一、散发性结直肠癌微卫星不稳定性与Mt-p53及bcl-2蛋白表达的研究（论文文献综述）
孙一涵[1]（2021）在《石斛提取物毛兰素对人结直肠癌细胞的干预作用及机制研究》文中研究表明目的:结直肠癌（CRC）是一类临床上较为常见的恶性肿瘤。近些年来,其发病率显着提升并已跃升为全球恶性肿瘤第三位。在我国,该病的发病率亦较为显着,同时,其较广泛的危害性严重影响着我国人民的生产生活。目前,对于本病的治疗仍以外科手术为主,并辅以化学治疗,此外亦有生物免疫以及分子靶向等治疗方法。然而,由于免疫、靶向疗法的不甚成熟以及外科手术、化学治疗较高的复发率和诸多的不良反应,使得新型辅助疗法的开发和使用较为必要。中医药疗法具有毒副作用较低、患者依从性与耐受性良好等综合优势。其在本病的应用具体体现在以联合结直肠癌切除/根治手术治疗、联合化学药物治疗以及针对并发症状,减轻患者不良反应等方面。在众多关于恶性肿瘤的治法中,养阴生津法具有悠远的应用历史以及较高的临床地位。因大肠与肺相表里,共同调节体内阴津的输布,故大肠癌发生发展对于阴津的影响更为显着,同时,肠道内阴津的输布失调亦可为肿瘤的发生发展提供重要条件。养阴生津法不但可对肿瘤的生长起到抑制作用,亦可改善手术、放化疗所造成的机体津亏以及疾病易进展的病理状态。石斛属中医学“养阴生津法”的常用药物之一,历代医家总结出其最主要的作用在于“养阴生津”,并列其为“养阴圣品”。对于大肠癌的治疗,无论是在养阴生津法、清热生津法还是益气养阴法中,石斛均可作为主要的中药配伍。毛兰素（Erianin）作为中药石斛发挥功效的主要活性成分,具有抗血管生成、杀菌以及灭活病毒的多重生物学作用。近年来随着对于本单体实验研究的增加,发现了其在抗癌方面具有较高的价值以及前景。现有的资料表明,在抗癌方面,毛兰素具有抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、防止转移和抑制血管生成等综合作用。本实验的主要目的为探究毛兰素对SW480、HCT116两种结直肠癌细胞生长增殖、周期、凋亡的调控作用及其相关机制,同时亦进行了免疫缺陷小鼠移植瘤实验以评估其在生物体内的作用。主要研究意义是在中医学“养阴生津法”的指导之下,通过对中药石斛提取物单体抗肿瘤的机制研究,为结直肠癌的治疗开拓一种全新、疗效显着、无毒副作用且经济、便捷的中医药辅助疗法。方法与结果:为探究本药物对于肠癌细胞以及人正常结直肠上皮细胞增殖的影响,应用不同浓度的毛兰素处理SW480、HCT116、NCM460三种细胞,并在不同的时间节点采用CCK8法测定细胞活性,应用集落形成实验评估肠癌细胞的长期生存能力。结果显示,高浓度、长时间的毛兰素的刺激作用可明显抑制肿瘤细胞增殖并减弱其活性（P<0.05）。此外,NEM460细胞在药物刺激后的增殖活性未发生明显改变。为探究本药物对于肠癌细胞周期的调控作用,应用不同浓度的毛兰素处理肿瘤细胞48小时,在流式细胞仪上观测各组细胞的周期分布情况。结果显示,毛兰素组在经药物刺激后,G2/M期的细胞占比出现了不同程度的提升（P<0.05）,相反,G0/G1以及S期细胞占比随药物浓度增高呈现下降趋势（P<0.05）。为探究本药物对于肠癌细胞凋亡的影响,我们应用荧光法测定Caspase3/7活性、免疫印迹法测定剪切PARP以及Bcl-2家族蛋白的表达情况,并应用Annexin V-FITC流式细胞术以及DAPI染色法直接观测毛兰素对细胞凋亡的影响。结果显示,高浓度毛兰素显着提升了肿瘤细胞Caspase3/7的活性以及裂解PARP、Bak、Bax的蛋白含量,并减少了Bcl-2以及Bcl-xl的表达（P<0.05）。此外,染色实验显示随着药物浓度的增加,死亡细胞数占比逐渐提升,提示毛兰素显着提升了肠癌细胞凋亡率。为探究本药物对于Wnt/β-catenin信号通路的作用影响及相关机制,我们进行了对β-catenin磷酸化、核浆易位、转录活性、热稳定性、靶基因表达情况以及与信号通路阻断剂WNT974的联合效应研究。结果显示,毛兰素可在不改变β-catenin磷酸化水平的情况下显着增加细胞浆内、减少细胞核内的β-catenin表达,同时亦降低了β-catenin对其下游T细胞因子的转录活性,提升了β-catenin的热稳定性（P<0.05）。此外,毛兰素显着降低了两种靶基因C-myc、Cyclin D1的m RNA水平以及其蛋白表达（P<0.05）,且在与WNT974联合应用后,该效应未发生显着变化。为探究本药物对于CD47的表达以及巨噬细胞吞噬效率的影响,我们应用QRT-PCR法、免疫印迹法以及流式细胞术观测CD47的表达情况,并采用离体巨噬细胞实验测定其对于两种肠癌细胞的吞噬效率。结果显示,高浓度的毛兰素减少了肿瘤细胞表面CD47的分布水平以及CD47的m RNA水平、蛋白含量（P<0.05）。同时,两种细胞被毛兰素处理后,巨噬细胞对其吞噬效率显着提升（P<0.05）。在体内实验中,我们予NOD/SCID免疫缺陷小鼠皮下接种SW480肿瘤细胞的方式构建免疫缺陷小鼠移植瘤模型,并予50mg/kg毛兰素进行腹腔内注射,同时测定相关指标。结果显示,毛兰素显着减小了移植瘤的肿瘤体积以及质量,降低了移植瘤组织Bcl-2并增加了Bax的表达,且对β-catenin具有明显的入核阻滞作用。此外,其亦降低了移植瘤组织内c-Myc、CD47的蛋白含量（P<0.05）。结论:毛兰素对于SW480、HCT116细胞具有抑制增殖,促进凋亡,阻滞Wnt/β-catenin信号通路的作用,减少CD47表达量的同时提升了巨噬细胞对肠癌细胞吞噬效率,展现出了显着的抗肿瘤疗效,为结直肠恶性肿瘤提供了全新的研究靶点与辅助治疗思路,亦提示我们中药石斛以及中医学养阴生津法在大肠癌治疗中的重要效用价值。
姜敏[2]（2021）在《干扰素调节因子3在结肠癌中的表达以及对结肠肿瘤生长的调控作用》文中研究表明研究背景结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率仍呈增高趋势。中国国家癌症中心2015年的统计数据显示,我国结肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均排在前5位。临床研究表明,结肠癌的发生与发展涉及多种基因,其中,腺瘤息肉病基因（adenomatouspolyposis coli,APC）的突变率约占85%,其突变可导致结直肠腺瘤的发生与发展,而大多数结直肠癌又源自于结直肠腺瘤的形成与发展。干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3,IRF3）是干扰素调节因子家族的重要成员之一,具有免疫调节、抗病毒、抗炎和抗肿瘤等多种生物学功能。一项关于干扰素调节因子与结肠癌和直肠癌发病率的研究指出,IFNγ、IRF2和IRF3 3个基因中的5个标记单核苷酸多态性（single-nucleotide polymor-phism,SNP）与结肠癌的发病率相关,并且指出IRF3的风险增加最强。并且,近年来,人们在多种肿瘤中检测到IRF3的高表达,并开始关注IRF3基因改变的相关影响。比如:IRF3缺失可导致角膜感染I型单纯疱疹病毒发病率升高;导致视网膜厚度降低以及破坏视网膜突触的完整性等,但这些研究多集中在炎症和免疫调节方面,关于IRF3与癌症发生发展和预后相关的报道较少,因此本课题围绕IRF3与结肠癌发生发展及其相关机制展开。实验方法1、免疫组化方法检测人结肠癌和癌旁组织中IRF3和p-IRF3的表达水平。以“染色强度评分”和“染色阳性率”的乘积作为免疫组化的总评分,进而量化分析IRF3和p-IRF3的表达差异。2、从年龄、性别、病理分级、最大肿瘤直径、T分期、N分期、M分期和TNM分期8个方面对75例临床病例进行分组,采用免疫组化方法进行检测,进而分析IRF3和p-IRF3表达水平与结肠癌患者临床病理的相关性。3、从TCGA数据库中选取了 597例数据,按照IRF3表达水平分为高表达（286例）和低表达（311例）两组,绘制Kaplan-Meier曲线,进而分析IRF3表达水平与结肠癌患者的生存时间的关系。4、建立APCMin+IRF3+/-小鼠模型。通过繁育方式得到子代双基因缺陷的APCMin/+IRF3+/-小鼠模型。具体繁育方法为:利用雄性APCMin/+小鼠与雌性IRF3-/-小鼠交配,通过剪尾法提取子代小鼠尾尖全DNA,qPCR扩增目的基因序列,筛选获得子代APCMin/+IRF3+/-小鼠。5、分析IRF3基因缺陷对APCMin/+小鼠肠道肿瘤生长的影响。我们建立了 APC基因突变诱导的小鼠肠道肿瘤,并结合H.E.染色法分析IRF3基因缺陷对APCMin/+小鼠肠道肿瘤的数目与大小。6、分析IRF3基因缺陷抑制APCMin/+小鼠肠道肿瘤生长的机制。采用Western blot方法检测IRF3和p-IRF3蛋白表达水平,采用免疫组化法检测Bax、Bcl-2、p-p38 MAPK和c-Myc的表达水平。实验结果1、IRF3在癌组织中的表达水平高于癌旁组织,且其表达水平与患者的病理分级和最大肿瘤直径相关,但与患者年龄、性别、T分期、病理类型、N分期、M分期以及TNM分期无显着相关性。2、p-IRF3在细胞质和细胞核中均有表达,且在癌组织中的表达水平高于癌旁组织。细胞质中p-IRF3的表达水平仅与患者病理分级密切相关,与患者年龄、性别、最大肿瘤直径、T分期、病理类型、N分期、M分期以及TNM分期无显着相关性。细胞核中p-IRF3的表达与年龄、性别和病理分级相关,但与肿瘤最大直径、T分期、病理类型、N分期、M分期以及TNM分期无密切关系。3、在病理分级的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中,IRF3和p-IRF3在Ⅱ级中高表达,且明显高于Ⅰ级和Ⅲ级。4、从TCGA数据库中选取的597例病例的统计结果表明,IRF3低表达的患者的生存时间高于IRF3高表达的患者。5、IRF3基因缺陷可通过减少APCMin/+小鼠肠道腺瘤的数目与大小,进而抑制腺瘤的发生与发展。6、IRF3基因缺陷可降低APCMin/+小鼠中IRF3和p-IRF3蛋白表达水平。7、IRF3基因缺陷可促进APCMin/+小鼠肠道腺瘤的细胞凋亡。8、IRF3基因缺陷可促进p38 MAPK/c-Myc信号通路的激活。实验结论IRF3在人结肠癌组织中的表达水平高于癌旁组织,且与患者的病理分级和最大肿瘤直径密切相关。p-IRF3在癌组织中的表达水平高于癌旁组织,细胞质中p-IRF3仅与患者病理分级相关,细胞核中p-IRF3与患者病理分级、年龄和性别均有一定联系。在病理分级中,IRF3和p-IRF3在Ⅱ级中的表达水平明显高于Ⅰ级和Ⅲ级中的表达水平。在APC基因突变诱导的小鼠结直肠癌模型中,IRF3基因缺陷可减少肠道肿瘤的数目与大小,缓解肠道腺瘤的发生发展,其机制可能与IRF3和p-IRF3的表达水平降低、细胞凋亡相关因子Bax/Bcl-2比例升高以及p38 MAPK/c-Myc信号通路的激活有关。创新点本课题主要有以下两点创新点:第一,我们初步判定IRF3具有癌基因特性,并且是结肠癌生长的正调控因子;第二,IRF3表达水平与结肠肿瘤病理分级密切相关,且IRF3基因缺陷可以抑制APC突变背景下的肠道肿瘤生长。
