2.与线性转录本（GAPDH,Esyt2）相比,circEsyt2可抵抗核酸外切酶RNase R的消化作用,放线菌素D抑制细胞内基因转录后能长时间维持表达不被降解,表现出环状结构的高度稳定性。CircEsyt2在小鼠全身主要脏器中均有表达,在心血管系统的主动脉中表达相对较高。亚细胞层面上,circEsyt2大部分布于VSMC胞质。序列比对后发现小鼠与人源circEsyt2具有高度相似性。3.CircEsyt2在血管主要组成细胞（平滑肌、内皮、外膜成纤维和巨噬细胞）中均有分布,但其表达在小鼠主动脉粥样斑块和严重CAD病人的冠状动脉组织中显着上调,并且在小鼠颈动脉线损伤后的血管重塑过程中明显增加,以上变化主要体现在VSMC内。4.敲降血管中的circEsyt2后小鼠颈动脉线损伤处的内膜新生受到抑制,代表细胞增殖的Ki-67阳性率明显降低,而血管平滑肌表型标志物（α-SMA、Myh11）的表达上调。相反,过表达circEsyt2可促进颈动脉损伤处的内膜新生,细胞Ki-67阳性率升高,而表型转换标志物表达下调。细胞水平上沉默circEsyt2后,VSMC增殖、迁移能力减弱,凋亡增加,表型转换标志物表达增多。5.结合生物信息学预测和RNA pulldown、蛋白质谱和RIP等实验,我们证明circEsyt2可与PCBP1蛋白直接相互结合。6.沉默细胞或颈动脉内circEsyt2的表达后,胞质内的PCBP1表达量减少,而胞核内的表达增加。说明circEsyt2在胞质中与PCBP1蛋白直接结合并阻碍其核转位,可作为“分子开关“调控PCBP1在胞质胞核中的分布。7.沉默circEsyt2可促进p53发生可变剪接生成p53β,从而激活p53通路中的细胞增殖相关调控基因而抑制VSMC增殖。8.PCBP1可与pre-mRNA p53直接结合,通过促进U2AF65结合到pre-mRNA p53上从而提升剪接活性而正向调控p53基因可变剪接生成p53β。9.干预PCBP1可影响circEsyt2对p53β生成的调控作用。细胞质内circEsyt2-PCBP1的相互作用影响了PCBP1的入核,并最终导致p53β的生成改变。结论:1.CircEsyt2是AS中一重要的致病分子。2.CircEsyt2通过影响VSMC的增殖、迁移、表型转换过程从而参与血管重塑的调控。3.CircEsyt2通过调控p53基因剪接异构体p53β的生成而影响VSMC的增殖。4.PCBP1与pre-mRNA p53直接结合并促进p53基因可变剪接生成p53β。5.CircEsyt2-PCBP1在胞质内的相互结合影响了PCBP1入核发挥促剪接作用。心肌梗死（myocardial infarction,MI）是主要由动脉粥样硬化引起的严重并发症之一,具有较高的院内和院外死亡率。而MI后心肌细胞的进行性丢失是导致心功能恶化和终末性心衰的基础病理表现。因此,如何减轻MI后心肌细胞损伤是防治MI后心衰的关键。心肌细胞上存在多种G蛋白偶联受体（GPCR）,例如β1肾上腺素能和脂联素受体。它们在生理状态下介导了正常心功能的维持和调节,但在MI后因过度磷酸化而失敏从而产生促心肌细胞凋亡的作用。GPCR的磷酸化水平在通常情况下受到G蛋白偶联受体激酶（GRK）的调控,但在MI后被其过度磷酸化。在7个GRK亚型中,GRK4与高血压的发病关系密切,其表达或活性升高均可通过GPCR损害肾脏正常的尿钠排泄功能。另外,人群研究结果提示,与野生型相比,带有活性增强突变体（A142V、A486V和R65L）的个体表现出显着升高的3年内全因死亡、MI和卒中风险。故我们将对GRK4可能参与的MI后心肌损伤作用进行深入阐释和研究,以及对GRK4与引起心肌梗死的重要危险因素—高血压日夜节律间的关系进行初步探讨。第二部分G蛋白偶联受体激酶4在心肌梗死中的作用和关联研究方法:1.在C57BL/6J小鼠上建立MI模型,通过qRT-PCR和Western blot实验检测GRK4在心肌内的表达水平变化。2.通过免疫荧光染色检测MI后上调的GRK4在小鼠心肌细胞内的定位。3.构建心肌特异性GRK4敲除小鼠并进行MI手术,4周后用Masson染色检测心脏梗死后面积,明确GRK4在MI中的作用。4.通过M型心脏超声检测MI后心肌特异性GRK4敲除小鼠的左室射血分数（LVEF）,确定GRK4对MI后心功能的影响。5.通过PCR结合外显子测序检测GRK4各活性增强突变体（A142V、A486V和R65L）在杓型和非杓型高血压患者中的分布。结果:1.GRK4在小鼠MI后的心脏组织内表达明显升高。2.MI后心肌细胞内上调的GRK4主要集中在细胞核内。3.心脏特异性敲除GRK4可缩小MI后心肌的梗死面积。4.心脏特异性敲除GRK4可改善MI后的心功能。5.在非杓型高血压患者中,GRK4活性增强突变体的携带率高达84%,各突变体与非杓型高血压间均具有正相关性。结论:1.GRK4在MI中具有致心肌损伤作用,抑制GRK4可减轻MI后的心肌损伤。2.GRK4可能通过影响核内的基因转录过程从而发挥病理学作用。3.GRK4活性突变增强体可能促进非杓型高血压的发病。大量动物实验及流行病学调查研究表明,在遗传和环境因素之外,处于胚胎发育关键期的不良子宫内环境可对子代的长期健康产生不利影响,包括增加子代成年后罹患高血压的概率。现有研究表明,暴露在孕期母代糖尿病环境下会导致胚胎编程改变,产生子代血管功能障碍并导致高血压的发生。因此,关注子宫内高血糖环境暴露对子代长期健康的影响及危害具有重要的意义。然而,由母代糖尿病/高血糖编程导致的子代高血压发病机制目前尚未完全清楚。既往大量的实验结果表明,内质网应激（endoplasmic reticulum stress）是导致高血压发病的一个重要的病理生理机制。内质网在蛋白质合成、折叠以及运输中发挥了基础而关键的作用,同时也被认为是细胞应激的初始感受器。内质网稳态和功能的损害将诱发内质网应激,导致"未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）"这一复制信号通路的激活以企图恢复内质网的稳态。然而,该通路的长期激活将干扰细胞的正常功能并导致慢性疾病如高血压的发病。另有证据表明,高血压中内质网应激也参与了血管内皮细胞功能障碍的发生,而抑制内质网应激可提升一氧化氮的生物利用度,进而改善血管内皮细胞依赖的血管舒张功能。因此,我们将对内质网应激引起的血管内皮功能障碍在母代糖尿病导致的子代高血压发病中的作用进行研究和阐释。第三部分内质网应激在孕期糖尿病所致的子代成年后高血压发病中的作用研究方法:1.腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）制备糖尿病孕期大鼠模型,检测母代大鼠血糖、胰岛素浓度以及评估平均动脉压、体重变化和同胎子代数与对照组的差异。2.检测糖尿病及对照母代鼠的成年子代大鼠的体重、血压、心率、空腹血糖浓度。3.在孕期糖尿病及对照母代鼠的成年子代大鼠中进行腹腔注射内质网应激抑制剂4-苯基丁酸钠盐（4-PBA）或牛磺熊去氧胆酸（Tudca）,监测子代成年大鼠血压的变化情况。结果:1.STZ处理后孕期大鼠血糖浓度明显升高,血胰岛素浓度降低,而孕期时间、平均动脉压、体重增加和同胎子代数与对照组相比无明显差异。2.与对照母代大鼠的子代成年大鼠相比,孕期糖尿病母代大鼠的子代成年鼠体重、收缩压更高,而心率、空腹血糖水平无显着差异。3.使用内质网应激抑制剂处理孕期糖尿病母代大鼠的子代成年大鼠可抑制其血压升高,而对对照组母代大鼠的子代成年大鼠血压无明显影响。结论:1.孕期糖尿病大鼠的子代成年鼠更容易患有高血压。2.抑制内质网应激有助于改善孕期糖尿病大鼠子代成年鼠的血压。
潘建安[6]（2020）在《MicroRNA-146a在阿霉素诱导心肌损伤中的保护作用及机制研究》文中认为【目的】本研究旨在通过构建体内外慢性阿霉素（DOX）心肌损伤模型,探讨miR-146a在DOX诱导的慢性心肌损伤中的作用及机制,以及循环miR-146a水平与DOX心肌损伤之间的关系。【方法】第一部分:使用浓度梯度（0-5μM）和时间梯度（0-72h）的DOX刺激人心室肌细胞系（AC16s）,CCK-8法检测细胞的活力;Western Blot检测下游凋亡、自噬相关蛋白表达变化;TUNEL、流式细胞术检测细胞凋亡水平;GFP-LC3检测细胞自噬流变化;AC16s分别转染miR-146a的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitors）后用DOX（0.5μM,48h）刺激,以探究miR-146a在DOX所致慢性心肌损伤中对凋亡和自噬的调控作用;最后,在Targetscan生物信息学网站上预测miR-146a的下游靶基因TAF9b,用RT-PCR及双荧光素酶报告基因法验证其靶向性,构建TAF9b si RNA,与miR-146a inhibitors共转染于AC16s后用DOX（0.5μM,48h）刺激,通过补救实验验证靶基因在DOX所致慢性心肌损伤中的作用。第二部分:6周龄雄性C57BL/6小鼠和miR-146a基因敲除小鼠,用DOX（5mg/kg/w,4w,i.p.）