一、自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.TK在鼻咽癌细胞中的构建及转染研究（论文文献综述）
卿菁,赵素萍,蒋卫红,章华[1]（2014）在《建立稳定表达融合自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株》文中认为目的:建立稳定表达融合自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株。方法:构建表达载体pcDNA3.1（-）E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49,经脂质体法转染CNE-2细胞,G418和前体药物5-氟胞嘧啶筛选出阳性克隆细胞并扩大培养。抽提阳性克隆细胞总蛋白质,Western-blotting检测目的基因表达。结果:融合自杀基因CD/UPRT.UL49在CNE-2转染细胞内稳定表达。结论:本组通过脂质体转染技术,成功地建立了稳定表达融合CD/UPRT.UL49基因的CNE-2细胞株。
李彬彬[2]（2013）在《组蛋白H3Ser10磷酸化在EB病毒LMP1诱导鼻咽癌变中的作用及调控通路的研究》文中提出表观遗传（epigenetics）是指DNA序列没有发生变化,但基因表达却发生了可遗传的改变,这种改变反映的是环境因素和遗传因素的相互作用。与人类多数疾病一样,肿瘤发生也有其自身的表观遗传学机制。DNA甲基化水平紊乱和组蛋白修饰异常是人类肿瘤最常见的表观遗传学改变。组蛋白在翻译完成后,其N-末端氨基酸残基发生乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等共价修饰,引起染色体结构的改变,进而调控基因的转录表达。近年来,在人类多数肿瘤中都发现有组蛋白修饰酶和组蛋白修饰的异常。组蛋白H3磷酸化是组蛋白修饰的重要方式之一,其中第10位丝氨酸（Ser10）磷酸化与有丝分裂染色体浓缩、细胞周期以及基因转录调控密切相关,在肿瘤研究领域中具有重要意义。已报道多种肿瘤促进因子如表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）、佛波酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA）、UVB和砷等以及原癌基因H-ras、v-Src均可诱导组蛋白H3Ser10磷酸化,与即刻早期（immediate-early, IE）基因c-fos、c-jun、c-myc以及Cox-2等转录激活有关。在人类多种肿瘤组织中包括直肠癌、肝癌、宫颈癌和胃癌等均发现有组蛋白H3SerlO磷酸化水平的增高,并且与肿瘤恶性程度相关。这些研究表明组蛋白H3SerlO磷酸化异常可能是调控细胞恶性转化的重要表观遗传学改变。大量研究证实各种体外刺激因素诱导的组蛋白H3SerlO磷酸化涉及多条不同的蛋白激酶信号通路,与特异性刺激/应激及细胞类型有关。近年来,各种蛋白激酶包括MSK1（mitogen-and stress-activated kinase1）、RSK2（ribosomal protein S6kinase2）、IKK-α （IkappaB kinase-alpha）、PKC （cAMP dependent protein kinase C）、Fyn及PIM1等相继被发现要参与调控不同刺激作用下组蛋白H3Ser10磷酸化,诱导特异性基因转录。在原癌基因H-ras、v-Src以及EGF、TPA诱导的细胞恶性转化中,MSK1活化对于组蛋白H3SerlO磷酸化以及激活蛋白-1（activating protein-1, AP-1）转录激活是必需的。因此,明确特异性刺激作用下调控组蛋白H3磷酸化的蛋白激酶及其信号通路对阐明组蛋白H3磷酸化的作用具有重要意义。鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma, NPC）是高发于我国南方和东南亚地区的一种头颈部恶性肿瘤。流行病学调查显示,鼻咽癌的病因主要与Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus, EBV）、遗传因素及环境因素有关,EB病毒与环境危险因素及宿主易感遗传背景交互作用,促进鼻咽癌的发生、发展。鼻咽癌发病的独特病因体系提示：鼻咽癌是研究肿瘤表观遗传修饰的最佳模型之一。潜伏性膜蛋白1（latent membrane protein1, LMP1）是目前唯一证实具有转化功能的EBV基因编码瘤蛋白,与EBV相关肿瘤的发生密切相关。LMP1的转化作用在于它能异常激活AP-1、NF-κB、JAK/STAT信号通路和多个转录因子,调控靶基因表达,促进细胞增殖、转化、侵袭与转移。组蛋白H3Ser10磷酸化作为基因转录调控的重要机制,是否介导了LMP1诱导的转录因子活化和鼻咽细胞恶性转化,值得我们进一步探讨。本课题以组蛋白H3Ser10磷酸化为切入点,从组织、细胞、分子水平研究组蛋白H3Ser10磷酸化在鼻咽癌变,尤其是在EBV-LMP1促进鼻咽癌细胞恶性表型中的作用,并进一步探讨调控组蛋白H3Ser10磷酸化的蛋白激酶及信号通路,将有助于从表观遗传学角度揭示LMP1的致瘤机制和鼻咽癌的发生机制,为组蛋白H3Ser10磷酸化作为鼻咽癌诊断、治疗的新靶标提供一定的实验依据。第一部分组蛋白H3Ser10磷酸化在LMP1诱导鼻咽癌变中的作用第一章Ser10磷酸化组蛋白H3在鼻咽癌组织中的表达及其与LMP1表达的相关性方法1.免疫组织化学法检测鼻咽癌组织、慢性鼻咽炎症组织以及癌旁/正常组织中组蛋白H3Ser10磷酸化水平。2.免疫组织化学法检测EBV-LMP1在鼻咽癌组织的表达,并分析与组蛋白H3Ser10磷酸化水平的相关性。3.免疫细胞化学法和Western blotting检测低分化鼻咽癌细胞系CNE2、高分化鼻咽癌细胞系CNE1以及永生化鼻咽上皮细胞系NP69中组蛋白H3Ser10磷酸化水平。结果1.鼻咽癌组织中存在组蛋白H3Ser10磷酸化水平增高组蛋白H3Ser10磷酸化在48例鼻咽癌组织、15例鼻咽炎症组织和36例癌旁/正常鼻咽组织的阳性标记指数（positive labeling index, PLI）分别为22.43±10.57、14.87±6.04和8.10±4.78,显示鼻咽癌组织中组蛋白H3Ser10磷酸化水平要明显高于慢性鼻咽炎症组织（P<0.05）和癌旁/正常鼻咽组织（P<0.001）。