一、苏云金芽胞杆菌转座子整合载体的构建（论文文献综述）
吕媛[1]（2016）在《苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白结构域Ⅲ的定点突变及结构与功能研究》文中提出苏云金芽胞杆菌（Bt）是应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于芽胞形成过程中产生的晶体蛋白,研究杀虫晶体蛋白的分子结构与功能的关系越来越受到重视。运用定点突变技术和结合生物信息学技术研究,将有助于明确和阐释伴胞晶体蛋白的结构和功能的关系。本文运用生物信息学技术,证实β20-β21 loop为Cry1Ac5蛋白结构域III中独特的功能环,通过定点突变技术研究了β20-β21 loop的结构和功能间的相互关系,获得了毒力或稳定性提高的突变子,研究内容如下:比较了Cry1A蛋白的各级结构并进一步分析Cry1蛋白结构域III的进化树,确定Cry1Ac5蛋白的结构域III作为研究对象。分析Cry1Ac5结构域III及其β20-β21 loop的特点,发现在H518FPST522、N543WGNSSI549、F578TSSLGN584等区域不同于其它Cry1A蛋白,Cry1Ac5的β20-β21 loop含有高度保守苯丙氨酸、丝氨酸及甘氨酸残基的F578、S581、G583,由此推测F578、S581、G583这三个位点极有可能是关键位点,Cry1Ac5蛋白β20-β21 Loop结构稳定性以及蛋白构象的改变可能此有关,确定以β20-β21 loop为关键,通过定点突变研究其结构与功能的关系。运用定点突变技术对Cry1Ac5的蛋白结构β20-β21 loop上10个残基进行丙氨酸扫描突变,所有突变子包括（N576A、F578A、T579A、S580A、S581A、L582A、G583A、N584A、I585A、V586A）都能表达130 kDa蛋白和产生菱形晶体,室内生测表明,突变子I585A和S581A对棉铃虫的毒力分别提高了1.86倍和1.45倍,而突变子G583A对棉铃虫的毒力则下降明显,其余突变子的毒性也有所下降。对Cry1Ac5蛋白分子的三维结构分析发现,野生型Cry1Ac蛋白的579、580、582、585位置氨基酸的侧链的侧链向外伸向Cry1Ac5蛋白分子的表面,Cry1Ac5蛋白和其受体的相互作用很可能与T579A、S580A、L582A、I585A的功能有关,而其余位置的侧链向内伸向蛋白分子内侧,可能与维持蛋白的结构稳定性有关。对I585进一步突变,构建、表达了I585E、I585F、I585T、I585V突变子,并对其进行了毒力测定:I585F、I585E、I585T的毒力下降明显,而I585V的毒力只略有下降;对I585突变子进行了蛋白酶稳定性和存贮稳定性研究,结果发现I585E、I585T、I585F的蛋白酶及存贮稳定性降低,而I585A的蛋白酶及存贮稳定性均明显提高;I585位的侧链对Cry1Ac5蛋白稳定产生了不利影响,对比野生型Cry1Ac5、I585A的晶体形态及杀虫活性,发现I585A杀虫活性高出野生Cry1Ac1.7倍以上。本研究第一次发现了Cry1Ac5此蛋白其结构域III上的β20-β21loop结构的独特之处,并且,首次报道Cry1Ac5蛋白结构域III中的β20-β21loop结构在Cry1Ac5蛋白功能中发挥的作用,此外,从生物学结构上解释了Cry1Ac5蛋白结构域III是如何与其受体分子进行识别和结合、如何维持蛋白的结构稳定性。
李玉呈[2]（2012）在《高效表达几丁质酶基因tchiB苏云金芽胞杆菌工程菌的构建及杀虫活性研究》文中指出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringinsis）是目前最为重要的一种杀虫微生物,广泛应用于农林害虫的生物防治。目前国内外对Bt工程菌的改造拟在完善其杀虫谱较窄、杀虫毒力不高等缺陷,获得性能优良的Bt重组工程菌。有研究报道几丁质酶能够破坏昆虫体内的围食膜,对Bt杀虫晶体蛋白的杀虫活性有着显着的增效作用。本研究利用Red/ET同源重组技术,将烟草几丁质酶基因tchiB置于cry2Aa基因启动子和crylAc基因终止子序列之间,获得嵌合基因pcry2Aa-tchiB-1Act。将嵌合基因pcry2Aa-tchiB-1Act克隆入穿梭载体pHT315中,获得重组质粒pHTtchiB。将pHTtchiB电转入高毒力Bt库斯塔克亚种（Bt subsp.kurstaki）野生菌株HD73中,获得工程菌株HDtchiB。经SDS-PAGE分析检测,外源基因于Bt cry2Aa强启动子下高效表达产生约30kD蛋白；经质谱进一步鉴定其正确表达。用DNS法测定烟草几丁质酶的活性,16h左右酶活力达到最高,为42.827U/mL。HD73和工程菌株HDtchiB发酵产物对棉铃虫初孵幼虫的生物活性测定,72h的LC50分别为264.255μg/mL和167.870μg/mL,较出发菌株HD73显示出更高的杀虫毒力。外源质粒在Bt工程菌株中容易出现不稳定甚至丢失的情况。为了使外源基因能够稳定的存在于Bt工程菌中,将其整合入Bt染色体是有效措施。本研究选取定位在Bt染色体上的几丁质酶基因作为外源基因的整合位点,构建E.coli-Bt温度敏感型穿梭质粒pKCHIUN。利用Red/ET同源重组技术,构建了含嵌合基因pcry2Aa-tchiB-1Act的整合载体pKTCHIUN。拟通过同源重组,将pcry2Aa-tchiB-1Act基因定点整合到Bt无晶体突变株XBU001染色体上,获得外源基因稳定遗传及表达的Bt工程菌株。本文利用Red/ET同源重组技术便捷高效地构建了穿梭表达载体pHTtchiB及整合载体pKTCHIUN,实现了高效表达烟草几丁质酶基因tchiB Bt杀虫工程菌HDtchiB的构建,为研究与cry1Ac具有协同作用的外源杀虫基因克隆入Bt菌株中,构建外源基因高效表达、性能稳定、毒力高的工程菌奠定了重要的研究基础。
常晓娇[3]（2011）在《苏云金芽胞杆菌芽胞和晶体形成相关功能基因研究》文中研究指明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）作为一类微生物农药,因其杀虫效果好、对人畜安全、不污染环境等优点而得到广泛应用,约占整个生物农药市场的90%。与芽胞杆菌属其它种相比,Bt的一个显着特点就是在形成芽胞的同时能够产生杀虫晶体蛋白（ICPs）。枯草芽胞杆菌作为模式菌株,有关芽胞形成的机制研究相对深入,而针对Bt杀虫晶体的形成机制的研究还主要集中于杀虫晶体蛋白基因的表达调控,关于晶体和芽胞形成相关基因关系的报道还很少。因此,本研究通过对功能基因组学相关方法的运用,初步研究了苏云金芽胞杆菌中分别位于染色体和质粒上的两个基因,并对它们对芽胞和晶体形成的作用加以阐述,这将有助于阐明Bt芽胞、晶体形成机制,为改造更为安全、高效的工程菌株提供理论依据。本研究利用携带Mini-Tn10转座子的pIC333温敏载体,完成了B. thuringiensis HD73的转座子突变体库的构建,获得了20,000株具有壮观霉素抗性的突变体,并完成了突变体库的鉴定。经过筛选,获得两株不能产生芽胞和晶体的突变株。通过对突变株转座子侧翼序列的分析,确定了插入位点分别位于染色体上copG基因和质粒上尚无任何报道的一条基因（命名为11sc）内部,分别造成了9个碱基的重复,并研究了突变株产生芽胞、晶体的能力。因此,将突变株分别命名为HD73（copG）::Mini-Tn10和HD73（11sc）::Mini-Tn10。进一步构建了敲除copG部分和全部基因载体,分别命名为pRN5101（copG△’）及pRN5101（copG△）,将其分别导入HD73出发菌株,经高温诱导突变,筛选获得了缺失相应基因的突变株,分别命名为HD73（copG△’）和HD73（copG△）。镜检结果显示,虽然杀虫蛋白的量较出发菌株少,但突变株依然有产生芽胞和晶体的能力。构建敲除11sc全部基因载体pRN5101（11sc△）,经转化、突变、筛选后获得相应突变株HD73（11sc△）,但仍未丧失产生芽胞、晶体的能力。对cry1Ac基因扩增及SDS-PAGE分析结果表明,突变株中均未丢失cry1Ac基因。突变株表现型结果表明,copG和11sc基因的缺失不能严重影响芽胞和晶体的形成,不是调控芽胞和晶体形成的主效基因。相关研究仍需要进一步深入分析转座子Mini-Tn10插入突变在破坏以上基因的同时还可能影响到其它基因的表达,单独或共同导致了插入突变株完全丧失了产生芽胞、晶体的能力。