建立慢性DOX心肌损伤模型,RT-PCR检测不同时间点心肌组织中miR-146a的表达;超声心动图检测小鼠心脏收缩功能;HE染色检测心肌组织结构变化;TUNEL检测心肌细胞凋亡水平;透射电镜检测心肌细胞超显微结构及自噬水平;Western Blot检测靶基因及下游凋亡、自噬相关蛋白表达改变。第三部分:6周龄雄性C57BL/6小鼠,用DOX（5mg/kg/w,4w,i.p.）建立慢性DOX心肌损伤模型,RT-PCR检测不同时间点血清中miR-146a的表达;收集DOX化疗病人及非DOX化疗病人化疗前后的血清标本及临床资料,RTPCR检测血清中miR-146a的含量并分析其与临床指标BNP,肌钙蛋白之间的关系。【结果】第一部分:CCK-8结果显示DOX呈时间和浓度依赖性降低AC16s细胞活力,并在DOX（0.5μM,48h）时细胞活力下降至50%左右;TUNEL、流式细胞术及Western Blot结果显示DOX促进AC16心肌细胞凋亡,表现为细胞凋亡率升高,Bax、Cleaved caspase-3表达上调和Bcl-2表达下调;GFP-LC3和Western Blot结果显示DOX抑制AC16心肌细胞自噬,表现为LC3荧光强度降低,LC3B-Ⅱ/Ⅰ及Beclin-1下调;RT-PCR结果显示,miR-146a在DOX干预后先上调,随后降低直至低于对照组水平;在DOX刺激下,过表达miR-146a能抑制AC16心肌细胞的凋亡,并促进其自噬,而敲除miR-146a进一步加剧心肌细胞的凋亡,并抑制其自噬;Targetscan生物信息学预测及双荧光素酶报告基因显示miR-146a靶向作用于TAF9b,并通过TAF9b/p53途径发挥其在DOX所致慢性心肌损伤中的保护作用。第二部分:RT-PCR结果显示,在DOX小鼠慢性心肌损伤模型的心肌组织中,miR-146a在3-7天升高,随后下降直至低于对照组水平;超声心动图结果显示,DOX干预后,与野生型小鼠相比,miR-146a敲除小鼠心脏收缩功能明显降低;HE染色结果显示DOX干预后,miR-146a敲除小鼠心肌纤维排列较野生型小鼠更加紊乱;TUNEL染色提示DOX干预后,miR-146a敲除小鼠的原位心肌细胞凋亡水平较野生型小鼠更高;透射电镜显示DOX干预后,miR-146a敲除小鼠的较野生型小鼠心肌细胞线粒体肿胀更加明显,自噬水平显着降低。第三部分:RT-PCR结果显示,在慢性DOX小鼠心肌损伤模型的血清中,miR-146a在3-7天升高,随后下降直至低于正常水平;在化疗病人血清中,DOX化疗后循环miR-146a水平在急性期升高,并与血清BNP水平呈正相关。【结论】miR-146a通过靶向TAF9b,调节P53的表达,抑制DOX引起的心肌细胞凋亡和自噬紊乱,从而保护DOX所致慢性心肌损伤;此外,循环miR-146a水平可能是DOX所致心肌损伤的标志物。
王兵[7]（2020）在《MDM2/MDMX-p53通路在肿瘤及其微环境中的功能研究》文中研究指明p53作为重要的肿瘤抑制因子,几乎在所有的人类肿瘤中都出现功能缺失。目前已有许多p53的激活剂被开发成肿瘤治疗药物,但是由于激活p53对正常组织带来的安全问题限制了其治疗效果。MDM2和MDMX是p53关键的两个负调控蛋白,MDM2与MDMX形成异源二聚体负责p53最核心的调控机制。对于生理状态下MDM2/MDMX异二聚体在成体中对p53的调控作用鲜有研究。肿瘤细胞与周围的基质组织和浸润的免疫细胞等共同构成复杂的肿瘤微环境,肿瘤免疫抑制的微环境干预着肿瘤的预后和治疗效果。肿瘤微环境中p53的失活也有助于免疫抑制微环境的形成。但是MDM2/MDMX-p53信号通路在肿瘤细胞和肿瘤微环境中的作用和具体调控机制仍不清楚。本论文主要以MdmxC462A和MdmxS314A两种突变小鼠为实验模型,分别探究了MDM2/MDMX异二聚体在生理状态、肿瘤及其微环境中对p53的调控以及p53发挥功能的机制。获得了如下的研究结果:（1）在生理状态下,利用时间特异性诱导表达的CreER MdmxC462A小鼠模型,克服了MdmxC462A/C462A胚胎致死的问题,MDMX RING结构域突变打开MDM2/MDMX异二聚体后未检测到p53的活性,小鼠脏器未出现病理变化,证明了该异二聚体在成体中对p53的调控并不是必需的。（2）在肿瘤发生发展过程中,以全身表达的ACTB-Cre MdmxC462A小鼠为模型,通过与E?-Myc小鼠杂交和不同p53功能突变质粒的转染,发现了部分打开的MDM2/MDMX异二聚体可以预保留p53的水平,预保留的p53以转录非依赖的方式在体外抑制MEF细胞的生长,在体内抑制淋巴瘤的发生。（3）在肿瘤微环境中,首次构建了MdmxS314A磷酸化突变的小鼠模型,利用该模型小鼠和原代骨髓来源巨噬细胞,通过皮下注射成瘤、流式分析、实时荧光定量PCR和组织免疫荧光等手段,发现Mdmx-S314A磷酸化突变介导的基质组织中p53上调可以通过提高肿瘤微环境中多种免疫细胞的浸润和M1型巨噬细胞的极化逆转免疫抑制的微环境进而抑制肿瘤的生长,提供了微环境中p53调控免疫状态的新功能。以上结果表明通过MDMX RING结构域或者磷酸化位点的突变靶向MDM2/MDMX异二聚体在正常生理状态下不影响p53的活性,揭示了预保留的p53非转录激活抑制肿瘤的新方式和调控肿瘤免疫微环境的新功能,这为利用MDM2/MDMX-p53通路开发更安全有效的肿瘤治疗手段提供了新的思路和理论依据。
李冠纬[8]（2020）在《单碱基基因编辑系统介导的FGF5基因敲除绒山羊的创制与评价》文中提出基于CRISPR技术衍生出的单碱基基因编辑系统,凭借其特有的碱基替换功能,理论上在不引入DNA双链断裂并且无需同源模板的情况下,完成胞嘧啶C向胸腺嘧啶T的转换。相比于传统的CRISPR/Cas9技术利用同源重组的方式完成单碱基替换,单碱基编辑系统具有操作更简便、适用范围更广泛、碱基替换效率更高、副产物更少等优势。同时,家畜经济性状的改变以及疾病的产生大多数是由单核苷酸变异引起。因此,利用单碱基编辑系统构建大型动物疾病模型和改良动物经济性状具有十分重要的意义。陕北白绒山羊的FGF5基因与毛囊生长发育相关,FGF5蛋白抑制陕北白绒山羊绒毛的生长发育,FGF5基因敲除后可以使陕北白绒山羊绒毛生长速度加快,产绒量大幅度提高。因此,本试验以陕北白绒山羊为试验对象,使用单碱基编辑器（Base Editor 3,BE3）在FGF5基因的第一外显子区域提前引入终止密码子,进而敲除FGF5基因在山羊个体中的功能表达。试验过程及具体结果如下:（1）山羊胎儿成纤维细胞的单碱基编辑器效率验证。在FGF5基因的第一外显子上设计4个sg RNA,并构建相应哺乳动物细胞表达质粒。将sg RNA和BE3质粒按照分组共同转染进入绒山羊胎儿成纤维细胞中,获得了产生单碱基突变的阳性细胞,分别检测4个sg RNA在细胞水平的编辑效率,编辑效率在10%-34%之间。表明设计的sg RNA能够有效靶向山羊胎儿成纤维细胞的FGF5基因。（2）FGF5基因编辑山羊的制备。构建这4个sg RNA的体外表达载体,4个sg RNA和BE3载体通过体外转录获得相应的sg RNA m RNA以及BE3 m RNA。通过同期发情与本交方式获得怀孕供体母羊,5只供体收集一细胞时期胚胎47枚。对胚胎注射BE3m RNA和sg RNA m RNA的混合液,体外培养后,将发育状态良好的22枚胚胎分别移植给7只受体母羊,受孕3只,最终获得5只山羊羔羊,编号分别为:#3、#16、#18、#19、#25。（3）基因编辑山羊编辑效率及脱靶效率检测。经检验发现所有的后代羔羊的FGF5基因均发生了编辑,并且部分位点产生了预期的高效率的点突变。因此,编辑效率为100%。对#16、#25两只基因编辑山羊进行脱靶预测与深度测序分析,在预测的19个脱靶位点中,发现了1处脱靶位点。遗传学分析后,表明该脱靶位点是由BE3系统造成,而非遗传所致。（4）基因编辑山羊的表型分析。采集基因编辑山羊和同龄野生型山羊的臀部皮肤组织,使用苏木精与伊红染色,观察到基因编辑山羊的毛囊数目多于野生型山羊。对比1月龄和2月龄基因编辑山羊与野生型山羊绒毛长度,发现基因编辑山羊的绒毛长度显着长于野生型山羊。转录组测序表明基因编辑山羊和与野生型山羊皮肤中FGF5基因的m RNA表达量基本无差异。使用免疫荧光和蛋白免疫印记杂交分析同月龄基因编辑山羊与野生型山羊臀部皮肤的FGF5蛋白表达情况,基因编辑山羊FGF5蛋白表达量低于野生型山羊。（5）山羊皮肤中癌症相关基因p53基因的检测,使用免疫荧光和蛋白免疫印迹杂交检测皮肤中p53蛋白的表达量,发现基因编辑山羊与野生型山羊之间无差异。表明BE3修饰后的基因编辑山羊与野生型山羊相比没有增加致癌率。综上所述,本研究成功利用单碱基编辑器BE3在基因组上提前引入了终止密码子,制备了FGF5基因敲除的陕北白绒山羊。该试验证明了在大型哺乳动物上使用碱基编辑器具有可行性,这一编辑策略可以简单、快捷地引入点突变并且敲除目的基因。