慢性鼻咽炎症组织中H3Ser10磷酸化水平也要明显高于癌旁/正常鼻咽组织（P<0.005）。2.鼻咽癌组织中LMP1的表达与组蛋白H3Ser10磷酸化水平呈正相关关系在48例鼻咽癌组织中,LMP1阳性表达为28例（58.3%,28/48）。相关性分析结果显示,LMP1的表达与组蛋白H3Ser10磷酸化水平在鼻咽癌组织中呈正相关关系（χ2=6.700,P=0.01；C=0.350）。3.鼻咽癌细胞中存在组蛋白H3Ser10磷酸化水平增高免疫细胞化学法和Western blotting结果显示,与永生化鼻咽上皮细胞系NP69相比,组蛋白H3Ser10磷酸化水平在鼻咽癌细胞中明显增高,其中以CNE2细胞表达水平最高。第二章EBV-LMP1诱导CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化方法1.免疫细胞化学和Western blotting检测CNE1G和CNE1GL细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平。2. Western blotting检测瞬时转染LMP1基因引起CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平的改变。3.双荧光素酶报告基因系统检测转染LMP1基因引起CNE1细胞中AP-1转录活性的改变。结果1.LMP1诱导CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平增高免疫细胞化学结果显示,在血清饥饿条件下,组蛋白H3Ser10磷酸化的阳性细胞数在稳定表达LMP1的CNE1GL细胞中要明显高于转染空质粒的CNE1G细胞,主要为有丝分裂间期细胞。Western blotting结果也显示CNE1GL细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化水平明显高于CNE1G细胞。此外,瞬时转染LMP1基因亦可引起CNE1细胞组蛋白H3Ser10磷酸化水平的增高,呈剂量依赖关系。2.LMP1诱导CNE1细胞中AP-1转录激活双荧光素酶报告基因分析显示,转染LMP1基因可促进CNE1细胞中AP-1转录活性增高,呈剂量依赖关系。第三章基因沉默组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响方法1.构建针对组蛋白H3基因和无关序列的siRNA真核表达质粒,与pcDNA6-Myc/HisB质粒共转染CNE1细胞,经杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定沉默组蛋白H3基因的CNE1细胞株及阴性对照细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测组蛋白H3基因沉默效果。2.采用CCK-8法、平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测基因沉默组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响。3.双荧光素酶报告基因系统检测基因沉默组蛋白H3对LMP1诱导AP-1转录激活的影响。结果1.稳定干扰组蛋白H3基因表达的CNE1细胞株的建立经杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定表达细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测组蛋白H3基因沉默效果,结果显示,与空白对照及阴性对照细胞相比,siRNA-H3质粒转染的CNE1细胞中组蛋白H3的mRNA和蛋白表达水平下调60%-70%。2.基因沉默组蛋白H3抑制LMP1促进的CNE1细胞增殖和转化能力与以往的报道相一致,转染LMP1基因可促进CNE1细胞增殖及克隆形成；但采用siRNA干扰组蛋白H3表达则可明显抑制LMP1促进的细胞增殖及克隆形成能力。CCK-8实验结果显示,与阴性对照细胞相比,基因沉默组蛋白H3的CNE1细胞在培养48h后生长速度明显减慢；平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验结果显示,其克隆形成数量和克隆形成大小均明显减少,差异有统计学意义（P<0.005）。3.基因沉默组蛋白H3抑制LMP1诱导的AP-1转录激活双荧光素酶报告基因分析显示,干扰组蛋白H3基因表达可明显抑制LMP1诱导的AP-1转录激活,与阴性对照细胞相比,其转录活性下降62.49%,差异有统计学意义（P<0.005）。第四章过表达野生型和突变型组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响方法1.将人组蛋白H3基因的cDNA重组于pcDNA6-Myc/HisB质粒以构建组蛋白H3野生型真核表达质粒（H3WT）,并以此为模板,通过反向PCR法对组蛋白H3基因第31位碱基进行T→G的定点突变,获得组蛋白H3突变型真核表达质粒（H3S10A）。2.将野生型和突变型组蛋白H3表达质粒转染入CNE1细胞,杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定过表达野生型和突变型组蛋白H3的CNE1细胞株,Western blotting检测转染基因的表达。3.采用CCK-8法、平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测过表达野生型和突变型组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响。4. Western blotting和双荧光素酶报告基因系统检测过表达野生型和突变型组蛋白H3对LMP1诱导的c-Jun、c-Fos蛋白表达以及AP-1转录活性的影响。结果1.稳定过表达野生型和突变型组蛋白H3的CNE1细胞株的建立经杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定表达细胞株,Western blotting结果显示,在转染组蛋白H3野生型（H3WT）和突变型（H3S10A）质粒的CNE1细胞中均可检测到标签（His）融合蛋白的表达,表明已成功构建过表达组蛋白H3的CNE1细胞株。2.