李明磊[4]（2009）在《Mariner转座子体内随机突变苏云金芽胞杆菌的研究》文中研究指明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种在土壤中广泛分布的革兰氏阳性细菌,在芽胞形成期可以高效表达杀虫晶体蛋白并形成晶体。研究者通过各种分子手段探索杀虫晶体蛋白高效表达及其形成晶体的机制并取得了一定的成果,但对这种机制具体的作用方式,特别是晶体形成的分子机理,仍然不清楚。本文从mariner转座子在苏云金芽胞杆菌中的转座效率,插入位点偏爱性的有无以及是否存在插入热点等方面阐述了mariner转座子在苏云金芽胞杆菌中的转座特性,为苏云金芽胞杆菌突变体库的构建和晶体形成机制的研究提供了有力的工具。1.测定了mariner整合载体pMarA和pMarB在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171和苏云金芽胞杆菌YBT2346中的转座特性。mariner转座子在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171和野生菌株YBT2346中的转座效率均在10%左右。在BMB171中,插入位点的检测效率非常低,使得后续进行的插入位点分析难以进行。而在YBT2346中,插入位点的检测也非常低,而且检测到的都是同一位点。这可能是由于pMarA和pMarB的两个反向重复序列之间没有大肠杆菌的复制起点,而通过反向PCR或者总DNA酶切产物与线性pUC19连接的方法检测插入位点的效率同样非常低。这一缺陷使得插入位点的分析相当困难。2.重新构建了mariner整合载体pMarA333和pMarB333。与pMarA和pMarB相比,pMarA333和pMarB333在两个反向重复序列之间加入了大肠杆菌的复制起点,我们可以用合适的限制性内切酶处理总DNA、自连、转化E.coli DH5α便可以检测插入位点。3.测定了pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171和苏云金芽胞杆菌YBT881中的转座特性。pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中的转座效率分别为7.6%和11.6%。而在苏云金芽胞杆菌YBT881（CCAM 020673）中的转座效率分别为4.2%和15.7%。pMarA333和pMarB333显示出比另外一个mariner整合载体pAW068更高的转座效率,这可能是由于转座酶启动子的不同所导致的。限制性酶切分析发现,pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中没有明显的插入偏爱性。在苏云金芽胞杆菌YBT881的插入位点分析中,大部分插入位点的DNA序列都与两株已经完全测序的苏云金芽胞杆菌97-27（GI:49328240）和Al Hakarn（GI:118415003）进行BLAST分析。结果显示,mariner转座子的插入位点的分布比较分散,对非编码区没有偏爱性。此外,某些插入位点的序列和已经测定的苏云金芽胞杆菌质粒的序列有比较高的相似性,说明mariner转座子可以插入到质粒上。因此,mariner转座子是一个比较良好的转座诱变剂,没有偏爱性,可以随机地插入到染色体和质粒上,编码区和非编码区中。这对我们研究基因组不同位点的功能是非常有利的。pMarA333和pMarB333中所含有的温度敏感性复制起点pe194ts,壮观霉素抗性基因,红霉素抗性基因以及转座酶的启动子PA与ctc具有比较好的通用性。因此,pMarA333和pMarB333可在构建苏云金芽胞杆菌以及其他革兰氏阳性菌插入突变体库中具有比较高的潜在应用价值。
方尚玲[5]（2009）在《苏云金芽胞杆菌bel基因生物学功能》文中研究表明以苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株YBT-1520的bel（Bacillusenhancin like）基因为研究对象,对苏云金芽胞杆菌的Bel蛋白的增效活性和增效机制做了深入研究,从而进一步认识bel基因的生物学功能。主要研究结果如下:1.BMB171中bel基因的敲除和生物活性的测定利用同源重组的方法敲除BMB171菌株中的bel蛋白基因,得到了突变株BMB1084。将表达杀虫晶体蛋白基因cry1Ac的重组质粒pBMB1086转入菌株BMB171和突变株BMB1084,分别构建重组菌BMB1087和BMB1088。用两个重组菌的胞晶混合物分别感染棉铃虫一龄幼虫,结果重组菌BMB1087和BMB1088的LC50分别为0.46mL/mL和2.73mL/mL,增效倍数为5.83,表明未敲除bel基因的Bt能提高Cry1Ac对棉铃虫幼虫的毒力。2.bel基因的大量表达和生物活性的测定从苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株中扩增出增效蛋白基因bel,以pGEX-6p-1为载体在大肠杆菌BL21中表达融合增效蛋白,通过亲和层析提纯到该融合增效蛋白,并测定其分子量为113KD。以棉铃虫为供试昆虫,测定Bel蛋白对杀虫晶体蛋白Cry1Ac杀虫的增效活性,结果显示当配比为Bel蛋白（0.8ug/mL）+Cry1Ac（3ug/mL）时,棉铃虫的死亡率为74.4%,比不添加Bel蛋白的34.2%增加120%,说明Bel蛋白能显着提高Cry1Ac对棉铃虫幼虫的毒力。同时以仅含Bel蛋白（1ug/mL）的饲料喂养棉铃虫,实验结果显示增效蛋白可以明显减缓棉铃虫幼虫体重的增长,说明该增效蛋白对棉铃虫生长有弱化作用。3.Bel蛋白增效机制的研究通过体内和体外Bel蛋白的增效机制的探讨,找出Bel蛋白增效机制。体内增效机制研究:将含Bel蛋白（1ug/mL）的饲料喂养5龄棉铃虫1.5天,提取棉铃虫围食膜（PM）,通过扫描电镜的观察,发现喂食Bel蛋白的棉铃虫PM较薄并且有穿孔现象。这样加大了Cry1Ac穿过PM的量,通过增加感染量来增加了Cry1Ac和肠上皮细胞受体结合的量。体外增效机制研究（此结果由河北农业大学提供）:用2ug/mL的Bel蛋白处理T.ni围食膜,SDS-PAGE后,以T.niⅡM抗体作为一抗,进行Western Blot检测。同时以T.ni的Enhancin蛋白处理T.ni围食膜作阳性对照,结果Bel蛋白可以体外降解T.ni的ⅡM。同样2ug/mL Bel蛋白体外处理HaⅡM86蛋白4小时后,SDS-PAGE后,以HaⅡM86抗体作为一抗,Western Blot检测。结果Bel蛋白可以体外降解棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM86。4.高效杀虫的苏云金芽胞杆菌基因工程菌的构建利用了Bel蛋白的增效特性,构建出了一株高效杀虫的苏云金芽胞杆菌基因工程菌BMB171/pHT304/bel+cry1Ac。结果:导入了bel基因的工程菌BMB0187对棉铃虫的杀虫毒力明显比未导入bel基因的菌株BMB171/pHT304/cry1Ac强,而且相对增效倍数为3倍。
巫益鸣[6]（2009）在《苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518插入突变体库的构建及芽胞萌发相关基因的初步研究》文中研究指明苏云金芽胞杆菌因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物,与其它芽胞杆菌相比,一个显着特点就是在形成芽胞的同时还能产生具有杀虫活性的晶体蛋白。芽胞在外界条件适宜的情况下又能萌发并形成营养体,其中的一些相关机制的研究虽然取得了长足的进步,但仍然有诸多未知的领域有待研究,苏云金芽胞杆菌的芽胞萌发及其相关机制方面的研究报道则更少。本研究利用携带Mini-Tn10转座子的温度敏感型质粒pIC333构建了苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518的随机插入突变体库,寻找和鉴定与芽胞萌发相关的一些基因。通过芽胞萌发实验初筛,以及相差显微镜观察和OD600nm检测的复筛,筛选到一株在萌发剂L-丙氨酸诱导下芽胞不萌发的突变株,命名为MA1。进一步研究表明突变株MA1在其他萌发剂（氨基酸以及糖类物质）的诱导下都不表现出萌发的表型。测序获得了转座子Mini-Tn10插入位点侧翼的核苷酸序列长度达6,250 bp,通过NCBI的序列比对分析,确定转座子Mini-Tn10插入基因的表达产物为葡萄糖酸盐透性酶（gluconate permease,GntP）,且插入位点位于gntP基因3’末端。GntP的主要功能是将Na+,砷酸盐,亚锑酸盐,硫酸盐等离子透过生物膜,推测GntP可能是作为一种通道蛋白或是一种转运蛋白,使得一些离子或小分子物质跨过芽胞衣以及皮层到达芽胞内膜并与其上的萌发受体结合,激活与萌发相关酶的活性,如皮层裂解酶,使芽胞皮层及芽胞衣更具通透性,致使芽胞皮层部分水化,芽胞核心的DPA以及一些阳离子释放,起始芽胞的萌发。通过对实验室已有的YBT-1518基因组文库的筛选以及借助载体pHT304亚克隆文库的构建,筛选得到了包含有完整gntP基因的亚克隆子,命名为pBMBW1,并将pBMBW1转化突变株MA1,得到MA1的回复突变菌株BMBW1,并观察其芽胞的萌发情况,结果显示芽胞萌发的表型并未得到回复,故推测转座子Mini-Tn10的插入突变不仅影响了gntP基因自身的功能,也影响了其侧翼基因（很可能是以操纵子的形式存在）的功能。
