一、IFN-γ激活的脐血树突状细胞对肿瘤细胞的杀伤作用及其机制研究（论文文献综述）
孙琳[1]（2021）在《1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究》文中提出研究目的:1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）是一种由遗传因素和环境因素共同诱导,细胞免疫及体液免疫共同介导胰岛β细胞损伤的自身免疫性疾病,在儿童和青少年中更为常见。近年来,流行病学研究表明,我国T1DM发病率明显增加,而患者进行性的胰岛功能下降导致其需要终身应用胰岛素治疗,鉴于其逐年增长的发病率和随之出现的多系统并发症,T1DM已成为重大的公共卫生挑战。目前,T1DM的发病机制尚未完全明确,T细胞相关的研究一直是1型糖尿病的研究热点,而近年来除了CD4+T细胞,越来越多的研究表明CD8+T细胞在1型糖尿病的发病进程中有着重要作用。淋巴细胞活化信号分子家族（signaling lymphocyte activated molecular family,SLAMF）被报道在多种免疫异常疾病中表达异常,并显着影响包括CD8+T细胞在内的免疫细胞分化及功能。然而对T1DM免疫细胞表面SLAMF分子的表达情况未被报道,且对于T1DM中SLAMF分子如何通过影响CD8+T细胞功能仍不明确。为探讨这一问题,本课题通过对T1DM患者及非肥胖的糖尿病小鼠模型（non-obese diabetic,NOD）免疫细胞分化情况及SLAMF分子表达情况进行分析,并进行mRNA测序及相关的体外细胞实验,以期探讨T1DM免疫系统异常分化及SLAMF分子表达对T1DM免疫微环境下CD8+T细胞功能和命运的影响。研究方法:（1）对T1DM患者及健康对照组（health control,HC）的一般临床资料进行统计,利用流式细胞分析法对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中T细胞及其亚群、NK细胞及其亚群、B细胞等免疫细胞比例进行分析,并检测T细胞、B细胞和NK细胞表面SLAM分子家族的表达情况;（2）利用流式细胞分析法对T1DM患者外周血中T细胞SLAMF4分子表达及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌情况进行检测,分析SLAMF4分子与细胞活化状态和细胞因子分泌能力之间的相关性;分析SLAMF4分子表达与1型糖尿病一般临床资料的相关性;（3）对自发性1型糖尿病小鼠模型NOD小鼠进行体重、随机血糖监测及小鼠尾静脉采血,对小鼠胰腺组织留取病理,进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosi,HE）染色,观察其组织细胞形态、炎细胞浸润情况;用流式细胞分析法检测小鼠外周血免疫细胞分化及外周血、胰腺引流淋巴结CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（4）采用流式细胞分选技术得到纯化的T1DM患者的SLAMF4+CD8+T细胞和SLAMF4-CD8+T细胞,并进行mRNA转录组测序,分析差异表达基因的分布及临床意义;（5）应用免疫磁珠分选技术分选脐带血细胞中CD8+T细胞,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体刺激下进行培养,检测作用不同时间CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（6）采用磁珠分选联合流式细胞分选技术正常健康人SLAMF4阳性CD8 T细胞和SLAMF4阴性CD 8 T细胞分别进行分选,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体的刺激下进行体外扩增,用CFSE标记细胞,检测细胞增殖情况,并于Day6检测两种细胞的凋亡情况。研究结果:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞比例与HCs比较存在异常,表现为CD4+T细胞和B细胞比例增多,Treg细胞的比例降低,总NK细胞及其CD56dim亚群的NK细胞比例减低,CD56bright亚群的NK细胞比例升高。与HCs相比,T1DM患者外周血PBMC中SLAMF4阳性的总T细胞百分比降低,且SLAMF4阳性的CD8+T细胞明显降低;SLAMF3分子表达在B淋巴细胞比例有所降低,SLAMF5在NK细胞表面表达升高,差异均有统计学意义。（2）T1DM患者T细胞表面SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关,且与SLAMF4阴性CD8+T细胞相比,SLAMF4阳性CD8+T细胞具备更强的分泌促炎因子IFN-γ和TNF-a的能力;在与T1DM相关的一般临床指标的分析中,发现SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比与糖化血红蛋白水平及T1DM病程呈负相关。（3）与同周龄的Balb/c小鼠相比,NOD小鼠CD4+T细胞及CD4+CD25+的调节性T细胞百分比明显降低,随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下降,且明显低于对照Balb/c小鼠。（4）mRNA转录组测序结果表明,1型糖尿病中SLAMF4作用后的CD8+T细胞表现出多个信号通路的异常改变,包括T细胞受体信号相关的信号通路、细胞因子分泌及细胞凋亡通路,差异表达的基因中也有多个与凋亡相关的基因,说明SLAFM4在1型糖尿病中调控CD8+T细胞的活性与命运。（5）通过体外培养人脐带血CD8+T淋巴细胞发现,一定程度的抗原刺激可促进SLAMF4在脐带血na?ve CD8+T细胞表面上调表达,随着免疫活化的时间延长,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下调。（6）通过SLAMF4阳性CD8+T细胞和SLAMF4阴性CD8+T细胞经CFSE标记后体外培养,发现SLAMF4阴性CD8+T细胞对抗CD3/CD28单克隆抗体的TCR刺激更敏感、更易扩增,增殖能力强,而SLAMF4阳性CD8+T细胞更容易凋亡。研究结论:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞分化比例与HCs相比存在异常,且外周血T细胞及B细胞表面多种SLAM分子表达水平发生变化,结合课题组前期结果,这在T1DM及T2DM之间存在一定共性和不同之处。（2）与HCs相比,T1DM患者SLAMF4阳性CD8 T细胞百分比显着下降,且SLAMF4分子表达与细胞活化的状态及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌有关。在T1DM患者中,SLAMF4+CD8+T细胞百分比与患者的糖化血红蛋白水平和1型糖尿病病程呈负相关。（3）在动物模型中我们发现NOD小鼠也存在外周血T细胞异常分化状态。且随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T百分比逐渐下降,明显低于对照Balb/c小鼠。（4）SLAMF4分子表达与1型糖尿病患者CD8+T细胞功能调控及凋亡显着相关,SLAMF4阳性的CD8+T细胞增殖能力较差且更容易凋亡,故体内持续抗原刺激会导致表达SLAMF4的CD8+T细胞的百分比降低,使其发挥类似调定点作用。综上所述,本课题首次分析了T1DM疾病模型中的SLAMF分子家族的表达谱,为SLAMF分子与T1DM免疫细胞的调控提供了实验证据,证实了在1型糖尿病免疫微环境中SLAMF4表达对CD8+T细胞的功能影响和命运的调控及SLAMF4阳性CD8+T细胞比例变化的具体机制,提示SLAMF4分子可能为T1DM的早期诊断,临床分期或免疫干预提供新靶点。
刘芹芹[2]（2020）在《树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究》文中认为急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是恶性的血液系统疾病,其特征是骨髓造血干祖细胞克隆性增生、分化异常及凋亡受阻,在外周血、骨髓内及其他组织内大量增殖及浸润。AML骨髓微环境以免疫抑制为特征,与AML的发生发展相关,可促进免疫耐受和白血病细胞免疫逃逸。近年来虽然AML的治疗方法不断改进,但是许多患者仍然出现耐药、难治及复发,长期生存及预后不容乐观。树突状细胞（dendritic cells,DCs）是机体重要的抗原提呈细胞,在机体免疫应答中发挥重要的核心作用。DCs是连接机体适应性免疫和先天性免疫重要的桥梁,具有强大的抗原提呈能力,可以“驾驭”B细胞和T细胞两种重要的免疫细胞,在机体对病原体和抗肿瘤的保护性免疫应答中发挥重要的作用。DCs可以刺激体内的T细胞产生免疫应答,并在对肿瘤细胞杀伤的免疫反应中起重要作用。DCs具有免疫调节特性可以克服骨髓的免疫耐受,增强骨髓微环境免疫并诱导抗白血病特异性T细胞的增殖。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导AML细胞杀伤。可以通过DCs免疫刺激自体T细胞减少或消除残留的白血病细胞预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者残留白血病细胞方面更加成功。炎症小体是参与固有免疫的主要成分之一,NLRP3炎症小体是目前为止研究最多、最透彻的。NLRP3炎症小体在感染性疾病和免疫性疾病中影响Th亚群分化,但在AML中的研究很少。NLRP3炎症小体活化后,释放IL-1β活性细胞因子,可以诱导T细胞产生并释放细胞因子IL-2,维持T细胞的存活和促进T细胞增殖。T细胞是机体抗肿瘤反应的重要免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质来清除白血病细胞,NLRP3炎症小体通过调节T细胞增殖和分化,最终达到调控肿瘤的作用。尽管多数AML化疗后病情会缓解,但长期生存率并不理想。免疫抑制的骨髓微环境有利于白血病细胞的生长和免疫逃逸,具有免疫调节特性的治疗可以克服免疫耐受,提高骨髓微环境的免疫力,增强肿瘤的免疫原性,改善AML的预后。因此探究AML骨髓DCs细胞NLRP3炎症小体对骨髓微环境免疫的作用,研究免疫相关基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）与AML的关系,探索骨髓微环境免疫在AML发生发展中的作用及其机制,从而进一步探索抗白血病细胞免疫治疗的方法,为AML的免疫治疗提供策略。第一部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病骨髓Th1亚群分化的作用及机制研究背景急性髓系白血病（AML）机体免疫功能异常在其发生发展和耐药中发挥重要作用,免疫紊乱的骨髓微环境促进了免疫耐受,有利于白血病细胞逃逸,其作用机制可能与骨髓Th亚群失衡有关。免疫细胞主要包括T细胞、B细胞和NK细胞,是骨髓微环境免疫的重要组成部分,其中T细胞中的Th细胞免疫失衡引起了研究者的高度关注。AML骨髓中T细胞增殖和产生细胞因子的能力明显降低,AML白血病细胞通过骨髓髓系来源的抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）对T细胞发挥抑制作用,或阻止T细胞进入细胞周期或分泌Th1相关细胞因子。Th1细胞参与机体细胞免疫,在细胞免疫中发挥重要作用。Th1细胞与AML发病及预后密切相关,但其分子机制尚未明确。NLRP3炎症小体是一种细胞内传感器,感受“危险”信号后将细胞因子IL-1β和IL-18前体转变成其活性形式,该信号可以是宿主或病原体。NLRP3炎症小体是参与机体免疫的多蛋白复合物,其作用机制可能与介导Th亚群分化有关。NLRP3炎症小体在肿瘤微环境中能诱导Th1、Th2、Th17细胞及CTL细胞的分化并能抑制肿瘤的免疫逃逸。AML骨髓微环境免疫失衡及功能失调可以导致白血病的发生,且与治疗后残留白血病细胞的免疫逃逸相关,免疫功能紊乱的骨髓微环境可导致AML的复发及难治。研究发现AML骨髓Th1/Th2及Th17/Treg免疫失衡参与了白血病细胞的免疫逃逸,在AML发生发展和耐药中发挥重要作用。但是,目前树突状细胞NLRP3炎症小体是否参与了 AML骨髓T细胞分化尚未明确,尤其是Th1亚群分化的机制尚待研究。研究目的本研究旨在研究Th1亚群在AML骨髓微环境中是否存在免疫失衡;探索树突状细胞NLPR3炎症小体对AML骨髓中Th1亚群分化的影响及机制;研究树突状细胞NLRP3炎症小体对Th1相关细胞因子IFN-γ水平及相关转录因子表达的影响,进而分析NLRP3炎症小体对骨髓Th1亚群分化影响的关键分子,通过对关键分子的干预观察对Th1亚群的影响,明确NLRP3炎症小体参与AML免疫失衡尤其是Th1亚群分化的作用机制。研究方法（1）临床标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的37例AML患者、30例AML治疗完全缓解（CR）患者、23例难治复发AML患者及16例对照的骨髓液,分离骨髓单个核细胞和CD4+T细胞,留取骨髓上清。（2）Th1细胞与AML患者临床特征的关系:收集、整理AML患者白细胞计数、治疗疗效等临床资料,流式细胞术检测骨髓中Th1细胞比例,分析骨髓Th1细胞比例与临床资料的相关性。（3）IFN-γ细胞因子水平与AML患者关系:酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测骨髓上清中的IFN-γ细胞因子水平,分析与AML的临床相关性。（4）树突状细胞及CD4+T细胞培养:AML患者骨髓单个核细胞（BMMCs）用IL-4和GM-CSF诱导培养为树突状细胞,并用流式细胞术检测树突状细胞CD14、CD11c、CD80、CD83、CD86分子表达情况及诱导DCs转化率。MACS分选骨髓BMMCs中的CD4+T细胞并用流式细胞术检测分选率。（5）树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:将诱导培养的树突状细胞分成三组:①实验组（LPS+ATP,LA）:树突状细胞先用脂多糖LPS预处理6小时,然后加ATP激活45分钟;②NLRP3炎症小体抑制组:LPS处理前,LPS处理前先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时（MLA）;③对照组:加入对应量的无菌PBS。检测树突状细胞NLRP3炎症小体相关分子NLRP3、ASC、IL-18、Caspase-1、IL-1β及 NF-κB 的表达情况。（6）树突状细胞NLRP3炎症对CD4+T细胞分化影响:将以上3组DCs与CD4+T细胞共培养,7天后流式细胞术检测Th1、Th2、Th17及Treg细胞比例。（7）细胞因子检测:用多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液中IL-12p70、IL-10、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-2、IL-8等细胞因子水平,用ELISA方法再次检测相关细胞因子水平。（8）IL-1β对Th1细胞分化的影响:在BMDCs和CD4+T细胞共培养对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子,在实验组加入人IL-1β中和抗体,流式细胞术检测Th1细胞比例。（9）树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:将树突状细胞与CD4+T细胞进行接触或用小室分离共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞中Th1比例,ELISA方法检测DCs与CD4+T细胞共培养上清液中IFN-y及IL-1β细胞因子水平。（10）IL-1β影响Th1细胞分化的机制:将分离的CD4+T细胞分为3组:①单独加入IL-12;②IL-12联合重组人IL-1β细胞因子;③加入对应量无菌PBS,RT-PCR检测各组CD4+T细胞中IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1的表达。（11）树突状细胞NLRP3炎症小体对体内Th1细胞分化的影响:体外培养野生型（WT）或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①实验组:LPS和ATP处理;②抑制组:炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组,然后将各组DCs通过尾静脉注入WT小鼠体内,观察树突状细胞NLRP3炎症小体对小鼠Th1亚群的影响,流式细胞检测小鼠骨髓、脾脏中Th1细胞比例。