过表达野生型组蛋白H3促进CNE1细胞增殖和转化能力CCK-8实验结果显示,与转染空质粒细胞相比,过表达野生型组蛋白H3可促进CNE1细胞的增殖,细胞在培养72h后生长速度明显增快；平板克隆形成实验结果显示,过表达野生型组蛋白H3可促进低血清条件下CNE1细胞克隆形成能力。软琼脂集落形成实验结果显示,与转染空质粒细胞相比,过表达野生型组蛋白H3可增强LMP1促进的CNE1细胞锚定非依赖性生长能力,其克隆形成率增加,差异有统计学意义（P<0.05）；但过表达突变型组蛋白H3并没有引起明显改变。3.过表达野生型组蛋白H3增强LMP1诱导的c-Jun、c-Fos蛋白表达及AP-1转录活性Western blotting结果显示,与转染空质粒细胞相比,过表达野生型组蛋白H3可增强LMP1诱导下c-Jun和c-Fos的蛋白表达水平；但过表达突变型组蛋白H3并没有引起明冠改变。双荧光素酶报告基因分析显示,过表达野生型,而不是突变型组蛋白H3,可增强LMP1诱导的AP-1转录活性,差异有统计学意义（P<0.05）。第二部分调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化的蛋白激酶信号通路第一章蛋白激酶MSK1调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化方法1.免疫组织化学法检测Thr581磷酸化MSK1在鼻咽癌组织及癌旁/正常组织中的表达,并分析与LMP1及Ser10磷酸化组蛋白H3在鼻咽癌组织中表达的相关性。2. Western blotting检测CNE1G和CNE1GL细胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平,以及转染LMP1基因引起CNE1细胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平的改变。3.体外激酶活性实验检测CNE1G和CNE1GL细胞中组蛋白H3激酶活性,以及MSK1抑制剂H89预处理后组蛋白H3激酶活性的改变。4.采用p-MSK1抗体免疫沉淀MSK1激酶,体外激酶活性实验检测CNE1G和CNE1GL细胞中MSK1激酶活性。5.ERK1/2抑制剂PD98059和MSK1抑制剂H89处理细胞,Western blotting检测CNE1细胞中LMP1诱导组蛋白H3Ser10磷酸化水平的改变。6.构建针对MSK1基因的siRNA表达质粒,与pcDNA6-Myc/HisB质粒共转染CNE1细胞,杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定沉默MSK1基因的CNE1细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测MSK1基因沉默效果。7. Western blotting检测干扰MSK1基因表达对LMP1诱导组蛋白H3Ser10磷酸化水平的影响。结果1.鼻咽癌组织中存在MSK1Thr581磷酸化水平增高48例鼻咽癌组织和36例癌旁/正常鼻咽组织的免疫组化结果显示,MSK1Thr581磷酸化水平在鼻咽癌组织中要明显高于癌旁/正常鼻咽组织,差异有统计学意义（P<0.001）。2.鼻咽癌组织中LMP1的表达与MSK1Thr581磷酸化水平呈正相关关系在48例鼻咽癌组织中,相关性分析结果显示,LMP1的表达与MSK1Thr581磷酸化水平呈正相关关系（χ2=9.600,P=0.002；C=0.408）；并且MSK1磷酸化水平与组蛋白H3Ser10磷酸化水平亦呈正相关关系（χ2=11.959,P=0.001；C=0.447）。3.LMP1促进CNE1细胞中MSK1Thr581磷酸化水平的增高Western blotting结果显示,稳定表达LMP1的CNE1GL细胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平明显高于转染空质粒的CNE1G细胞。此外,瞬时转染LMP1基因也可促进CNE1细胞中ERK1/2及MSK1磷酸化水平的增高,呈剂量依赖关系。4.LMP1增强CNE1细胞中组蛋白H3激酶活性体外激酶活性分析显示,与CNE1G细胞相比,CNE1GL细胞蛋白提取液中组蛋白H3激酶活性明显增高,但给予MSK1抑制剂H89预处理后,两种细胞的组蛋白H3激酶活性均出现降低。5.LMP1增强CNE1细胞中MSKl激酶活性采用p-MSK1抗体免疫沉淀MSK1蛋白,Western blotting结果显示,p-MSK1抗体能有效地将蛋白提取液中MSK1激酶下拉。体外激酶活性分析显示,与CNE1G细胞相比,来自CNE1GL细胞的免疫沉淀复合物的MSK1激酶活性明显增强。6.PD98059和H89抑制LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化Western blotting结果显示,较低浓度的PD98059（10μmol/L）和H89（5μmol/L）即能明显降低LMP1诱导的H3Ser10磷酸化水平,呈剂量依赖关系。7.稳定干扰MSKl基因表达的CNE1细胞株的建立经杀稻瘟霉素加压筛选获得稳定表达细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测MSK1基因沉默效果,结果显示,与阴性对照细胞相比,siRNA-MSK1质粒转染的CNE1细胞中MSK1的mRNA和蛋白表达水平下调70%-80%。8.基因沉默MSK1抑制LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化Western blotting结果显示,与阴性对照细胞相比,采用siRNA干扰MSK1基因表达可明显抑制LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化。第二章蛋白激酶MSK1在LMP1促进CNE1细胞增殖和转化中的作用方法1.采用CCK-8法、流式细胞术、平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测H89或基因沉默MSK1对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响。2.双荧光素酶报告基因系统检测H89或基因沉默MSK1对LMP1诱导AP-1转录激活的影响。结果1.H89或基因沉默MSKl抑制LMP1促进的CNE1细胞增殖和转化能力CCK-8实验结果显示,与阴性对照细胞相比,干扰MSK1基因表达可抑制LMP1促进的CNE1细胞增殖,细胞在培养48h后生长速度明显减慢；采用流式细胞术分析细胞周期分布,结果显示,与阴性对照细胞相比,干扰MSK1基因表达可引起Go/G1期细胞比例增加（P<0.001）,而S期细胞比例减少（P<0.001）,提示阻滞细胞周期G1/S进程可能是下调MSK1表达抑制细胞增殖的重要原因。