田野[7]（2008）在《苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒素对棉铃虫作用机理的研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种分布广泛的革兰阳性细菌,伴随芽胞形成产生杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins,简称ICPs）,能够毒杀包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目等九个目的500多种昆虫,被广泛应用于害虫防治。棉铃虫是世界性重要农业害虫,随着Bt杀虫剂的广泛使用和转基因棉花的广泛种植,棉铃虫的抗性问题已经成为制约生物Bt农药产业发展的瓶颈,更深入地了解Bt对鳞翅目昆虫的作用机理,对于研究Bt合理使用、制定延缓昆虫抗性发展的策略具有重要意义。本研究以Bt HTX-42（Cry1Ac）为研究菌株,利用液体双相分离法初步提取毒素晶体蛋白,采用等电点沉淀法进行纯化,然后将所得毒素蛋白溶解,最后经凝胶过滤层析,收集280nm紫外吸收峰蛋白样品,SDS-PAGE分析得到高纯度、高浓度的Bt Cry1Ac毒素。本研究以四龄棉铃虫幼虫为供试昆虫,通过差速离心法,成功分离到棉铃虫幼虫中肠刷状缘膜囊（BBMV）,采用Bradford法分别对其提取后的组织碎片、离心上清液、离心沉淀中的蛋白含量进行测定,发现大部分蛋白质都存在于提取的中肠BBMV离心沉淀中。利用生物素标记Bt Cry1Ac毒素活化片段,进行体外竞争结合印迹分析,在大约60kDa处明显有一条单一的蛋白条带,增加未经生物素标记的Cry1Ac毒素含量,蛋白条带呈现减弱趋势,毒素与BBMV的结合相对量也不断降低,当未经生物素标记的Cry1Ac毒素含量增加为初始浓度的100倍时,毒素与BBMV的结合相对量由开始的100%下降为20%,相对降低了约80%。表明Cry1Ac毒素相互之间能够发生同源竞争结合,制备的Cry1Ac毒素和棉铃虫中肠BBMV能够用于后续试验,具有较高的生理活性。采用SDS-PAGE和免疫共沉淀技术研究表明,Cry1Ac毒素对棉铃虫中肠BBMV总蛋白量和棉铃虫中肠受体蛋白都产生明显影响。与未饲喂毒素棉铃虫相比较,毒素作用后的棉铃虫中肠小分子量蛋白条带出现丢失,尤其是在蛋白表达量上表现出较大差异,特别是成功分离到一种120kDa的蛋白,经过质谱分析鉴定为氨肽酶APN,并且中肠受体蛋白氨肽酶APN表达量也明显增加。采用Western blot技术研究Cry1Ac毒素寡聚体形成能力,结果表明Cry1Ac毒素在棉铃虫中肠BBMV中能够形成二聚体和四聚体,经过100℃高温处理后毒素寡聚体完全解离为毒素单体。研究Cry1Ac毒素作用前后对棉铃虫幼虫病理学的影响发现,与正常棉铃虫幼虫相比,饲喂毒素的棉铃虫幼虫形态和发育都发生明显变化,利用透射电镜观察发现,苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒素主要影响棉铃虫幼虫中肠细胞微绒毛,导致微绒毛明显变短变粗,顶端出现空泡,随后部分微绒毛发生溶解脱落。
刘萍[8]（2008）在《外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达》文中研究指明在构建高效广谱苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）工程菌时,常将携带外源基因的高拷贝质粒转入Bt菌株中。Bt芽胞形成过程需要消耗大量能量,而高拷贝质粒的复制和维持将消耗宿主菌许多能量,从而导致Bt宿主菌芽胞数量减少,芽胞形成期延滞,进而影响Bt菌株的杀虫活力。同时,外源质粒在芽胞杆菌中复制时经常出现不稳定的单链（ssDNA）形式,导致质粒以及外源基因的丢失。本研究旨在通过将外源基因整合入Bt染色体中,以解决以上问题,从而构建遗传稳定、高效表达的Bt工程菌。本研究选取定位在Bt染色体上的trigger factor基因为外源基因整合位点。本研究室利用蛋白质组学技术在Bt无晶体突变株XBU001中同样鉴定了Trigger Factor蛋白的存在。通过对Bt各亚种间trigger factor基因的同源性分析,在其保守区域设计两对引物TF1-F/TF1-R和TF2-F/TF2-R,分别扩增该基因的5’端和3’端作为外源基因整合染色体的同源臂,并克隆入Ecoli-Bt温度敏感型穿梭载体pKSV7,构建了整合质粒pKTF12。利用pKTF12,通过同源重组将cry1Ac基因成功定点整合到Bt无晶体突变株XBU001染色体上,获得了工程菌株KCTF12。对工程菌株KCTF12、宿主菌XBU001以及携带高拷贝外源质粒的Bt工程菌HTX42进行生长特性的比较分析,外源基因稳定性检测,原子力显微镜形态观察,芽胞形成与数量的比较分析,SDS-PAGE蛋白检测以及生物活性测定,实验结果表明,cry1Ac基因定点插入染色体上的trigger factor位点,对宿主菌XBU001的正常生长没有影响;连续培养约6d后,KCTF12中的cry1Ac基因能够稳定遗传、表达并形成菱形晶体;KCTF12和XBU001在12h左右便开始产生芽胞,而HTX42在18h才开始产生芽胞;KCTF12和XBU001在芽胞数量上没有显着差异,HTX42的芽胞数量要明显少于KCTF12菌株和XBU001菌株;KCTF12菌株晶体的规格为（1.37±0.23）μm×（0.53±0.16）μm,要小于HTX42菌株产生的晶体（2.0±0.19）μm×（1.2±0.13）μm;KCTF12菌株在发酵培养12h后检测到了的Cry1Ac晶体蛋白,20h其表达量达到最大,而重组菌株HTX42的Cry1Ac晶体蛋白直到18h才检测到表达,到28h达最大值;KCTF12和HTX42菌株发酵液中Cry1Ac晶体蛋白对棉铃虫二龄幼虫的毒力无显着性差异。本研究表明,利用整合载体将外源基因定点整合到宿主菌的染色体上,这是一种构建获得稳定表达的Bt工程菌有效方法。同时,温度敏感型载体pKSV7的使用,消除了Bt工程菌中的抗性标记基因,避免了环境释放潜在风险。本研究为外源基因在Bt中稳定表达,构建无抗性标记基因的Bt工程菌奠定了重要的研究基础。
刘晶晶,张杰,黄大昉[9]（2008）在《苏云金芽胞杆菌重组工程菌研究进展》文中指出作为一种重要的生防微生物,苏云金芽胞杆菌在实际应用中还存在不少问题,本文回顾了苏云金芽胞杆菌重组工程菌的研究历史,总结了工程菌构建方法技术,并结合国内外动态对工程菌的产业化未来前景进行了展望。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）可以产生对多种农业害虫有毒性的晶体蛋白（Insecticidal crystal protein,ICP）,是目前世界上使用范围最广、应用最成功的杀虫微生物。已经发现苏云金芽胞杆菌可以对包括鳞翅目、鞘翅目、直翅目等在内的9个目500多种昆虫具有杀虫活性①,同时对某些螨类、吸虫、鞭毛虫及动植物线虫也有一定的活性。