杨永平[3]（2021）在《在结直肠癌中SSBP1基因的表达上调影响肿瘤细胞的生存能力的研究》文中研究说明结直肠癌（Colorectal Carcinoma,CRC）是世界范围内最常见的癌症之一,其发病率及死亡率在诸多癌症中均居前列。尽管有许多治疗方法的进展和应用,但仍难以治疗,仍难以获得较为满意的5年生存率。尽管近年来在精确医学和基因导向的治疗方面取得了重大进展,但肿瘤生长和发展的机制仍不完全清楚。众所周知,癌症细胞的供能模式以无氧呼吸为主,这种现象在正常结肠上皮中是不存在的。但是,介导这一过程的分子机制,特别是在线粒体内部、表面,以及周边的分子相互作用的过程及其机制,尚未完全阐述清楚。目前还不清楚线粒体容量（质量）和氧化磷酸化（电位）对于结直肠癌细胞在增殖过程中和对化学药物产生耐药性过程中的机制及重要性。目前已经有许多文献报道了有关肿瘤耐药性的通路。然而,很少有文献详细描述线粒体在肿瘤耐药性以及细胞氧化应激当中的作用。虽然在化疗药物治疗后,线粒体损伤是常见的,但这种损伤与肿瘤的增殖分裂能力、对化疗药物治疗的敏感性是否有一定的关联,尚无统一定论。在本报告中,我们生成了具有代表性的CRC三个病理分期（II期、III期、IV期）和附近正常肠道组织的蛋白质组学图谱,在每个分期当中将多个患者的蛋白质组学分析结果汇总在一起,以期在更大的队列中发现可能存在的共同差异。从这些图谱中,我们能够识别线粒体蛋白表达模式的显着变化,特别是关键调控因子线粒体单链DNA结合蛋白1（Mitochondrial single-strand DNA-binding protein 1,SSBP1）。之后,我们又将结肠癌细胞株中SSBP1的表达下调,发现其能够触发线粒体质量的下降和肿瘤细胞死亡的增加,并且在常规化疗药物顺铂的存在下,这种作用进一步加强。这些结果均提示线粒体的生物合成和维持可能在肿瘤细胞存活中起重要作用,并且提示SSBP1在化疗药物产生耐药的情况下有可能成为下一个治疗靶点。主要实验步骤:1、收集病人结肠癌组织、癌旁正常肠道组织。根据病理分期进行分组。2、按分组进行蛋白质组学分析。根据结果绘制基因表达热图,并对病理分期的组间进行Pearson相关性分析。样本的主要成分分析证实了不同病理分期的肿瘤组与正常样本组的关联性,同时也将黏液腺癌肿瘤样本与其他样本分离。并利用火山图显示正常和肿瘤样本间差异表达的基因。3、根据蛋白质组学结果中的细胞形态学相关数据,在数据库Reactome中,利用Reactome FI功能,对肿瘤样品中上调的蛋白质进行网络分析,确定了几种高度相关的蛋白质。4、KEGG途径的基因集富集分析,明确正常组织和肿瘤样本之间多种细胞通路的差异性表达。5、绘制线粒体基因表达热图,显示每个基因的表达谱,所有线粒体蛋白表达水平的相关性。火山图显示了所有肿瘤和正常组织样本中表达差异性较大的基因,包括高表达和低表达基因。6、根据线粒体蛋白的表达情况,应用通路数据库Reactome进行网络分析,建立多种蛋白质之间的联系。7、调取TCGA数据,和单细胞RNA序列配对分析。我们观察到的蛋白质组学数据与TCGA数据进行比较。绘制小提琴图计算正常和原发肿瘤样本之间的表达水平,绘制结直肠癌样本单细胞测序数据库的t SNE可视化图。进行二次印证。8、根据上述实验结果,确定SSBP1基因作为主要研究对象。9、选取两种结肠癌细胞系SW480和HT29。订制SSBP1si RNA。对SW480和HT29细胞系进行脂质体转染SSBP1si RNA,沉默SSBP1。同时订制SSBP1sh RNA,转染SW480和HT29,沉默SSBP1。10、通过Western blotting以及RT-PCR方法印证SSBP1-sh的有效性。11、将SW480结肠癌细胞系分成SSBP1-NC组、SSBP1-sh组、SSBP1-NC-cis组以及SSBP1-sh-cis组,分别检测细胞三磷酸腺苷（ATP）浓度、线粒体相关活性氧（ROS）。12、将HT29结肠癌细胞按前一步骤方法分成4组,分别检测细胞三磷酸腺苷（ATP）浓度、线粒体相关活性氧（ROS）。13、在HT29结肠癌细胞系中,分别检测Bax、Bcl-2蛋白在上述4组中的表达情况。14、在SW480和HT29细胞系中,通过7-AAD染色进行流式细胞术实验,通过靶向si RNA或scramble而沉默SSBP1,测量肿瘤细胞死亡数量。通过基于有丝分裂跟踪器染料的流式细胞术评估两个细胞系的线粒体质量和电位。15、进行对照组、siRNA组的划痕实验,以观察细胞生长情况。16、设定对照组、siRNA组,分别加入顺铂、5-FU进行24小时细胞培养后,测定细胞活性的情况。17、通过小鼠成瘤实验,观察在SSBP1沉默与非沉默组中,两种不同的结肠癌细胞系SW480和HT29对顺铂以及5Fu的不同反应（肿瘤生长速度）。主要实验结果:1、在结肠癌中,蛋白质表达的种类和数量与病理学分期有相关性。2、在结肠癌细胞中,有一些与细胞复制和合成相关的基因如PCNA、EIF3B等表达量升高,另外有明显升高的还有SERPINH1、TNC、S100A11、CEACAM5、HSPH1、FN1、NSUN2、LARS、PSME3、IPO5、PRKDC、STAT1、DDB1、RANGAP1等。3、在结肠癌细胞中,有一些与上皮细胞表面蛋白相关的基因如COL14A1、MUC2、DCN等表达量明显降低,另外有明显降低的还有CA1、OGN、IGHA2、CLCA1、FCGBP、CA2、ACADM、DPT、FUCA1、RPL8、CTSZ、CTSS、APOBR、GALM等。4、在结肠癌细胞中,某些通路的相关基因的表达量明显增加,前三位的通路有Aminoacyi-tRNA-Synthesis、Spliceosome、Proteasome。同时某些通路的相关基因的表达量明显降低,前三位的通路有OXPHOS、BCAA-Degradation、Lysosome。5、在与正常组织相比,在结肠癌肿瘤细胞中表达量具有明显差别的基因中,表达量上调的有SSBP1、TRP1、PYCR1、TOMM22,表达量下调的有ATP5C1、ACADS、ACADM、MAOA、CKB、VAT、HMGCS2、NMES1、CASP1。6、在结肠癌肿瘤细胞中,SSBP1的表达量直接参与调控线粒体的质量和肿瘤细胞的活性。7、在结肠癌肿瘤细胞中,SSBP1的表达量与线粒体的电位变化无明显相关性。8、在结肠癌细胞系中加入1uM/ml顺铂后,SSBP1的调控效果更加明显,即沉默SSBP1后,肿瘤细胞的死亡比例更高。9、在结肠癌细胞系中加入1uM/ml5-FU后,SSBP1的调控效果并不明显。10、沉默SSBP1后,肿瘤细胞生长速度减慢。11、在结肠癌细胞中沉默SSBP1后会导致线粒体功能障碍（ATP产生减少,ROS含量增加）,其效果在加入顺铂后更加明显。12、SSBP1参与了结肠癌细胞的增殖与细胞凋亡。具体表现为沉默SSBP1后肿瘤细胞生长速度减慢,细胞凋亡增加。此调控效果在加入顺铂后更加显着。结论:SSBP1作为线粒体重要的基因,在结肠癌细胞中的表达量较正常组织明显升高,并参与结肠癌肿瘤细胞的生长调控。当化疗药物产生耐药性后,顺铂有可能作为下一个靶点,来控制肿瘤细胞的生长。
项灵云[4]（2021）在《伴有CRC的MPCs患者的临床特征及MSI状态分析》文中进行了进一步梳理目的:分析单发结直肠癌（CRC）患者及伴有CRC的多原发癌（MPCs）患者的临床特征,探讨CRC的微卫星不稳定（MSI）状态与MPCs之间的相关性。方法:回顾性分析武汉市第四医院2015.01.01-2018.12.31经病检确诊的CRC患者的临床病理特征,以免疫组化法检测CRC患者肿瘤组织中的MLH1、MSH2、MSH6和PMS2四种蛋白的表达水平,探讨CRC患者的MSI状态与MPCs之间的相关性。结果:在224例CRC中,183例为单发CRC（81.7%,183/224）,伴有CRC的MPCs患者共41例（18.3%,41/224）。单发CRC患者与伴有CRC的MPCs患者男女比分别为1.1:1和0.8:1;224例CRC的中位年龄为58岁（28-86岁）,其中单发CRC中位年龄为61岁（28-86）,41例伴有CRC的MPCs者中位发病年龄65岁（51-79）。分组显示:单发CRC及伴有CRC的MPCs组≥50岁以上分别为88.0%（161/183）和87.8%（36/41）;两者的CRC发病部位均以直肠多见,分别为42.7%（78/183）和47.0%（19/41）;两者的CRC分期均以I-II期多见,分别占59.0%（108/183）和65.9%（27/41）。伴有CRC的MPCs患者性别、年龄、CRC部位、CRC的TNM分期与单发CRC患者之间差异无统计学意义（P>0.05）。在41例MPCs中,同时性MPCs占19.5%（8/41）,异时性MPCs占80.5%（33/41）,异时MPCs明显高于同时MPCs。第一原发癌（FPC）与第二原发癌（SPC）间隔时间为0-696个月,中位时间95月（90.5±10）。其中,FPC诊断后的2年内发生SPC病例占46.3%（19/41例）、10年后发生比例占24.4%（10/41例）,56.1%（23/41例）为其他时间段发生。在41例MPCs中,SPC的肠外病灶共43个,按照发生部位依次为胃（9/43,20.9%）、肺（8/43,19.0%）、乳腺（6/43,14.0）。在8例同时性多原发癌中右半结肠5例,占62.5%;33例异时性多原发癌中直肠18例,占54.5%。单发CRC及伴有CRC的MPCs患者中MSI-H的患者分别为（1.1%,2/183）及14.6%（6/41）,MPCs患者中MSI-H者明显高于单发CRC中MSI-H者（P=0.001）。结论:在CRC中,MPCs发生率为18.3%;伴有CRC的MPCs患者性别、年龄、CRC部位、CRC诊断时的TNM分期与单发CRC患者类似,不能通过CRC诊断时的性别、年龄、CRC部位、CRC诊断时的TNM分期预测MPCs的发生;伴有CRC的MPCs患者中,肠外发病器官中以胃最常见;异时性MPCs发生率更高;MPCs可发生于CRC的2年内及10年后;MSI-H的CRC患者具有更高地发展为MPCs的风险。