平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验结果显示,H89或基因沉默MSK1表达均可明显抑制LMP1促进的CNE1细胞克隆形成能力,其克隆形成数量和克隆形成大小均减少,差异有统计学意义（P<0.005）。2.H89或基因沉默MSKl抑制LMP1诱导的AP-1转录激活双荧光素酶报告基因分析显示,与未处理组细胞相比,5μmol/L H89即可明显降低LMP1诱导的AP-1活性,呈剂量依赖关系；同样,采用siRNA干扰MSK1基因表达亦可明显抑制LMP1诱导的AP-1转录激活,与阴性对照细胞相比,其转录活性下降57.21%,差异有统计学意义（P<0.005）。第三章TAK1通过激活p38/MSK1通路参与调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化方法1.采用TAK1抗体免疫沉淀TAK1激酶,以MKK6重组蛋白为底物,体外激酶实验检测LMP1诱导TAK1激酶活性的改变。2.用活化的TAK1-TAB1激酶与组蛋白H3蛋白进行体外激酶反应,Western blotting检测TAK1能否体外磷酸化组蛋白H3。3.CNEl细胞转染LMP1基因,免疫荧光和免疫共沉淀法检测TAK1和Ser10磷酸化组蛋白H3在细胞内定位及其结合情况。4.构建针对TAK1基因的siRNA表达质粒,与pcDNA6-Myc/HisB质粒共转染CNE1细胞,杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定沉默TAK1基因的CNE1细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测TAK1基因沉默效果。5. Western blotting检测TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1对LMP1诱导组蛋白H3磷酸化的影响。6.双荧光素酶报告基因系统检测5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1对LMP1诱导AP-1转录激活的影响。7. Western blotting检测5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1对LMP1诱导MAPK通路激酶ERK1/2、p38和MSK1磷酸化水平的影响。结果1.LMP1增强CNE1细胞TAKl激酶活性采用TAK1抗体免疫沉淀TAK1蛋白,Western blotting结果显示,TAK1抗体能有效地将蛋白提取液中TAK1激酶下拉。体外激酶活性分析显示,与转染空质粒相比,转染LMP1基因能够增强CNE1细胞中TAK1激酶活性。2.活化的TAK1-TAB1激酶体外磷酸化组蛋白H3Western blotting结果显示,活化的TAK1-TAB1激酶能引起组蛋白H3Ser10磷酸化水平的增高,呈剂量依赖关系,提示TAK1-TAB1激酶能在体外磷酸化组蛋白H3。3.TAK1与Ser10磷酸化组蛋白H3可能不存在细胞内共定位免疫荧光结果显示,在LMP1诱导下,TAK1主要表达在细胞质中,未见有明显核转移,提示TAK1与磷酸化组蛋白H3可能不存在细胞核内共定位。免疫共沉淀结果显示TAK1与磷酸化组蛋白H3未见有明显结合。4.稳定干扰TAKl基因表达的CNE1细胞株的建立经杀稻瘟菌素加压筛选获得稳定表达细胞株,采用实时定量RT-PCR及Western blotting检测TAK1基因沉默效果,结果显示,与阴性对照细胞相比,siRNA-TAK1质粒转染的CNE1细胞中TAK1的mRNA和蛋白表达水平下调70%-80%。5.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAKl抑制LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化Western blotting结果显示,与未处理组细胞相比,给予TAK1抑制剂5z-7-oxozeaenol作用细胞可降低LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化水平,呈剂量依赖关系,而H3Ser28磷酸化水平未见明显改变。TAK1siRNA结果与其一致。6.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAKl抑制LMP1诱导的AP-1转录激活双荧光素酶报告基因分析显示,与未处理组细胞相比,给予5z-7-oxozeaenol作用细胞可降低LMP1诱导的AP-1转录活性,呈剂量依赖关系。同样,采用siRNA干扰TAK1基因表达亦可明显抑制LMP1诱导的AP-1转录激活,与阴性对照细胞相比,其转录活性下降59.38%,差异有统计学意义（P<0.005）。7.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAKl抑制LMP1诱导的p38和MSK1磷酸化Western blotting结果显示,给予5z-7-oxozeaenol处理或基因沉默TAK1均能有效抑制LMP1诱导的CNE1细胞p38和MSK1激酶的磷酸化水平,而ERK1/2磷酸化水平未见明显改变,提示TAK1通过p38MAPK通路,而不是ERK1/2,调控MSK1活性。结论1.鼻咽癌组织中组蛋白H3Ser10磷酸化水平明显增高；EBV-LMP1可诱导CNE1细胞组蛋白H3Ser10磷酸化。2.组蛋白H3,尤其是Ser10磷酸化,在LMP1促进CNE1细胞增殖和转化中起重要调控作用,与其介导AP-1活性有关。3.MSK1作为组蛋白H3激酶,直接调控LMP1诱导的CNE1细胞组蛋白H3Ser10磷酸化；并在LMP1促进CNE1细胞增殖、转化中发挥重要作用,有望成为肿瘤治疗的新靶点。4.TAK1通过激活p38MAPK/MSK1通路参与调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化。