王莉[10]（2007）在《苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析》文中研究说明本论文以苏云金芽胞杆菌为研究对象，克隆并绘制了质粒pBMB165的物理图谱，同时对苏云金芽胞杆菌BMB171 Enhancin蛋白基因的增效活性做了初步研究。本文第一部分，以苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp．tenebrionis，H8ab)菌株YBT-1765为出发菌株，对其可检测到的最大质粒pBMB165进行克隆分析研究。通过对YBT-1765总质粒和全基因组DNA分别进行BamHI和HindⅢ不完全酶切，以pBeloBACll为载体，成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1765的基因组的细菌人工染色体（BAC）文库和质粒的BAC文库。根据已克隆的包含复制子oril65在内的3.6kb片段（pBMB165-F4A）中编码复制蛋白Rep165的核苷酸序列设计探针，通过染色体步移方式进行筛选。在对质粒文库进行筛选时，得到5个具有重叠关系的克隆子，测定这些克隆子的末端序列。根据这些末端序列设计引物，通过染色体步移方式，对YBT-1765的基因组BAC文库进行筛选，获得8个覆盖质粒pBMB165不同区域的克隆子。测定这8个阳性克隆子的末端序列，序列结果显示它们之间存在着重叠群，并且能够覆盖整个质粒pBMB165。通过对上述13个克隆子进行NotI、SphI、HindⅢ和BamHI酶切分析，建立了质粒pBMB165的物理图谱和线状重叠连锁图，并测算出该质粒的大小为82kb。对其中一个阳性克隆pBMB165A2作了序列测定；根据部分核苷酸序列初步统计了pBMB165上转座因子的存在机率，在pBMB165A2上转座因子存在的机率值为40.5％，说明pBMB165中存在丰富的转座因子，YBT-1765菌株基因组文库的构建和物理图谱的绘制为克隆苏云金芽胞杆菌大质粒提供了一套可行的方案，成功解决了大质粒难克隆的问题。本文第二部分，以苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171为研究对象，对苏云金芽胞杆菌的Enhancin蛋白的增效活性做了初步研究，从而进一步认识Enhancin蛋白在促进Bt感染昆虫中的作用。根据已知的Enhancin蛋白基因序列设计特异引物，以BMB171菌株的基因组DNA为模板，能扩增出对应的预期目的片段Enhancin蛋白基因。经测序分析其预计蛋白质由742个氨基酸组成，其氨基酸序列与已经发现的昆虫病毒的增效蛋白有20％左右的序列一致，与鼠疫杆菌的增效蛋白同源性在31％以上。利用同源重组敲除BMB171菌株中的Enhancin蛋白基因，构建了突变株BMB1084。将表达杀虫晶体蛋白基因crylAc10的重组质粒pBMB1086导入菌株BMB171和突变株BMB1084，分别构建重组菌BMB1087和BMB1088。用上述重组菌的胞晶混合物分别感染棉铃虫一龄幼虫，重组菌BMB1087的LD50为0.46 mL／mL，比BMB1088 （2.73mL／mL）降低了82.85％，增效倍数为5.83，表明Enhancin蛋白显着提高了Bt对棉铃虫幼虫的毒力。
二、苏云金芽胞杆菌转座子整合载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、苏云金芽胞杆菌转座子整合载体的构建（论文提纲范文）
（1）苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白结构域Ⅲ的定点突变及结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表(中英文对照) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 Bt生物学特性及分类 |
| 1.1.1 Bt生物学特性 |
| 1.1.2 Bt分类 |
| 1.1.3 Bt活性谱 |
| 1.1.4 Bt产生的活性物质 |
| 1.2 Bt产生的杀虫晶体蛋白及其编码基因 |
| 1.2.1 杀虫晶体蛋白及其编码基因的应用 |
| 1.2.2 杀虫晶体蛋白及其编码基因 |
| 1.2.3 杀虫晶体蛋白基因的分类 |
| 1.2.4 杀虫晶体蛋白的结构与功能 |
| 1.3 Bt产生的营养期杀虫蛋白及其编码基因 |
| 1.3.1 营养期杀虫蛋白蛋白及其编码基因的应用 |
| 1.3.2 营养期杀虫蛋白蛋白及其编码基因 |
| 1.3.3 营养期杀虫蛋白基因的分类 |
| 1.3.4 营养期杀虫蛋白蛋白的结构与功能 |
| 1.4 Bt产生的伴胞蛋白（PS）及其编码基因 |
| 1.4.1 伴胞蛋白对癌细胞的活性 |
| 1.4.2 伴胞蛋白及其编码基因 |
| 1.4.3 伴胞蛋白基因的分类 |
| 1.4.4 伴胞蛋白的结构与功能 |
| 1.5 Bt杀虫晶体蛋白基因的高效表达 |
| 1.5.1 高效目的基因的克隆 |
| 1.5.2 目的基因的改造 |
| 1.5.3 高表达载体的构建 |
| 1.5.4 增效基因的转录调控 |
| 1.6 Bt杀虫晶体蛋白的改造 |
| 1.6.1 定点突变的研究进展 |
| 1.6.2 杀虫晶体蛋白结构域Ⅰ的改造 |
| 1.6.3 杀虫晶体蛋白结构域Ⅱ的改造 |
| 1.6.4 杀虫晶体蛋白结构域Ⅲ的改造 |
| 1.6.5 突变蛋白对提高活性、延缓抗性、扩大杀虫谱的影响 |
| 1.7 苏云金芽胞杆菌在医学上的研究和应用进展 |
| 1.7.1 苏云金芽胞杆菌防治医学昆虫 |
| 1.7.2 苏云金芽胞杆菌抗寄生虫的作用 |
| 1.7.3 Bt抗癌作用的展望 |
| 1.8 立题依据和意义 |
| 第二章 Cry1Ac5蛋白的分析和突变位点确定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 Cry1Ac5蛋白序列 |
| 2.1.2 软件和数据库 |
| 2.1.3 分析方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Cry1Ac5蛋白与其它Cry1A蛋白的比较 |
| 2.2.2 三维结构特征 |
| 2.2.3 Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ的特点 |
| 2.2.4 β20-β21 loop在Cry1Ac5蛋白三维结构中的位置 |
| 2.2.5 β20-β21 loop的特点及作用 |
| 2.2.6 Cry1Ac5与其它Cry蛋白的β20-β21 loop比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Cry1Ac5蛋白β20-β21 loop丙氨酸扫描突 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Cry1Ac蛋白的丙氨酸扫描突变 |
| 3.2.2 突变子表达载体的构建 |
| 3.2.3 突变子在cry-B宿主菌中的表达 |
| 3.2.4 突变株生物活性测定分析 |
| 3.2.5 软件分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 PCP定点突变原理 |
| 3.3.2 突变效果 |
| 3.3.3 突变前后的变化 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 I585的定点突变及其功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 I585在Cry1Ac5三维结构中的作用 |
| 4.2.2 突变子的测序结果分析 |
| 4.2.3 I585突变子镜检和SDS-PAGE验分析 |
| 4.2.4 生测分析 |
| 4.2.5 毒蛋白的纯化 |
| 4.2.6 稳定性分析 |
| 4.2.7 突变前后结构变化比较 |
| 4.2.8 I585A与野生Cry1Ac晶体的形态比较 |
| 4.2.9 荧光光谱分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 I585 在Cry1Ac5蛋白中的作用 |
| 4.3.2 I585 突变稳定性和杀虫活性之间的联系 |