（12）IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,观察IL-1β对小鼠体内Th1亚群影响,流式细胞检测小鼠骨髓和脾脏中Th1细胞比例。研究结果:（1）AML初诊患者骨髓中Th1细胞比例与对照组相比显着降低,治疗达CR后患者骨髓Th1细胞比例明显增高;骨髓中Th1细胞比例与AML初诊患者外周血白细胞计数呈负相关,Th1细胞比例≤10%的AML患者外周血白细胞计数明显高于Th1>10%AML患者。（2）AML初诊患者骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平明显低于对照组,患者治疗骨髓达CR后骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平升高。（3）树突状细胞培养及CD4+T细胞:流式细胞仪检测结果为树突状细胞表达CD11c,不表达CD80和CD14,少量表达CD83和CD86,DCs诱导转化率在>90%。利用CD4+MACS磁珠分选骨髓中CD4+T细胞的分离纯度>90%。（4）树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:RT-PCR检测实验组较对照组树突状细胞NLRP3炎症小体激活后caspase-1和IL-1β的表达增加,抑制组caspase-1和IL-1β的表达较实验组有降低趋势。ELISA检测实验组与对照组相比BMDCs上清液中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制组IL-1β分泌明显较实验组降低。此外,western blot结果表明,IL-1β的活化形式IL-1β（p17）蛋白在实验组树突状细胞NLRP3炎症小体活化后表达增加。（5）树突状细胞NLRP3炎症小体对CD4+T细胞分化影响:流式细胞术检测结果显示:实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,而NLRP3炎症小体被MCC950抑制后促进Th1细胞分化的作用明显降低。Th2、Th17和Treg细胞比例无明显变化。（6）细胞因子检测:多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液,发现实验组NLRP3炎症小体激活后上清液中的IL-1β显着升高,MCC950抑制组较实验组明显降低。用ELISA方法检测验证了 12例AML患者树突状细胞NLRP3炎症小体激活后上清中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制后降低。（7）IL-1β对Th1细胞分化的影响:在对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子后Th1细胞比例升高,IL-1β可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,并且IL-1β可逆转抑制组MCC950的抑制作用,在实验组加入人IL-1β中和抗体后Th1细胞比例降低,IL-1β中和抗体可抑制NLRP3炎症小体激活的DCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化的作用。（8）树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:树突状细胞和CD4+T细胞无论是接触共培养还是小室分离共培养,DCs NLRP3炎症小体激活促进CD4+T细胞向Th1分化的作用是一样的,而且共培养上清液中细胞因子IFN-y和IL-1β的水平没有显着差异。（9）IL-1β影响Th1细胞分化的机制:RT-PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1表达在IL-1β和IL-12联合组明显升高,IL-12单独刺激或PBS组升高不明显。（10）树突状细胞NLRP3炎症小体在体内对Th1细胞分化的影响:WT小鼠树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进WT小鼠骨髓或脾脏中Th1细胞的分化,Th1细胞比例高于对照组,而抑制组MCC950可抑制这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠树突状细胞无论在实验组还是对照组均不能促进WT小鼠中Th1细胞分化。（11）IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,与未注射IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比Th1细胞比例明显降低。研究结论1.AML初诊患者骨髓Th1细胞比例及IFN-γ水平降低,且Th1细胞比例降低与白细胞计数呈负相关,提示AML骨髓微环境中存在免疫失衡。2.树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进的Th1细胞分化需要一个有功能的炎症小体,该结果为纠正AML骨髓微环境的免疫失衡提供新的研究方向。3.树突状细胞NLRP3炎症小体激活不依赖于细胞接触通过IL-1β分泌的方式促进Th1细胞分化,表明IL-1β是促进Th细胞分化的关键分子,可以通过干预IL-1β提高骨髓微环境的免疫。第二部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病抗白血病作用及机制的研究研究背景急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性致命的血液系统恶性肿瘤,为成人急性白血病最常见的一种,占儿童白血病的20%。AML标准诱导化疗方案可使50%到75%的AML患者得到缓解,由于化疗耐药性克隆的出现,标准疗法通常不足以维持持久缓解,细胞遗传学不良的AML即使采用积极的化疗效果也较差,大多数患者会复发并死于自身疾病,其5年生存率约为25%。但是年龄大于65岁的患者其预后并没有得到改善,最新报道其生存率低于10%,因此,迫切需要新的治疗方案,正是在这种情况下,免疫疗法在近年来脱颖而出。近年来基于免疫的治疗方法已经使某些晚期癌症患者的生存率得到意想不到的提高。免疫疗法治疗的前提是肿瘤会抑制免疫系统,肿瘤微环境中的T细胞功能受到抑制,并且可能与AML发病有关,而且新诊断的AML患者骨髓微环境中的T细胞浸润与总生存期之间存在显着关联。使用AML/树突状细胞融合的疫苗接种可引起白血病特异性T细胞的扩增,预防疾病复发,因此新型的个性化树突状细胞疫苗是一种新的治疗方法,产生防止疾病复发的免疫记忆,具有治疗AML的潜力。通过DCs刺激可以使T细胞产生免疫应答,并在针对肿瘤杀伤的免疫应答反应中起重要作用。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导对AML细胞杀伤作用。近年来,DCs作为AML免疫治疗的工具引起了人们的极大兴趣,通过DCs免疫刺激自体T细胞是一种创新策略,可减少或消除残留的白血病细胞来预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者中残留白血病细胞方面更加成功。AML患者在接受相当数量的DCs治疗后,可以获得非特异性和抗原特异性的免疫效应。NLRP3炎症小体在癌症发生和发展中的作用具有争议性。NLRP3炎症小体及其成分促进了恶性肿瘤如黑素瘤、肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤的生长、增殖、侵袭和转移。但是,在NLRP3基因敲除动物模式中使用氧化偶氮甲烷（AOM）及葡聚糖硫酸钠（DSS）（AOM/DSS）诱发结肠癌的实验研究中,NLRP3炎症小体对癌变具有保护作用。NLRP3炎症小体在不同肿瘤中的功能也突出了炎症小体的治疗潜力。前期我们研究结果显示AML患者骨髓中Th1细胞比例降低,存在骨髓微环境免疫抑制,树突状细胞炎症小体激活可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,Th1细胞效应细胞因子为IFN-γ,IFN-γ具有抗肿瘤免疫的作用,然而树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化对白血病细胞是否具有杀伤作用及其机制尚待研究。研究目的本研究旨在探究树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化是否对白血病细胞增殖和凋亡有影响;研究影响AML白血病细胞增殖和凋亡的关键分子,通过干预关键分子分析其对白血病细胞增殖和凋亡影响的机制,从而明确NLRP3炎症小体参与AML骨髓免疫促进Th1亚群分化抗白血病的作用机制。研究方法（1）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:将AML患者BMDCs分成三组:①NLRP3炎症小体激活实验组（LA）:DCs先用脂多糖LPS预处理6小时,再加ATP作用45分钟,激活NLRP3炎症小体;②抑制组（MLA）:LPS处理前,预先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时,抑制NLRP3炎症小体活性;③对照组:加入对应量的无菌PBS。用小室将CD4+T细胞与三组BMDCs共培养,共培养后的CD4+T细胞再与THP-1或U937 AML细胞系共培养,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,用CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖。（2）影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA方法检测共培养细胞上清液中的Th1细胞主要效应细胞因子IFN-γ水平。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖,探讨细胞因子IFN-γ对影响白血病细胞的凋亡和增殖的影响。（3）树突状细胞NLRP3炎症小体对AML白血病小鼠的影响:体外培养WT或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①激活NLRP3炎症小体实验组:LPS和ATP处理;②抑制NLRP3炎症小体抑制组:先用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组。先通过WT小鼠尾静脉注射了 MLL-AF9-GFP白血病细胞,3天后将各组BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,7天后检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏及肝脏中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。（4）IFN-y对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IFN-γ中和抗体在第4、6和8天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。（5）IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IL-1β中和抗体连续4天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。研究结果（1）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:与对照组相比,实验组CD4+T细胞与THP-1或U937白血病细胞共培养后白血病细胞凋亡明显增加,而抑制组MCC950会降低这种促凋亡作用。与对照组或抑制组的BMDCs组共培养的CD4+T细胞相比,实验组CD4+T细胞使THP-1或U937白血病细胞的增殖明显降低。（2）影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA检测实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs与CD4+T细胞共培养上清液中的细胞因子IFN-γ水平明显高于对照组,而抑制组IFN-γ的水平显着降低。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的凋亡显着降低。同样,在实验组共培养体系中加入IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的增殖较未加入IFN-γ的实验组明显增加。（3）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病小鼠肿瘤影响:与对照相比,注射NLRP3炎症小体激活WT/BMDCs的实验组白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着降低,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例低于对照组,而MCC950可逆转WT/BMDCs NLRP3炎症小体激活抑制白血病细胞增殖的这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠的实验组BMDCs NLRP3炎症小体激活后注射入白血病小鼠体内后,未观察到对白血病小鼠白血病细胞的抑制作用。（4）IFN-γ对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:与未注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠相比,注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠的脾脏体积或肝脏重量和体积显着增加,小鼠中骨髓、脾脏或肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。（5）IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:实验组小鼠注射鼠IL-1β中和抗体后,与未注射鼠IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着增加,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。研究结论1.NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进Th1细胞分化有抗白血病的作用,为AML的免疫治疗提供新的研究方向。2.IFN-γ是BMDCs NLRP3炎症小体激活抗白血病作用重要的效应分子。3.NLRP3炎症小体通过IL-1β/Th1/IFN-γ参与抗白血病作用,调节树突状细胞NLRP3炎症小体和IL-1β有望成为AML治疗新的靶点。第三部分免疫相关基因单核苷酸多态性在急性髓系白血病中的研究研究背景急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是髓系原始幼稚细胞在骨髓内大量增殖导致正常造血功能受损,并伴有遗传学异常,是成人发病率最高的血液系统恶性肿瘤。恶性肿瘤存在免疫失衡,AML患者骨髓存在免疫系统损伤,免疫系统最重要的组成部分T细胞存在数量和功能上的缺陷。免疫T细胞是至关重要的抗肿瘤免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质消灭AML白血病细胞。同时,AML白血病细胞也会影响T细胞的分化和增殖,并通过释放抑制性细胞因子等方式发挥免疫抑制作用。T辅助（Th）细胞在T细胞免疫系统网络中起着举足轻重的作用,Th1/Th2及Th1 7/Treg失衡与实体瘤的发病机理以及血液系统恶性肿瘤有关,但是Th细胞在AML骨髓微环境中研究不多。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）是最常见的遗传变异类型,其功能在生物学的许多领域被发现,特别是在人类各种疾病方面的研究最多。炎症相关的SNPs在AML患者中的作用已已有相关研究,并且发现SNPs与化疗敏感性、疾病预后和生存时间相关的SNPs。例如IL-1β（rs16944）GA基因型与AML遗传学预后良好相关,而含有IL-18（rs1946518）GT基因型的AML患者生存率较差。