卿菁,赵素萍,蒋卫红,章华[3]（2013）在《融合自杀基因对鼻咽癌细胞的体内杀伤作用》文中指出[目的]研究融合自杀基因对鼻咽癌细胞的体内杀伤作用。[方法]培养鼻咽癌CNE-2细胞,建立裸鼠荷瘤模型。随机分为6组,每组5只,A组:脂质体包裹质粒瘤内注射瘤内组;B组:脂质体包裹质粒瘤内注射+肿瘤局部照射γ射线（总剂量9Gy）组;C组:脂质体包裹质粒瘤内注射+腹腔注射5氟胞嘧啶（5-Fc）组;D组:脂质体包裹质粒瘤内注射+肿瘤局部照射γ射线（总剂量9Gy）+腹腔注射5-Fc组;E组:肿瘤局部照射γ射线（总剂量9Gy）+腹腔注射5-Fc,以及空白对照组。记录肿瘤体积变化;计算各组肿瘤抑制率,绘制肿瘤生长曲线;取肿瘤组织进行病理观察;鉴定肿瘤组织中CD/UPRT.UL49基因。肿瘤体积变化的比较采用单向方差分析,组间多重比较采用LSD法。[结果]成功建立鼻咽癌裸鼠荷瘤模型,生长曲线显示:5组瘤体积差异有统计学意义（F=720.684,P<0.01）,测序结果证实,除E组外,其余各处理组均检测到目的基因,且Western blot检测结果示:B和D组肿瘤组织内自杀基因的表达高于其余各组。病理切片证实肿块为低分化鳞癌,其中D组肿瘤组织在干预作用下出现明显坏死。[结论]E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49自杀基因载体联合前药5-Fc在放射线的作用下,可明显抑制鼻咽癌移植瘤的生长,转染该融合自杀基因可增强放疗敏感性,为鼻咽癌的基因—放射治疗开辟了新思路。
郑英[4]（2012）在《基于鼻咽癌潜在靶标的活体光学成像与靶向治疗研究》文中研究说明鼻咽癌是具有地域特性的恶性肿瘤疾病，高发于我国广东，因此又称“广东瘤”。由于其发生部位较小且隐蔽，又与重要器官相邻，所以症状多变或不明显，导致漏诊误诊，常拖至晚期才被诊断出，而晚期的治疗效果差，5年存活率极低，严重的影响到人类健康。因此迫切需要寻找新的鼻咽癌生物标志物，进而针对该生物标志物进行相应的靶向诊疗研究。生物相容性好及靶向性高的仿生纳米载体是实现特异性地杀伤肿瘤而避免其它正常组织不受药物毒害的有效手段之一。为了更好地对鼻咽癌进行研究，需要迫切地建立起可视化鼻咽癌动物模型，能实时动态地监测鼻咽癌的发生发展和转移，进而有效地评估鼻咽癌的诊疗效果。本文旨在寻找出鼻咽癌潜在的生物标志物，建立高信噪比的可视化鼻咽癌动物模型，进而借由高密度脂蛋白仿生纳米载体对鼻咽癌进行有效的靶向诊疗。得出以下结果：（1）发现在鼻咽癌细胞和鼻咽癌患者病理组织中均高表达跨膜蛋白B类1型清道夫受体（SR-B1），故将SR-B1定义为鼻咽癌潜在的生物标志物。研究发现高表达SR-B1的鼻咽癌细胞，侧向迁移能力增强，而纵向侵袭能力受抑制。SR-B1的表达量与癌细胞的生长速度和成瘤性无关。（2）发现仿高密度脂蛋白纳米颗粒（HPPS）能够特异性地识别SR-B1高表达的鼻咽肿瘤，通过抑制肿瘤细胞的侧向迁移能力和克隆形成率，进而显着性地延缓鼻咽癌在活动物体内的生长速度。（3）尝试将携带chol-si-bmi1的HPPS用于鼻咽癌的靶向基因治疗，细胞水平实验结果表明，可以有效地抑制鼻咽癌的侧向迁移能力和克隆形成率，然而动物水平的实验未获得明显的肿瘤生长抑制效果。（4）建立了一系列荧光蛋白标记的可视化鼻咽癌实验动物模型，为鼻咽癌的活体光学成像和靶向治疗提供了良好的动物模型。其中获得了超亮远红荧光蛋白mLumin标记的鼻咽癌5-8F细胞，具有良好的皮下成瘤性和转移性。同时，还获得了一株不成瘤的远红荧光蛋白Katushka S158A标记鼻咽癌细胞株5-8F-KattushkaS158A。研究证实，这些细胞株的成瘤性与其侧群细胞比率密切相关。（5）建立了基于疱疹病毒1胸苷激酶（TK）、远红荧光蛋白（mLumin）和萤火虫荧光素酶（Fluc）的三融合报告基因的可视化鼻咽癌实验动物模型，可同时用于荧光成像、生物发光成像和microPET成像。由于将远红荧光蛋白引入到三融合报告基因中，明显提升了活体荧光成像的检测能力，从而为肿瘤的多模式成像研究提供了良好的多标记动物模型。本文发现了SR-B1为鼻咽癌的新型潜在生物标志物，为鼻咽癌的靶向诊疗提供了有效的新型膜蛋白运输靶点。证明仿高密度脂蛋白纳米颗粒HPPS能有效的延缓鼻咽癌生长，且能有效的携带siRNA对鼻咽癌细胞进行胞浆释放进而达到基因治疗的效果。该研究建立的一系列可视化鼻咽癌动物模型，为动态监测鼻咽癌的发生发展和转移，有效的药效评估和直观的评判诊疗手段提供了便利。
周文胜,张剑,李朝霞,文三立,江红群,朱亲耀[5]（2010）在《鼻咽癌基因治疗的实验研究》文中研究说明目的研究Survivin表达下调和p53过表达对鼻咽癌细胞CNE-2的靶向杀伤作用。方法扩增hTERT启动子不同区段,构建真核表达质粒pcDNA3.1-hTERT-Survivin,用于启动Survivin反义寡核苷酸的表达;扩增p53基因,克隆到pcDNA3.1质粒中,构建p53的过表达载体pcDNA3.1-p53;联合pcDNA3.1-hTERT-Survivin和pcDNA3.1-p53转染鼻咽癌细胞株CNE-2,RT-PCR和免疫印迹法检测p53和Survivin的表达情况,MTT法检测CNE-2细胞活率情况,Annexin V/PI双染色法检测共转后的细胞凋亡情况。结果成功扩增270 bp和728 bp 2种不同大小片断的hTERT启动子区域,并与CMV增强子连接,以GFP为报告基因检测发现,270 bp启动子区段能较有效启动基因的表达;进一步成功构建Survivin反义寡核苷酸表达质粒pcDNA3.1-hTERT-Survivin和p53过表达载体pcDNA3.1-p53;转染鼻咽癌细胞株CNE-2后检测表明Survivin表达下调和p53表达上调;MTT和流式细胞检测显示联合转染pcDNA3.1-hTERT-Survivin和pcDNA3.1-p53可诱导鼻咽癌细胞株CNE-2的凋亡。结论利用hTERT启动子和CMV增强子可有效启动Survivin反义寡核苷酸的表达转染鼻咽癌细胞CNE-2后可抑制Survivin的表达,同时联合过表达p53基因后,可以有效诱导鼻咽癌细胞CNE-2的凋亡,提示该方法可以成为有效治疗鼻咽癌的一种新的靶向治疗方法。