| 4.3.3 I585A增强蛋白稳定性的意义 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 主要结论和今后的研究设想 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的创新点和科学意义 |
| 5.3 下一步的研究设想 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的论文 |
| 致谢 |
（2）高效表达几丁质酶基因tchiB苏云金芽胞杆菌工程菌的构建及杀虫活性研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 苏云金芽胞杆菌概论 |
| 2 几丁质酶的概述 |
| 2.1 几丁质酶的研究进展 |
| 2.2 几丁质酶基因结构及其特性的研究 |
| 2.3 几丁质酶的应用研究 |
| 3 Bt工程菌的研究进展 |
| 3.1 外源抗虫基因 |
| 3.1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 3.1.2 几丁质酶 |
| 3.1.3 植物外源凝集素 |
| 3.1.4 淀粉酶抑制剂 |
| 3.1.5 昆虫神经毒素基因 |
| 3.2 Cyt毒素与Cry之间的协同作用 |
| 3.3 对Cry毒素的修饰 |
| 3.3.1 定点突变 |
| 3.3.2 Hybrid toxins |
| 3.4 Bt工程菌的应用 |
| 4 染色体整合技术的研究进展 |
| 4.1 外源基因的随机整合 |
| 4.2 外源基因的定点整合 |
| 5 Red/ET同源重组 |
| 5.1 Red/ET同源重组技术简介 |
| 5.2 Red/ET同源重组的原理及应用 |
| 6 立体依据与意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1 菌株和质粒 |
| 2 培养基和抗生素 |
| 3 试剂和引物 |
| 3.1 工具酶及试剂盒 |
| 3.2 琼脂糖凝胶电泳试剂 |
| 3.3 XBU001感受态制备及转化试剂 |
| 3.4 蛋白质电泳试剂 |
| 3.5 胶内酶解用试剂 |
| 3.6 几丁质酶活性测定试剂 |
| 3.7 室内生测材料及试剂 |
| 3.8 引物 |
| 4 主要仪器设备 |
| 5 试验方法 |
| 5.1 PCR扩增烟草几丁质酶基因 |
| 5.2 质粒pHT2Aa-vip3A提取以及酶切后线性片段的回收 |
| 5.3 Red/ET同源重组技术构建重组质粒pHTtchiB |
| 5.4 重组质粒pHTtchiB电转化XBU001 |
| 5.5 重组菌株XBtchiB中几丁质酶的SDS-PAGE检测及质谱鉴定 |
| 5.6 重组质粒pHTtchiB电转化HD73 |
| 5.7 重组菌株HDtchiB中几丁质酶的SDS-PAGE检测及质谱鉴定 |
| 5.8 重组菌株HDtchiB生长曲线的测定 |
| 5.9 重组菌株HDtchiB的形态学观察 |
| 5.10 重组菌株HDtchiB中几丁质酶的活性测定 |
| 5.11 重组菌株HDtchiB的生物活性测定 |
| 5.12 PCR扩增p2Aa-tchiB-1Act基因片段 |
| 5.13 质粒pKCHIUN提取以及酶切后线性片段的回收 |
| 5.14 Red/ET同源重组技术构建定点整合质粒pKTCHIUN |
| 5.15 重组质粒pKTCHIUN电转化XBU001 |
| 5.16 重组菌株KTCHIUN的筛选 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 chi基因上、下游片段序列 |
| 2 整合质粒pKTCHIUN的构建 |
| 2.1 重组质粒pHTtchiB的构建 |
| 2.2 整合载体pKTCHIUN的构建 |
| 3 重组质粒pHTtchiB电转化无晶体突变株XBU001 |
| 4 重组质粒pHTtchiB电转化HD73 |
| 5 HDtchiB重组菌株生长特性 |
| 6 HDtchiB重组菌株形态学观察 |
| 7 HDtchiB中几丁质酶酶活力测定 |
| 8 HDtchiB生物活性测定 |
| 讨论 |
| 1 外源基因的选择 |
| 2 实现外源基因高效表达的策略及其苏云金杆菌工程菌的构建 |
| 3 Red/ET同源重组技术在构建重组载体中的应用 |
| 4 染色体定点整合技术及其整合位点的选择 |
| 主要结论和今后的研究设想 |
| 1 本研究的主要结论 |
| 2 今后工作设想 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文 |
| 课题受资助的基金项目 |
（3）苏云金芽胞杆菌芽胞和晶体形成相关功能基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 芽胞和杀虫晶体蛋白 |
| 1.1.1 芽胞 |
| 1.1.2 杀虫晶体蛋白 |
| 1.2 copG 基因 |
| 1.2.1 结构 |
| 1.2.2 功能及研究进展 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌基因组研究概况 |
| 1.4 转座子的随机插入突变 |
| 1.5 同源重组敲除技术 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 培养基与抗生素 |
| 2.1.3 酶与生化试剂 |
| 2.1.4 常用溶液与缓冲液 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 转座子突变体库的构建和筛选 |
| 2.2.2 copG 基因的功能研究 |
| 2.2.3 11sc 基因功能研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HD73 菌株突变体库的构建与鉴定 |
| 3.1.1 突变体库的构建 |
| 3.1.2 抗性鉴定 |
| 3.1.3 PCR 鉴定 |
| 3.1.4 突变株芽胞和晶体的观察 |
| 3.1.5 突变株cry 基因型的鉴定 |
| 3.2 筛选获得了两株丧失产生芽胞和晶体能力的突变株 |
| 3.2.1 copG 基因的功能研究 |
| 3.2.2 11sc 基因的功能研究 |
| 3.2.3 突变株产杀虫蛋白能力的分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 转座子及同源重组技术 |
| 4.2 无芽胞和无晶体突变株的筛选 |
| 4.3 敲除基因的研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）Mariner转座子体内随机突变苏云金芽胞杆菌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.苏云金芽胞杆菌简介 |
| 2.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 |
| 2.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的定位与分类 |
| 2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构和功能 |
| 3.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的表达与调控 |
| 3.1 转录水平的调控 |
| 3.1.1 依赖芽胞形成的cry基因的转录 |
| 3.1.2 不依赖芽胞形成的cry基因的转录 |
| 3.1.3 启动子及上游区和σ因子与转录调控 |
| 3.1.3.1 启动子与转录调控 |
| 3.1.3.2 启动子上游区和转录调控 |
| 3.1.3.3 σ因子的竞争和转录调控 |
| 3.2 转录后水平的调控 |
| 3.2.1 mRNA3'末端的终止子结构 |
| 3.2.2 mRNA5'末端的特殊结构 |
| 3.3 翻译水平的调控 |
| 3.4 影响cry基因表达的其他因素 |
| 3.4.1 cry基因拷贝数对表达的影响 |
| 3.4.2 宿主对cry基因表达的影响 |
| 3.4.3 cry基因间的协同作用对表达的影晌 |
| 4 杀虫晶体蛋白形成的机制及其影响因素 |
| 4.1 P20蛋白 |
| 4.2 P19蛋白 |