韩玮[5]（2021）在《苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究》文中研究指明目的:观察苦豆碱（ALO）对结直肠癌（CRC）细胞生物学行为的影响,研究苦豆碱在CRC中对miR-296-5p和转导和转录激活因子3（STAT3）的表达影响,从而进一步探讨苦豆碱抗CRC的作用及其潜在机制。方法:1.用不同浓度的ALO处理细胞,MTT法检测CRC细胞增殖。2.qRT-PCR检测不同浓度的ALO处理CRC细胞中miR-296-5p的表达。3.利用生物信息网站TargetScan V7.2对基于miRNA序列的靶基因进行预测,并采用双荧光素酶报告分析（dual-luciferase reporter assay）对预测结果进行验证。4.在室温下转染或共转染miR-296-5p mimics、过表达 STAT3 质粒、miR-296-5p inhibitor、siSTAT3,并且予以 ALO 处理。采用 qRT-PCR 检测处理后CRC细胞miR-296-5p的表达情况,Western blot检测STAT3的表达情况。5.采用细胞克隆形成实验检测ALO处理后转染的HCT116和SW480细胞增殖影响情况,使用流式细胞仪检测细胞凋亡影响情况,最后采用western-blot检测细胞凋亡蛋白相关影响情况。6.采用划痕愈合实验检测ALO对采用不同转染方案的HCT116和SW480细胞迁移影响,使用Transwell侵袭试验细胞侵袭影响。7.采用western-blot检测处理后EMT相关蛋白N-cadherin和E-cadherin的表达影响况。结果:1.采用MTT法检测,结果表明ALO对不同CRC细胞增殖具有不同程度抑制作用,并且具有剂量依耐性。其中针对不同的CRC细胞抑制作用不同,以对SW480细胞增殖的抑制作用最强,但对HCT116细胞增殖的抑制作用最弱,并且SW480细胞的IC50为 0.611mmol/L,而 HCT116 细胞的 IC50 为 1.141mmol/L。2.通过 StarBasev3.0 分析比较了结直肠腺癌和正常样本miR-296-5p,明确了 miR-296-5p再结直肠腺癌中低表达,再通过 qRT-PCR 验证了 CRC 细胞系（SW480、HCT116、HT29、SW620）内 miR-296-5p 的表达低于人肠上皮细胞HIEC,并且miR-296-5p在SW480细胞表达最高,HCT116表达最低。选择SW480细胞和HCT116细胞做为代表,经过ALO处理24h后,检测两者miR-296-5p表达,结果表明ALO能够上调SW480细胞和HCT116细胞miR-296-5p的表达,并且呈现剂量依赖性。3.采用TargetScan V7.2对miR-296-5p进行靶基因预后,结果提示STAT3是靶基因,并且目标位点位于3’-UTR。构建野生型（STAT3-WT）和突变型（STAT3-MUT）基因靶点STAT3的3’UTR-荧光素酶表达载体。对miR-296-5p表达最低的HCT116细胞行miR-296-5p mimic共转染,对miR-296-5p表达最高的SW480细胞进行miR-296-5p inhibitor共转染。双荧光素酶报告基因系统分析后,结果提示与STAT3-MUT共转染的细胞相比,miR-296-5p mimic和STAT3-WT共转染的HCT116细胞的荧光素酶活性明显抑制,而与miR-296-5p inhibitor和STAT3-WT共转染的SW480细胞的荧光素酶活性增强,从而证明STAT3是miR-296-5p靶基因。4.miR-296-5p mimics和ALO都抑制了 CRC细胞中STAT3的表达,但miR-296-5p inhibitor增强了 STAT3的表达。从而得出结论:上调MIR-296-5p和ALO处理均抑制STAT3的表达。5.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的增殖以及Bcl-2的表达,但促进凋亡以及Bax表达,并且这些作用都通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞增殖和凋亡。6.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的迁移、侵袭,并且通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞迁移和侵袭。7.上调miR-296-5p和ALO抑制CRC细胞的N-cadherin的表达,但促进E-cadherin的表达,这些作用可以被过表达的STAT3逆转,结果表明:ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达。结论:ALO以剂量依赖性的方式抑制CRC细胞增殖。miR-296-5p在CRC组织和细胞中低表达,ALO促进miR-296-5p的表达。STAT3是mi R-296-5p的靶基因,上调miR-296-5p和ALO均抑制STAT3的表达。ALO可以通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC的增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT。
林义真[6]（2020）在《大肠湿热证管状腺瘤与hMLH1、hMSH2表达的相关性研究》文中指出目的:探讨hMLH1和hMSH2在大肠湿热证管状腺瘤中的表达及二者的关系。方法:随机选取2019年2月至2020年1月福建省第二人民医院门诊及病房行电子结肠镜检查发现大肠息肉并行息肉电切术,息肉经病理证实为大肠管状腺瘤伴IN的患者80例,四诊合参进行中医辨证分为研究组（大肠湿热证组）、对照组（脾胃虚弱证组）各40例,并设立正常对照组20例（大肠正常黏膜）。通过免疫组织化学方法检测上述3组中hMLH1及hMSH2的表达并进行对比分析,探讨它们之间的相关性。结果:1、大肠湿热证组、脾胃虚弱证组、正常对照组3组间年龄、性别无明显差异（P>0.05）,具有可比性;对大肠湿热证组及脾胃虚弱证组的IN程度进行比较,两组间IN程度分布无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。2、hMLH1、hMSH2表达与年龄、性别均无明显差异（P>0.05）;在不同IN程度中的表达,差异均有统计学意义（P<0.05）。3、在大肠湿热证组、脾胃虚弱证组、正常对照组中hMLH1蛋白阴性表达率分别为50%（20/40）、35%（14/40）、0%（0/20）,两中医证型组与正常对照组中hMLH1的表达,差异均有统计学意义（P<0.05）;而大肠湿热证组与脾胃虚弱证组阴性表达率接近,二者均无明显差异（P>0.05）。4、在大肠湿热证组、脾胃虚弱证组、正常对照组中hMSH2蛋白阴性表达率分别为37.5%（15/40）、32.5%（13/40）、0.00%（0/20）,两中医证型组与正常对照组中的hMSH2表达,差异均有统计学意义（P<0.05）;而大肠湿热证组与脾胃虚弱证组阴性表达率接近,二者均无明显差异（P>0.05）。5、同是大肠管状腺瘤伴LGIN中,大肠湿热证组及脾胃虚弱证组中hMLH1阴性表达率分别为30.8%（8/26）、34.4%（11/32）,二者差异无统计学意义（P>0.05）;同是大肠管状腺瘤伴HGIN中,大肠湿热证组及脾胃虚弱证组中hMLH1阴性表达率分别为85.7%（12/14）、37.5%（3/8）,二者差异具统计学意义（P<0.05）。6、同是大肠管状腺瘤伴LGIN中,大肠湿热证组及脾胃虚弱证组中hMSH2阴性表达率分别为21.3%（10/32）、31.3%（6/26）,二者差异无统计学意义（P>0.05）;同是大肠管状腺瘤伴HGIN中,大肠湿热证组及脾胃虚弱证组中hMSH2阴性表达率分别为64.3%（1/13）、37.5%（9/14）,二者差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1、大肠管状腺瘤伴HGIN中,hMLH1表达与大肠湿热证可能存在相关。2、hMLH1、hMSH2阴性率的高表达可能与大肠管状腺瘤的发生与恶性转化有一定关系。
王欣[7]（2020）在《散发性结直肠癌胚系基因突变的相关性研究》文中研究表明目的:散发性结直肠癌的发病率占总结直肠癌的80%以上,是结直肠癌的“主力军”,它的发生发展是一个多基因、多步骤不断积累的过程,病因和发病机制尚未完全清楚。近年来,在散发性结直肠癌中随机发现的胚系突变被学者不断报道,这提示我们应多关注遗传因素在散发性结直肠癌发病机制中的作用,从新的视角来深入了解散发性结直肠癌的遗传基础。本课题利用二代测序技术检测散发性结直肠癌的基因突变,尤其对胚系突变的发生情况进行深入研究,为完善散发性结直肠癌的遗传易感性筛查及发病机制提供理论基础。通过比较发生胚系突变和未发生胚系突变患者的临床病理参数,评估胚系突变与散发性结直肠癌患者临床病理特征之间的关系。方法:收集2017年1月至2019年1月来自天津医科大学总医院的32例散发性结直肠癌患者的肿瘤组织和外周血进行DNA样本的提取。通过二代测序技术对DNA样本进行测序,测序数据经生物信息学分析后筛选出突变基因。根据基因检测结果,将患者分为胚系突变组和非胚系突变组,对两组患者的突变基因及突变个数进行比较。利用SPSS 25.0软件对两组患者的临床病理学参数进行统计分析,P<0.05认为差异具有统计学差异,P<0.01时认为差异显着。结果:1.本研究共筛选出2515个基因突变,分布在1590个基因中,其中突变频率较高的基因主要为:TP53、APC、KRAS、PIK3CA、AR、ATM、MUC4、TCF7L2、TMEM67、TTN、VKORC1、FBXW7。突变频率最高的基因为TP53基因（23/32）,其次为APC基因（22/32）和KRAS基因（11/32）,其中APC基因的突变类型主要为无义突变。错义突变类型为主的基因:TP53、KRAS、PIK3CA、ATM、MUC4、TTN。2.本研究纳入了32例散发性结直肠癌患者,其中发生胚系突变的患者11例,占全部患者的34.4%。这11例患者中共筛选出42个胚系突变,包括:78.6%的错义突变、14.3%的插入缺失和7.1%的无义突变。突变频率最高的基因为ATM基因（3/11）,其次为AR、CYP2C19、IDH2、TGFBR2、UGT1A1基因（2/11）。除AR、CYP2C19、FANCD2、MSH6、MUTYH、SMAD4基因外,其他基因的突变类型均为错义突变。3.本研究筛选出的胚系突变中,81.0%（34/42）的突变在Clin Var、1000G或Ex AC数据库中有归档,66.7%（28/42）为致病性突变,这些致病性胚系突变的基因主要跟错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、范可尼贫血通路等通路密切有关。4.将胚系突变组（n=11）和非胚系突变组（n=21）两组患者的临床病理参数和基因突变情况进行统计学分析,发现胚系突变组患者的发病年龄明显低于非胚系突变组患者（49.45±17.52 vs.64.00±12.77,P=0.027）,胚系突变组患者较非胚系突变组患者的肿瘤直径有增大的趋势（P=0.159）、基因突变个数有增多的趋势（P=0.120）。结论:1.本研究利用二代测序技术来筛选散发性结直肠癌相关的基因突变,证实了该方法的可靠性和可行性,为散发性结直肠癌的发病机制和遗传风险评估提供理论依据。2.本研究呈现了入组的散发性结直肠癌队列中基因突变的结果,34.4%的患者发生了胚系突变,81.0%的胚系突变在Clin Var、1000G或Ex AC数据库中有归档,66.7%的胚系突变为致病性突变,这提示我们应重视散发性结直肠癌中的胚系突变的存在及作用,我们还需深入研究来探讨这些致病性胚系突变在散发性结直肠癌发病机理的作用。3.我们还发现了一些新的胚系突变,扩展了散发性结直肠癌易感基因的胚系突变谱,有助于以后探讨与散发性结直肠癌相关的候选易感基因及少见的突变,对散发性结直肠癌患者的早期诊断、遗传咨询及临床表现前筛查具有重要的意义。4.临床病理资料显示,携带遗传易感基因胚系突变的散发性结直肠癌患者发病年龄更小,肿瘤直径有增大的趋势,基因突变个数有增多的趋势,这提示我们在临床中面对具有这些临床病理特征的散发性结直肠癌患者时,应尤其重视胚系突变的存在及肿瘤基因的筛查,为患者制定更完善的治疗方案、进行更严密的术后肿瘤监测、尽早警惕患其他肿瘤的风险,从而做好相应的早期预防工作。