卿菁[6]（2010）在《E6.BARF1p调控CD/UPRT.UL49的表达对鼻咽癌的靶向放射—基因治疗研究》文中指出鼻咽癌是一类以放射治疗为主的恶性肿瘤,如何提高肿瘤的局控率及生存率、减轻放射治疗对正常组织的损伤、提高患者的生存质量一直是该病的研究重点,本文将分章讨论E6.BARF1启动子（简称BARF1p）调控CD/UPRT.UL49的表达对鼻咽癌的靶向放射-基因研究。目的设计BARF1基因的启动子序列,验证该序列是否具有启动子活性,通过比较该启动子在人鼻咽正常上皮细胞NP69和人鼻咽癌细胞CNE-2中的启动子活性,验证所设计的BARF1基因的启动子是否具有肿瘤相对特异性。方法结合启动子预测软件结果（TRANSFAC和MATINSPECTOR）及引物设计软件（Primer premier5.0）,设计BARF1基因的启动子序列,从B95-8细胞株中提取基因组DNA,PCR扩增所设计的BARF1基因的启动子,将扩增的启动子连接在荧光素酶报告基因载体上,通过脂质体介导,瞬时转染入NP69和CNE-2细胞细胞中,验证所设计的启动子是否具有启动子活性,同时比较该启动子在NP69细胞和CNE-2细胞中的的启动子活性的差异,验证该启动子是否具有肿瘤相对特异性,差异的比较采用SPSS10.0的t检验。结果所设计的BARF1基因的启动子在CNE-2细胞中具有启动子活性,但是活性较低,而在NP69细胞中不具备启动子活性,且该启动子在CNE-2细胞中的启动子活性远高于NP69细胞,差异有统计学意义（p<0.05）。结论本研究设计的BARF1基因的启动子具有启动子活性,且该启动子具有肿瘤相对特异性。目的建立稳定表达自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2细胞自杀基因修饰细胞株。方法构建真核基因表达质粒pcDNA3.1 （-）E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49,经脂质体法转染CNE-2细胞,G418筛选出阳性克隆细胞并扩大培养,抽提阳性克隆细胞的总蛋白质,通过Western-blotting检测目的基因表达。结果自杀基因CD/UPRT.UL49在CNE-2转染细胞内稳定表达。结论本组通过脂质体转染技术,成功地建立了稳定表达CD/UPRT.UL49基因的CNE-2细胞株。目的体外实验观察CD/UPRT.UL49/5-FC系统对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应。方法给予野生型CNE-2细胞和稳定转染CD/UPRT.UL49的CNE-2细胞株不同剂量的丫射线照射,同时联合不同剂量前体药物5-Fc作用48h后,用MTT法检测细胞的杀伤效应；再给予野生型CNE-2细胞和稳定转染CD/UPRT.UL49的CNE-2细胞株2Gy的γ射线照射,联合200μg／ml前体药物5-FC作用48h后,流式细胞仪检测前体药物对表达CD/UPRT.UL49基因的CNE-2细胞的杀伤作用,并检测CD/UPRT UL49基因对CNE-2细胞的旁杀效应。统计分析采用SPSS10.0软件进行t检验及方差分析。P<0.05表示有统计学意义。结果表达自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2细胞的生长受到不同程度的抑制,当仅有10%的CNE-2细胞表达CD/UPRT基因时,可以杀死37.46%的细胞。结论CD/UPRT.UL49/5-FC自杀基因／前体药物系统对鼻咽癌CNE-2细胞具有直接杀伤和旁杀效应。目的通过建立裸鼠CNE-2动物模型,观察自杀基因表达载体pcDNA3.1（-）E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49在前体药物干预下对鼻咽癌放射治疗的增敏效应。方法CNE-2细胞接种裸鼠皮下建立鼻咽癌动物模型,进行脂质体包裹质粒DNA瘤内注射的原位基因（in situ）治疗实验,待肿瘤长至0.8-1.0cm时,将裸鼠随机分组,记录肿瘤体积,比较不同处理组的抑瘤效应,病理切片证实肿快性质,抽提肿瘤组织RNA, RT-PCR反应,确定CD/UPRT.UL49基因在肿瘤组织中的表达。结果成功建立鼻咽癌动物模型,病理切片证实肿块为低分化鳞癌,通过原位基因治疗实验发现,各处理组均能抑制肿瘤生长,较对照组的抑瘤效应更明显（P<0.01）。结论E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49自杀基因载体具有放射诱导和相对肿瘤特异性双重特性,对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应,为鼻咽癌的基因-放射治疗开辟了新思路。
叶玲[7]（2010）在《胃癌联合基因治疗的实验研究》文中研究指明背景与目的：胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,发病率逐年增高。由于临床症状隐匿,多数患者就诊时已进展至中晚期,传统治疗复发率高,预后较差。如何进一步提高疗效、降低死亡率一直是研究的重要课题。随着分子生物学的发展,肿瘤基因治疗已成为目前研究热点。然而,临床实验提示单基因治疗恶性肿瘤效果有限,主要原因可能在于肿瘤的发生、发展涉及多个基因的变化,功能失常的基因互相配合,促进肿瘤进展。因此,向肿瘤细胞导入多种相关基因以提高抗肿瘤效果是基因治疗的发展方向。基因疗法中,自杀基因以其强大的杀伤肿瘤细胞作用及“旁观者效应”备受关注。目前应用最广泛的自杀基因/前药治疗系统是胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶（cytosine deaminase/5-Fluorocytosine, CD/5-FC）和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/环氧鸟苷（herps simplex virus thymidine kinase/ganciclovir, HSV-TK/GCV）。这两种自杀基因/前药系统各有特点：HSV-TK/GCV直接杀伤肿瘤细胞的作用较强,而CD/5-FC旁观者效应更为显着；此外,不同类型的肿瘤对这两种自杀基因/前药系统的敏感性不同,推测联合应用CD/5-FC和HSV-TK/GCV可增加抗肿瘤效应。实体瘤的生长、浸润及转移都离不开瘤内新生血管形成,抑制新生血管形成已成为治疗肿瘤的重要靶点之一。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是最重要的促血管生成因子之一,在多数肿瘤组织中高表达,与肿瘤的预后及复发密切相关。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是在mRNA水平上的基因阻断技术,可高效、特异抑制靶基因表达。既往研究证实利用RNAi可有效下调VEGF在鼻咽癌、结肠癌、胃癌等多种肿瘤细胞中表达,降低微血管密度（micro vessel density, MVD）,有效抑制肿瘤生长。