| 4.3 ORF2和ORF1 |
| 5 转座子 |
| 5.1 转座子Tn916和Tn917 |
| 5.2 转座子Tn10 |
| 5.3 转座子mariner |
| 6 研究的立项依据和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 抗生素及其使用浓度 |
| 1.4 试剂与器材 |
| 1.4.1 试剂 |
| 1.4.2 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DNA操作方法 |
| 2.1.1 大肠杆菌质粒的提取 |
| 2.1.2 苏云金芽胞杆菌质粒的抽提 |
| 2.1.3 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提 |
| 2.1.4 DNA的体外重组操作 |
| 2.2 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定 |
| 2.2.1 大肠杆菌转化 |
| 2.2.2 苏云金芽胞杆菌的转化 |
| 2.2.3 大肠杆菌转化子的筛选 |
| 2.2.4 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选 |
| 2.3 mariner转座突变体的筛选和插入位点的检测 |
| 2.3.1 mariner在苏云金芽胞杆菌内转座效率测定和转座突变体筛选 |
| 2.3.2 mariner整合载体插入位点的检测 |
| 2.3.2.1 采用反向PCR检测插入位点 |
| 2.3.2.2 酶切产物连接检测插入位点 |
| 2.3.2.3 酶切产物自连检测法插入位点 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 1 pMarA与pMarB在苏云金芽胞杆菌中的转座特性 |
| 1.1 pMarA与pMarB在苏云金芽胞杆菌BMB171中的转座特性 |
| 1.1.1 pMarA与pMarB在BMB171中的转座效率 |
| 1.1.2 pMarA与pMarB在BMB171中的插入位点分析 |
| 1.2 pMarA在苏云金芽胞杆菌YBT2346中的转座特性 |
| 1.2.1 pMarA在YBT2346中的转座效率 |
| 1.2.2 pMarA在YBT2346中的插入位点分析 |
| 1.3 小结与讨论 |
| 2 mariner转座子的整合载体pMarA333和pMarB333的构建 |
| 3 pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌中的转座特性 |
| 3.1 pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌BMB171中的转座特性 |
| 3.1.1 pMarA333和pMarB333在BMB171中的转座效率 |
| 3.1.2 pMarA333和pMarB333在BMB171的插入位点分析 |
| 3.2 pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌YBT881中的转座特性 |
| 3.2.1 pMarA333和pMarB333在YBT881中的转座效率 |
| 3.2.2 pMarA333和pMarB333在YBT881中插入位点分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）苏云金芽胞杆菌bel基因生物学功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌及其杀虫活性 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌的杀虫活性和杀虫机理 |
| 1.1.3 昆虫体内可能对Bt杀虫晶体蛋白产生抗性的环节 |
| 1.1.4 苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌群的系统学关系 |
| 1.1.5 苏云金芽胞杆菌与昆虫的关系 |
| 1.2 昆虫围食膜 |
| 1.2.1 围食膜的种类 |
| 1.2.2 围食膜组成成分及理化特性 |
| 1.2.3 围食膜的功能 |
| 1.2.4 昆虫肠粘蛋白 |
| 1.3 昆虫杆状病毒增效蛋白 |
| 1.3.1 增效蛋白及其杀虫增效作用 |
| 1.3.2 昆虫病毒增效蛋白的功能域和氨基酸特征 |
| 1.3.3 昆虫病毒增效蛋白对昆虫的弱化作用 |
| 1.4 Bt中的增效蛋白类似基因 |
| 1.5 科学问题 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 本研究的学术思想、理论根据及创新之处 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 供试昆虫及饲料 |
| 2.1.3 试剂,培养基,仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA常规操作 |
| 2.2.1.1 质粒的制备与纯化 |
| 2.2.1.2 DNA的体外重组操作 |
| 2.2.1.3 重组质粒的转化 |
| 2.2.1.4 PCR扩增 |
| 2.2.2 SDS-PAGE蛋白质电泳 |
| 2.2.2.1 菌体蛋白样品的制备 |
| 2.2.2.2 SDS-PAGE凝胶的制备 |
| 2.2.2.3 电泳、染色及脱色 |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌菌株BMB171中bel基因的敲除 |
| 2.2.3.1 同源重组 |
| 2.2.3.2 复红简单染色 |
| 2.2.3.3 伴胞晶体的培养 |
| 2.2.3.4 生物测定 |
| 2.2.3.5 菌体生长时间与菌体OD_(600)值对应曲线 |
| 2.2.4 Cry1Ac晶体蛋白的表达 |
| 2.2.5 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的提纯和定量 |
| 2.2.6 苏云金芽胞杆菌bel的表达 |
| 2.2.7 苏云金芽胞杆菌Bel的提纯,定量和分子量的测定 |
| 2.2.8 苏云金芽胞杆菌Bel的增效活性测定 |
| 2.2.8.1 感染液的配制 |
| 2.2.8.2 感染饲料的配制 |
| 2.2.8.3 接虫感染 |
| 2.2.8.4 结果统计及数据分析处理 |
| 2.2.9 苏云金芽胞杆菌增效蛋白对棉铃虫生长的弱化作用 |
| 2.2.9.1 感染液的配制 |
| 2.2.9.2 接虫感染 |
| 2.2.9.3 数据处理 |
| 2.2.10 PM and IIM的制作 |
| 2.2.11 石蜡切片制作 |
| 2.2.12 扫描电镜样品的制作 |
| 2.2.13 Western blot |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 bel基因的克隆及序列分析 |
| 3.2 BMB171突变体的构建 |
| 3.2.1 整合载体的构建 |
| 3.2.2 突变体的筛选及验证 |
| 3.2.3 BMB171和突变株BMB1084比较 |
| 3.2.3.1 BMB171与突变株BMB1084生长情况的比较 |
| 3.2.3.2 BMB171与突变株BMB1084芽胞形成的比较 |
| 3.2.4 Bel蛋白基因对Bt杀棉铃虫幼虫的增效杀虫活性 |
| 3.2.4.1 晶体蛋白基因cry1Ac在BMB171和突变株BMB1084表达 |
| 3.2.4.2 生物测定 |
| 3.3 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的表达、提纯和检测 |
| 3.4 增效蛋白Bel的原核表达,提纯及定量检测 |
| 3.4.1 Bel蛋白的表达 |
| 3.4.2 增效蛋白Bel的提纯 |
| 3.4.3 增效蛋白Bel的定量检测 |
| 3.5 生物活性测定 |
| 3.5.1 增效蛋白对Cry1Ac杀虫的增效活性的测定 |
| 3.6 增效蛋白Bel对棉铃虫幼虫生长的弱化作用 |
| 3.7 Bel蛋白的增效机制研究 |
| 3.7.1 体内Bel蛋白增效机制研究实验 |