孟鑫[8]（2020）在《Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究》文中研究指明肠道菌群在人类健康和疾病中起着重要的作用。肠黏膜表面的黏膜层是肠细胞与肠道菌群相互作用的场所,对维持肠道健康和肠道微生态平衡至关重要。黏蛋白2（Muc2）是肠黏膜层的主要成分。黏蛋白基因家族中有17个人类黏蛋白基因,根据其不同的结构主要分为分泌型黏蛋白和膜结合型黏蛋白两大类,其中Muc2是第一个被克隆并完全测序的人类分泌型黏蛋白基因,它主要由人结肠和小肠的杯状细胞表达,是小肠和大肠黏液的主要成分。Muc2已被证明是对抗外部病原体的重要保护屏障,与多种癌症疾病相关,如结直肠癌（CRC）、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌。在CRC中Muc2过表达有助于肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫效应分子的识别从而促进CRC的发展。Akkermansia muciniphila是肠道菌群的重要组成部分,具有多种生物学功能,如通过自身的蛋白水解酶调节Muc2的水平。Akkermansia muciniphila利用黏蛋白作为其生长唯一的碳源和氮源,还能产生多种降解黏蛋白的蛋白,但目前尚不清楚哪些蛋白可以降解黏蛋白。本论文工作主要包括三个部分:第一部分,从Akkermansia muciniphila基因库中选择一个编码假定蛋白的基因Amuc-1434,通过原核表达系统纯化重组蛋白Amuc-1434,探究其活性和基本的酶学性质。第二部分,主要制备和评估重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体,研究重组蛋白Amuc-1434与结直肠癌细胞系LS174T细胞表达的Muc2之间的相互作用和其降解Muc2的能力,并研究蛋白Amuc-1434在小鼠肠道中的表达位置。第三部分,主要探究重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞增殖、周期、凋亡、ROS水平和线粒体膜电位的影响及其发挥作用的机制。第一部分:重组蛋白Amuc-1434的纯化、活性鉴定、酶学性质及其活性位点的初步探究首先委托华大基因（公司）全基因合成了含有组氨酸标签的Amuc-1434重组质粒,重组的Amuc-1434以pET25b（+）为载体,酶切位点为BamH?和Xho?。将重组的Amuc-1434转到表达菌E.coli Rosetta感受态细胞中,经氨苄和氯霉素抗性筛选得到E.coli Rosetta-pET25b（+）-Amuc-1434转化子,通过对诱导条件的优化,确定在诱导时间为4 h、诱导剂IPTG浓度为1.0 mM、诱导温度为37℃条件下可以实现重组蛋白Amuc-1434的可溶表达。采用Ni2+-NTA亲和层析纯化了重组蛋白Amuc-1434,并通过Western blot鉴定了纯化结果。在接下来的测活实验中,通过紫外分光光度法发现重组蛋白Amuc-1434能够水解血红蛋白,活性为17.21 U/μg。通过动力学分析发现重组蛋白Amuc-1434对血红蛋白的Km值为0.22μM,Vmax值为0.26μM/min,Kcat值为0.18 min-1,催化效率(Kcat/Km)为0.82/min/μM。我们还发现重组蛋白Amuc-1434的浓度与水解血红蛋白的酶促反应速率呈正相关。重组蛋白Amuc-1434于pH 8.0和40℃条件下具有最佳水解活性,并且在40℃下具有良好的热稳定性,半衰期大于4 h。通过抑制剂Pepstatin A预处理,我们鉴定出重组蛋白Amuc-1434属于天冬氨酸蛋白酶家族的一员。通过不同金属离子预处理,我们发现Ca2+和Mn2+的存在能够显着提高重组蛋白Amuc-1434的活性。随后,我们发现将重组蛋白Amuc-1434含有的天冬氨酸蛋白酶保守位点“DTG”和“LLG”突变为“AAA”后,得到的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG仍然具有活性,为此,我们得出结论蛋白Amuc-1434的活性中心与“DTG”和“LLG”无关,可能涉及其序列中的其他天冬氨酸。第二部分:重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体的制备、对Muc2的降解及其在小鼠肠道中表达位置的研究本研究制备了重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体,通过ELISA检测其效价为1:4000,通过Western blot验证其特异性良好,通过HPLC鉴定其纯度可达89.72%。Dot-blot实验和细胞黏附实验表明,重组蛋白Amuc-1434与LS174T细胞表达的Muc2之间存在相互作用,并且重组蛋白Amuc-1434浓度越高,它们之间相关作用越强。ELISA实验发现这两个蛋白间的作用表现为重组蛋白Amuc-1434对Muc2的降解作用。此外,Western blot和免疫荧光实验也发现重组蛋白Amuc-1434可以降解Muc2。随后,通过免疫组化实验发现蛋白Amuc-1434主要表达在BALB/c小鼠的结肠中。第三部分:重组蛋白Amuc-1434对结直肠癌细胞LS174T增殖的抑制作用及机制的研究本研究通过MTT法发现重组蛋白Amuc-1434可以抑制LS174T细胞增殖,并且和其降解Muc2的能力有关。流式细胞术分析显示重组蛋白Amuc-1434会使LS174T细胞周期阻滞在G1期,并且上调细胞周期相关蛋白p53的表达。流式细胞术分析还表明重组蛋白Amuc-1434促进LS174T细胞凋亡,也能升高LS174T细胞内和线粒体相关的ROS水平。荧光显微镜观察表明重组蛋白Amuc-1434下调LS174T细胞线粒体膜电位。本研究通过Western blot发现重组蛋白Amuc-1434通过上调死亡配体TRAIL和与之结合的死亡受体DR4和DR5的表达激活了外源性死亡受体途径,活化形式的Caspase 8和Caspase 3被检测到表达上调,这可能是重组蛋白Amuc-1434促进LS174T细胞凋亡和抑制LS174T细胞增殖的原因。我们还发现由于Caspase 8的激活,重组蛋白Amuc-1434又间接激活线粒体途径,引起线粒体途径中凋亡相关蛋白表达的变化。研究结果显示,重组蛋白Amuc-1434诱导促凋亡蛋白Bid和Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,线粒体释放因子CytC、EndoG以及活化形式的Caspase 9表达上调,从而促进LS174T细胞凋亡。本篇论文首次表达纯化了来源于Akkermansia muciniphila的假定蛋白Amuc-1434,并发现其基本的酶学性质和天冬氨酸蛋白酶的属性,同时发现重组蛋白Amuc-1434具有降解Muc2的能力和通过上调TRAIL的表达激活细胞凋亡途径进而抑制LS174T细胞增殖的功能特性。
林欣[9]（2020）在《miR-452-5p调控ERK/MAPK正反馈环路在结直肠癌进展中的作用及机制研究》文中认为目的结直肠癌（colorectal cancer,CRC）为全球第三大恶性肿瘤,中晚期结直肠癌患者治疗效果不佳。因此深入研究结直肠癌发生发展的分子机制,有助于寻找其治疗靶点及改善患者预后。miRNA是小的单链非编码RNA,主要通过与3’非翻译区的互补序列结合而与mRNA相互作用,从而发挥基因负性调控的作用。miR-452-5p已被报道在多种肿瘤的发生发展中起重要作用,但其在结直肠癌中的研究较少。本研究旨在研究miR-452-5p在结直肠癌中的表达情况,探索miR-452-5p是否能够影响结直肠癌细胞的生物学功能及其发挥作用的具体分子机制。方法1.miR-452-5p在结直肠组织及细胞系中的表达验证1)公共数据库TCGA分析明确miR-452-5p在结直肠癌组织及正常肠上皮组织中的表达情况;2)qRT-PCR实验检测miR-452-5p在结直肠癌组织及配对正常组织、结直肠癌细胞系及正常肠上皮细胞系中的表达水平。2.miR-452-5p促进结直肠癌细胞恶性生物学行为1)体外增殖:将miR-452-5p mimics和inhibitors瞬时转染至结直肠癌细胞中,验证效率后进行CCK8实验及平板克隆实验;2)细胞周期:通过细胞周期实验验证miR-452-5p对结直肠癌细胞周期的影响;3)化疗抵抗:通过IC50、细胞凋亡实验及western Blot实验验证miR-452-5p对结直肠癌细胞凋亡以及对5-氟尿嘧啶化疗抵抗的影响;4)体内增殖:miR-452-5p过表达慢病毒感染结直肠癌细胞进行裸鼠皮下成瘤实验。3.miR-452-5p—PKN2/DUSP6—c-Jun 正反馈环路机制验证1)将测序结果中表达下调基因与预测靶基因数据库交集明确靶基因,并通过qRT-PCR、western Blot、双荧光素酶报告基因实验进行验证;2)通过western blot实验明确miR-452-5p对ERK/MAPK信号通路的作用;3)通过恢复实验（CCK8实验、平板克隆实验）验证PKN2/DUSP6轴参与miR-452-5p调控结直肠癌的过程。4)通过生物信息学分析预测、qRT-PCR及染色质免疫共沉淀实验证实了c-Jun对miR-452-5p的转录调控作用。结果1.与正常组织比较,结直肠癌组织中miR-452-5p的表达水平明显上调;并且在恶性程度较高的肿瘤细胞系HT29细胞中表达较高,在恶性程度较低的细胞系RKO、SW480中表达水平较低,且FHC中表达水平最低。2.miR-452-5p过表达后体外及体内增殖能力增强,且促进结直肠癌细胞G1/S期转化。3.miR-452-5p过表达的细胞5-氟尿嘧啶IC50值升高,凋亡率下降,5-氟尿嘧啶处理细胞后凋亡率趋势与之相同,提示miR-452-5p可以降低凋亡并且增强结直肠肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的化疗抵抗作用。4.miR-452-5p直接靶向PKN2、DUSP6,促进ERK/MAPK信号通路的异常激活。5.恢复性实验证明,PKN2、DUSP6过表达可抵消miR-452-5p对结直肠癌恶性生物学行为的促进作用。6.c-Jun对miR-452-5p的表达水平起转录调控作用。结论本研究证实miR-452-5p在结直肠癌中表达上调,过表达miR-452-5p可通过靶向PKN2/DUSP6轴来激活ERK/MAPK信号通路,miR-452-5p—PKN2/DUSP6—c-Jun正反馈环路机制促进结直肠癌的恶性生物学行为。