因此,本课题通过构建表达融合自杀基因yCDglyTK及VEGF-shRNA的联合基因表达载体,通过体内外实验研究其抗胃癌作用,探讨联合应用自杀基因治疗与抗血管生成基因疗法治疗胃癌的可行性。方法：（1）选择有效靶序列并构建靶向VEGF的干扰质粒pGenesil-shVEGF;采用PCR法从pGenesil-shVEGF中扩增shRNA表达框架,亚克隆至融合自杀基因载体pcDNA3.1（-）CV-yCDglyTK,构建联合基因质粒pcDNA3.1（-）shVEGF-yCDglyTK;酶切、测序等鉴定重组质粒；（2）以磷酸钙纳米颗粒（calcium phosphate nanoparticles, CPNPs）为载体,介导空白质粒、靶向VEGF的干扰质粒、融合自杀基因质粒及联合基因质粒分别转染SGC7901细胞,G418筛选,建立稳定转染的细胞株,RT-PCR、Western-blot及免疫荧光检测目的基因表达；（3）MTT法检测shVEGF-yCDglyTK/5-FC联合基因/前药治疗体系对胃癌SGC7901细胞的杀伤作用及该体系的“旁观者效应”；平板克隆形成实验检测联合基因/5-FC对胃癌细胞克隆形成率的影响；高效液相色谱仪（high-performance liquid chromatography, HPLC）测定细胞上清中5-FC和5-FU的含量；Hoechst 33258染色及流式细胞仪检测细胞凋亡；（4）以SGC7901细胞建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型,实验分5组：A组为空白对照组,未施加任何处理；B组：瘤内注射CPNPs-空白质粒,腹腔注射5-FC；C组：瘤内注射CPNPs-干扰质粒；D组：瘤内注射CPNPs-融合自杀基因质粒,腹腔注射5-FC；E组：瘤内注射CPNPs-联合基因质粒,腹腔注射5-FC。观察各组移植瘤生长情况；待观察期满,瘤组织行HE染色鉴定组织病理类型；免疫组化染色鉴定肿瘤组织中yCDglyTK和VEGF的表达并测定微血管密度（MVD）。结果：（1）成功构建干扰质粒pGenesil-shVEGF及联合基因质粒pcDNA3.1（-）shVEGF-yCDglyTK;（2）成功建立4种稳定转染不同质粒的胃癌细胞株：SGC/null, SGC/shVEGF, SGC/CDTK及SGC/shVEGF-CDTK;在SGC/shVEGF-CDTK中,检测到yCDglyTK基因表达,VEGF基因表达较野生型SGC7901明显下调；（3）体外细胞实验：加入前体药物5-FC后,SGC/shVEGF, SGC/CDTK、SGC/shVEGF-CDTK与野生型SGC7901细胞及SGC/null相比较,细胞存活率下降,且凋亡比例增高,以SGC/shVEGF-CDTK组差异最明显（P< 0.01）; HPLC检测该组细胞上清中5-FC向5-FU转化的效率为92.00%；该组细胞具有强大的旁观者效应,当阳性细胞比例达40%时,细胞相对存活率仅为（19.00±2.44）%。（4）体内动物实验：与A、B对照组相比,实验组C、D组移植瘤生长受到不同程度抑制,E组抑制效应最明显；至观察期满,与空白对照组A组相比,E组抑瘤率为72.91%。E组瘤组织常规病理检查显示大量肿瘤细胞坏死；免疫组化可检测到yCDglyTK的表达；与对照组A组或B组相比,E组瘤组织VEGF表达下调,MVD明显减少。结论：（1）成功构建联合基因载体pcDNA3.1（-）shVEGF-yCDglyTK,在该载体中,shVEGF及yCDglyTK都可正常表达。（2）shVEGF-yCDglyTK/5-FC联合基因治疗体系可有效杀伤胃癌SGC7901细胞,并具有强大的“旁观者效应”；诱导细胞凋亡可能是该联合基因治疗体系发挥作用的重要机制。（3）瘤内直接注射CPNPs-pcDNA3.1（-）shVEGF-yCDglyTK复合物,联合腹腔注射5-FC,可有效抑制胃癌生长,减少肿瘤组织新生血管形成,是一种具有良好应用前景的治疗策略,为胃癌的临床治疗提供新思路。
樊萍[8]（2010）在《超声介导携自杀基因微泡对卵巢癌细胞抗瘤效应的实验研究》文中指出卵巢癌是病死率较高的妇科肿瘤,近20年来,尽管在其治疗方面取得诸多进展,但晚期患者5年生存率一直徘徊在15%-30%。卵巢癌是机体在各种发病高危因素下,在基因水平上失去了对局部组织细胞生长的正常调控,导致异常增生而形成的新生物,其具体发病原因仍不明确,通常一些学者认为机体细胞生长要受原癌基因和抑癌基因的双重调控,正常情况下,两类基因协同调控,使细胞生长处于平衡状态。抑癌基因功能减弱,或者原癌基因被激活,都会打破这一平衡,导致癌症的发生。随着分子生物学和基因技术的发展,基因治疗为卵巢癌患者提供了一种新的治疗策略,但目前由于缺乏一种安全、稳定、高效的基因转染方法,而极大地限制了基因治疗在临床上的应用。新近研究发现,超声靶向破坏微泡定位释放技术（UTMD）应用于基因治疗是一种新型的无创性基因转移技术。开展UTMD介导目的基因靶向治疗的深入研究可望为卵巢癌的基因治疗提供一种新型、无创、高效、靶向、安全的新途径。本课题首先构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与HSV1TK共表达载体;然后分析了超声微泡介导外源基因转染卵巢癌的可行性并筛选出合适的超声参数;最后,应用UTMD技术将HSV1TK转染入卵巢癌细胞,观察转染后HSV1TK基因在卵巢癌细胞内的表达情况及自杀基因对卵巢癌细胞的杀伤效应,探讨超声微泡介导自杀基因系统对卵巢癌细胞抗瘤效应的机理,为研究和评价UTMD介导的自杀基因转染卵巢癌提供可靠的实验依据,为卵巢癌基因治疗提供一个新的途径和手段。本课题研究主要包括以下三个部分的内容:第一部分增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与I型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1TK）共表达载体的构建及其在卵巢癌细胞SKOV3的表达鉴定目的:构建单纯疱疹病毒I型胸苷激酶（HSV1TK）的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/HSV1TK,鉴定其在真核细胞中的表达和功能。方法:以pORF-HSV1TK为模板,PCR扩增的目的基因HSV1TK片段与pMD18-T载体相连接构建重组克隆pMD18-T/HSV1TK。