| 3.7.2 体外Bel蛋白体外降解肠粘蛋白活性 |
| 3.7.2.1 Bel对粉纹夜蛾肠粘蛋白PM的作用 |
| 3.7.2.2 Bel对棉铃虫肠粘蛋白HaIIM86的作用 |
| 3.8 利用增效蛋白bel基因构建苏云金芽胞杆菌高效杀虫基因工程菌 |
| 3.8.1 含bel基因的大肠杆菌-苏云金芽胞杆菌穿梭表达载体的构建 |
| 3.8.2 增效蛋白Bel和杀虫晶体蛋白Cry1Ac共表达载体的构建 |
| 3.8.3 增效蛋白基因bel在苏云金芽胞杆菌BMB171中的表达 |
| 3.8.4 苏云金芽胞杆菌高效杀虫工程菌BMB0187对棉铃虫的生物测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Bel蛋白与病毒Enhancin蛋白的氨基酸序列比较 |
| 4.2 Bel蛋白的表达和增效作用 |
| 4.3 蜡状芽胞杆菌群的系统学关系 |
| 4.4 bel基因的来源 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 待发表论文和专利 |
| 附录 YBT1520的bel基因序列 |
（6）苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518插入突变体库的构建及芽胞萌发相关基因的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.2 芽胞结构及芽胞形成 |
| 1.3 芽胞萌发的研究进展 |
| 1.3.1 芽胞萌发过程的事件 |
| 1.3.2 促进芽胞萌发的萌发剂 |
| 1.3.3 芽胞萌发的主要元件 |
| 1.3.4 芽胞萌发受体的定位 |
| 1.3.5 芽胞萌发的途径的研究 |
| 1.4 转座子插入突变 |
| 1.4.1 转座子的介绍 |
| 1.4.2 转座子插入突变技术 |
| 1.5 本研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂和仪器 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 菌株和材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 本研究所用培养基配方 |
| 2.2.3 细菌质粒的制备和 DNA操作 |
| 2.3 转化 |
| 2.3.1 大肠杆菌的电转化 |
| 2.3.2 苏云金芽胞杆菌的电转化 |
| 2.4 相差显微镜观察 |
| 2.5 吸光值检测 |
| 2.6 苏云金芽胞杆菌突变体库的构建 |
| 2.6.1 突变体的构建流程 |
| 2.6.2 突变体库 PCR检测用引物 |
| 2.6.3 突变体库的保存 |
| 2.7 芽胞萌发实验 |
| 2.7.1 芽胞前处理 |
| 2.7.2 芽胞萌发实验(筛选萌发受体被突变突变子) |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 YBT-1518菌株突变体库的构建与鉴定 |
| 3.1.1 突变体库的构建 |
| 3.1.2 突变子的抗性筛选与鉴定 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 芽胞萌发缺陷突变株的筛选与鉴定 |
| 3.2.1 突变株的初步筛选 |
| 3.2.2 突变株的复筛 |
| 3.2.3 突变株的PCR鉴定 |
| 3.2.4 突变株MA1在其他萌发剂诱导下的萌发情况 |
| 3.2.5 芽胞的抗逆性实验 |
| 3.2.6 小结 |
| 3.3 MA1的Mini-Tn10插入突变基因的克隆与分析 |
| 3.3.1 MA1插入突变侧翼序列的获得 |
| 3.3.2 MA1插入突变基因的克隆 |
| 3.3.3 MA1插入位点侧翼序列的分析 |
| 3.3.4 GntP蛋白生物学功能的预测 |
| 3.3.5 芽胞萌发表型的回补实验 |
| 3.3.6 小结 |
| 4 讨论 |
| 4.1 转座子及转座插入突变 |
| 4.2 突变位点的确定和目的基因的克隆 |
| 4.3 芽胞萌发缺陷突变菌株的筛选 |
| 4.4 Gntp蛋白的功能 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 本研究所用工具载体的物理图谱 |
| 附录二 发表文章 |
（7）苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒素对棉铃虫作用机理的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1.苏云金芽胞杆菌的研究进展 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌的细胞生物学特性 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 1.3 苏云金芽胞杆菌的应用研究 |
| 2.昆虫中肠受体的概述 |
| 2.1 昆虫中肠受体的研究 |
| 2.2 关于受体氨肽酶 |
| 2.3 关于受体类钙粘蛋白 |
| 2.4 关于其它类受体 |
| 3.昆虫中肠受体与抗性机制的关系 |
| 3.1 受体氨肽酶和昆虫抗性的关系 |
| 3.2 受体类钙粘蛋白和昆虫抗性的关系 |
| 3.3 其它类受体和昆虫抗性的关系 |
| 4.立题依据和意义 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 培养基和培养条件 |
| 1.3 供试昆虫 |
| 1.4 试验试剂 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 CrylAc毒素的提取、纯化和酶解活化 |
| 2.2 棉铃虫中肠BBMV的提取 |
| 2.3 棉铃虫中肠BBMV各组分蛋白含量的定量比较 |
| 2.4 CrylAc毒素与棉铃虫中肠BBMV体外竞争结合印迹试验 |
| 2.5 棉铃虫中肠BBMV总蛋白电泳试验 |
| 2.6 CrylAc受体蛋白免疫共沉淀 |
| 2.7 目的蛋白的原位酶解和质谱鉴定 |
| 2.8 氨肽酶APN表面电势预测 |
| 2.9 CrylAc毒素寡聚体形成能力试验 |
| 2.10 CrylAc毒素对四龄棉铃虫幼虫虫体病理学影响试验 |
| 2.11 透射电镜超薄切片的制备 |
| 2.12 生测 |
| 结果与分析 |
| 1.CrylAc毒素的酶解活化和纯化 |
| 2.棉铃虫中肠BBMV各组分的蛋白含量分析 |
| 3.CrylAc毒素与棉铃虫中肠BBMV体外竞争结合印迹分析 |
| 4.棉铃虫中肠BBMV总蛋白电泳分析 |
| 5.CrylAc受体蛋白免疫共沉淀分析 |
| 6.CrylAc毒素寡聚体形成能力分析 |
| 7.Bt CrylAc毒素对四龄棉铃虫幼虫病理学影响 |
| 8.Bt HTX-42晶体蛋白的生物活性测定 |
| 讨论 |
| 1.BtCrylAc毒素和棉铃虫幼虫中肠BBMV提取方法的探讨 |
| 2.BtCrylAc毒素对棉铃虫中肠BBMV总蛋白和受体蛋白的影响 |
| 3.BtCrylAc毒素寡聚体形成能力的探讨 |
| 4.BtCrylAc毒素对棉铃虫中肠病理学影响 |
| 5.BtCrylAc毒素杀虫机理的探讨 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士期间撰写、发表与课题相关学术论文 |
| 本论文感谢以下项目的资助 |
| 致谢 |
（8）外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌概论 |
| 1.2 Bt生物活性成分 |
| 1.3 Bt CrylAc杀虫晶体蛋白 |
| 1.4 外源抗虫基因 |
| 1.5 Bt的应用研究 |
| 1.6 染色体整合技术的应用研究 |
| 1.7 立题依据与意义 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 培养基和抗生素 |
| 2.3 试剂和引物 |
| 2.4 仪器设备 |
| 2.5 Bt 4.0718菌株总DNA的提取 |
| 2.6 PCR扩增 |
| 2.7 DNA片段连接 |