Zhu等报道IL-17F的G单突变体和GG突变纯合子与AML易感性有关。TNF-α、IL-10、TGF-β1等功能性变异可能与AML的发病机制有显着相关性。我们在前期研究中发现AML骨髓中Th亚群失衡及其相关细胞因子分泌紊乱,并发现失衡的Th亚群与紊乱的细胞因子可能共同参与AML的发生和发展。因此,我们进一步研究免疫相关基因（包括促炎或抗炎细胞因子以及T细胞亚群的关键调节因子）的SNPs与AML的关系,探索SNPs在AML发病过程中涉及一些尚未发现的功能及病理机制,寻找新的治疗AML重要的免疫靶点。研究目的本研究旨在探索免疫相关基因的单核苷酸多态性与AML易感性、预后危险分层和生存分析之间的关系;分析免疫相关基因的单核苷酸多态性不同基因型与AML临床特征之间的关系;结合相关基因mRNA表达和功能分析,进一步确定了潜在的信号通路,寻找AML新的免疫治疗靶点。研究方法标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的269例初诊AML患者及200例健康对照标本,分离单个核细胞并提取DNA及RNA。收集整理患者临床相关资料。（1）将AML患者及健康对照标本进行质谱SNPs分型信息采集及分析。Sequenom MassARRAY平台对21个候选SNPs进行了引物延伸质谱的基因分型,得出269例AML病例和200例健康对照的基因分型准确性结果。本研究利用Hardy-Weinberg平衡和微小等位基因频率（MAF）对21个候选SNPs的适用性进行了评价。（2）实时荧光定量PCR检测AML骨髓单个核细胞中IL-12 mRNA的表达。研究结果:（1）免疫相关基因SNPs与AML易感性的关系:IL4（rs2070874、rs2243250）和IL22 rs1179251在显性模式下基因型频率与AML易感性显着相关;单因素logistic回归分析显示,调整年龄和性别后,在显性模式下只有IL4（rs2243250）与AML的易感性显着相关,但是经过Bonferroni多重校正后,没有SNPs与AML的易感性相关。（2）免疫相关基因SNPs与骨髓原始幼稚细胞的关系:在隐性模式下IL2（rs2069762）基因型频率在骨髓高幼稚细胞（≥42%）和低幼稚细胞（<42%）组间差异有统计学意义。（3）免疫相关基因SNPs与外周血白细胞的关系:IL22（rs2227491）在显性、共显性和等位基因模式下的基因型频率与白细胞计数显着相关;另外IL4（rs2243250）等位基因频率也与白细胞计数显着相关;rs2227491在显性和等位模式下的基因型频率经Bonferroni多重校正后与白细胞计数也显着相关;在调整年龄和性别后,IL22（rs2227491）在显性模式下AML患者携带TT基因型发生高白细胞计数的风险是TC/CC基因型携带患者的4.2倍,IL22 rs2227491等位基因的分布也有统计学差异。（4）免疫相关基因SNPs与血红蛋白、血小板及乳酸脱氢酶的关系:在共显性和显性模式下STAT6（rs324011）和IL12A（rs2243115）的基因型频率在高血红蛋白（≥80g/L）和低血红蛋白（<80/L）间差异有统计学意义;在共显性和隐性模式下IFN-γ（rs2069718）等位基因频率和基因型频率与血红蛋白高低也显着相关;在调整年龄和性别后,IL6R（rs2228145）基因型频率仅在显性模式下与高乳酸脱氢酶（LDH）显着相关性,但是在Bonferroni多重校正后,SNPs与血红蛋白、LDH无显着相关性。未发现SNPs与血小板高低相关。（5）免疫相关基因SNPs与WHO分型重现性遗传学异常的关系:STAT5B（rs6503691）在共显性和隐性模式下与AML重现性遗传学异常（RGAs）显着相关,即使Bonferroni多重校正后,rs6503691与重现性遗传学异常之间的相关性也具有统计学意义;调整年龄和性别后进行单变量逻辑回归分析,rs6503691 CC基因型（共显性模式）或CC/CT基因型（隐性模式）被作为参考时,TT或CT基因型（共显性模式）和TT（隐性模式）与重现性遗传学异常显着相关。（6）免疫相关基因SNPs与AML危险度分层的关系:在共显性、显性和隐性模式下TGF-β1（rs1800469）与AML危险度分层显着相关,但是经多元回归调整年龄和性别因素后rs1800469在共显性、显性和隐性模式下差异无统计学意义。（7）AML缓解组和难治组总生存时间（OS）:对191名化疗诱导治疗患者的治疗效果进行OS的单因素分析,结果显示完全缓解（CR）组和难治组之间的结果有显着差异,中位OS分别为39个月和18个月。（8）免疫相关基因SNPs与AML非M3诱导化疗敏感性的关系:在共显性和隐性模式下STAT1（rs3771300）的等位基因频率和基因型频率在治疗敏感组、中等组和无效难治组间差异有统计学意义;在共显性模式下GATA3（rs3824662）等位基因频率和基因型频率在三组间均有显着相关性,但是经过Bonferroni多重校正后无SNPs与诱导化疗敏感性相关。（9）免疫相关基因SNPs与AML生存的关系:在显性和共显性模式下STAT3（rs744166）基因型频率与AML患者生存期显着相关;IL12A（rs6887695）在等位基因、隐性和共显性模式下的与AML患者的生存期显着相关;在Bonferroni多重校正后IL12A（rs6887695）只有在共显性和隐性模式下的与AML患者的生存显着相关;在IL12A（rs6887695）共显性模式下AML患者携带CC基因型的比GG基因型的携带患者OS降低22个月;IL12A（rs6887695）在GC/CC下的生存期（22.0个月）明显短于隐性模式下GG（33.0 个月）。（10）rs6887695与IL12 mRNA表达水平的关系:在共显性模式下,CC基因型患者IL12mRNA表达水平高于GG基因型患者;与GG基因型相比,CG杂合子患者的IL12水平也升高;在隐性模式下,与CG/GG基因型相比,GG基因型的样本中IL12表达显着降低;而在显性模式下,CC/CG基因型和GG基因型的IL12 mRNA表达无差异。研究结论1.IL22（rs2227491）与白细胞计数显着相关,提示IL22与AML预后有相关性。2.STAT5B（rs6503691）与AML患者重现性遗传学异常密切相关,提示STAT5B与AML预后关。3.IL12A（rs6887695）与 AML 患者的 IL12 mRNA 表达及 OS 相关,对 AML的预后有独立的负面影响。
张曦文[3]（2020）在《肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究》文中进行了进一步梳理肺癌是临床最常见的肿瘤,患病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。肺癌的主要治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,能够有效激活T淋巴细胞免疫,是肿瘤免疫治疗中的调控关键。在肿瘤微环境中,肿瘤相关树突状细胞（Tumor-associated dendritic cells,TDCs）中脂质过氧化激活内质网应激,引起未折叠蛋白反（Unfolded Protein Response,UPR）,激活下游 IRE1α-XBP1 通路,产生的剪切型XBP1-s通过靶向多个脂质合成基因,诱导TDCs内脂质的异常积累,表现出未成熟表型和功能障碍,抑制了抗肿瘤免疫。有研究表明,PI3K-AKT-mTOR信号途径在脂质代谢中起重要调控作用,能够通过调节脂肪合成相关基因的表达来调控脂质合成,XBP1过表达会导致PI3K/mTOR表达的上调,敲除XBP1后,PI3K/mTOR表达下调,还有研究表明,抑制mTOR2可以下调脂质的生成。“脂浊”既为病理产物也是致病因素,多归属于中医学“痰浊”的病理范畴。肺瘤平膏是由“全国名中医”朴炳奎教授研制的临床治疗肺癌具有确切疗效的中药复方,具有益气养阴、化痰散结、解毒活血的功效,可通过多作用靶点发挥抗肿瘤作用。前期研究表明,肺瘤平膏（FLP）能够明显提高DCs功能,通过调节DCs的抗原递呈功能发挥抗肿瘤效应,并且在调控PI3K/mTOR通路方面具有一定优势。作为肺瘤平膏中化痰类代表药物桔梗的主要有效组分,研究表明,桔梗皂苷D（PlatycodinD,PD）具有明确的抗肿瘤、免疫调节、降脂和抗氧化等功能,并且具有抑制ROS聚集、调节PI3K/mTOR信号的作用。因此,我们推测PD可能是FLP调控脂质代谢逆转TDCs功能的有效组分之一,可能通过抑制TDCs脂质异常堆积逆转TDCs功能,并希望对其效应机制进行初探。目的:（1）构建TDCs共培养体系,探究肺瘤平膏在毒胡萝卜素（TG）诱导ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及作用机制。（2）初探PD对TDCs的免疫调节功能,及探究TG激活ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及可能的效应机制。方法:（1）小鼠骨髓源树突状细胞的分离、培养,建立体外肿瘤相关树突状细胞共培养模型。（2）模拟肿瘤微环境,通过FLP含药血清干预TDCs模型后,流式细胞术观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达;通过混合淋巴细胞反应,CCK8检测混合淋巴细胞增殖、流式检测T淋巴细胞亚群活化,Luminex技术检测TDCs细胞因子分泌。（3）毒胡萝卜素干预TDCs模型,观察TG激活ERS,对IRE1α-XBP1通路的影响,及对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（4）FLP含药血清,作用TG干预后的ERS激活后的TDCs模型,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（5）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 FLP 含药血清对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。（6）通过LDH、CCK8检测技术,观察PD对DCs毒性和Lewis肺癌细胞的杀伤能力。（7）模拟肿瘤微环境,通过PD干预TDCs模型后,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（8）通过构建TG激活ERS后的TDCs模型,观察PD对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（9）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 PD 对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。结果:（1）流式检测诱导后DCs表面分子CD1 1c+阳性表达比例为76.5%,并与肺癌细胞培养上清共培养,冻融抗原刺激,构建TDCs共培养模型。（2）在模拟的肿瘤微环境中,FLP含药血清干预后,降低TDCs胞内脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86的表达最为明显（P<0.05）,FLP刺激共培养淋巴细胞增殖（P<0.05）,明显提高T细胞中Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）,降低Tregs细胞的表达（P<0.05）,提高细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（3）TG作用后,在TDCs培养模型中,BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA、蛋白表达增加（P<0.05）,脂质含量较模型组增加（P<0.05）,影响TDCs表面分子的表达,MCH-Ⅱ、CD80、CD86的表达均明显降低（P<0.05）;抑制混合淋巴细胞的增殖能力（P<0.05）,降低Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,提高Tregs亚群的表达（P<0.05）,同时抑制细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌（P<0.05）。（4）FLP含药血清作用于TG干预后的TDCs,脂质含量明显下降（P<0.05）,恢复TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86表达水平较为明显（P<0.05）,提高TG干预后的混合淋巴细胞增殖能力（P<0.05）,提高Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）、降低Tregs细胞的亚群表达（P<0.05）,促进TG作用后 TDCs 细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（5）qPCR、Western blot 结果显示,对于 TG 激活 ERS 后,BiP-IRE1 α-XBP 1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白表达量增加（P<0.05）;FLP含药血清干预TG作用后的TDCs,FLP+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1通路mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,对重要脂质调节转录因子XBP1-s,具有降低其mRNA和蛋白表达的作用;同时,肺瘤平膏含药血清作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,并且明显降低AKT蛋白的磷酸化水平。（6）LDH结果显示,30uM以下的PD浓度,对DCs无明显损伤,或影响DCs细胞LDH的释放;CCK-8实验结果显示,PD能够有效杀伤Lewis肺癌细胞,其IC50值在13uM左右。（7）在TDCs共培养体系中,PD高中低浓度均能够有效降低TDCs中的脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,提高CD80（PDH、PDM,P<0.05）、CD86（PDM、PDL,P<0.05）的表达;PDH较强混合淋巴细胞的增殖（P<0.05）;PD高中低组均能提高Th、CTL细胞的亚群表达率（P<0.05）,抑制 Tregs 亚群表达（PDH,P<0.05）;提高 IL-12p70（PDH、PDM,P<0.05）IFN-γ（PDH,P<0.05）细胞因子的分泌。（8）TG干预诱导RES后,PD高、中、低剂量组均能降低TG干预后TDCs中脂质含量（P<0.01）;PDH能够提高表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,各剂量组均能提高CD80及CD86的表达（P<0.05）,PDH具有提高淋巴混合细胞的增殖能力（P<0.05）,PDH、PDM能够明显提高Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,PD各剂量组均能降低Tregs细胞亚群的表达（P<0.05）,并能促进 TDCs 分泌 IL-12p70（PDH,P<0.05）、IFN-γ（PDH、PDM,P<0.05）细胞因子。（9）qPCR、Western blot结果显示,TG激活ERS后,PD+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA和蛋白的表达（P<0.01）,同时,PD+TG组作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,其中降低p-AKT磷酸化蛋白表达（P<0.05）水平作用较为明显。结论:基于本实验条件下,我们推测:（1）TG诱导ERS,激活IRE1α-XBP1通路,产生XBP1-s剪切形式,可造成TDCs脂质异常堆积和TDCs的功能障碍。（2）FLP含药血清能够逆转TG激活ERS诱导XBP1剪切造成的TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能障碍。（3）PD可能是FLP发挥改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的有效组分之一。（4）FLP含药血清及其有效组分PD调节改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的作用机制可能是通过调控BiP-IRE1α-XBP1 和 PI3K-AKT-mTOR 通路实现的。