李小丽[9]（2020）在《诱导内质网应激下调LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的作用及分子机制研究》文中研究说明背景:乳腺癌（breast cancer,BC）是女性发病率最高的恶性肿瘤,每13分钟就有1人死于乳腺癌。因此乳腺癌已成为严重危害全球女性健康的重要疾病。其中三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是指不表达雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体（HER2）的乳腺癌,具有高异质性、高发病率、高侵袭性、较高抗药性及易复发转移等特点。因此在个体化治疗和特定靶向治疗的时代深入研究TNBC发生发展机制,寻找有效的治疗靶点和策略一直是该领域的研究热点。TNBC根据分子表型可分为4种亚型:腔面雄激素受体型、免疫调节型、基质样免疫抑制型和间充质干细胞样型。其中腔面雄激素受体型三阴性乳腺癌（LAR TNBC）以雄激素受体（androgen receptor,AR）信号通路活化为特征,AR在促进其发生发展中起至关重要的作用。因此针对LAR TNBC,靶向AR的治疗已成为近年来新的研究热点。AR是配体依赖性转录因子,与雄激素结合后进入细胞核,与特异的DNA部位即雄激素应答元件结合调控靶基因的转录表达。拮抗AR信号通路目前主要有两种策略:（1）雄激素剥夺治疗降低循环中雄激素水平;（2）使用AR拮抗剂直接阻断AR信号通路。这两种策略在早期治疗效果较好,但随着治疗时间的延长会逐渐表现出敏感性降低或反弹性快速增长,究其原因仍然与AR密切相关,主要表现为AR信号通路的异常活化:AR水平增加或敏感性增强、AR氨基酸突变、产生多种剪接变异体或AR通过配体非依赖的方式进行活化等,导致抗雄激素及抗AR治疗的抵抗。因此有研究明确提出第3种策略,直接减少AR,即通过促进AR降解或抑制其转录,以从源头靶向拮抗AR信号通路已成为一种新的治疗策略,目前相关药物正在进行临床前研究。因此寻找能直接减少AR表达的药物或途径具有重要意义。内质网是蛋白折叠和修饰的主要场所,未折叠或错误折叠蛋白在内质网聚集将引发内质网应激（ER stress）,从而激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。内质网应激可通过UPR启动PKR-样内质网激酶（PKR-like ER kinase,PERK）、肌醇需求型1（inositol requiring 1,IRE1）和激活转录因子-6（activating transcription factor 6,ATF6）通路抑制未折叠蛋白的生成或加速错误折叠蛋白降解,以缓解内质网压力,恢复细胞稳态。但若细胞内存在强烈的或持续的内质网应激反应,将促使UPR过度抑制未折叠蛋白生成和过度降解错误折叠蛋白,反而最终造成细胞死亡。我们课题组前期研究发现内质网应激诱导剂可显着降低前列腺癌LNCaP和C4-2细胞中AR mRNA和蛋白表达。由于乳腺癌与前列腺癌具有广泛的相似性生物学表型,那么诱导内质网应激反应是否也能降低LAR TNBC中AR表达呢?诱导内质网应激反应是否可以用于LAR TNBC治疗呢?方法:一、内质网应激诱导剂对LAR TNBC细胞中AR表达的影响1.采用western blotting检测内质网应激诱导剂毒胡萝卜素（TG）、布雷非德菌素A（BFA）和衣霉素（TM）对MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR蛋白水平的影响;2.采用real-time PCR检测TG和BFA对MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR mRNA表达的影响;3.采用western blotting检测蛋白合成抑制剂放线菌酮对TG下调MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR蛋白水平的影响;采用real-time PCR检测mRNA合成抑制剂放线菌素D对TG下调MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR mRNA表达的影响。二、内质网应激诱导剂抑制LAR TNBC中AR表达的分子机制研究1.采用western blotting研究PERK抑制剂GSK2656157、IRE1抑制剂4μ8c和ATF6 siRNA对TG下调MDA-MB-453细胞中AR表达的影响;2.采用western blotting研究PERK siRNA、ATF4 siRNA和CHOP siRNA对TG下调MDA-MB-453细胞中AR表达的影响;采用慢病毒过表达ATF4研究高表达的ATF4对MDA-MB-453和CAL-148细胞活力、增殖能力以及AR表达的影响;3.采用ChIP-PCR和DNA测序技术鉴定AR启动子区域是否含有ATF4结合位点;采用双荧光素酶报告实验研究TG和过表达ATF4对AR启动子活性的影响;4.在体内建立过表达ATF4的CAL-148细胞原位移植瘤模型,观察高表达ATF4对肿瘤生长和AR表达的影响;5.采用TCGA数据库分析AR和ATF4在乳腺癌组织中的相关性;采用免疫荧光双染检测TNBC组织芯片中AR和ATF4的表达并分析两者的相关性。三、选择性PERK/eIF2α激活剂对LAR TNBC的作用及机制研究在此部分我们以选择性PERK/eIF2α激活剂CCT020312为研究对象,观察其对LAR TNBC的作用及作用机制。1.采用CCK-8、实时无标记细胞增殖和细胞克隆实验观察CCT020312对MDA-MB-453和CAL-148细胞活力和增殖的影响;2.采用western blotting检测CCT020312对MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、mTOR、p-mTOR、AKT和p-AKT水平的影响;3.采用流式细胞术观察CCT020312对MDA-MB-453和CAL-148细胞周期和凋亡的影响;采用western blotting检测CCT020312对凋亡相关蛋白cleaved PARP、Bax和Bcl-2以及周期相关蛋白CDK4、CDK6和Cyclin D1水平的影响;采用RNAi敲低CHOP,再次观察CCT020312对凋亡的影响;4.在体内建立MDA-MB-453细胞原位移植瘤模型,观察CCT020312对肿瘤生长、AR、CDK4、CDK6、PERK/eIF2α通路和AKT/mTOR中关键分子表达的影响。结果:一、内质网应激诱导剂下调LAR TNBC细胞中AR表达1.在蛋白层面,3种内质网应激诱导剂TG、BFA和TM均能显着升高MDA-MB-453细胞中内质网应激反应标志分子Bip、CHOP、ATF4和XBP1s水平,显着降低AR的蛋白水平;2.在mRNA层面,TG和BFA也呈时间和剂量依赖性的显着降低MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR mRNA表达（P<0.05或P<0.01）;3.与单独的放线菌酮组比较,放线菌酮联合TG处理组并没有明显降低MDA-MB-453和CAL-148细胞中AR蛋白水平;与单独的放线菌素D组比较,放线菌素D联合TG处理组也没有明显降低细胞中ARmRNA表达。以上结果表明,TG并不促进LAR TNBC细胞中AR蛋白和mRNA降解,提示内质网应激诱导剂是从转录水平抑制AR表达。二、内质网应激诱导剂通过PERK/eIF2α/ATF4通路抑制AR转录1.内质网应激信号通路IRE1、ATF6和PERK对TG下调AR表达的影响。（1）与单独的IRE1抑制剂4μ8c组比较,4μ8c联合TG处理组可显着降低MDA-MB-453细胞中AR水平;（2）与ATF6siRNA+DMSO组比较,ATF6 siRNA+TG处理组可显着降低MDA-MB-453细胞中AR水平;（3）与单独的PERK抑制剂GSK2656157组比较,GSK2656157联合TG处理组不能显着降低MDA-MB-453细胞中AR水平。以上结果表明,诱导内质网应激可能通过PERK通路而不是IRE1和ATF6通路下调AR表达。2.干扰或过表达PERK、ATF4和CHOP对TG下调AR表达的影响。（1）PERK siRNA可显着逆转TG引起的MDA-MB-453细胞中AR下调;（2）ATF4 siRNA也可显着逆转TG引起的MDA-MB-453细胞中AR下调;（3）CHOP siRNA对TG引起的MDA-MB-453细胞中AR下调无明显影响;（4）过表达ATF4可显着升高MDA-MB-453和CAL-148细胞中ATF4和CHOP表达,显着下调AR表达;过表达ATF4也可显着降低CAL-148细胞活力和增殖能力（P<0.05或P<0.01）。以上结果表明,诱导内质网应激通过PERK/eIF2α/ATF4通路下调AR表达。3.AR基因调控序列上含有ATF4结合位点,结合位点分别位于AR启动子区域的-2813-2486、-2084-1742、-1453-1254;TG可促进ATF4与AR启动子结合并显着降低AR启动子活性,过表达ATF4也可显着降低AR启动子活性（P<0.05或P<0.01）。以上结果初步表明,诱导内质网应激反应可负调控AR的转录。4.体内实验也进一步证实过表达ATF4可显着抑制CAL-148细胞原位移植瘤的生长（P<0.05）和下调AR水平。5.