王晓红[10]（2020）在《芒柄花素通过激活线粒体依赖性MAPK信号通路诱导结直肠癌细胞凋亡》文中进行了进一步梳理目的:充分探讨芒柄花素通过线粒体依赖性途径调控MAPK信号通路对结直肠癌细胞凋亡及增殖的调控作用,给予临床一定启发。材料与方法:选取人直肠腺癌细胞SW1463作为研究对象,采用原代细胞培养的手段进行培养,选取第三代单层直肠腺癌细胞作为研究对象,进行如下分组:Control组（细胞不做处理）、H-FE组（高浓度芒柄花素组）、H-EF-i组（高浓度芒柄花素+ROS拮抗剂）、H-EF-p组（高浓度芒柄花素+ROS激动剂）。细胞继续培养24小时后进行相关项目观察。细胞形态学:HE染色观察各组细胞形态;免疫组织化学染色观察各组细胞IL-1β、Bax、Bcl-2及Caspase-9蛋白浓度表达;线粒体膜电位分析检测各组细胞膜电位及ATP合成能力;SEM观察各组细胞表面形态;TEM观察各组细胞内部线粒体形态;TUNEL检测各组细胞凋亡。细胞因子学:ELISA检测各组细胞中白细胞介素（IL-6、IL-8）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、血管内皮因子（VEGF）浓度表达;比色法检测ROS活性氧浓度;双荧光素酶法检测MAPK信号通路ERK、p38、JUN蛋白及其磷酸化浓度表达;RT-PCR检测细胞凋亡相关蛋白mRNA表达;WB检测各组细胞凋亡相关蛋白及MAPK通路关键蛋白浓度表达;CCK-8检测各组细胞增殖;划痕实验及Transwell实验检测细胞侵袭及迁移。最后总结分析数据。结果:1.细胞线粒体检测1.1膜电位检测芒柄花素干预后,细胞的膜电位出现降低,当ROS拮抗剂加入后,细胞的膜电位略有升高,而当其激动剂加入后,细胞的膜电位持续走低。初步证实,芒柄花素干预的结直肠癌细胞线粒体膜电位的走向与ROS活性氧的浓度变化具有直接的关联性。各组结直肠癌细胞膜电位变化的定性分析趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,提示细胞内氧化应激性损伤逐步明显,细胞将会持续发生线粒体氧化还原状态失常、呼吸链解偶联等现象,结直肠癌细胞将无法得到足够的能量供给,细胞发生凋亡及坏死的可能性逐步升高。1.2膜电位ΔΨm及ATP合成能力线粒体内部膜电位AΨm的分析,各组细胞的表达趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;线粒体内部ATP合成能力的统计分析,各组细胞的表达趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。提示结直肠癌细胞线粒体的膜电位及ATP合成能力与胞体内ROS活性氧的表达浓度具有直接的关联性。1.3 ROS活性氧浓度表达ROS活性氧的表达,各组结直肠癌细胞中的表达趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;HSP70的表达过程与ROS的表达体现出相同的趋势,各组结直肠癌细胞中的表达趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;SOD表达过程,各组结直肠癌细胞的表达趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。综上可以看出芒柄花素可以充分提高细胞内线粒体ROS活性氧的表达含量,充分削弱细胞的抗氧化能力。2.双荧光素酶系统检测MAPK信号通路关键蛋白活性2.1 ERK1/2信号通路各组蛋白的表达活性趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。2.2JNK信号通路各组蛋白的表达活性趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。2.3 p38信号通路各组蛋白的表达活性趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。3.RT-PCR检测ERK1/2、JNK及p38蛋白的磷酸化,各组细胞表达趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。4.细胞形态学4.1 HE染色对照组癌细胞的结构基本正常,细胞的绒毛比较正常,细胞整体的排列较为规则,细胞间质无水肿现象。当芒柄花素干预后,细胞明显出现萎缩状态,粘膜层出现萎缩,细胞绒毛逐渐脱落,细胞逐步出现坏死现象,水肿明显。随着ROS在细胞内表达含量升高,细胞的坏死及凋亡现象逐渐明显。4.2免疫组织化学染色促细胞凋亡蛋白Bax的分析过程中,研究提示各组细胞的表达趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;在抑细胞凋亡蛋白 Bcl-2 的分析过程中,研究提示各组细胞的表达趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Caspase-3的分析过程中,各组细胞的表达趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。4.3 SEM扫描电镜观察对照组细胞表面绒毛较多,芒柄花素干预后,细胞表面褶皱较多,表面绒毛逐渐减少,随着ROS表达含量的增加,结直肠癌细胞表面粗糙性逐渐增加,细胞坏死及凋亡性增加。4.4 TEM透射电镜观察对照组结直肠癌细胞线粒体正常,无明显的凸起及中毒现象。芒柄花素干预后,细胞线粒体中毒现象比较明显,在细胞内部可以少许看见凋亡小体存在,随着ROS在细胞内表达含量的增加,线粒体中毒现象逐渐明显,结直肠癌细胞中凋亡小体数目逐渐增多。在H-EF-p组结直肠癌细胞中可以明显的看到细胞内凋亡小体的存在。5.ELISA 检测:IL-6、IL-8、TNF-α 及 VEGF 浓度表达趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。6.细胞侵袭与迁移6.1划痕实验及Transwell实验各组结直肠癌细胞在24小时以后的迁移速度及侵袭程度趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。7.细胞增殖与凋亡7.1CCK-8检测细胞增殖结直肠癌细胞在完成转染后12小时、24小时、36小时及48小时后的增殖趋势比较为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。7.2细胞凋亡:各组结直肠癌细胞的凋亡率比较趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。7.3RT-PCR 检测增殖凋亡蛋白 Survinvin mRNA 的表达趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Bax表达趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Bcl-2的表达趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。7.4Western-blot检测细胞增殖与凋亡相关蛋白Survivin蛋白:各组结直肠癌细胞的表达趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Bax蛋白:各组结直肠癌细胞的表达趋势为Control<H-EF-i<H-EF<H-EF-p,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Bcl-2:各组结直肠癌细胞的表达趋势为H-EF-p<H-EF<H-EF-i<Control,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:芒柄花素可以充分降低结直肠癌细胞的增殖趋势,促进其凋亡趋势,导致结直肠癌细胞线粒体损伤加剧,癌细胞的应激性损伤明显增加,膜的通透性增加,线粒体膜电位及ATP合成能力降低,促进促细胞凋亡蛋白Bax的产生,联合Caspase蛋白激酶家族,最终促进结直肠癌细胞凋亡过程。芒柄花素可以充分促进结直肠癌细胞线粒体内部ROS活性氧的表达,通过ROS活性氧的表达量来激活结直肠癌细胞的线粒体凋亡途径,ROS作为最上游的信号因子参与了结直肠癌细胞凋亡过程,充分诱导ROS的表达含量,可以充分作为其上游信号参与线粒体途径介导结直肠癌细胞凋亡的产生。芒柄花素干预可以增加结直肠癌细胞中MAPK信号通路关键蛋白表达含量,二者体现出正向趋势。总结来看,在结直肠癌细胞的凋亡过程中,芒柄花素的作用机制为芒柄花素-ROS活性氧表达增加-启动线粒体凋亡途径-MAPK信号通路激活-结直肠癌细胞的凋亡发生。
二、散发性结直肠癌微卫星不稳定性与Mt-p53及bcl-2蛋白表达的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、散发性结直肠癌微卫星不稳定性与Mt-p53及bcl-2蛋白表达的研究（论文提纲范文）
（1）石斛提取物毛兰素对人结直肠癌细胞的干预作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 实验研究 |
| 第一章 实验材料 |
| 第二章 实验方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 1 毛兰素对于细胞活性及增殖的作用影响 |
| 2 毛兰素对于细胞周期以及凋亡的作用影响 |
| 3 毛兰素对于细胞Wnt/β-catenin信号通路及其靶基因的作用影响 |
| 4 毛兰素对CD47的表达以及巨噬细胞吞噬效果影响 |
| 5 毛兰素对免疫缺陷小鼠及其体内移植瘤的作用研究 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）干扰素调节因子3在结肠癌中的表达以及对结肠肿瘤生长的调控作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 结直肠癌概述 |
| 1.1 结直肠癌与调控基因 |
| 1.2 结直肠癌与临床病理指标 |
| 2 APC基因与结直肠癌 |
| 2.1 APC~(Min/+)小鼠模型 |
| 2.2 双基因突变小鼠模型 |
| 2.3 IRF3基因缺陷小鼠模型 |
| 3 小结 |
| 第二章 干扰素调节因子3在结肠癌中的表达以及对结肠肿瘤生长的调控作用 |
| 第一部分 结肠癌患者组织中IRF3和p-IRF3的表达水平及其与临床病理指标的相关性分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 组织类型 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 相关液体试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 原始实验数据的判读方式 |
| 2.2 原始实验数据的标准化方案 |
| 2.3 临床资料的分组方案 |
| 2.4 免疫组化实验操作步骤 |
| 2.5 实验数据的处理 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 IRF3在结肠癌和癌旁组织中的表达 |
| 3.2 IRF3表达水平与结肠癌患者临床指标相关性 |
| 3.3 p-IRF3在结肠癌和癌旁组织中的表达 |
| 3.4 p-IRF3表达水平与结肠癌患者临床指标相关性 |
| 3.5 IRF3和p-IRF3表达水平与结肠癌患者病理分级的相关性 |
| 3.6 IRF3表达水平与结肠癌患者生存时间的相关性 |
| 4 讨论与结论 |
| 第二部分 IRF3敲低对APC~(Min/+)小鼠肠道肿瘤生长的影响及分子机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 小鼠基因型鉴定所需试剂 |
| 1.4 组织病理形态学检测试剂 |
| 1.5 凝胶电泳试剂 |
| 1.6 相关试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 双基因缺陷小鼠模型的建立 |
| 2.2 APC~(Min/+)IRF3~(+/-)双基因缺陷小鼠基因型的鉴定 |
| 2.3 小鼠肠道肿瘤大小与数目的测定 |
| 2.4 小鼠肠道肿瘤组织病理学检测 |