孙莹莹[4]（2020）在《髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究》文中提出目的通过研究SAA患者mDC内cofilin 1表达水平,及其对mDC和下游效应T淋巴细胞的影响,探索cofilin 1在SAA免疫发病中的作用,为完善SAA免疫发病机制,寻求新的治疗靶点提供理论依据。方法一,通过流式细胞术、WB方法检测30例SAA患者（初治15例、完全缓解15例）和15名健康对照者mDC内cofilin 1蛋白表达水平,并将SAA患者cofilin 1水平与其血常规、免疫指标作相关性分析。通过q RT-PCR方法检测三组患者mDC内cofilin 1的m RNA相对表达水平。二,应用RNAi技术敲低SAA患者mDC内cofilin 1表达水平,对敲低前后的mDC进行如下检测:CCK-8检测细胞增殖、流式细胞术检测凋亡、流式细胞术和免疫荧光方法检测吞噬能力、Transwell实验检测细胞迁移能力、流式细胞术检测共刺激分子CD80和CD86表达水平,免疫荧光检测F-actin。三,将cofilin 1敲低前后的SAA患者mDC与CD4+T淋巴细胞共培养,流式细胞术检测各组共培养上清Th1和Th2相关细胞因子的表达差异,流式细胞术检测Treg细胞foxp3的表达水平。四,将cofilin 1敲低前后的SAA患者mDC与CD8+T淋巴细胞共培养,CFSE检测各组CD8+T淋巴细胞的增殖状况差异,流式细胞术检测其分泌穿孔素、颗粒酶B水平变化。结果一,流式检测初治SAA患者mDC内cofilin 1水平[（70.37±22.70）%]明显高于健康对照者[（39.65±23.43）%,P=0.006]及SAA完全缓解者[（43.97±21.23）%,P=0.002],完全缓解组及健康对照组之间无统计学差异。SAA患者mDC内cofilin1水平,与患者的白细胞计数显着负相关（r=-0.57,P=0.0026）,与中性粒细胞绝对值显着负相关（r=-0.49,P=0.0134）,与血小板计数显着负相关（r=-0.57,P=0.0028）,与血红蛋白水平显着负相关（r=-0.47,P=0.0192）,与网织红细胞绝对值显着负相关（r=-0.4089,P=0.0424）;与CD4+/CD8+比值显着负相关（r=-0.62,P=0.0010）,与IL-2浓度显着正相关（r=0.56,P=0.0037）,与IFN-γ浓度显着正相关（r=0.56,P=0.0037）。WB检测显示SAA初治患者mDC内cofilin 1表达水平高于SAA完全缓解者及健康对照者。q RT-PCR检测提示SAA初治组患者骨髓培养mDC内cofilin 1的m RNA相对表达量（9.13±10.32）显着高于完全缓解组（2.91±3.08,P=0.049）和健康对照组（1.74±1.70,P=0.020）。二,经q RT-PCR和WB验证成功敲低mDC中cofilin 1水平,蛋白敲低水平为31.6%。应用流式细胞术检测mDC吞噬功能显示敲低组显着低于阴性转染组[（22.64±12.53）%vs（40.07±11.90）%,P=0.000],免疫荧光实验支持上述结果。Transwell检测mDC迁移功能结果示cofilin 1敲低组显着低于阴性转染组（45.08±31.98 vs 67.75±38.07,P=0.044）。流式细胞术检测mDC表面CD86表达水平示敲低组显着低于阴性转染组[（73.80±17.18）%vs（77.26±14.39）%,P=0.034]。Cofilin 1敲低组与阴性转染组之间mDC增殖、凋亡、CD80表达水平无统计学差异。免疫荧光检测结果显示cofilin 1敲低组F-actin含量增高,细胞突起密度增加,发生明显的重构。三,流式细胞术检测mDC与CD4+T淋巴细胞共培养体系中CD4+T淋巴细胞分泌Th1相关细胞因子水平:与阴性转染组相比,cofilin 1敲低组IL-2浓度降低[（179.48±180.52）pg/ml vs（216.32±203.24）pg/ml,P=0.024],TNF-α浓度降低[（178.08±146.00）pg/ml vs（232.48±157.75）pg/ml,P=0.017],IFN-γ浓度降低[（2499.71±2051.73）pg/ml vs（3020.96±2340.99）pg/ml,P=0.023];Th2相关细胞因子仅IL-6浓度降低（357.19±237.02）pg/ml vs（435.74±325.01）pg/ml,P=0.047],IL-4和IL-10浓度无差异。Cofilin 1敲低前后共培养体系Treg表达foxp3水平无差异。四,CFSE检测mDC与CD8+T淋巴细胞共培养体系中CD8+T淋巴细胞增殖,结果显示cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞CFSE平均荧光强度为显着高于阴性转染组（1610313.97±1182187.85 vs 1107368.41±901731.27,P=0.028）。流式细胞术检测cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞分泌穿孔素显着低于阴性转染组[（29.39±15.51）%vs（31.71±14.99）%,P=0.023],cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞分泌颗粒酶B显着低于阴性转染组[（15.49±10.89）%vs（23.35±10.56）%,P=0.019]。结论一,初治SAA患者mDC内cofilin 1蛋白水平高于完全缓解者和健康对照者。SAA患者mDC内cofilin 1水平和患者的免疫状态、疾病严重程度密切相关,cofilin 1水平越高,免疫紊乱越严重,病情越重。q RT-PCR检测发现cofilin 1m RNA升高,提示cofilin 1在转录水平即升高。二,经RNAi技术敲低SAA患者mDC内cofilin 1,可通过F-actin重构,降低mDC吞噬、迁移功能以及表面共刺激分子CD86的表达水平。对mDC增殖、凋亡、CD80表达无影响。三,Cofilin 1能够增加SAA患者mDC刺激CD4+T淋巴细胞分泌Th1相关细胞因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）和Th2相关细胞因子（IL-6）的能力,以Th1为着。对Treg表达Foxp3能力无影响。四,Cofilin 1能够增加SAA患者mDC刺激CD8+T淋巴细胞增殖和分泌穿孔素、颗粒酶B的能力。五,SAA患者中cofilin 1表达水平或许可以作为SAA诊断和评价的新指标,有望成为SAA治疗的新靶点。
王盛东[5]（2020）在《丙戊酸钠联合唑来膦酸增强γδ T细胞介导的杀伤骨肉瘤效应》文中研究说明骨肉瘤是发病率最高的原发恶性骨肿瘤,常见于儿童和青少年,具有局部侵犯和早期肺转移的趋势。通过使用新辅助化疗联合手术的治疗方案,已经将骨肉瘤患者的5年生存率提高到了60%-80%,但在过去的近40年间并未得到进一步改善。尤其是对于复发和发生肺转移的患者,目前尚无有效的治疗手段,预后极差。同时,目前临床的一线化疗药,如甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂、异环磷酰胺等毒副作用很大,且耐药的情况常有发生,疗效有限。因此,寻找新型、高效和安全的治疗方案是目前亟待解决的问题。免疫治疗被认为是除手术、化疗、放疗以外的第四大治疗手段。其中,过继细胞输注治疗（ACT）是最有前景的免疫治疗方案之一,已经在白血病的研究中取得了显着的成果。包括NK细胞、巨噬细胞和T细胞在内的各种免疫细胞均被研究应用于ACT中,尤其是T细胞,因其在抗肿瘤免疫效应中扮演着重要角色,成为ACT的首选效应细胞。然而,包括骨肉瘤在内的多数实体肿瘤,都缺少特异性、高表达的免疫治疗靶点,成为了ACT应用的一个主要限制因素。γδT细胞占外周血T细胞的1～10%,因其能够直接识别肿瘤细胞并且不依赖MHC的限制而被认为是充满前景的效应T细胞。活化的γδT细胞能够产生穿孔素、颗粒酶和炎症因子直接杀伤被识别的肿瘤细胞,从而产生有效的抗肿瘤效应。本课题组在先前研究已经证实通过唑来膦酸（ZOL）预处理后,γδT细胞能够在体外对骨肉瘤细胞和软骨肉瘤细胞产生显着的杀伤效应。因而,过继转移γδT细胞有望成为治疗包括骨肉瘤在内的各种恶性实体肿瘤的一种有效治疗方案。然而,大量体外研究显示诱导γδT细胞产生强大的免疫效应所需的ZOL浓度较高,已超出体内实验和临床应用所能长时间维持的浓度。因而,我们需要寻找有效的佐剂以增强ZOL的作用,从而降低其诱导γδT细胞发挥显着免疫效应所需的浓度,促进该方案的临床应用。丙戊酸钠（VPA）是已经得到FDA批准的一种去乙酰化酶抑制剂,临床广泛应用于抗癫痫治疗。近年来研究显示VPA还具有抑制肿瘤细胞增殖和激活免疫系统的潜在作用。不仅如此,VPA还表现出能够增强包括放疗、化疗和多种免疫治疗杀伤肿瘤效应的潜能,并且对正常组织毒性较小。早有研究报道组蛋白去乙酰化酶抑制剂或许具有增强γδT细胞免疫效应的作用,其中VPA似乎与γδT细胞的多种功能相关,具体仍有待进一步阐明。综上,我们推测VPA能够联合ZOL发挥协同作用,显着增强γδT细胞介导的抗骨肉瘤免疫效应。本次研究中,我们发现VPA能够显着的增强ZOL诱导的γδT细胞抗骨肉瘤效应,表现出协同作用。并且,相比单药刺激,VPA联合ZOL刺激的γδT细胞,表达更高水平的细胞毒作用相关的标记分子和炎症因子等,包括CD107a、Perforin和IFN-γ等。我们进一步发现VPA和ZOL能够协同阻断甲羟戊酸途径,引起中间产物积聚,从而激活γδT细胞。我们还通过建立免疫缺陷鼠骨肉瘤模型,进行过继输注γδT细胞实验。结果显示,相比单ZOL处理组,VPA联合ZOL能够显着增强γδT细胞的体内抗骨肉瘤效应,有效抑制骨肉瘤的增长,并促进T细胞的浸润。组织学检测也显示联合处理组表现出最显着的甲羟戊酸通路阻断效果。我们还搜集了7例骨肉瘤临床样本,来自原发、复发、转移和化疗耐药等不同患者,分离培养获得原代骨肉瘤细胞。实验结果表明VPA联合ZOL能够协同增强γδT细胞杀伤原代骨肉瘤细胞的作用,为该治疗方案的临床试验提供依据。综上,本研究表明VPA联合ZOL能够协同阻断甲羟戊酸通路,引起中间产物积聚,从而刺激γδT细胞发挥强大的杀伤骨肉瘤效应。
蒋文秀[6]（2018）在《ECCE-CIK的诱导及其抗肿瘤和抗病毒作用的初步研究》文中研究指明细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,CIK）治疗能有效抑制慢性乙型肝炎（chronic hepatitis b,CHB）患者体内乙型肝炎病毒（hepatitis b virus,HBV）的复制,被认为是一种有效的治疗CHB的过继免疫治疗策略。然而,由于个体差异的存在以及部分CHB患者处于免疫抑制状态,部分CHB患者来源的CIK细胞数量少,抗HBV效果差。共刺激基因工程细胞（engineered cells for costimulatory enhancement,ECCE）是稳定表达4-1BBL的K562细胞系,能与T细胞表面的4-1BB结合促进T细胞的增殖。本研究将ECCE加入CIK的培养体系共培养,获取了共刺激基因工程细胞共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells enhanced by engineered cells for costimulatory enhancement,ECCE-CIK）,并检测了ECCE-CIK的表型、对肿瘤细胞株的杀伤能力及细胞因子的分泌。随后,我们培养了CHB患者来源的ECCE-CIK,并检测了其对HepG2.2.15中HBV的抑制作用。【目的】1.构建ECCE-CIK,检测其增殖、表型、对肿瘤细胞株的杀伤功能及细胞因子分泌,为改进CIK的培养提供新方法。2.初步探索CHB患者来源的ECCE-CIK对人肝癌细胞系HepG2.2.15中HBV的抑制作用,为ECCE-CIK用于治疗CHB提供实验依据。【方法】1.采集10名健康人外周血。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）。使用干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、CD3单抗、白介素-2（Interleukin-2,IL-2）细胞因子刺激PBMC诱导产生传统CIK。将被γ射线辐照过的ECCE以不同比例与健康人PBMC混合,然后加入IFN-γ、CD3单抗及IL-2诱导,优化培养体系,建立ECCE-CIK体外培养方法。随后,比较传统CIK和ECCE-CIK增殖能力,采用流式细胞术分析其细胞表型,采用CFSE/PI染色法、CCK-8检测法检测细胞杀伤肿瘤细胞株的功能,采用ELISA检测其细胞因子的分泌。2.采集10名CHB患者的外周血,培养获取ECCE-CIK,随后,将ECCE-CIK与靶细胞HepG2.2.15在体外直接与间接共培养系统中分别共培养3h、24h、48h（在直接共培养系统中,ECCE-CIK和HepG2.2.15直接接触;在间接共培养系统中,ECCE-CIK和HepG2.2.15由一个0.4μm半透膜分隔,由ECCE-CIK产生的可溶性因子通过隔膜作用于HepG2.2.15）,采用乳酸脱氢酶释放法（lactate dehydrogenase release assay,LDH）检测细胞毒作用,采用实时定量PCR方法检测HBV DNA,化学发光微粒子免疫分析法检测HBsAg,ELISA法检测IFN-γ、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor recept,TNF-α）含量。【结果】1.以健康人来源的PBMC 1×10^5/ml为起始浓度,培养至第21d时,传统CIK组的扩增倍数是73.79±7.28（PBMC（10^5））,ECCE-CIK组的扩增倍数分别是398.05±36.37（ECCE:PBMC=1:1）和567.23±108.30（ECCE:PBMC=10:1）。以健康人来源的PBMC 1×10^6/ml为起始浓度,培养至第21d时,传统CIK组的扩增倍数是523.51±62.81（PBMC（10^6））,ECCE-CIK组的扩增倍数分别是2856.21±94.17（ECCE:PBMC=1:10）和4123.25±158.54（ECCE:PBMC=1:1）。与传统CIK相比,健康人来源的ECCE-CIK的扩增倍数明显增高,差异具有统计学意义。其中,PBMC以1×10^6/ml为起始浓度,ECCE:PBMC=1:1组ECCE-CIK扩增倍数最高。2.健康人来源的ECCE-CIK中的CD3+CD8+细胞亚群占78.2%±4.6%,而传统CIK中CD3+CD8+细胞占65.9%±5.7%,P<0.01;ECCE-CIK中CD3+CD56-细胞亚群占43.5%±4.2%,传统CIK中CD3+CD56-细胞占37.8%±3.6%,P<0.01。3.健康人来源的ECCE-CIK对人肿瘤细胞系SMMC7721、MGC803、A375、A549的杀伤作用随着效靶比的增加而逐渐增强,并优于传统CIK。效靶比为20:1,作用3h,当以SMMC7721为靶细胞时,ECCE-CIK和传统CIK的杀伤效率分别为83.2%±3.5%和20.5%±4.3%（P<0.01）;以MGC803为靶细胞,ECCE-CIK和传统CIK的杀伤效率分别为48.7%±5.5%和20.4%±6.3%（P<0.01）;以A375为靶细胞,ECCE-CIK和传统CIK的杀伤效率分别为53.6%±4.5%和22.3%±3.3%（P<0.01）;以A549为靶细胞,ECCE-CIK和传统CIK的杀伤效率分别为53.5%±3.5%和23.6%±4.3%（P<0.01）。4.健康人来源的ECCE-CIK及传统CIK分别与肿瘤细胞SMMC7721混合培养2h后,ECCE-CIK分泌的IFN-γ明显高于传统CIK（1090.99±127.52 pg/ml VS 396.58±49.1 pg/ml,P<0.01）;ECCE-CIK分泌的TNF-α亦高于传统CIK（732.71±234.49 pg/ml VS 117.41±30.01 pg/ml,P<0.01）。5.CHB患者来源的ECCE-CIK扩增倍数明显高于传统CIK。培养至第20d,ECCE-CIK的扩增倍数是1563.76±186.55倍,传统CIK的扩增倍数是228.53±65.82倍,二者差异具有统计学意义。ECCE-CIK中CD3+CD8+细胞亚群比例比传统CIK高（90.5%±13.6%VS 80.3%±8.3%,P<0.05）。6.当CHB患者来源的ECCE-CIK与HepG2.2.15直接共培养时,随着效靶比的增加、时间的延长,ECCE-CIK对HepG2.2.15的杀伤效率逐渐增加。当作用时间为24h时,效靶比为1:1、5:1、10:1的杀伤效率分别是23.6%±2.6%、63.9%±5.3%、98.2%±2.0%,差异具有统计学差异。当效靶比为5:1时,共培养3h、24h、48h的杀伤效率分别是23.5%±2.5%、63.9%±5.3%、95.6%±2.5%,三者两两比较均具有统计学差异。当ECCE-CIK与HepG2.2.15间接共培养时,各实验组ECCE-CIK的杀伤效率均低于2%。7.直接共培养系统及间接共培养系统中,随着效靶比增加、共培养时间的延长,CHB患者来源的ECCE-CIK对HepG2.2.15分泌的HBV DNA及HBsAg的抑制率均逐渐增加。两组培养系统相比,对应各组间HBV DNA及HBsAg的抑制率差异无统计学意义。8.CHB患者来源的ECCE-CIK与HepG2.2.15共培养时,直接共培养系统中IFN-γ及TNF-α的分泌量随着效靶比增加而增加。间接共培养系统中IFN-γ和TNF-α的分泌量与直接共培养系统相似。两组培养系统相比,对应各组间IFN-γ、TNF-α的分泌量无差异。【结论】1.ECCE能够明显增强健康人来源CIK的体外增殖能力,生成ECCE-CIK。与传统CIK相比,ECCE-CIK的效应细胞CD3+CD8+亚群的比例增加,同时细胞杀伤肿瘤细胞株的功能和分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α能力增强。2.ECCE能够明显增强CHB患者来源CIK的体外增殖能力,生成CHB患者来源的ECCE-CIK,其能够以HBV非特异性、直接接触方式杀伤HepG2.2.15细胞,且杀伤效率随效靶比的增加和时间的延长而增加。3.CHB患者来源的ECCE-CIK能通过非细胞裂解方式体外抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制,且抑制作用随效靶比的增加和作用时间的延长而增加。4.CHB患者来源的ECCE-CIK能分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α,其可能是ECCE-CIK抑制HepG2.2.15细胞中HBV复制的主要效应分子。