来自TCGA数据库中的结果表明ATF4与AR在乳腺癌组织中呈负相关（P<0.01）;人TNBC组织芯片结果表明ATF4与AR在三阴性乳腺癌组织中呈负相关,但由于样本量太少而无统计学差异。三、选择性PERK/eIF2α激活剂抑制LAR TNBC的作用及分子机制研究1.体外研究（1）选择性PERK/eIF2α激活剂CCT020312可显着抑制MDA-MB-453和CAL-148细胞增殖（P<0.05或P<0.01）。（2）CCT020312可显着诱导MDA-MB-453和CAL-148细胞凋亡（P<0.05或P<0.01）;显着升高cleaved PARP和促凋亡蛋白Bax水平以及明显降低抗凋亡蛋白Bcl-2水平;RNAi敲低CHOP可显着逆转CCT020312诱导的cleaved PARP和Bax水平升高。以上结果表明CCT020312可诱导LAR TNBC细胞凋亡。（3）CCT020312可显着诱导MDA-MB-453和CAL-148细胞G1期阻滞;显着抑制G1期关键蛋白CDK4、CDK6和CyclinD1水平。以上结果表明CCT020312可诱导LAR TNBC细胞G1期阻滞。（4）CCT020312可显着升高PERK、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP水平,明显降低AR、p-AKT和p-mTOR水平。2.体内研究（1）CCT020312可显着抑制MDA-MB-453细胞原位移植瘤的生长（P<0.05）,但对裸鼠体重无明显影响。（2）CCT020312可显着升高p-eIF2α、ATF4和CHOP水平;CCT020312可显着降低AR、CDK4、CDK6、p-mTOR和p-AKT水平。结论:1.诱导内质网应激可从转录水平下调AR表达;2.诱导内质网应激通过激活PERK/eIF2α通路促进ATF4与AR启动子结合,从而抑制AR的转录活性;3.选择性PERK/eIF2α激活剂CCT020312在体内外均可显着抑制LAR TNBC,其机制与激活PERK/eIF2α通路抑制AR、诱导细胞凋亡和G1期阻滞以及抑制AKT/mTOR通路密切相关;以上研究结果表明,靶向激活内质网应激特定信号通路可为LAR TNBC的治疗提供新的策略和思路。通过本项目的研究也为其他基于内质网应激理论的药物研发提供理论参考。
李思奕[10]（2020）在《卵巢癌人源肿瘤异种移植模型的建立、鉴定与铂化疗药效观察》文中研究指明研究背景上皮性卵巢癌（EOC）是死亡率最高的女性生殖系统肿瘤,超过70%的患者在诊断时已经进入临床晚期,经过规范的一线手术与化疗,70%的患者在3年内肿瘤复发,晚期病例5年生存率仅为29%。基于动物模型的临床前研究可为筛选卵巢癌药物、优化临床用药方案提供理论支持。传统肿瘤模型使用体外持续传代的细胞系,在分子和细胞水平均与临床肿瘤差距较大,应用此模型筛选出的有效药物在人体中的有效性不足5%。人源性组织异种移植（PDX）模型是一种将肿瘤患者的肿瘤组织移植至重度免疫缺陷型小鼠（如NSG品系）体内,并使肿瘤组织在小鼠体内生长而构建成的一种肿瘤模型。PDX模型将肿瘤组织直接移植到NSG小鼠体内,尽可能保留了亲代肿瘤生长的微环境,例如肿瘤细胞周围浸润的淋巴细胞、细胞外基质、微血管等,完好的表现了亲代肿瘤性状,维持了肿瘤的异质性,是现阶段最优秀的肿瘤动物模型。但部分研究者也发现二者存在的差异。目前多种类型的肿瘤均成功建立PDX模型,对于EOC,不同研究中PDX模型建模成功率差距较大,影响移植成瘤的因素尚未明确。卵巢癌PDX模型能否替代临床卵巢癌组织进行肿瘤机制研究及抗肿瘤药物实验,现有研究对此也缺乏充分、有效的阐述。本研究建立了 EOC-PDX模型,从多个角度验证了卵巢癌PDX模型与临床肿瘤的一致性,并对模型在药效试验中的应用价值进行了初步评估,为PDX模型在临床前研究中的合理应用奠定了基础。此外,本研究探究移植成瘤的影响因素,有助于进一步提高成瘤率,建立更稳定、高效的卵巢癌PDX模型。研究方法1.卵巢癌PDX模型的建立（1）收集在北京协和医院行肿瘤细胞减灭术的EOC患者的新鲜肿瘤样本,移植至NOD-Prkdc-I12rg（NPI）免疫缺陷小鼠侧腹皮下,建立卵巢癌PDX模型。使用流式细胞学技术检测移植瘤中CD19和CD45表达水平以除外淋巴瘤。2.卵巢癌PDX模型的鉴定（1）卵巢癌PDX模型进行石蜡病理切片,将HE染色结果与原代肿瘤对比,在组织细胞水平验证PDX模型与原代肿瘤的一致性;（2）选取高级别浆液性卵巢癌PDX模型,对病理切片进行PAX-8、CK7、CK20、P16、P53、WT-1、ER、PR免疫组化染色,在蛋白质水平比较PDX模型与原代肿瘤的一致性。（3）对卵巢癌原代肿瘤和PDX模型肿瘤配对样本进行全外显子测序和转录组测序,在分子遗传学水平比较PDX模型与原代肿瘤的一致性。3.卵巢癌PDX模型成瘤影响因素分析统计卵巢癌患者的临床及病理信息,通过多因素回归模型分析各项临床病理特征与PDX模型成瘤率的关系。对原代肿瘤样本进行全外显子测序,在基因层面探究成瘤率的影响因素。4.卵巢癌PDX模型铂化疗药效观察通过移植传代扩大卵巢癌PDX模型数量后,在模型上进行铂类药物为基础的药效试验,将临床患者化疗结局和对应PDX模型化疗缓解情况进行一致性分析,评估卵巢癌PDX模型药效试验对临床患者化疗疗效的预测价值。研究结果1.卵巢癌PDX模型的建立本研究入组了北京协和医院2018年1月至2019年10月诊治的113例Ⅱ-Ⅳ期EOC患者,在肿瘤细胞减灭术中收集新鲜肿瘤样本,离体12小时内移植至免疫缺陷小鼠皮下,成功建立69位卵巢癌患者的PDX模型,P0代成瘤率61.1%,中位成瘤时间176天,通常在移植后4-8月内成瘤。通过标记CD19和CD45的流式细胞分析结果表明,移植过程中淋巴瘤率形成率处于较低水平。将成功建立的P0代模型进行传代,P1代成瘤率高达96.7%,并且成瘤周期明显缩短（p<0.001）。2.卵巢癌PDX模型的鉴定（1）HE染色结果显示,PDX模型较好地还原了原代肿瘤的组织形态学特征,同时观察到PDX模型中肿瘤间质成分减少,肿瘤细胞发生富集;（2）免疫组化结果显示10例高级别浆液性癌的PDX模型中,PAX-8、CK7、CK20、P16、P53、WT-1、ER、PR蛋白表达水平与原代肿瘤的一致性系数为0.698,提示一致性较好;（3）对10例高级别浆液性卵巢癌患者肿瘤与对应模型肿瘤样本分别进行全外显子测序,发现PDX模型较好地保留了原代卵巢癌的高频突变基因、杂合性缺失模式以及Signature 1（与自发脱氨产生内源性点突变相关）与Signature3（与DNA双链断裂后同源重组修复程序错误）两类重要突变特征;PDX模型与原代肿瘤拷贝数变异趋势一致,但前者基因组更不稳定,拷贝数变异程度更大。9对高级别浆液性癌配对样本的mRNA测序结果显示,PDX模型和原代肿瘤的转录组可能存在一定差异,移植成瘤将对肿瘤细胞的转录模式产生影响。3.卵巢癌PDX模型成瘤影响因素分析统计分析患者的临床病理特征,Logistic多因素回归模型结果显示,新辅助化疗是成瘤率的独立影响因素（OR=0.315,p=0.006）;而患者年龄、是否是复发病例、卵巢癌病理类型、分级与分期、术前CA125水平、TP53与BRCA1/2基因突变情况、移植位点数均不影响PDX模型的建立。进一步分析新辅助化疗对成瘤的影响,发现肿瘤Ki-67指数越高,成瘤率越高,而新辅助化疗显着降低了卵巢癌Ki-67指数。通过对38例卵巢癌原代肿瘤进行全外显子测序,发现新辅助化疗可导致肿瘤基因组杂合性缺失频率降低（p=0.014）,而杂合性缺失频率明确与成瘤率相关（p=0.024）;而肿瘤突变负荷、单碱基突变类型、微卫星不稳定性与成瘤结果不相关,也不受新辅助化疗的影响。4.卵巢癌PDX模型铂化疗药效观察本研究在31例患者卵巢癌样本建立的P1、P2代PDX模型上进行了以顺铂或卡铂为主的药效实验,利用改良的实体瘤的疗效评价标准（mRECIST）评价PDX模型的化疗疗效,发现PDX模型铂化疗的完全缓解率（60.6%）与临床患者铂敏感率（68.0%）具有良好的一致性（Kappa=0.655,p=0.001）,卵巢癌PDX模型可以较准确地预测临床患者的铂敏感性。完全缓解的PDX模型对应的卵巢癌患者比未获得完全缓解的PDX模型对应的患者有更长的无进展生存期（p=0.0111）。结论1.EOC在NPI小鼠中有较好的成瘤性,PDX模型P0代成瘤率为61.1%,但成瘤周期较长。传代后成瘤率增加、成瘤周期缩短。2.卵巢癌PDX模型与临床肿瘤在组织细胞学水平、蛋白质水平和基因组水平均显示出较好的一致性,PDX模型完整地保留了原代卵巢癌的组织细胞类型与分子遗传特征。3.新辅助化疗降低了肿瘤组织的Ki-67指数、降低肿瘤基因组杂合性缺失频率,从而导致移植成瘤率降低,应避免使用新辅助化疗后的肿瘤进行移植建模。4.PDX模型的铂药效试验结果与临床卵巢癌患者的铂敏感性具有良好的一致性,模型显示完全缓解的病例有更长的PFS,PDX模型对患者预后有预测价值。
二、PCR扩增石蜡包埋小鼠组织p53基因突变热点片段（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PCR扩增石蜡包埋小鼠组织p53基因突变热点片段（论文提纲范文）