| 2.5 Western blot方法检测小鼠肠道肿瘤组织中IRF3和p-IRF3蛋白的表达 |
| 2.6 数据处理与分析 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 小鼠基因型鉴定 |
| 3.2 IRF3基因缺陷减少了APC~(Min/+)小鼠肠道肿瘤的数目与大小 |
| 3.3 IRF3基因缺陷降低了APC~(Min/+)小鼠中IRF3和p-IRF3蛋白表达水平 |
| 3.4 IRF3基因缺陷可延长APC~(Min/+)小鼠的生存时间 |
| 3.5 IRF3基因缺陷可抑制APC~(Min/+)小鼠肠道肿瘤的发生与发展 |
| 3.6 IRF3基因缺陷可促进APC~(Min/+)小鼠肠道肿瘤的细胞凋亡 |
| 3.7 IRF3基因缺陷可促进p38 MAPK/c-Myc信号通路的激活 |
| 4 讨论与结论 |
| 全文总结 |
| 本论文的不足之处 |
| 第三章 综述 |
| 1 IRF3结构和功能概述 |
| 2 IRF3与先天免疫的关系 |
| 3 IRF3对干扰素(Interferon,IFN)-γ及其相关信号通路介导的抗肿瘤作用研究进展 |
| 4 IRF3对Hippo信号通路介导的抗肿瘤作用研究进展 |
| 5 IRF3对STING及其相关信号通路的抗肿瘤作用研究进展 |
| 6 IRF3对TLR3/IRF3和TLR4/IRF3信号通路的抗肿瘤作用研究进展 |
| 6.1 IRF3对TLR3/IRF3信号通路的抗肿瘤作用研究进展 |
| 6.2 IRF3对TLR4/IRF3信号通路的抗肿瘤作用研究进展 |
| 7 IRF3抗肿瘤作用及其机制研究进展小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术成果 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）在结直肠癌中SSBP1基因的表达上调影响肿瘤细胞的生存能力的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 综述 结直肠癌的流行病学特点以及蛋白质组学、线粒体在结直肠癌研究中的现状 |
| 1.1 世界范围内的结直肠癌流行病学特点 |
| 1.1.1 世界范围内的结直肠癌发病率 |
| 1.1.2 世界范围内的结直肠癌死亡率 |
| 1.1.3 世界范围内的结直肠癌的预后情况 |
| 1.1.4 结直肠癌的危险因素 |
| 1.1.5 世界范围内的结直肠癌的流行病学特点的总结 |
| 1.2 我国结直肠癌流行病学 |
| 1.2.1 数据来源 |
| 1.2.2 国内CRC的发病率 |
| 1.2.3 国内CRC的死亡率 |
| 1.2.4 年龄标准化率 |
| 1.2.5 关于CRC流行病学的思考 |
| 1.3 蛋白质组学 |
| 1.3.1 蛋白质组学的研究背景 |
| 1.3.2 蛋白质组学主要技术 |
| 1.4 蛋白质组学在CRC中的应用 |
| 1.4.1 蛋白质组学在CRC的发病机制及早期诊断中的应用 |
| 1.4.2 CRC发生远处、局部转移时蛋白质组学的改变 |
| 1.4.3 蛋白质组学在CRC的分子靶向治疗中的应用 |
| 1.5 蛋白质组学在CRC研究中存在的问题 |
| 1.6 有关蛋白质组学的展望 |
| 1.7 线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)与结直肠癌的相关性 |
| 1.7.1 线粒体DNA概述 |
| 1.7.2 线粒体DNA的改变与结直肠癌发生、发展的相关性 |
| 1.7.2.1 线粒体DNA突变 |
| 1.7.2.2 线粒体拷贝数 |
| 1.7.2.3 线粒体基因组微卫星不稳定性 |
| 1.7.3 线粒体DNA与结直肠癌的诊断、治疗中的应用前景 |
| 1.7.4 针对线粒体DNA的总结与展望 |
| 1.8 总结 |
| 第2章 研究背景 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 主要实验试剂 |
| 3.2 主要实验仪器 |
| 3.3 主要试剂配制 |
| 3.4 病人样本 |
| 3.5 蛋白质组学 |
| 3.5.1 蛋白质肽段的标记及质谱检测前预处理 |
| 3.5.1.1 缓冲液替换及蛋白质样本预处理 |
| 3.5.1.2 配置所需流动相 |
| 3.5.1.3 上机加样及测量 |
| 3.5.1.4 脱盐处理 |
| 3.5.2 质谱检测 |
| 3.6 细胞培养 |
| 3.7 Western-blot及RT-PCR实验 |
| 3.7.1 Western-blot |
| 3.7.2 RT-PCR |
| 3.8 流式细胞术 |
| 3.8.1 有丝分裂跟踪器绿色(MitoTracker Green) |
| 3.8.2 有丝分裂跟踪器深红色(MitoTracker Deep Red) |
| 3.8.3 FlowJo(TreeStar) |
| 3.9 细胞三磷酸腺苷(ATP)浓度检测 |
| 3.10 线粒体相关活性氧(ROS)测定 |
| 3.11 动物实验 |
| 3.11.1 shRNA |
| 3.11.2 HT29结肠癌细胞系实验 |
| 3.11.3 SW480结肠癌细胞系实验 |
| 3.11.4 免疫荧光实验 |
| 3.12 Meta分析与可视化 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 蛋白质组学部分 |
| 4.1.1 人结直肠癌的蛋白质组学特征 |
| 4.1.2 大肠癌患者线粒体基因表达的变化 |
| 4.1.3 联合数据库提供的数据分析证实结肠癌线粒体表达的改变 |
| 4.1.4 蛋白质组学数据中SSBP1相关肽段在不同样本中的表达情况 |
| 4.2 体外细胞水平实验 |
| 4.2.1 SSBP1在结肠癌细胞中的表达情况 |
| 4.2.2 在结肠癌细胞中SSBP1 的表达下调诱导了线粒体的功能障碍 |
| 4.2.3 在HT29结肠癌细胞系中SSBP1 参与了细胞增殖与细胞凋亡 |
| 4.2.4 SSBP1对大肠癌细胞系线粒体质量和细胞存活的影响 |
| 4.3 体内实验 |
| 4.3.1 HT29结肠癌细胞系于小鼠皮下种瘤,沉默组与非沉默组肿瘤生长对比 |
| 4.3.2 HT29结肠癌细胞系对顺铂敏感性分析 |
| 4.3.3 HT29结肠癌细胞系对5-Fu敏感性对照分析 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 蛋白质组学 |
| 5.1.1 蛋白质组学发展史及现状 |
| 5.1.2 蛋白质组学的机遇和未来发展前景 |
| 5.2 线粒体概述 |
| 5.3 恶性肿瘤与线粒体 |
| 5.3.1 线粒体DNA突变 |
| 5.3.2 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生 |
| 5.3.3 线粒体酶缺陷或失活 |
| 5.3.4 癌基因/抑癌基因改变 |
| 5.4 线粒体基因组成员之一SSBP1 |
| 5.4.1 基因SSBP1概述 |
| 5.4.2 SSBP1与结肠癌的关系 |
| 5.4.3 SSBP1通过影响结肠癌细胞中的有氧酵解(HIF-1α、PDK1、HK2、PKM2),导致线粒体的功能异常(ATP、ROS),进而导致线粒体质量的改变,最终影响肿瘤细胞的生存能力(增殖、凋亡)的变化 |
| 5.5 本实验中在肿瘤细胞中同时表达异常的其他基因 |
| 5.5.1 增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA) |
| 5.5.2 黏蛋白亚型2(mucoprotein 2,MUC2) |
| 5.5.3 核心蛋白聚糖(decorin,DCN) |
| 5.5.4 热休克蛋白D1(Heat Shock Proteins D1,HSPD1) |
| 5.5.5 NOP2/Sun结构域家族成员 2(NSUN2) |
| 5.6 线粒体质量及活性相关因子 |
| 5.6.1 与生物发生相关因子 |
| 5.6.2 与融合相关因子——MFN1/2、OPA1 |
| 5.6.3 与分裂相关因子——Drp1/Fis1 |
| 5.7 关于结直肠癌信号通路的发现 |
| 5.8 对于未来工作的展望 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）伴有CRC的MPCs患者的临床特征及MSI状态分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 本研究课题的学术背景及研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.3 本研究的主要来源及目的 |
| 1.3.1 研究来源 |
| 1.3.2 研究目的 |
| 第2章 研究内容 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 临床资料收集 |
| 2.2.2 组织标本收集 |
| 2.2.3 MLH1、MSH2、MSH6和PMS2 蛋白表达水平的检测 |
| 2.2.4 MSI免疫组化结果判读 |
| 2.2.5 统计学处理 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 结论 |
| 3.1 研究结论 |
| 3.2 本研究的特色与创新之处 |
| 3.3 应用前景与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 多原发癌 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的论文及成果 |
（5）苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 祖国医学部分 |
| 1. 祖国医学对肿瘤的认识(历史沿革) |
| 2. 祖国医学对结直肠癌的认识 |
| 2.1 祖国医学对结直肠癌疾病的认识 |
| 2.2 祖国医学对结直肠癌病因病机的认识 |
| 2.3 祖国医学对结直肠癌证型的认识 |
| 2.4 祖国医学对结直肠癌辨病、辩证治疗的认识 |
| 2.5 祖国医药抗结直肠肿瘤的优势 |
| 2.6 中药治疗结直肠癌的研究进展 |
| 3. 中药苦豆子及其成分苦豆碱的研究进展 |
| 3.1 中药苦豆子的研究进展 |
| 3.2 苦豆碱的药理学作用及其机制研究进展 |
| 现代医学部分 |
| 1 现代医学对结直肠癌病因及机制的研究 |
| 1.1 结直肠癌分子标志物 |
| 1.2 结直肠癌相关信号通路 |
| 2 microRNAs与结直肠癌的研究进展 |
| 2.1 microRNAs与结直肠癌相关机制研究 |
| 2.2 microRNAs在结直肠癌临床应用 |
| 3 结直肠癌EMT的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 ALO抑制结直肠癌细胞增殖 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞株的培养 |