谭庆龙[7]（2018）在《巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价》文中认为肿瘤微环境是一个复杂结构系统,具有增强或逃避宿主免疫监视和杀伤的作用。组成肿瘤免疫环境的核心免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC细胞和中性粒细胞。肿瘤微环境中的免疫细胞的位置、数量、功能表型和Closstalk影响肿瘤的免疫应答、治疗和预后结果。因此,重塑肿瘤免疫环境中免疫细胞的特征和削弱其在肿瘤免疫治疗中抑制性,对开发针对癌症的新型免疫治疗和化疗抵抗至关重要。由于肿瘤生长通常伴随着髓系细胞在肿瘤中的积累和免疫表型改变,从而抑制T细胞靶向肿瘤的免疫治疗。本研究针对肿瘤微环境中关键的“保安”巨噬细胞和“特种兵”T淋巴细胞入手,分别探寻调节巨噬细胞免疫极化表型的物质及其机制,和构建人源化T细胞免疫的小鼠膀胱癌肿瘤评价模型,希冀为重塑肿瘤免疫环境的治疗关键问题提供启示。1、巨噬细胞具有两种作用相反的表型,经典激活的M1表型和选择激活的M2表型,M1型巨噬细胞抵抗入侵病原体、抑制肿瘤、吞噬微生物、促进炎症反应和增强免疫监视功能。相反,M2型为“休息”表型,抑制免疫反应、促进组织愈合、降低炎症发生和促进肿瘤生长。猪苓多糖具有免疫调节作用已被证实,在本研究中,通过甲醇脱脂、水提醇沉提取猪苓粗多糖,经过滤、Savage法去蛋白、冷冻干燥、DEAE-Cellulose及Sephadex G-100柱层析分离猪苓均一多糖（Polyporus polysaccharide,PPS）;发现纯化的PPS极化M-CSF诱导人M2(CD206 high)型巨噬细胞极化为M1(CD86 high)型,且PPS影响巨噬细胞的粘附和诱变细胞形态;降低PD1表达,升高MHCⅡ分子表达;促进细胞因子白细胞介素（IL）‐1β、IL‐6、IL‐8、IL10及肿瘤坏死因子（TNF）‐α（P<0.01）分泌;增强M2巨噬细胞对肿瘤杀伤的能力（P<0.05）;降低FN、COLⅢ和ICMA-1转录水平（P<0.05）,升高TLR2、TLR4和NF-κB蛋白的表达（P<0.05）;RNA-seq也证实NF-κB信号及细胞生理的基质组成参与了PPS对巨噬细胞的作用。本研究发现PPS抑制M2巨噬细胞的粘附和伪足生成,且具有显着增强巨噬细胞免疫和抗肿瘤功能。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）对非肌层浸润性膀胱癌有效,其激活了免疫系统和加剧炎症反应,其中巨噬细胞为BCG的重要靶细胞之一。实验探讨了BCG在巨噬细胞极化调控中的作用和潜在机制,以及和信号调节蛋白-α（SIRPα）的关系。将单核细胞系THP-1分化为M2巨噬细胞(CD206 high和Th2细胞因子分泌细胞),观察到BCG诱导的M2极化为M1表型(CD86 high、CD197 high和Th1细胞因子分泌细胞);下调SIRPα（CD172α）;促进IL-1β、IL-6、TNF-α、干扰素（IFN）-γ和诱导型一氧化氮合酶（i NOS）等促炎因子的表达（P<0.05）。与BCG处理的M2巨噬细胞共培养的人膀胱癌T24和RT4细胞,显示出CD47高表达的于生长抑制作用的正相关（P<0.05）。此外,BCG以剂量依赖性方式显着增加Janus激酶2（JAK2）和p信号转导物和转录激活物1（STAT1）蛋白的表达。实验结果表明JAK2/STAT1途径介导BCG极化巨噬细胞为M1和抑制SIRPα表达是BCG作用于巨噬细胞为杀伤膀胱癌的重要机制。另外,通过体内研究BCG（0.25、1.25和6.25μg/小鼠,i.v.）在NOD/scid IL2Rg-/-（NSI）小鼠膀胱癌肿瘤模型中的作用和潜在机制。惊讶的是,观察到NSI小鼠T24膀胱癌模型在尾静脉注射BCG后,显示巨噬细胞标志物CD11b+F4/80+高水平浸润以及肿瘤体积的显着减少（P<0.05）。与对照组相比,外周巨噬细胞的M2比例显着下降（P<0.05）,血清和肿瘤上清中巨噬细胞相关炎症和分化细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12P70、RANKL和MCP-1的水平也显着增加（P<0.05）。此外,BCG促进骨髓中促分化基因PU-1、EGR-1、NF-κB和C-Fos m RNA转录的表达（P<0.05）。结合分析,本研究结果表明体内注射BCG可以靶向巨噬细胞来抑制膀胱癌的生长,其机制与巨噬细胞成熟、免疫激活和浸润膀胱肿瘤的巨噬细胞数量增加有关。2、人源化小鼠或小鼠-人类嵌合体已成为研究体内替代活生物体的重要模型。近年来,人源化小鼠模型在人类艾滋病、癌症、传染病、血液疾病和退行性疾病领域研究得到了广泛的认可和应用。患者来源的异种移植肿瘤（PDX）保留了原始的肿瘤特征如组织学异质性、生物分子特征、临床恶性表型、基因型、肿瘤结构和肿瘤脉管系统,可提供相关评估特别是新型癌症疗法和对临床结果的具有预见性,与肿瘤细胞系相比为更可靠的药物研发平台,已成为公认的临床前药物评价模型。Atezolizumab（MPDL3280A）作为化免疫治疗药物为膀胱肿瘤近30年以来的首个重大药物,开启了膀胱癌精准免疫靶向治疗。实验建立PBMC人源化NSI皮下荷瘤T24膀胱癌CDX小鼠模型,Atezolizumab（10mg/kg,i.v）每周尾静脉给药2次,连续治疗4周,对Atezolizumab的免疫治疗效果和机制进行评价。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;但对T细胞亚群CD8+/CD4+比例无影响;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1、TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）但对T细胞激活分子CD25、CD69均无影响。实验另进行了人源化NSI膀胱癌PDX小鼠模型构建,观测Atezolizumab（高、中、低:20、10、5 mg/kg,i.v）对患者来源肿瘤样本（PDX）的治疗作用。与空白对照组相比,Atezolizumab能明显降低肿瘤大小,其差异具有统计学意义（P<0.05）;外周血检测中,Atezolizumab升高人T淋巴细胞比例（P<0.05）;能明显增加CD4+亚群细胞数量;降低T细胞PD1表达量（P<0.05）,但对外周T细胞激活CD25、CD69无影响。在肿瘤微环境中,Atezolizumab能降低T细胞耗竭分子PD1和TIM3表达量（P<0.05）和肿瘤PD-L1表达量（P<0.01）,对T细胞激活分子CD25和CD69均无影响。本次建立的人源化膀胱癌PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,且具有与CDX某些不同的特征表型,特别是T细胞浸润情况,CDX模型中浸润T细胞远大于PDX模型肿瘤。实验建立的人源化膀胱癌CDX或PDX小鼠模型能良好评价免疫治疗药物的作用,为具有T淋巴细胞特征的肿瘤免疫评价模型。实验表明Atezolizumab不仅对肿瘤PD-L1具有明显抑制作用,还能间接抑制PD1促进NSI小鼠体内人源T细胞的增加,具有重塑肿瘤免疫环境的作用。PDX与CDX模型的差异,能为患者肿瘤的异质性、不同免疫浸润环境和精准治疗提供临床前依据。
周凌飞[8]（2017）在《DC-CTL免疫细胞对卵巢上皮癌细胞的靶向性治疗研究》文中指出目的:制备卵巢癌冻融抗原负载的树突状细胞,建立卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤动物模型,探讨成熟期树突状细胞（DC）刺激肿瘤免疫T细胞,生成的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）靶向性地抑制卵巢上皮癌细胞的机制,旨在为DC-CTL应用于临床治疗,从而推进卵巢癌临床试验提供理论实验依据。方法:（1）采用免疫磁珠分离法分选人脐血CD34+造血干细胞并通过体外诱导将之分化为树突状细胞（DC）前提细胞,用反复冻融法从卵巢癌SKOV3细胞系中提取的全肿瘤细胞抗原负载DC;随后运用流式细胞术对负载抗原后DC表面主要特征表型情况进行检测,混合淋巴细胞反应测定DC体外刺激T细胞增殖活化的能力,MTT法分别检测负载抗原CTL、CTL以及单核T细胞对卵巢上皮癌SKOV3细胞系的杀伤活性。（2）无胸腺BALB/C-nu/nu裸鼠48只,分为4组,每组12只,建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,用经DC诱导的CTL免疫细胞（实验组）和未经DC诱导的CTL免疫细胞（对照组）进行治疗,观察各组裸鼠生长情况,测定其体重、移植瘤体积和重量,比较各组抑瘤率,用实时荧光定量PCR技术进行移植瘤miRNAlet-7表达并比较差异,运用免疫组织化学染色法检测各组移植瘤中HMGA2蛋白的表达的差异。结果:（1）经卵巢癌细胞株冻融抗原和肿瘤坏死因子α刺激后的DC细胞形态呈成熟状态,且能更高地表达各种DC分化相关抗原（CD80、CD83、CD86和HLA-DR）,同时刺激同种异体T淋巴细胞增殖的作用增强;MTT法结果表明,负载冻融抗原的DC-CTL组对SKOV3细胞的杀伤活性显着高于CTL组。（2）DC-CTL组和CTL组裸鼠的移植瘤体积和移植瘤重量低于模型对照组（F值分别为8.175、6.823,均P<0.05）,DC-CTL组裸鼠的移植瘤体积和移植瘤重量低于CTL组,且差异具有统计学意义（t=13.244,P<0.05）;DC-CTL组裸鼠的抑瘤率（69.57-10.81）高于CTL组（42.35-8.15）,且差异具有统计学意义（t=6.965,P<0.05）;DC-CTL组和CTL组裸鼠的移植瘤miRNAlet-7表达均高于模型对照组（F=7.528,P<0.05）,DC-CTL组裸鼠的HMGA2蛋白表达的ISH评分（15.31-1.72）低于CTL组（17.18-1.86）,且差异具有统计学意义（t=3.143,P<0.05）。结论:（1）DC-CTL免疫细胞组能够抑制裸鼠移植瘤的生长作用更明显。（2）DC-CTL免疫细胞治疗组能够明显抑制卵巢癌移植瘤的生长,其机制可能为上调miRNAlet-7表达和抑制HMGA2蛋白表达有关。
付泽娴[9]（2016）在《转染CD137L的人脐血树突细胞对结直肠癌患者自然杀伤细胞体外扩增及功能影响的实验研究》文中研究表明第一部分不同处理作用后树突细胞对志愿者外周血免疫细胞体外扩增及功能影响的实验研究目的:通过密度梯度离心法分离获取志愿者外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs）及脐带血单个核细胞（Mononuclear Cells,MNCs）,观察经不同处理作用后树突细胞（Dendritic cells,DCs）细胞表型表达差异,和其对志愿者外周血PBMCs体外扩增、分化的刺激促进能力,以及增殖后的免疫效应细胞对肿瘤靶细胞杀伤效率的差异;方法:1采用密度梯度离心法经志愿者外周血及脐带血离心分离获取PBMCs及MNCs,利用贴壁法纯化获取DCs并单独培养;2利用人结肠癌细胞株SW-1116作为靶细胞提取肿瘤特异性抗原（Tumor Special Antigen,TSA）并对外周血树突细胞（Peripheral Dendritic cells,pDCs）及脐血来源树突细胞（Umbilical Dendritic cells,uDCs）进行负载活化;3不同处理后的DCs与PBMCs进行体外混合培养扩增,利用流式细胞仪、酶联免疫法及淋巴细胞毒性杀伤实验观察不同处理组DCs细胞表型和增殖扩增后的PBMCs细胞含量及种类的差异,以及培养上清中细胞因子γ干扰素（IFN-γ）的含量和对靶细胞杀伤能力的差异。结果:1不同处理组的DCs表型变化及抗原提呈能力差异:经TSA负载后的pDCs其CD83细胞表型较培养前（12.26±3.78）%明显增高（55.69±5.24）%,表达差异有统计学意义（t=7.87,P=0.01）;CD86的表达较培养前（35.71±4.44）%有明显增高（87.99±4.94）%,表达差异有统计学意义（t=7.65,P=0.02）。经TSA负载后的uDCs其CD83细胞表型较培养前（13.79±2.18）%有所增高（31.65±8.01）%,但表达差异无统计学意义（t=2.15,P=0.10）;CD86的表达较培养前（20.73±5.27）%有所增高（58.81±13.88）%,表达差异也无统计学意义（t=2.56,p=0.06）。2不同处理组dcs对pbmcs体外扩增的影响差异:负载tsa后的pdcs对pbmcs体外扩增有明显促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3+cd8+t（40.22±1.13）%、cd3+cd4+t（36.68±0.55）%及cd3-cd56+nk（42.45±1.49）%等混合细胞;未负载tsa的pdcs对pbmcs体外扩增也有一定促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3+cd4+t（46.93±1.01）%、cd3-cd56+nk（37.39±2.04）%和cd3+cd8+t（24.88±0.55）%等混合细胞,其中cd3+cd8+t含量较负载tsa后的pdcs组明显下降（f=242.01,p<0.01）;无pdcs的pbmcs体外培养后也有扩增,扩增后的pbmcs中含有cd3+cd4+t（53.18±2.16）%、cd3-cd56+nk（26.14±0.99）%及cd3+cd8+t（11.51±0.30）%等混合细胞,其中cd3+cd4+t含量较其他组明显升高而cd3+cd8+t含量较其他组明显降低（f=83.99,p<0.01）;负载tsa后的udcs对pbmcs体外扩增有较强地促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk（61.98±0.67）%、cd3+cd8+t（29.57±0.67）%和cd3+cd4+t（33.57±0.97）%等混合细胞,其中cd3-cd56+nk含量较其他组明显增高（f=246.97,p<0.01）;未负载tsa的udcs对pbmcs体外扩增有一定促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk（62.08±1.79）%、cd3+cd8+t（20.12±0.55）%和cd3+cd4+t（54.71±0.68）%等混合细胞,其中cd3-cd56+nk含量与负载tsa后的udcs相似;3不同处理组dcs对pbmcs细胞培养上清ifn-γ含量的影响差异:负载tsa后的pdcs混合pbmcs培养组上清内ifn-γ含量为（11.64±0.91）pg/ml,随着培养时间的延长增高至（63.03±1.69）pg/ml,培养前后差异有明显统计学意义（t=19.76,p=0.03）;未负载tsa的pdcs混合pbmcs培养组上清内ifn-γ含量较负载tsa的pdcs组低（10.92±0.89）pg/ml,随着培养时间的延长其含量为（20.26±0.43）pg/ml,培养前后差异无统计学意义（t=7.08,p=0.09）;无pdcs混合pbmcs培养组上清内ifn-γ含量为（10.04±0.69）pg/ml,且随着培养时间的延长变化不明显（15.11±1.79）pg/ml,培养前后差异无统计学意义（t=4.61,p=0.14）;负载tsa的udcs混合pbmcs培养组上清内ifn-γ含量为（11.46±1.09）pg/ml,随着培养时间的延长有增高趋势（48.17±4.49）pg/ml,但培养前后差异无明显统计学意义（t=6.58,p=0.09）;未负载tsa的udcs混合pbmcs培养组培养上清ifn-γ含量（11.63±0.55）pg/ml及变化趋势（29.55±2.26）pg/ml与负载tsa的udcs混合pbmcs培养组含量相似（t=10.46,p=0.06）;4不同处理组dcs混合pbmcs培养后免疫效应细胞对结肠癌靶细胞sw-1116的杀伤效率差异:负载tsa的pdcs刺激扩增1周后的pbmcs对结肠癌靶细胞sw-1116的杀伤效率最高（63.93±0.75）%,具有很强的特异性杀伤能力（t=2.99,p=0.04）;未负载tsa的pdcs刺激扩增1周后pbmcs对结肠癌sw-1116靶细胞有一定杀伤效率（30.91±0.03）%,但无明显特异性杀伤能力（t=0.58,p=0.59）;无pdcs存在的pbmcs扩增1周后对结肠癌sw-1116靶细胞也有杀伤效果（10.78±0.02）%,其杀伤效率低且无明显特异性（t=0.69,p=0.53）;负载tsa的udcs刺激扩增1周后pbmcs对结肠癌靶细胞sw-1116有一定杀伤效率（39.84±0.02）%,但其特异性杀伤能力不明显（t=0.66,p=0.99）;未负载tsa的udcs刺激扩增1周后pbmcs对结肠癌靶细胞sw-1116的杀伤效果（22.83±0.09）%与负载tsa的udcs组相同,也无明显特异性杀伤能力（t=0.05,p=0.97）。