| 2.8 DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.9 连接产物转化DH5α |
| 2.10 阳性转化子的筛选 |
| 2.11 大肠杆菌质粒的提取方法 |
| 2.12 重组质粒pKCTF12的构建 |
| 2.13 质粒pKCTF12电转XBU001 |
| 2.14 工程菌株KCTF12的筛选 |
| 2.15 生长曲线的测定 |
| 2.16 重组基因的检测 |
| 2.17 重组菌株KCTF12的形态学观察 |
| 2.18 重组菌株KCTF12的芽胞检测 |
| 2.19 重组菌株KCTF12中CrylAc蛋白的表达 |
| 2.20 重组菌株KCTF12的杀虫活力测定 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 Bt4.0178菌株总DNA的提取 |
| 3.2 trigger factot基因上、下游片段PCR扩增 |
| 3.3 整合质粒pKCTF12的构建 |
| 3.4 pKCTF12电转化无晶体突变株XBU001 |
| 3.5 重组菌株KCTF12 crylAc基因检测 |
| 3.6 生长特性分析 |
| 3.7 工程菌株形态学观察 |
| 3.8 芽胞形成情况检测 |
| 3.9 晶体蛋白的表达 |
| 3.10 生物测定 |
| 4.讨论 |
| 4.1 外源基因crylAc在重组菌株KCTF12中的表达 |
| 4.2 染色体定点整合位点的选择 |
| 4.3 染色体定点整合技术特点及其优势 |
| 4.4 整合外源基因的选择 |
| 4.5 crylAc基因以及trigger factor基因的克隆策略 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析 |
| 1.1 前言 |
| 1.1.1 细菌质粒的基本特征 |
| 1.1.1.1 质粒的类型 |
| 1.1.1.2 质粒的复制 |
| 1.1.1.3 质粒拷贝数 |
| 1.1.1.4 质粒的不相容性 |
| 1.1.1.5 质粒分离的稳定性 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌质粒的研究进展 |
| 1.1.2.1 苏云金芽胞杆菌质粒的分类 |
| 1.1.2.2 苏云金芽胞杆菌质粒多态性 |
| 1.1.2.3 苏云金芽胞杆菌质粒的功能 |
| 1.1.2.4 YBT-1765菌株质粒的研究进展 |
| 1.1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.1.1 菌株和质粒 |
| 1.2.1.2 培养基及培养条件 |
| 1.2.1.3 试剂和仪器 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.2.1 DNA操作 |
| 1.2.2.2 DNA电泳分析 |
| 1.2.2.3 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定 |
| 1.2.2.4 BAC文库的构建 |
| 1.2.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.2.6 酶切片段大小的估算 |
| 1.2.2.7 序列测定和序列分析 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 菌株YBT-1765 BAC文库的构建 |
| 1.3.2 菌株YBT-1765 BAC文库的筛选和分析 |
| 1.3.2.1 YBT-1765质粒的BAC文库的筛选与分析 |
| 1.3.2.2 YBT-1765基因组的BAC文库筛选与分析 |
| 1.3.3 质粒pBMB165的拼接 |
| 1.3.3.1 质粒pBMB165的部分限制性酶切图谱 |
| 1.3.3.2 质粒pBMB165的线状重叠连锁图 |
| 1.3.4 转座因子存在的大致机率 |
| 1.4 讨论 |
| 2 苏云金芽胞杆菌Enhancin蛋白的初步研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 昆虫杆状病毒增效蛋白 |
| 2.1.1.1 昆虫杆状病毒增效蛋白的发现及其增效活性 |
| 2.1.1.2 增效蛋白的作用机理 |
| 2.1.1.3 增效蛋白核苷酸和氨基酸序列分析 |
| 2.1.2 Bt中的增效蛋白类似基因 |
| 2.1.3 增效蛋白在害虫防治上应用的展望 |
| 2.1.4 本研究的目的和意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.2.1.2 培养基及培养条件 |
| 2.2.1.3 试剂和仪器 |
| 2.2.1.4 供试昆虫 |
| 2.2.1.5 生物测定试剂和感染饲料配方 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 DNA操作，DNA电泳分析，重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定 |
| 2.2.2.2 聚合酶链式反应 |
| 2.2.2.3 同源重组 |
| 2.2.2.4 复红简单染色 |
| 2.2.2.5 伴胞晶体的培养 |
| 2.2.2.6 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.2.7 生物测定 |
| 2.2.2.8 菌体生长时间与菌体OD_(600)值对应曲线 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.3.1 Enhancin蛋白基因的克隆及序列分析 |
| 2.3.2 BMB171突变体的构建 |
| 2.3.2.1 整合载体的构建 |
| 2.3.3.2 突变体的筛选及验证 |
| 2.3.3 BMB171和突变株BMB1084比较 |
| 2.3.3.1 BMB171与突变株BMB1084生长情况的比较 |
| 2.3.3.2 BMB171与突变株BMB1084芽胞形成的比较 |
| 2.3.4 Enhancin蛋白基因对Bt杀棉铃虫幼虫的增效杀虫活性 |
| 2.3.4.1 晶体蛋白基因cry1Ac10在BMB171和突变株BMB1084表达 |
| 2.3.4.2 生物测定 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、苏云金芽胞杆菌转座子整合载体的构建（论文参考文献）
- [1]苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白结构域Ⅲ的定点突变及结构与功能研究[D]. 吕媛. 湖南师范大学, 2016(06)
- [2]高效表达几丁质酶基因tchiB苏云金芽胞杆菌工程菌的构建及杀虫活性研究[D]. 李玉呈. 湖南师范大学, 2012(01)
- [3]苏云金芽胞杆菌芽胞和晶体形成相关功能基因研究[D]. 常晓娇. 东北农业大学, 2011(04)
- [4]Mariner转座子体内随机突变苏云金芽胞杆菌的研究[D]. 李明磊. 华中农业大学, 2009(S1)
- [5]苏云金芽胞杆菌bel基因生物学功能[D]. 方尚玲. 华中农业大学, 2009(09)
- [6]苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518插入突变体库的构建及芽胞萌发相关基因的初步研究[D]. 巫益鸣. 华中农业大学, 2009(07)
- [7]苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒素对棉铃虫作用机理的研究[D]. 田野. 湖南师范大学, 2008(11)
- [8]外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达[D]. 刘萍. 湖南师范大学, 2008(11)
- [9]苏云金芽胞杆菌重组工程菌研究进展[J]. 刘晶晶,张杰,黄大昉. 生物产业技术, 2008(02)
- [10]苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析[D]. 王莉. 华中农业大学, 2007(02)