（1）HOXC6对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内皮细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 同源框C6影响细胞增殖、迁移与凋亡的机制及其在心血管疾病的研究进展 |
| 引言 |
| 1.HOXC6与细胞生长相关分子和(或)信号通路 |
| 2.HOXC6与细胞凋亡相关分子和(或)信号通路 |
| 3.HOXC6与非编码RNA |
| 4.HOXC6影响细胞增殖、迁移及凋亡的其它机制 |
| 5.HOXC6在心血管疾病研究进展 |
| 6.总结及展望 |
| 7.本论文立题依据和研究目的意义 |
| 8.本研究技术路线 |
| 第二章 粥样硬化主动脉异常表达的同源框基因及Hoxc6促进大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 组织、细胞和主要实验试剂 |
| 2.1.3 siRNA和引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 建AS大鼠模型和采集组织标本 |
| 2.2.2 大鼠主动脉组织苏木素和伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色 |
| 2.2.3 大鼠主动脉组织免疫化学染色 |
| 2.2.4 细胞实验分组与细胞培养及鉴定 |
| 2.2.5 siRNA转染细胞 |
| 2.2.6 反转录实时定量聚合酶链式反应(real time quantitative reverse transcription olymerase chain reaction, qRT-PCR) |
| 2.2.7 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.8 Cell counting kit-8(CCK-8)实验 |
| 2.2.9 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU)细胞增殖检测方法 |
| 2.2.10 细胞划痕实验 |
| 2.2.11 Transwell实验 |
| 2.2.12 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 大鼠主动脉组织H&E染色结果 |
| 3.2 AS大鼠主动脉壁异常表达的Hox基因 |
| 3.3 Hoxc6 mRNA和蛋白在正常大鼠主动脉和心脏的差异表达 |
| 3.4 Hoxc6、p53及PCNA在 AS大鼠主动脉壁的异常表达 |
| 3.4.1 Hoxc6、p53及PCNA mRNAs在AS大鼠主动脉壁的异常表达 |
| 3.4.2 Hoxc6、p53及PCNA蛋白在AS大鼠主动脉壁的异常表达 |
| 3.5 大鼠血管平滑肌细胞免疫荧光鉴定结果 |
| 3.6 Hoxc6 siRNAs抑制RVSMCs中 Hoxc6表达的效率 |
| 3.7 下调Hoxc6表达抑制RVSMCs增殖 |
| 3.8 下调Hoxc6表达抑制RVSMCs迁移 |
| 3.9 下调Hoxc6表达对RVSMCs中p53和PCNA蛋白表达的影响 |
| 3.10 p53 siRNA抑制RVSMCs中p53的表达 |
| 3.11 下调p53 表达部分逆转Hoxc6 siRNA抑制RVSMCs增殖的作用 |
| 3.12 下调p53 表达部分逆转Hoxc6 siRNA抑制RVSMCs迁移的作用 |
| 3.13 Hoxc6与p53 siRNAs对 Hoxc6、p53和PCNA蛋白表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 39个Hox基因中的17个在AS大鼠主动脉壁异常表达 |
| 4.2 Hoxc6在AS大鼠主动脉壁高表达可能与VSMCs增殖活性增高有关 |
| 4.3 Hoxc6可能与ox-LDL协同促进RVSMCs增殖及迁移 |
| 4.4 Hoxc6促进RVSMCs增殖、迁移的效应可能与Hoxc6负调控p53表达有关 |
| 5.小结 |
| 第三章 HOXC6促进血管内皮细胞凋亡 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 细胞及主要实验试剂 |
| 2.1.3 siRNA和引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 H&E染色 |
| 2.2.2 免疫组织化学染色 |
| 2.2.3 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 细胞实验分组和细胞培养、鉴定及细胞转染 |
| 2.2.6 原位末端转移酶标记技术(Td T-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL)检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 H&E染色验证AS大鼠建模成功 |
| 3.2 Hoxc6、Bcl-2和Bax蛋白在大鼠主动脉壁的原位表达 |
| 3.3 大鼠主动脉内皮细胞的鉴定 |
| 3.4 鼠Hoxc6 siRNAs对 RAECs中 Hoxc6表达的抑制作用 |
| 3.5 下调Hoxc6 表达抑制RAECs凋亡 |
| 3.6 下调RAECs中 Hoxc6表达影响凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.7 人脐静脉内皮细胞的鉴定 |
| 3.8 人HOXC6 siRNAs对HUVECs中HOXC6表达的抑制作用 |
| 3.9 下调HOXC6表达抑制HUVECs凋亡 |
| 3.10 下调HOXC6表达影响HUVECs中凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.11 过表达HOXC6促进HUVECs凋亡 |
| 3.12 过表达 HOXC6影响HUVECs中凋亡相关蛋白的表达 |
| 4.讨论 |
| 4.1 Hoxc6在AS大鼠主动脉壁表达升高可能与VECs异常凋亡有关 |
| 4.2 HOXC6可促进体外培养的VECs凋亡 |
| 5.小结 |
| 第四章 HOXC6 经 PLCβ/PKCζ/NFκ-Bp65/IL-18途径促进人脐静脉内皮细胞凋亡 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 qPCR引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组和细胞培养及细胞转染 |
| 2.2.2 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.3 总蛋白提取和细胞膜蛋白及胞浆蛋白提取 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 下调HOXC6表达抑制PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性 |
| 3.1.1 下调HOXC6表达抑制PLCβmRNA表达 |
| 3.1.2 下调HOXC6表达抑制PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性 |
| 3.2 过表达HOXC6促进PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性 |
| 3.2.1 过表达 HOXC6促进PLCβmRNA表达 |
| 3.2.2 过表达HOXC6激活PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路 |
| 3.3 溶血磷脂酰胆碱逆转下调HOXC6表达而抑制 PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性的效应 |
| 3.4 LPC逆转下调HOXC6表达而抑制HUVECs凋亡的效应 |
| 3.5 LPC逆转下调HOXC6表达所致凋亡相关蛋白的表达变化 |
| 4.讨论 |
| 4.1 VECs异常凋亡是AS发生的始动环节 |
| 4.2 HOXC6经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径促进HUVECs凋亡 |
| 5.小结 |
| 第五章 HOXC6靶向血小板活化因子受体经PLCβ/PKCζ/NFκ-Bp65/IL-18途径促进人脐静脉内皮细胞凋亡 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 qPCR引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组和细胞培养及细胞转染 |