第二部分转染cd137l脐血树突细胞对志愿者外周血免疫细胞体外扩增及功能影响的实验研究目的:通过构建cd137l/pegfp-n1质粒,利用脂质体法将质粒转染体外分离培养的udcs得到成功转染后的工程udcs（transfectumbilicaldendriticcells,tudcs）,观察tudcs细胞表型变化及其对外周血pbmcs体外扩增及免疫功能的影响;方法:1通过基因库查询获取cd137l基因的核心序列,针对cd137l基因cds区域设计并合成引物,其引物序列中添加利于质粒构建的限制性内切酶xho1及ecor1酶切位点序列;2利用pcr技术以目的基因引物为模板进行扩增,扩增产物经电泳鉴定后,利用胶切回收技术回收扩增后的目的基因扩增产物;3以pegfp-n1质粒作为表达载体,利用引物设计中的限制性内切酶酶切位点将扩增引物与表达载体质粒连接,并将带有目的基因的质粒经dh5α感受态细胞转化后扩增,同时经克隆pcr鉴定及阳性质粒抽提,获取目的质粒,并送测序鉴定质粒中目的基因的表达;4经测序鉴定后的含有cd137l目的基因的pegfp-n1表达质粒（cd137l/pegfp-n1）,利用无更换培养基的polodeliver3000转染剂将cd137l/pegfp-n1加入udcs中混合培养,通过荧光显微镜观察转染成功后tudcs表面荧光蛋白表达情况,通过流式细胞仪观察tudcs表面cd137l表达情况;5将tudcs与pbmcs体外混合培养,利用流式细胞仪、酶联免疫法及淋巴细胞毒性杀伤实验观察tudcs细胞表型和增殖扩增后的pbmcs细胞含量及种类的差异,以及培养上清中细胞因子ifn-γ的含量和对靶细胞杀伤能力的差异。结果:1成功构建的cd137l/pegfp-n1质粒能够顺利转染udcs并使其成功表达cd137l（31.65±0.23）%;2培养后tudcs其cd83细胞表型较培养前（10.23±0.68）%明显增高（73.96±3.69）%,表达差异与未转染组比较有明显统计学意义（t=14.02,p<0.01）;细胞表型cd86较培养前（11.37±0.38）%有明显增高（91.02±6.80）%,表达差异与未转染组比较有明显统计学意义（t=10.69,p<0.01）;3tudcs对pbmcs体外扩增有明显促进作用;扩增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk（92.79±1.59）%、cd3+cd4+t（47.25±1.05）%和cd3+cd8+t（21.64±1.99）%等细胞,cd3-cd56+nk细胞含量与未转染组比较明显增多（f=113.89,p<0.01）;4tudcs混合pbmcs培养组上清ifn-γ含量检测为（11.81±0.01）pg/ml,随着培养时间的延长增高至（57.04±1.74）pg/ml,与未转染组比较差异有明显统计学意义（p=0.01）;5tudcs刺激扩增1周后的pbmcs（cd3-cd56+nk）对结肠癌特异性靶细胞sw-1116有明显的杀伤效率（51.52±0.05）%,其杀伤效率与负载tsa的udcs组（41.07±0.01）%相比无明显统计学差异（p=0.09）,而明显高于空转对照组（ctudcs）（31.29±0.04）%和未负载tsa的udcs组（31.01±0.01）%,组间差异比较有明显统计学意义（p<0.01）;tudcs混合培养1周后的pbmcs（cd3-cd56+nk）对结肠癌非特异性靶细胞ls-174-t同样有明显的杀伤效率（53.26±0.02）%,其杀伤效率明显高于负载tsa的udcs组（38.32±0.02）%、ctudcs组（31.94±0.05）%和未负载tsa的udcs组（29.69±0.01）%,组间差异比较有明显统计学意义（f=6.88,p=0.01）;针对特异性靶细胞sw-1116和非特异性靶细胞ls-174-t,ctudcs组杀伤率无明显差异（t=0.32,p=0.76）。第三部分转染cd137l脐血树突细胞对结直肠癌患者外周血自然杀伤细胞体外扩增及功能影响的实验研究目的:采用密度梯度离心方法获取结直肠癌患者外周血pbmcs及脐带血mncs,采用贴壁法获取udcs和肿瘤患者外周血dcs（tumorperipheraldendriticcell,tpdcs）;通过转染及抗原负载对udcs进行分组处理后使其分别与结直肠癌患者外周血pbmcs共培养,观察体外培养过程中不同处理组dcs对结直肠癌患者外周血pbmcs体外扩增、免疫功能恢复及免疫杀伤能力变化的影响差异。方法:1采用密度梯度离心的方法获取结直肠癌患者外周血pbmcs及脐带血mncs,通过贴壁法获取肿瘤患者外周血tpdcs,分别进行体外培养;2利用polodeliver3000转染剂将构建成功的cd137l/pegfp-n1质粒、pegfp-n1质粒分别转染至udcs细胞内即转染组（tudcs）和空转对照组（ctudcs）。将靶细胞sw-1116的ag负载tpdcs作为阳性对照组（tpdcs）,将不同处理组dcs与患者外周血pbmcs混合培养,利用流式细胞术、酶联免疫吸附及淋巴细胞毒性杀伤实验观察其体外扩增能力、细胞分群、培养上清ifn-γ含量以及免疫效应细胞对肿瘤靶细胞杀伤效率的差异。结果:1tudcs对结直肠癌患者外周血pbmcs体外扩增有明显促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk（91.63±0.49）%、cd3+cd4+t（9.15±4.65）%和cd3+cd8+t（19.15±0.60）%等细胞,其中cd3-cd56+nk含量明显增高,与其他组间差异有统计学意义（p<0.01）;2tudcs混合培养的pbmcs组上清ifn-γ含量为（57.05±0.87）pg/ml与培养前（9.69±0.34）pg/ml差异比较有统计学意义（t=50.78,p<0.01）,tudcs组上清ifn-γ含量与ctudcs组（18.35±2.63）pg/ml和tpdcs组（47.98±0.67）pg/ml比较,组间差异明显（f=151.36,p<0.01）;3tudcs刺激扩增1周后的pbmcs（cd3-cd56+nk）对人结肠癌特异性靶细胞sw-1116（52.87±0.02）%和非特异性靶细胞ls-174-t（53.61±0.01）%都具有明显的杀伤效率。ctudcs组对靶细胞sw-1116（29.16±0.07）%和ls-174-t（30.91±0.07）%的杀伤率低于tudcs组,差异比较有明显统计学意义（p<0.01）;tudcs组对特异性靶细胞sw-1116杀伤率与tpdcs组比较,杀伤效率差异无明显统计学意义（p=0.46）;tudcs组对非特异性靶细胞ls-174-t杀伤率高于tpdcs组（37.91±0.01）%,组间差异比较有统计学意义（p=0.03）;tudcs诱导扩增的肿瘤患者外周血cd3-cd56+nk对人结肠癌靶细胞sw-1116及ls-174-t细胞杀伤无靶细胞特异性（p=0.27）。第四部分转染cd137l脐血树突细胞激活的志愿者外周血自然杀伤细胞对荷瘤裸鼠的体内抗瘤作用影响的实验研究目的:选择scid/beige裸鼠作为研究对象,以人结肠癌sw-1116作为肿瘤细胞在裸鼠腋侧皮下接种移植瘤后构建人结肠癌肿瘤模型;通过鼠尾静脉回输人外周血pbmcs细胞模拟重建人源化免疫环境状态;荷瘤后裸鼠明确腋下移植瘤移植成功,通过鼠尾静脉回输不同处理组活化扩增后的志愿者外周血免疫效应细胞,观察荷瘤裸鼠的生活习性改变及生存时间,并记录肿瘤体积、裸鼠体重、离体瘤重及裸鼠肝脾脏器重量等数据指标,从而评估免疫细胞在荷瘤裸鼠体内的抗肿瘤作用。方法:1培养扩增人结肠癌细胞株sw-1116细胞,收集生长对数期细胞作为移植瘤接种细胞;2选取5×105/0.5mlsw-1116细胞接种于裸鼠腋窝皮下处构建人结肠癌动物模型;选取1×106/0.5ml人pbmcs细胞经鼠尾静脉回输构建人源化免疫环境;观察空白对照组（blank）、人源化对照组（cpbmcs）、抗原负载组（pdcs）和转染组（tudcs）裸鼠,确定各组裸鼠移植瘤成瘤时间及瘤体体积大小的差异;3明确成瘤后实验组及阳性对照组经鼠尾静脉给予不同免疫效应细胞回输,观察不同处理组荷瘤小鼠生活习性改变及生存时间情况,记录各组荷瘤裸鼠瘤体体积变化、裸鼠体重变化、裸鼠瘤体离体重量以及肝脾脏器重量,通过计算不同观察指标从而评价免疫效应细胞在荷瘤裸鼠体内对移植瘤的抑制作用效果的差别。结果:1接种人结肠癌细胞株sw-1116细胞的各组裸鼠成瘤时间分别为blank组（4.71±0.18）ds、cpbmcs组（7.71±0.29）ds、pdcs组（7.86±0.26）ds和tudcs组（8.14±0.69）ds,blank组成瘤时间与其他三组比较,组间差异有统计学意义（f=40.96,p<0.01）;2cpbmcs组裸鼠成瘤体积（201.43±69.84）mm3低于blank组（436.04±54.50）mm3,差异比较有明显统计学意义（t=4.02,p<0.01）;cpbmcs组裸鼠离体瘤重（1.25±0.12）g低于blank组（2.83±0.24）g,差异比较有明显统计学意义（t=5.83,p<0.01）;离体肿瘤免疫组织化学染色观察可见明显cd3+cd4+t及cd3+cd8+t免疫细胞在肿瘤组织周围浸润;3 tuDCs组荷瘤裸鼠瘤体体积均值（92.11±11.55）mm3明显低于Blank组（t=6.17,P<0.01）和cPBMCs组（t=3.79,P<0.01）,差异比较有明显统计学意义;tuDCs组荷瘤裸鼠离体瘤重均值（0.66±0.07）g明显低于Blank组（t=8.57,P<0.01）和cPBMCs组（t=4.21,P<0.01）,差异比较有明显统计学意义;tuDCs组与pDCs组荷瘤裸鼠瘤体体积（85.61±11.59）mm3（t=0.39,P=0.69）及离体瘤重均值（0.63±0.09）g（t=0.33,P=0.75）比较,差异无明显统计学意义。结论:1在IL2、IL-15共同存在的体外培养环境下,脐血树突细胞能够促进外周血PBMCs体外扩增,并可诱导细胞向CD3-CD56+NK细胞方向转化且具备有较强的免疫杀伤功能;2利用PoloDeliver 3000转染剂能够将构建的CD137L/pEGFP-N1质粒成功转染脐血树突细胞并使其表面瞬时表达CD137L;3转染CD137L/pEGFP-N1的脐血树突细胞对外周血PBMCs体外培养扩增有明显的促进作用,可诱导其转化产生大量具有杀伤活性的CD3-CD56+NK细胞;4转染CD137L/pEGFP-N1脐血树突细胞可改善结直肠癌患者外周血PBMC免疫细胞的抑制状态,诱导并增强CD3-CD56+NK细胞数量及其免疫杀伤功能;5转染CD137L/pEGFP-N1脐血树突细胞诱导生成的CD3-CD56+NK细胞在体内体外均对肿瘤细胞有明显的杀伤效应,可作为重要的临床免疫治疗细胞在肿瘤的预防、术后复发等方面为肿瘤临床免疫治疗方式提供新的策略。
徐梅[10]（2014）在《化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察》文中进行了进一步梳理卵巢癌发病隐匿，大部分患者就诊时已经是晚期，位居妇科肿瘤患者致死首位。结肠癌的发病率和死亡率也位居消化系统肿瘤首位。因此，它们都迫切需要寻找更有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学和分子生物学的不断发展，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤的第四大治疗模式。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）兼具有强大的抗瘤活性和增殖活性，又具有非MHC限制性杀瘤的优点，近些年已经得到广泛关注并应用于多种实体瘤的临床治疗，但对卵巢癌治疗报道少见。本文首先通过体外实验研究顺铂（cis-Dichloro diamine in platinum，CDDP或DDP）、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应，接着通过体内实验研究氟尿嘧啶（5-FU）、CIK细胞及其联合对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用，初步探讨其作用机制。最后，回顾分析本中心6例CIK细胞治疗的卵巢癌患者临床资料，初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性及有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。第一部分DDP联合CIK细胞对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应目的：探讨DDP、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应并初步探讨其机制。方法：利用人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）在体外用多种细胞因子诱导生成CIK细胞，于培养第0、7、14、21、28及35天进行细胞计数及流式细胞术分析CD3+CD56+双阳性细胞百分比；于培养14天收获CIK细胞作为效应细胞，用含有CIK细胞培养液上清的培养液培养对数生长期的SKOV-3细胞，于培养24及48小时用流式细胞仪检测SKOV-3细胞的凋亡情况，同时设正常培养的SKOV-3细胞作对照组；杀伤实验分为Ａ14CIK细胞作用组（效靶比分别为5:1、10:1、20:1、40:1）、B17DDP作用组（DDP浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）及C12CIK联合DDP作用组（DDP浓度均为2.5μg/ml，效靶比分别为5:1和10:1）。同时设效应细胞和靶细胞作对照孔。于24h和48h采用MTT法检测各组对SKOV-3的生长抑制效应。结果：CIK细胞体外培养第0、7、14、21、28及35天细胞计数依次为（1.8±0.2）×107、（14.67±1.53）×107、（230.0±20.0）×107、（225.0±22.91）×107及（220.0±17.32）×107，细胞数于培养第2l天时约增加127.78倍，达到增殖高峰；CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量依次为（0.47±0.17）%、（11.30±1.96）%、（35.50±2.30）%、（38.23±1.92）%、（31.40±3.91）%和（28.61±3.45）%，到21天也达到增殖高峰；SKOV-3与CIK细胞培养液上清共培养24h及48h后凋亡率分别为（12.30±1.47）%和（27.13±2.03）%，差异有统计学意义（P <0.05）。