| 2.2 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.3 MTT实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 不同浓度ALO对不同结直肠癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2 ALO对不同结直肠癌细胞的IC50 |
| 4. 总结 |
| 第二部分 ALO对miR-296-5p在结直肠癌细胞中表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 利用生物信息网站StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 2.3 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 2.4 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 3.3 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三部分 STAT3和miR-296-5p存在结合位点 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 TargetScan V7.2靶基因预测 |
| 2.3 野生型(WT)和突变型(MUT)-STAT3 3'UTR片段设计和合成 |
| 2.4 质粒的建立、提取及鉴定 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 生物信息学网站TargetScan V7.2显示STAT3是miR-296-5p的靶基因 |
| 3.2 miR-296-5p mimics能够抑制STAT3-荧光素酶活性 |
| 3.3 miR-296-5p inhibitor增强STAT3-荧光素酶活性 |
| 4. 总结 |
| 第四部分 ALO和miR-296-5p对结直肠癌细胞STAT3表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.4 qRT-PCR实验 |
| 2.5 Western blot实验 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 qRT-PCR检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等不同处理后HCT116细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等处理后SW480细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.3 Western blot检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等处理后HCT116细胞中STAT3的表达 |
| 3.4 Western blot检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等不同处理后SW480细胞STAT3的表达 |
| 4. 总结 |
| 第五部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞增殖和凋亡 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞克隆形成实验(Clone formation assay) |
| 2.4 细胞凋亡检测(Cell apoptosis detection) |
| 2.5 Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞增殖 |
| 3.2 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.3 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞凋亡 |
| 3.4 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.5 HCT116细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 3.6 SW480细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 4. 总结 |
| 第六部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞迁移和侵袭 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 划痕愈合实验 |
| 2.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞迁移 |
| 3.2 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞迁移 |
| 3.3 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞侵袭 |
| 3.4 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞侵袭 |
| 4. 总结 |
| 第七部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、 HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 Western blot实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Western blot检测HCT116细胞EMT相关蛋白N-cadherin(N-cad)和E-cadherin(E-cad)的表达 |
| 3.2 Western blot检测SW480细胞EMT相关蛋白N-cadherin (N-cad)和E-cadherin (E-cad)的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三章 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）大肠湿热证管状腺瘤与hMLH1、hMSH2表达的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 诊断标准 |
| 2.1 西医诊断标准 |
| 2.2 中医证候诊断标准 |
| 3 纳入和排除标准 |
| 3.1 研究、对照组纳入标准 |
| 3.2 正常对照组纳入标准 |
| 3.3 排除标准 |
| 4 免疫组织化学方法 |
| 4.1 电子结肠镜检查 |
| 4.2 组织标本的取材 |
| 4.3 主要试剂及仪器设备 |
| 4.4 免疫组化检测方法 |
| 4.5 染色结果判断标准 |
| 5 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 各组性别、年龄、IN程度构成情况比较 |
| 2 hMLH1在各临床参数中的表达 |
| 3 hMSH2在各临床参数中的表达 |
| 4 hMLH1在不同证型及正常对照组中的表达 |
| 5 hMSH2在不同证型及正常对照组中的表达 |
| 6 hMLH1在不同IN程度中与中医证型的表达 |
| 7 hMSH2在不同IN程度中与中医证型的表达 |
| 讨论与分析 |
| 1 大肠腺瘤与现代医学的相关性 |
| 1.1 大肠腺瘤与大肠癌的关系 |
| 1.2 一般资料分析 |
| 2 大肠腺瘤与hMLH1、hMSH2的相关性 |
| 2.1 微卫星不稳定性与大肠腺瘤的相关性 |
| 2.2 hMLH1、hMSH2蛋白与大肠腺瘤的相关性 |
| 2.3 hMLH1、hMSH2蛋白的临床参数分析 |
| 3 大肠腺瘤与祖国医学的关系 |
| 3.1 大肠腺瘤的中医病名 |
| 3.2 大肠腺瘤的中医病因病机 |
| 3.3 大肠腺瘤的中医证型分布 |
| 3.4 不同证型中hMLH1、hMSH2的表达情况 |
| 3.5 同一IN程度不同中医证型中hMLH1、hMSH2的表达情况 |
| 4 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）散发性结直肠癌胚系基因突变的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.1.4.1 新鲜组织DNA提取 |
| 1.1.4.2 石蜡包埋卷片组织DNA提取 |
| 1.1.4.3 外周血采集、处理及DNA提取 |
| 1.1.4.4 DNA测序 |
| 1.1.4.5 生物信息学分析 |
| 1.1.5 统计学分析方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 测序数据的质量控制 |
| 1.2.2 基因突变的分布情况 |
| 1.2.2.1 所有突变的分布情况 |
| 1.2.2.2 胚系突变的分布情况及富集分析 |
| 1.2.2.3 体细胞突变的分布情况 |
| 1.2.2.4 胚系突变与临床病理特征的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 二代测序技术 |
| 1.3.2 散发性结直肠癌的基因突变 |
| 1.3.3 散发性结直肠癌的易感基因 |
| 1.3.4 胚系突变与散发性结直肠癌的生物学特征 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 二代测序技术在结直肠癌易感基因检测方面的应用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 AKKERMANSIA MUCINIPHILA的基本特性和生物学功能 |
| 1.1.1 Akkermansia muciniphila在肠道中的分布及特征 |
| 1.1.2 Akkermansia muciniphila在宿主健康中的作用 |
| 1.1.3 Akkermansia muciniphila与免疫系统 |
| 1.2 分泌型黏蛋白MUC2 |
| 1.2.1 Muc2 结构、功能与肠道内稳态 |
| 1.2.2 Muc2 与肠道相关疾病 |
| 1.3 结直肠癌(CRC) |
| 1.3.1 CRC简介 |
| 1.3.2 CRC与 TRAIL相关的凋亡途径 |
| 1.3.3 ROS与 CRC |
| 1.4 立题依据和研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 重组蛋白AMUC-1434 的纯化、活性鉴定、酶学性质及其活性位点的初步探究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验用品 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组质粒的转化 |