| 2.2.2 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.3 总蛋白提取和BCA测蛋白浓度 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 生物信息学分析 |
| 2.2.8 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.9 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 对3个CHD相关数据集进行生物信息学分析的结果 |
| 3.2 敲低HOXC6基因抑制PTAFR表达 |
| 3.3 过表达HOXC6促进PTAFR表达 |
| 3.4 血小板活化因子逆转下调HOXC6表达而抑制HUVECs凋亡的效应 |
| 3.5 PAF逆转敲低HOXC6而抑制PTAFR表达及PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性的效应 |
| 3.6 过表达HOXC6促进HOXC6与PTAFR启动子结合 |
| 3.7 ChIP-qPCR验证HOXC6蛋白与PTAFR启动子特定位点序列结合 |
| 3.7.1 10%total Input染色质DNA样品片段化效果的验证 |
| 3.7.2 ChIP-qPCR标准曲线 |
| 3.7.3 ChIP-qPCR扩增产物的特异性及片段大小的验证 |
| 3.7.4 HOXC6 蛋白与PTAFR启动子特定位点结合 |
| 3.7.5 过表达HOXC6促进HOXC6蛋白与PTAFR-promoter扩增位点结合 |
| 4.讨论 |
| 4.1 HOXC6可能靶向PTAFR经 PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18信号通路促进VECs凋亡 |
| 4.2 HOXC6与PTAFR启动子特定位点序列结合而促进PTAFR/PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18轴活性 |
| 5.小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 4.研究不足之处 |
| 致谢 |
| 主要参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ:发表论文 |
| 附录 Ⅱ:参加科研项目 |
（2）假基因RPL34-PS1促进B细胞淋巴瘤生长的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 假基因RPL34-PS1促进B细胞淋巴瘤生长 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第二部分 假基因RPL34-PS1促进体内B细胞淋巴瘤生长的机制研究 |
| 1 实验材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 综述 费城染色体样急性淋巴细胞性白血病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）假基因UBDP1竞争性结合microRNA调控胶质母细胞瘤恶性增殖侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胶质母细胞瘤基因表达谱芯片及临床样本分析研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二部分 UBDP1和UBD在胶质母细胞瘤细胞中作用的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第三部分 UBDP1/mi RNA/UBD调控胶质母细胞瘤进展机制的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第四部分 UBDP1和UBD在体内对胶质母细胞瘤的调控作用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 FAT10 基因及其编码蛋白的功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表论文及参加科研情况 |
| 致谢 |
（4）长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、~(60)Co-γ射线照射 |
| 2、细胞培养与处理 |
| 3、总RNA的提取、纯化及质量评估 |
| 4、RNA的反转录 |
| 5、实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 6、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) |
| 7、RIP-seq生信分析 |
| 8、SCARNA2下调(敲低/敲除)和过表达细胞系的构建 |
| 9、蛋白凝胶电泳(Western Blot) |
| 10、中性彗星电泳(Comet Assay) |
| 11、免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 12、统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| 1、RNA免疫共沉淀及高通量测序 |
| 2、ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| (二)SCARNA2的染色体定位及二级结构预测 |
| (三)SCARNA2在不同肿瘤细胞系中表达 |
| (四)结肠癌细胞在应答IR和 DNA损伤诱导剂时SCARNA2转录水平的变化 |
| 1、SCARNA2可以响应IR诱导的DNA损伤 |
| 2、SCARNA2可以响应CPT和 ETO诱导的DNA损伤 |
| (五)DDR通路抑制剂对SCARNA2表达水平的影响 |
| (六)SCARNA2下调和过表达细胞系的构建与验证 |
| (七)下调SCARNA2显着增加结肠癌细胞受到照射后的DNA损伤程度 |
| (八)下调SCARNA2显着抑制照后结肠癌细胞的DNA损伤修复过程 |
| (九)SCARNA2对DNA损伤修复信号通路的影响 |
| 1、下调SCARNA2可以抑制照后DNA损伤修复通路的激活 |
| 2、下调SCARNA2可以抑制由CPT和 ETO诱导的DNA损伤修复通路的激活 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 LncRNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径调控作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、真核RNA-seq测序 |
| 2、构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统 |
| 3、RNA pull down-MS |
| 4、蛋白免疫共沉淀(IP) |
| 5、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)敲除SCARNA2对照后基因转录组的影响 |
| 1、文库质检 |
| 2、基因表达相关性分析 |
| 3、基因差异表达分析 |
| 4、差异表达基因的GO富集分析 |
| 5、差异表达基因的KEGG富集分析 |
| (二)SCARNA2主要通过HR通路修复DNA损伤 |
| (三)下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2 的募集 |
| (四)SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定 |
| (五)下调SCARNA2可以影响ATR与 HR通路相关蛋白的互作 |
| (六)下调SCARNA2抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 LncRNA SCARNA2促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌放疗敏感性 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、实验动物 |
| 3、主要实验试剂 |
| 4、主要实验仪器及耗材 |
| 5、SABER-ISH探针信息 |
| 6、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、克隆形成率 |
| 2、细胞凋亡 |
| 3、细胞增殖/细胞活力 |
| 4、细胞周期 |
| 5、构建裸鼠皮下荷瘤(CDX)模型 |
| 6、移植瘤体内注射慢病毒载体方法 |
| 7、荷瘤裸鼠放射处理 |
| 8、石蜡切片制作实验 |
| 9、石蜡切片免疫组化实验 |
| 10、石蜡切片荧光TUNEL实验 |