对照组24h及48h凋亡率分别为（0.62±0.35）%和（0.65±0.38）%，差异无统计学意义（P>0.05）；Ａ14CIK作用组24h抑制率分别为（16.52±2.52）%、（24.18±4.05）%、（35.98±5.19）%及（53.98±5.02）%，48h抑制率分别为（24.20±5.59）%、（41.23±3.64）%、（57.27±6.68）%及（74.74±6.87）%。在相同时间各组间细胞抑制率差异有统计学意义（P <0.05），相同效靶比24h和48h抑制率差异有统计学意义（P <0.05）；CIK细胞对SKOV-3细胞的抑制率随着效靶比的提高及作用时间的延长而提高；B17DDP作用组24h抑制率分别为（15.09±4.03）%、（25.95±3.36）%、（37.11±3.05）%、（50.07±5.21）%、（62.93±5.85）%、（77.93±3.28）%及（92.55±1.39）%，48h抑制率分别增为（23.42±5.63）%、（32.39±1.47）%、（46.04±2.76）%、（60.46±3.26）%、（72.77±2.38）%、（86.42±1.46）%及（96.24±0.59）%。除外DDP0.625μg/ml组24h和48h抑制率差异无统计学意义（P=0.102），其余各组差异均有统计学意义。DDP对SKOV-3细胞的抑制率也随着药物浓度的提高及作用时间的延长而提高；C12CIK联合DDP作用组24h抑制率分别为（50.50±3.69）%和（68.19±2.07）%，48h抑制率分别为（69.87±2.67）%和（80.11±6.87）%。CIK细胞联合DDP与单一处理因素相比，对SKOV-3的生长抑制率差异有统计学意义。但析因分析结果显示，低剂量组（效靶比为5:1）24h和48h抑制率未见到协同效应（P值分别为0.171和0.895），而高剂量组（效靶比为10:1）24h和48h抑制率见到协同效应（P <0.05）。结论：PBMC在体外经多种细胞因子刺激诱导下可大量扩增获得CIK细胞，其主要效应细胞（CD3+CD56+CIK）在第1421天为高表达平台期，在此期间可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可明显增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用。第二部分氟尿嘧啶联合CIK细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究目的：探讨氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）、CIK细胞以及5-FU联合CIK细胞对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用。方法：建立BALB/C小鼠结肠癌模型，在体外诱导培养小鼠CIK细胞，于第0和7天进行流式细胞术CIK主要效应细胞表型分析。10只荷瘤鼠随机分两组，一组给5-FU（12.5mg/kg）当天腹腔注射，另一组给予NS（0.2ml/只）腹腔注射作对照，第十天采用流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞细胞毒性T细胞活化抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-activation antigen4，CTLA-4）和非淋巴细胞CD80、CD86表达。另取40只荷瘤鼠随机分成四组，A组（正常对照组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；B组（5-FU组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；C组（CIK组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）；D组（5-FU+CIK组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）。观察肿瘤生长并绘制肿瘤生长曲线，生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。用药第10天各组处死5只小鼠，采用RT-PCR法检测四组肿瘤组织中IFN-γ和TNF-表达量。结果：小鼠CIK主要效应细胞在体外扩增第7天达到（18.4±6.8）%。与对照组相比，5-FU处理后小鼠移植瘤组织中CD45+细胞表面CTLA-4表达量提高，且CD45-细胞CD80和CD86表达量增加；5-FU联合CIK细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显慢于单因素治疗组，差异有统计学意义（P <0.05）；5-FU联合CIK细胞治疗可提高肿瘤组织IFN-γ与TNF-表达量，且联合治疗组与单治疗组中IFN-γ的表达量之间的差异有统计学意义（P <0.05）。结论：5-FU联合CIK细胞治疗对结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用，且可提高BALB/C小鼠结肠癌模型的免疫功能。第三部分化疗联合CIK细胞治疗卵巢癌的临床观察目的：初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性和有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。方法：利用接受常规手术和化疗结束后卵巢癌患者外周血分离出单个核细胞，在体外经多种细胞因子诱导培养出CIK细胞，流式细胞术分析其表型特征。将体外培养第1421天的CIK细胞通过静脉回输给患者，流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞表型变化，回顾性观察6例接受CIK细胞治疗的卵巢癌患者资料，观察患者治疗前后卡式评分（Karnofsky performance score，KPS）差异、肿瘤指标差异、外周血T细胞亚群分布及治疗后相关毒副反应。结果：有5例治疗后KPS较治疗前明显提升，另外1例治疗后KPS保持不变。所有接受CIK细胞治疗的患者均未出现明显毒副作用。1例III期EOC患者手术联合化疗治疗后CA199升高，在接受CIK细胞治疗3个疗程后，CA199逐渐下降至正常。目前状况良好，肿瘤标记物和影像学随访没有肿瘤复发迹象，无瘤生存期（progression free survival，PFS）已达到3年。1例II期透明细胞癌合并浆液性癌患者，接受CIK细胞治疗2个疗程，PFS已接近4年，随访瘤标和影像学检查无肿瘤复发迹象。另外1例II期EOC患者接受8个疗程CIK细胞治疗后，PFS已达5年，目前状况良好，也没有肿瘤复发迹象。结论：CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生存质量，是一种有希望的治疗方法。综上所述，本文通过对化疗联合CIK细胞治疗肿瘤的基础研究和治疗卵巢癌病例的回顾分析，我们认为，CIK细胞可在体外经多种细胞因子刺激下诱导扩增，第1421天可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用；5-FU联合CIK细胞治疗对BALB/C小鼠结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用5-FU或CIK细胞，且可提高小鼠结肠癌模型的细胞免疫功能。CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生活质量，是一种有希望的治疗方法。
二、IFN-γ激活的脐血树突状细胞对肿瘤细胞的杀伤作用及其机制研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IFN-γ激活的脐血树突状细胞对肿瘤细胞的杀伤作用及其机制研究（论文提纲范文）
（1）1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 1型糖尿病免疫系统异常概述 |
| 2.1.1 适应性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.2 先天性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.3 免疫治疗在1型糖尿病中的应用 |
| 2.2 SLAM分子家族在免疫系统异常疾病中的表达 |
| 2.2.1 SLAM分子家族概述 |
| 2.2.2 SLAM分子家族在多种疾病中异常表达 |
| 2.3 SLAMF4(CD244)研究现状综述 |
| 2.3.1 SLAMF4(CD244)的结构与功能 |
| 2.3.2 SLAMF4(CD244)的异常表达与疾病 |
| 2.3.3 SLAMF4(CD244)的应用前景与展望 |
| 第3章 T1DM患者免疫系统变化及SLAM分子家族表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 人外周血来源 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 3.3.2 生化的测定 |
| 3.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 3.3.4 细胞外标志物染色 |
| 3.3.5 细胞内Foxp3 染色 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 T1DM患者及HCs基线指标及生化检测结果 |
| 3.4.2 T1DM患者及HCs外周血PBMC中T细胞表达 |
| 3.4.3 T1DM患者及HCs外周血PBMC中B细胞表达 |
| 3.4.4 T1DM患者及HCs外周血PBMC中NK细胞表达 |
| 3.4.5 T1DM患者及HCs外周血PBMC中髓系细胞表达 |
| 3.4.6 各免疫细胞表面SLAM分子家族表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 T1DM患者T细胞表面SLAMF4 分子表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 人外周血来源 |
| 4.2.2 材料和试剂 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.3.2 生化及一般临床资料的测定 |
| 4.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 4.3.4 细胞外标志物染色 |
| 4.3.5 细胞内IFN-γ/TNF-a染色 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 T1DM患者及HCs外周血T细胞SLAMF4分子表达 |
| 4.4.2 T1DM患者及HCs外周血T细胞亚群SLAMF4分子表达 |
| 4.4.3 SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关 |
| 4.4.4 T1DM患者外周血SLAMF4分子表达与一般临床资料相关性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 NOD小鼠免疫细胞分化及SLAMF4分子表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和动物 |
| 5.2.1 材料和试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.2.4 垫料与饲料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 NOD小鼠体重及一般情况 |
| 5.3.2 NOD小鼠血糖的测量 |
| 5.3.3 检测小鼠外周血免疫细胞分化及血清分离 |
| 5.3.4 胰腺淋巴结单细胞悬液制备 |
| 5.3.5 小鼠尾静脉采血及血清分离 |
| 5.3.6 密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞 |
| 5.3.7 细胞外标志物染色 |
| 5.3.8 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin stain,HE)染色 |
| 5.3.9 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 NOD小鼠1型糖尿病发病情况 |
| 5.4.2 NOD小鼠外周血T细胞亚群分布异常 |
| 5.4.3 NOD小鼠T细胞表面SLAMF4分子异常表达 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 SLAMF4调控CD8~+T细胞的增殖与凋亡 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 人脐带血来源 |
| 6.2.2 正常人外周血来源 |
| 6.2.3 T1DM患者外周血来源 |
| 6.2.4 材料与试剂 |
| 6.2.5 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞 |
| 6.3.2 磁珠分选脐带血CD8~+T细胞 |
| 6.3.3 体外培养脐带血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.4 流式分选T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞转录组测序 |
| 6.3.5 磁珠分选正常人外周血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.6 流式分选正常人SLAMF4~+CD8+T细胞及SLAMF4~-CD8+T细胞 |
| 6.3.7 细胞凋亡检测 |
| 6.3.8 细胞增殖检测 |
| 6.3.9 统计分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 体外培养脐带血来源CD8~+T细胞SLAMF4表达情况 |
| 6.4.2 T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞的RNA测序 |
| 6.4.3 SLAMF4与CD8+T细胞凋亡 |
| 6.4.4 SLAMF4与CD8+T细胞增殖 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第7章 T1DM免疫损伤机理及SLAMF分子异常表达的思考 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病骨黼Thl亚群分化的作用及机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病抗白血病作用及机制的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 免疫相关基因单核苷黢多态性在急性醢系白血病中的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学位论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
（3）肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分: 文献综述 |
| 综述一: 中医药调节肿瘤免疫应答防治肿瘤的研究进展 |
| 1 先天性免疫调节 |
| 2 适应性免疫调节 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二: 树突状细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中的作用 |
| 1 树突状细胞亚群分类 |
| 2 肿瘤免疫中树突状细胞功能 |
| 3 肿瘤对树突状细胞功能的调节作用 |
| 4 肿瘤治疗中的树突状细胞功能 |
| 5 基于树突状细胞的肿瘤免疫疗法 |
| 6 抗肿瘤树突状细胞疫苗 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三: 桔梗皂苷D的抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 1 调控肿瘤细胞凋亡途径 |