| 2.3.2 重组蛋白的诱导表达及表达条件优化 |
| 2.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.4 纯化蛋白浓度的测定 |
| 2.3.5 Western blot鉴定纯化蛋白 |
| 2.3.6 纯化蛋白活性的测定 |
| 2.3.7 重组蛋白Amuc-1434 动力学反应的测定 |
| 2.3.8 重组蛋白Amuc-1434 浓度对酶促反应速率影响的研究 |
| 2.3.9 重组蛋白Amuc-1434 最适反应pH和温度的测定 |
| 2.3.10 重组蛋白Amuc-1434 温度稳定性的测定 |
| 2.3.11 抑制剂对重组蛋白Amuc-1434 活性影响的研究 |
| 2.3.12 金属离子对重组蛋白Amuc-1434 活性影响的研究 |
| 2.3.13 点突变对重组蛋白Amuc-1434 活性影响的研究 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 重组蛋白Amuc-1434 诱导条件的优化 |
| 2.4.2 重组蛋白Amuc-1434 的纯化及Western blot鉴定 |
| 2.4.3 重组蛋白Amuc-1434 的活性测定 |
| 2.4.4 重组蛋白Amuc-1434 动力学检测 |
| 2.4.5 重组蛋白Amuc-1434 浓度与酶促反应速率的关系 |
| 2.4.6 重组蛋白Amuc-1434 的最适pH值 |
| 2.4.7 重组蛋白Amuc-1434 的最适反应温度和热稳定性 |
| 2.4.8 几种蛋白酶抑制剂对重组蛋白Amuc-1434 活性的影响 |
| 2.4.9 金属离子对重组蛋白Amuc-1434 活性的影响 |
| 2.4.10 突变的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG的纯化 |
| 2.4.11 突变的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG活性测定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 重组蛋白AMUC-1434 多克隆抗体的制备、对 MUC2 的降解及其在肠道中表达位置的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验用品 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 实验溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 抗原的处理 |
| 3.3.2 抗血清的制备 |
| 3.3.3 抗血清效价检测 |
| 3.3.4 抗血清特异性检测 |
| 3.3.5 HPLC检测抗血清纯度 |
| 3.3.6 细胞培养 |
| 3.3.7 贴壁细胞总蛋白的提取 |
| 3.3.8 Dot-blot检测蛋白间相互作用 |
| 3.3.9 Sandwich ELISA免疫分析 |
| 3.3.10 Western blot实验 |
| 3.3.11 细胞黏附实验 |
| 3.3.12 Muc2 降解实验 |
| 3.3.13 免疫荧光实验 |
| 3.3.14 组织切片的制作 |
| 3.3.15 免疫组化实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 重组蛋白Amuc-1434 抗体效价的评估 |
| 3.4.2 重组蛋白Amuc-1434 抗体特异性和纯度的检测 |
| 3.4.3 重组蛋白Amuc-1434与Muc2 的相互作用 |
| 3.4.4 重组蛋白Amuc-1434对Muc2 表达细胞的黏附作用 |
| 3.4.5 重组蛋白Amuc-1434 降解Muc2 |
| 3.4.6 蛋白Amuc-1434在BALB/c小鼠肠道中的表达位置 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 重组蛋白AMUC-1434 对结直肠癌细胞LS174T增殖的抑制作用及机制的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验用品 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验溶液 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 MTT |
| 4.3.3 细胞周期实验 |
| 4.3.4 细胞凋亡实验 |
| 4.3.5 ROS水平检测 |
| 4.3.6 线粒体膜电位检测 |
| 4.3.7 细胞凋亡相关蛋白表达水平的检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 重组蛋白Amuc-1434 抑制LS174T细胞增殖 |
| 4.4.2 重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞周期的影响 |
| 4.4.3 重组蛋白Amuc-1434 诱导LS174T细胞凋亡 |
| 4.4.4 重组蛋白Amuc-1434 增加LS174T细胞内ROS含量 |
| 4.4.5 重组蛋白Amuc-1434 引起LS174T细胞线粒体膜电位下降 |
| 4.4.6 重组蛋白Amuc-1434 影响LS174T细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（9）miR-452-5p调控ERK/MAPK正反馈环路在结直肠癌进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 miR-452-5p在结直肠癌组织及细胞中的表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 miR-452-5p表达异常对结直肠癌细胞生物学行为的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 转录组测序初步探讨miR-452-5p促进结直肠癌恶性生物学行为的机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 miR-452-5p调控结直肠癌恶性生物学行为的分子机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料及试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 MIR-452与肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（10）芒柄花素通过激活线粒体依赖性MAPK信号通路诱导结直肠癌细胞凋亡（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1. 结直肠癌 |
| 2. ROS-线粒体途径-MAPK信号通路介导细胞凋亡 |
| 2.1 JNK信号通路 |
| 2.2 ERK信号通路 |
| 2.3 p38MAPK信号通路 |
| 3. 黄芪与芒柄花素 |
| 4. 论文研究 |
| 材料与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 实验试剂及仪器 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验设备 |
| 2.3 试剂配制 |
| 3. 实验过程 |
| 3.1 直肠腺癌细胞SW 1463分离与培养 |
| 3.2 SW1463细胞转染 |
| 3.3 项目分析 |
| 4. 统计学分析 |
| 结果 |
| 1. 细胞线粒体检测 |
| 1.1 膜电位检测 |
| 1.2 膜电位ΔΨm及ATP合成能力 |
| 1.3 ROS浓度表达检测 |
| 2. 双荧光素酶系统检测MAPK信号通路关键蛋白活性 |
| 2.1 ERK1/2信号通路 |
| 2.2 JNK信号通路 |
| 2.3 p38信号通路 |
| 3. RT-PCR检测MAPK信号通路关键蛋白mRNA表达 |
| 4. 细胞形态学检测 |
| 4.1 HE染色 |
| 4.2 免疫组织化学染色 |
| 4.3 SEM扫描电镜检测 |
| 4.4 TEM透射电镜检测 |
| 5. ELISA检测 |
| 6. 细胞侵袭与迁移 |
| 6.1 划痕实验 |
| 6.2 Transwell实验 |
| 7. 细胞增殖与凋亡 |
| 7.1 CCK-8检测细胞增殖 |
| 7.2 细胞凋亡检测 |
| 7.3 RT-PCR检测细胞增殖与凋亡相关蛋白 |
| 7.4 Western-blot检测细胞增殖与凋亡相关蛋白 |
| 讨论 |
| 1. 结直肠癌 |
| 2. 中医对结直肠癌的认识 |
| 3. 黄芪提取物与结直肠癌 |
| 3.1 肿瘤细胞增殖抑制 |
| 3.2 参与肿瘤细胞凋亡诱导 |
| 3.3 参与肿瘤细胞分化的诱导 |
| 3.4 对肿瘤血管的生长抑制 |
| 3.5 增强机体免疫力 |
| 4. MAPK信号通路 |
| 4.1 ERK1/2信号通路特征 |
| 4.2 JNK1/2特征 |
| 4.3 MAPK与细胞凋亡 |
| 5. ROS与肿瘤细胞凋亡 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 黄芪提取物芒柄花素抗肿瘤作用机制研究论述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、散发性结直肠癌微卫星不稳定性与Mt-p53及bcl-2蛋白表达的研究（论文参考文献）
- [1]石斛提取物毛兰素对人结直肠癌细胞的干预作用及机制研究[D]. 孙一涵. 长春中医药大学, 2021(01)
- [2]干扰素调节因子3在结肠癌中的表达以及对结肠肿瘤生长的调控作用[D]. 姜敏. 山东大学, 2021(12)
- [3]在结直肠癌中SSBP1基因的表达上调影响肿瘤细胞的生存能力的研究[D]. 杨永平. 吉林大学, 2021(01)
- [4]伴有CRC的MPCs患者的临床特征及MSI状态分析[D]. 项灵云. 江汉大学, 2021(01)
- [5]苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究[D]. 韩玮. 南京中医药大学, 2021(01)
- [6]大肠湿热证管状腺瘤与hMLH1、hMSH2表达的相关性研究[D]. 林义真. 福建中医药大学, 2020(08)
- [7]散发性结直肠癌胚系基因突变的相关性研究[D]. 王欣. 天津医科大学, 2020(06)
- [8]Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究[D]. 孟鑫. 吉林大学, 2020(08)
- [9]miR-452-5p调控ERK/MAPK正反馈环路在结直肠癌进展中的作用及机制研究[D]. 林欣. 南方医科大学, 2020
- [10]芒柄花素通过激活线粒体依赖性MAPK信号通路诱导结直肠癌细胞凋亡[D]. 王晓红. 南京中医药大学, 2020(01)