| 11、组织芯片荧光原位杂交(FISH) |
| 12、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)下调SCARNA2可以降低由IR和 DNA损伤剂诱导的细胞存活率 |
| (二)下调SCARNA2可以增加照射和DNA损伤剂诱导的细胞凋亡 |
| (三)下调SCARNA2可以降低照射后结肠癌细胞的增殖能力和细胞活力 |
| (四)下调SCARNA2可以显着抑制结肠癌细胞经照射和DNA损伤剂诱导的G2/M期阻滞 |
| (五)SCARNA2对结直肠癌荷瘤模型放射敏感性的影响 |
| 1、构建裸鼠皮下荷瘤模型 |
| 2、移植瘤内多点注射慢病毒模型构建成功 |
| 3、下调SCARNA2可以抑制照后裸鼠皮下肿瘤细胞的增殖 |
| 4、下调SCARNA2可以促进照后结肠癌肿瘤细胞的凋亡 |
| 5、下调SCARNA2可以抑制照后结直肠癌肿瘤组织的HR修复 |
| (六)SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着 |
| 三、讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 附表一、RIP-seq数据分析软件及参数列表 |
| 附表二、RIP-seq数据库信息 |
| 附表三、RNA-seq测序质量预处理结果 |
| 附表四、ATR结合相关lncRNA列表(前100 位) |
| 附表五、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表六、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表七、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表八、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表九、RNA pulldown-MS鉴定的差异蛋白列表 |
| 文献综述 lncRNA在DNA损伤诱导的细胞周期检查点激活中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）CircEsyt2调控血管重塑及GRK4加重梗死后心肌损伤的相关研究；内质网应激在孕期糖尿病所致子代成年后高血压中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 第一部分 环状RNA circEsyt2调控血管平滑肌细胞重塑在动脉粥样硬化中的作用及机制研究 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 CircEsyt2 的鉴定以及调控血管重塑作用的研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料与实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二章 CircEsyt2 结合并调控PCBP1 核转位 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 CircEsyt2 调控p53 可变剪接生成p53β在 VSMC增殖中的机制研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 CircEsyt2-PCBP1 相互作用调控剪接异构体p53β生成的机制研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料与实验方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第一部分 全文总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 G蛋白偶联受体激酶4 在心肌梗死引起的心肌细胞损伤中的作用和机制研究 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与实验方法 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论及结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 内质网应激在孕期糖尿病所致的子代成年后高血压发病中的作用研究 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 6.1 研究背景 |
| 6.2 材料与实验方法 |
| 6.3 统计学分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.5 讨论及结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述环状RNA在动脉粥样硬化及相关疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章与科研成果 |
| 致谢 |
（6）MicroRNA-146a在阿霉素诱导心肌损伤中的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 绪论 |
| 材料与试剂 |
| 第一部分 miR-146a在慢性DOX诱导的AC16心肌细胞损伤中的作用 |
| 1.引言 |
| 2.实验方法 |
| 2.1.实验对象 |
| 2.2.DOX对 AC16s心肌细胞凋亡及自噬的影响 |
| 2.3.miR-146a对 DOX诱导的AC16s心肌细胞毒性的影响 |
| 2.4.miR-146a在 DOX诱导的AC16s细胞毒性中的作用机制探究 |
| 2.5.统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1.DOX通过诱导凋亡和干扰自噬对AC16s产生毒性 |
| 3.2.miR-146a通过抑制心肌细胞凋亡和改善自噬水平部分逆转DOX诱导的AC16s细胞损伤 |
| 3.3.miR-146a通过靶向TAF9b抑制P53 的表达参与部分逆转DOX诱导的AC16s细胞损伤 |
| 4.结论 |
| 第二部分:miR-146a在 DOX诱导的小鼠慢性心功能损伤中的作用 |
| 1.引言 |
| 2.实验方法 |
| 2.1.实验对象 |
| 2.2.小鼠DOX化疗过程中心肌组织中miR-146a的表达变化 |
| 2.3.miR-146a在 DOX诱导的小鼠心肌损伤中的作用 |
| 2.4.统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1.小鼠DOX化疗过程中心肌组织中miR-146a表达先升高后降低 |
| 3.2.miR-146a在通过抑制心肌细胞凋亡和改善自噬水平部分逆转DOX诱导的小鼠心功能损伤 |
| 4.结论 |
| 第三部分:循环miR-146a与 DOX诱导的心肌损伤的关系 |
| 1.引言 |
| 2.实验方法 |
| 2.1.实验对象 |
| 2.2.小鼠DOX化疗过程中血清miR-146a含量的变化 |
| 2.3.DOX化疗患者血清miR-146a含量的变化 |
| 2.4.统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1.小鼠DOX化疗过程中血清miR-146a含量先升高后降低 |
| 3.2.DOX化疗患者急性期血清miR-146a升高并与BNP呈线性相关 |
| 4.结论 |
| 讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的学术论文 |
（7）MDM2/MDMX-p53通路在肿瘤及其微环境中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肿瘤与微环境 |
| 1.1.1 肿瘤现状 |
| 1.1.2 肿瘤微环境的定义 |
| 1.1.3 肿瘤微环境中的免疫与炎症 |
| 1.1.4 肿瘤治疗 |
| 1.2 p53与肿瘤 |
| 1.2.1 p53概述 |
| 1.2.2 p53的功能 |
| 1.2.3 p53突变与肿瘤 |
| 1.2.4 靶向p53的肿瘤治疗 |
| 1.3 MDM2/MDMX异二聚体 |
| 1.3.1 MDM2 |
| 1.3.2 MDMX |
| 1.3.3 MDM2/MDMX对 p53 的调控 |
| 1.3.4 MDMX磷酸化修饰对p53的调控 |
| 1.4 本课题的研究目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和材料 |
| 2.2 主要仪器列表 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因工程小鼠饲养、繁育与管理 |
| 2.3.2 小鼠基因型鉴定 |
| 2.3.3 皮下注射成瘤处理 |
| 2.3.4 细胞培养、复苏与冻存 |