| 2 调控肿瘤细胞自噬 |
| 3 调控肿瘤细胞增殖 |
| 4 抑制血管生成 |
| 5 抑制肿瘤的侵袭和转移 |
| 6 体内抗肿瘤调控 |
| 7 免疫调节及降脂活性 |
| 8 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一: 肿瘤相关树突状细胞的诱导培养 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状脂质及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三: 毒胡萝卜素激活内质网应激对肿瘤相关树突状细胞中脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四: 肺瘤平膏含药血清逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质及功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六: 桔梗皂苷D对树突状细胞毒性和肿瘤细胞杀伤能力的研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞脂质含量及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验八: 桔梗皂苷D逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验九: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（4）髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、重型再生障碍性贫血患者髓样树突状细胞中cofilin1表达水平研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 试剂与仪器 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 FACS检测SAA患者及健康对照者外周血mDC内cofilin1水平 |
| 1.2.2 SAA患者外周血mDC内cofilin1水平与疾病严重程度及患者免疫状态相关 |
| 1.2.3 mDC体外诱导分化过程的显微镜形态观察 |
| 1.2.4 mDC体外诱导分化效率及分选效率 |
| 1.2.5 WB检测SAA患者及健康对照者mDC内cofilin1水平 |
| 1.2.6 qRT-PCR方法检测SAA患者及健康对照者mDC内cofilin1 mRNA水平 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC增殖凋亡及功能的影响及机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 mDC体外诱导分化、磁珠分选及纯度检测 |
| 2.2.2 流式细胞术转染效率验证,筛选最适细胞及转染试剂比例 |
| 2.2.3 qRT-PCR检测mRNA水平转染效率 |
| 2.2.4 Western Blot验证转染效果 |
| 2.2.5 CCK-8方法检测cofilin1-siRNA转染前后mDC增殖情况变化 |
| 2.2.6 FACS检测cofilin1-si RNA转染前后mDC凋亡情况变化 |
| 2.2.7 FACS及免疫荧光检测cofilin1-siRNA转染前后mDC吞噬功能变化 |
| 2.2.8 Transwell实验检测cofilin1-siRNA转染前后mDC迁移能力的变化 |
| 2.2.9 FACS检测cofilin1-siRNA转染前后mDC共刺激分子CD80/CD86表达水平变化 |
| 2.2.10 免疫荧光检测cofilin1-siRNA转染前后mDC内F-actin的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC刺激CD4~+T淋巴细胞功能的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 mDC体外诱导分化、分选、纯度检测 |
| 3.2.2 mDC质粒转染及效果验证 |
| 3.2.3 CD4~+T淋巴细胞分选纯度检测 |
| 3.2.4 mDC与CD4~+T淋巴细胞共培养形态观察 |
| 3.2.5 转染前后mDC刺激CD4~+T淋巴细胞产生细胞因子能力变化 |
| 3.2.6 转染前后mDC刺激Treg细胞Foxp3表达水平变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 树突状细胞对CD4~+T淋巴细胞的的影响 |
| 3.3.2 树突状细胞与CD4~+T淋巴细胞之间的相互作用与细胞骨架密切相关 |
| 3.3.3 Cofilin1影响mDC对CD4~+T淋巴细胞的作用 |
| 3.4 小结 |
| 四、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC刺激CD8~+T淋巴细胞功能的影响 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 mDC体外诱导分化、分选、纯度检测 |
| 4.2.2 mDC质粒转染及效果验证 |
| 4.2.3 CD8~+T淋巴细胞分选纯度检测 |
| 4.2.4 mDC与CD8~+T淋巴细胞共培养形态观察 |
| 4.2.5 CFSE检测转染前后mDC刺激CD8~+T淋巴细胞增殖能力变化 |
| 4.2.6 FACS检测转染前后mDC刺激CD8~+T淋巴细胞杀伤功能变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 获得性再生障碍性贫血发病机制及遗传学异常研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）丙戊酸钠联合唑来膦酸增强γδ T细胞介导的杀伤骨肉瘤效应（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照缩写词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 骨肉瘤的现状 |
| 1.2 过继细胞治疗 |
| 1.3 γδ T细胞 |
| 1.4 唑来膦酸 |
| 1.5 丙戊酸钠 |
| 2 丙戊酸钠联合唑来膦酸协同促进γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞系及其机制探究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 丙戊酸钠联合唑来磷酸协同致敏γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞系 |
| 2.4 丙戊酸钠联合唑来膦酸协同致敏γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞机制 |
| 2.5 丙戊酸钠联合唑来膦酸协同阻断甲羟戊酸通路促进γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞 |
| 2.6 讨论与小结 |
| 3 丙戊酸钠联合唑来膦酸促进γδ T细胞杀伤原代骨肉瘤细胞效应研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 4 丙戊酸钠联合唑来膦酸致敏γδ T细胞体内抑制骨肉瘤增殖的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 γδ T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介及研究生期间科研情况 |
（6）ECCE-CIK的诱导及其抗肿瘤和抗病毒作用的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表(ABBREVIATIONS) |
| 前言 |
| 第一部分 ECCE-CIK的诱导及其抗肿瘤作用 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 ECCE-CIK对 HEPG2.2.15 细胞中HBV抑制作用研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 巨噬细胞与肿瘤免疫治疗相关进展 |
| 一、巨噬细胞来源和功能分型 |
| 二、目前的肿瘤相关的巨噬细胞 |
| 三、TAM在肿瘤治疗中的作用与治疗策略 |
| 第二节 人源化PDX小鼠肿瘤模型研究进展 |
| 一、国内外研究现状发展趋势评述 |
| 二、人源化鼠的模型建立方法 |
| 三、人源化PDX小鼠模型研究与应用 |
| 第三节 中药猪苓研究进展 |
| 一、化学成分研究 |
| 二、现代药理作用研究 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究 |
| 第一部分 猪苓多糖对人巨噬细胞的形态及抗肿瘤作用的影响 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果分析 |
| 四、小结 |
| 第二部分 卡介苗增强THP-1 源巨噬细胞的抗膀胱癌作用及其机制 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第三部分 卡介苗(BCG)在膀胱癌NOD /scid~(IL2Rg -/-) (NSI)小鼠模型中通过靶向巨噬细胞的免疫治疗研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第二节 人源化肿瘤小鼠模型的建立与Atezolizumab免疫治疗评价 |
| 第一部分 人源化膀胱癌CDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 第二部分 人源化膀胱癌PDX小鼠模型的免疫表型与Atezolizumab的免疫治疗评价 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校发表论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）DC-CTL免疫细胞对卵巢上皮癌细胞的靶向性治疗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 卵巢癌细胞株冻融抗原负载DC诱导CTL的制备 |
| 一 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 二 结果 |
| 1 脐血来源DC形态学观察 |
| 2 扫描电镜观察DC超微结构 |
| 3 细胞表型鉴定结果 |
| 4 T细胞增殖、活化检测结果 |
| 5 DC与T淋巴细胞共培养结果 |
| 6 MTT法检测结果 |
| 三 讨论 |
| 第二章 DC-CTL靶向治疗卵巢癌荷瘤裸鼠作用的研究 |
| 一 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 二 结果 |
| 1 各实验组裸鼠的一般生长情况 |
| 2 各实验组裸鼠的体重变化情况 |
| 3 各组裸鼠移植瘤体积变化 |
| 4 各组裸鼠移植瘤重量变化 |
| 5 各组裸鼠移植瘤mi RNAlet-7 表达比较 |
| 6 各组裸鼠移植瘤组织HMGA2蛋白的表达 |
| 三 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的主要学术论文及参与课题 |
| 致谢 |
（9）转染CD137L的人脐血树突细胞对结直肠癌患者自然杀伤细胞体外扩增及功能影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 不同处理作用后树突细胞对志愿者外周血免疫细胞体外扩增及功能影响的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 转染CD137L的脐血树突细胞对志愿者外周血免疫细胞体外扩增及功能影响的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 转染CD137L的脐血树突细胞对结直肠癌患者外周血自然杀伤细胞体外扩增及功能影响的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 经转染CD137L脐血树突细胞激活的志愿者外周血自然杀伤细胞对荷瘤裸鼠体内抗肿瘤作用影响的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 肿瘤微环境中的自然杀伤细胞在机体抗肿瘤免疫中的功能作用及其临床应用展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 一、EOC 的生物标志物 |
| 二、筛查策略 |
| 三、治疗 |
| 四、小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DDP 联合 CIK 细胞对卵巢癌细胞株 SKOV-3 的杀伤效应 |
| 第一章 材料与方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 氟尿嘧啶联合 CIK 细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究 |
| 第一章 材料和方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 化疗联合 CIK 细胞治疗卵巢癌的临床观察 |
| 第一章 资料与方法 |
| 第二章 临床病例资料结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一：CIK 细胞过继免疫治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二：协同刺激分子 B7-H4 在卵巢癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三：miRNA 与卵巢癌 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 本研究所获的基金资助 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
四、IFN-γ激活的脐血树突状细胞对肿瘤细胞的杀伤作用及其机制研究（论文参考文献）
- [1]1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究[D]. 孙琳. 吉林大学, 2021(01)
- [2]树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究[D]. 刘芹芹. 山东大学, 2020(04)
- [3]肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究[D]. 张曦文. 中国中医科学院, 2020(01)
- [4]髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究[D]. 孙莹莹. 天津医科大学, 2020(06)
- [5]丙戊酸钠联合唑来膦酸增强γδ T细胞介导的杀伤骨肉瘤效应[D]. 王盛东. 浙江大学, 2020(01)
- [6]ECCE-CIK的诱导及其抗肿瘤和抗病毒作用的初步研究[D]. 蒋文秀. 东南大学, 2018(01)
- [7]巨噬细胞极化抗肿瘤作用研究与人源化膀胱癌小鼠肿瘤模型的Atezolizumab免疫治疗评价[D]. 谭庆龙. 广州中医药大学, 2018(01)
- [8]DC-CTL免疫细胞对卵巢上皮癌细胞的靶向性治疗研究[D]. 周凌飞. 湖南师范大学, 2017(01)
- [9]转染CD137L的人脐血树突细胞对结直肠癌患者自然杀伤细胞体外扩增及功能影响的实验研究[D]. 付泽娴. 河北医科大学, 2016(08)
- [10]化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察[D]. 徐梅. 苏州大学, 2014(04)
标签：树突状细胞论文; 肿瘤免疫论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 细胞免疫论文; 细胞分化论文;