| 2.3.5 细胞辐照处理 |
| 2.3.6 小鼠胚胎成纤维细胞MEF体外分离 |
| 2.3.7 骨髓来源巨噬细胞BMDM体外分离 |
| 2.3.8 组织固定、包埋与切片 |
| 2.3.9 病理切片HE染色 |
| 2.3.10 免疫组织荧光染色 |
| 2.3.11 肿瘤组织单细胞悬液制备 |
| 2.3.12 免疫细胞流式检测 |
| 2.3.13 质粒克隆、转化与转染 |
| 2.3.14 细胞克隆形成试验 |
| 2.3.15 细胞和组织中RNA提取 |
| 2.3.16 实时荧光定量PCR |
| 2.3.17 蛋白质免疫印迹 |
| 2.3.18 数据统计与分析 |
| 第3章 MDM2/MDMX异二聚体在成体中对p53 的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 构建CreER Mdmx~(C462A)小鼠 |
| 3.2.2 CreER Mdmx~(C462A/C462A)小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.3 Tamoxifen诱导CreER Mdmx~(C462A/C462A)的表达 |
| 3.2.4 Mdmx~(C462A)小鼠的主要脏器未出现明显病理变化 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 p53以转录非依赖的方式抑制肿瘤的发生发展 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 CreER Mdmx~(WT/C462A) MEF细胞的基因型鉴定 |
| 4.2.2 保留p53水平抑制MEF细胞的生长,但是没有转录激活下游靶基因 |
| 4.2.3 保留p53水平抑制淋巴瘤的发生,但是没有转录激活下游靶基因 |
| 4.2.4 构建多种p53不同功能突变的质粒 |
| 4.2.5 仅p53~(R175H)突变不影响肿瘤细胞的生长 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 MDMX磷酸化介导的p53调控肿瘤免疫微环境 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 构建Mdmx~(S314A)突变小鼠模型 |
| 5.2.2 体外分离骨髓来源巨噬细胞并诱导极化 |
| 5.2.3 p38抑制剂预处理促进骨髓来源巨噬细胞M1型极化 |
| 5.2.4 Mdmx-S314A突变促进骨髓来源巨噬细胞M1 型极化 |
| 5.2.5 Mdmx~(S314A)小鼠抑制肿瘤生长 |
| 5.2.6 Mdmx-S314A阻断肿瘤生长导致的p53 下调 |
| 5.2.7 Mdmx-S314A介导的p53 上调促进肿瘤微环境中免疫细胞浸润 |
| 5.2.8 Mdmx-S314A介导的p53 上调促进肿瘤微环境中M1 型极化 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）单碱基基因编辑系统介导的FGF5基因敲除绒山羊的创制与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 单碱基基因编辑系统 |
| 1.1.1 单碱基编辑系统研究进展 |
| 1.1.2 单碱基编辑系统脱靶效应研究 |
| 1.2 单碱基编辑技术的应用 |
| 1.2.1 动物育种以及疾病模型方面的应用 |
| 1.2.2 单碱基编辑系统在植物方面的应用 |
| 1.2.3 碱基编辑器在哺乳动物细胞以及细菌中的应用 |
| 1.3 FGF5基因简述 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 FGF5基因敲除山羊的制备与评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 构建FGF5-sg RNA表达载体 |
| 2.1.3 细胞的培养与转染 |
| 2.1.4 细胞编辑效率检测 |
| 2.1.5 BE3 m RNA体外转录 |
| 2.1.6 sgRNA体外转录 |
| 2.1.7 受精卵胞质注射及胚胎移植 |
| 2.1.8 新生山羊的基因编辑效率检测 |
| 2.1.9 T-A单克隆基因分型及点突变效率初步统计 |
| 2.1.10 基因敲除山羊的深度靶向测序分析 |
| 2.1.11 脱靶效应检测 |
| 2.1.12 绒毛长度检测 |
| 2.1.13 蛋白质免疫印迹杂交 |
| 2.1.14 HE染色分析 |
| 2.1.15 免疫荧光 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 细胞编辑效率检测 |
| 2.2.2 BE3介导的山羊羔羊打靶效率验证 |
| 2.2.3 基因敲除山羊基因型分型分析 |
| 2.2.4 脱靶效应分析 |
| 2.2.5 表型分析 |
| 2.2.6 皮肤中p53基因表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 总结 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 创新点 |
| 3.3 下一步的研究内容 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）诱导内质网应激下调LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 诱导内质网应激对LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第二部分 诱导内质网应激下调LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的分子机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第三部分 选择性PERK/eIF2α激活剂对LAR型三阴性乳腺癌的作用及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间的研究成果 |
（10）卵巢癌人源肿瘤异种移植模型的建立、鉴定与铂化疗药效观察（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 卵巢癌人源肿瘤异种移植模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 卵巢癌人源肿瘤异种移植模型的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 卵巢癌人源肿瘤异种移植模型成瘤影响因素分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四章 卵巢癌人源肿瘤异种移植模型铂化疗药效观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、PCR扩增石蜡包埋小鼠组织p53基因突变热点片段（论文参考文献）
- [1]HOXC6对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内皮细胞凋亡的影响[D]. 龙向淑. 贵州大学, 2021(01)
- [2]假基因RPL34-PS1促进B细胞淋巴瘤生长的机制研究[D]. 刘金晶. 扬州大学, 2021(08)
- [3]假基因UBDP1竞争性结合microRNA调控胶质母细胞瘤恶性增殖侵袭的机制研究[D]. 洪帆. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制[D]. 陈媛媛. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [5]CircEsyt2调控血管重塑及GRK4加重梗死后心肌损伤的相关研究；内质网应激在孕期糖尿病所致子代成年后高血压中的作用研究[D]. 龚雪. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [6]MicroRNA-146a在阿霉素诱导心肌损伤中的保护作用及机制研究[D]. 潘建安. 上海交通大学, 2020(01)
- [7]MDM2/MDMX-p53通路在肿瘤及其微环境中的功能研究[D]. 王兵. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所), 2020(01)
- [8]单碱基基因编辑系统介导的FGF5基因敲除绒山羊的创制与评价[D]. 李冠纬. 西北农林科技大学, 2020
- [9]诱导内质网应激下调LAR型三阴性乳腺癌中雄激素受体表达的作用及分子机制研究[D]. 李小丽. 重庆医科大学, 2020(01)
- [10]卵巢癌人源肿瘤异种移植模型的建立、鉴定与铂化疗药效观察[D]. 李思奕. 北京协和医学院, 2020(05)