将双酶切的HSV1TK片段,插入pcDNA3.1-EGFP多克隆位点,构建pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。分别用荧光显微镜观察和RT-PCR方法检测脂质体介导pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK在卵巢癌细胞SKOV3的表达;分别用MTT法和光镜检测胸苷激酶/丙氧鸟苷（HSV1TK/GCV）系统对SKOV3体外杀伤作用及旁观者效应。结果:重组载体酶切鉴定结果与预期结果一致,基因序列与GENEBANK上报道的HSV1TK基因序列完全一致。荧光显微镜观察转染后的细胞发出绿色荧光;RT-PCR结果表明HSV1TK基因能在SKOV3内有效表达。MTT和光镜结果显示转染HSV1TK基因的SKOV3细胞,加入前体药物GCV处理后对其有明显的杀伤作用和旁观者效应。结论:成功构建的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK,能在SKOV3细胞中稳定表达,HSV1TK对卵巢癌细胞SKOV3体外有强大的杀伤作用和旁观者效应。第二部分超声微泡介导基因转染卵巢癌细胞SKOV3的超声参数及转染效率研究目的:探究超声介导携Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1TK）自杀基因微泡转染SKOV3细胞的超声参数及转染效率。方法:超声在不同微泡浓度与辐照时间（8,15,30,60 s间隔1 s）组合下辐照SKOV3细胞,MTT法筛选最适辐照时间和微泡浓度。将SKOV3分成6组分别进行以下处理:超声辐照组,脂质体+超声辐照组,脂质体+微泡+超声辐照组,微泡+超声辐照组,阴性对照组（裸质粒）,阳性对照组（脂质体）,分别转染pcDNA3.1-EGFP/HSV1TK质粒后,用荧光显微镜、流式细胞技术对各组转染效率进行定性和定量检测,最后采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测HSV1TK基因的表达。结果: MTT检测在超声强度0.5 W/cm2,频率1 MHz,微泡浓度5.6×107个/ml,辐照时间8 s间隔1 s条件下,超声辐照微泡转染组与对照组比较（P>0.05）,超声辐照微泡对细胞活性无明显抑制。经此条件转染后荧光显微镜下可观察到脂质体+微泡+超声辐照组的绿色荧光强度最强;流式细胞技术检测表明,微泡+超声辐照组转染效率为（11.74±0.19）% ,比超声辐照组（2.19±0.22）%高,而脂质体+微泡+超声辐照组（25.62±0.08）%均高于其他各组（P<0.05）; RT-PCR检测HSV1TK基因mRNA表达结果示,在脂质体+微泡+超声辐照组的SKOV3细胞中表达最高。结论:在最适的超声参数下,超声介导微泡不仅能单独促进HSV1TK基因转染并有效在SKOV3细胞中表达,而且还能够增强脂质体的转染效率。第三部分超声微泡介导自杀基因系统对卵巢癌细胞抗瘤效应实验研究目的:探讨超声微泡介导的自杀基因系统对卵巢癌细胞抗瘤效应的机理。方法:使用最适的超声转染参数,超声介导微泡将pORF-HSV1TK质粒转染SKOV3细胞后,RT-PCR检测SKOV3中HSV1TK mRNA的表达;转染的SKOV3细胞与不同浓度的前药丙氧鸟苷（GCV）共培养后,MTT法测定各组转染细胞的增殖抑制率及在最适GCV浓度下各组转染细胞增殖抑制率随时间的变化情况;光镜观察给予GCV后不同组转染细胞的数量、形态变化;流式细胞术（FCM）检测各组SKOV3细胞早期凋亡率及细胞周期。结果:RT-PCR检测HSV1TK基因的mRNA在各组转染细胞中均有表达（阴性对照组除外）,其中在脂质体+微泡+超声辐照组的SKOV3细胞中表达最高;MTT检测到脂质体+微泡+超声辐照组的HSV1TK/GCV在GCV浓度为10-100μg/ml范围内时,对SKOV3的增殖抑制率明显强于其它组（P<0.05）;同时检测了在GCV（浓度为100μg/ml）作用24-48 h内,各组细胞增殖抑制率也显着增高,并且脂质体+微泡+超声辐照组细胞增殖抑制率明显强于其它组（P<0.05）;光镜下可见脂质体+微泡+超声辐照组经HSV1TK/GCV处理后SKOV3的数量显着减少,形态明显异常;FCM检测脂质体+微泡+超声辐照组SKOV3细胞凋亡率为（49.13±0.82）%,且大多数细胞周期被阻断于G1期,和其他各组比较有显着差异, P <0.05。结论:超声介导微泡能增强HSV1TK/ GCV系统抑制SKOV3增殖和诱导SKOV3凋亡的作用,并且SKOV3细胞周期被阻断在G1期,从而发挥抗瘤效应。
龚育凡,刘霆,陈选民,张鸽文,冷爱民,彭杰,张桂英[9]（2010）在《新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗胃癌的实验研究》文中研究表明目的构建靶向性基因治疗载体pcDNA3.1（-）CVyCDglyTK,并以新型磷酸钙纳米为基因治疗载体,研究该基因治疗体系在胃癌细胞中体外与体内专一性表达和杀伤作用。方法采用PCR、RT-PCR、融合PCR、酶切及连接等技术构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3.1（-）CVyCDglyTK表达载体和融合自杀基因pcDNA3.1（-）CMVyCDglyTK表达载体。以磷酸钙纳米为载体分别转染CEA阳性的人胃癌细胞株SGC7901细胞和CEA阴性的Hela细胞.采用RT—PCR、免疫荧光法检测感染细胞中yCDglyTK基因的表达,并在体外观测其对胃癌细胞的作用。结果 SGC7901细胞在感染以上两种质粒表达载体后均有yCDglyTK mRNA表达,Hela细胞在转染纳米-pcDNA3.1（-）CMVyCDglyTK复合物后有yCDglyTK mRNA表达,对5-FC的敏感性增强,而在转染纳米-pcDNA3.1（-）CVyCDglyTK复合物后则没有yCDglyTK mRNA表达,5-FC对其亦无杀伤作用。在体外实验中,经纳米转染pcDNA3.1（-）CVyCDglyTK筛选的阳性克隆组细胞存活率为8.0%,纳米-pcDNA3.1（-）CVyCDglyTK转染组为25.4%,而对照组的细胞存活率为99.0%。结论本实验构建的由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因yCDglyTK靶向性基因治疗载体,能使融合自杀基因在CEA阳性的胃癌细胞中专一性表达,从而达到靶向治疗胃癌的目的 。
徐芳,文忠,邱元正,肖健云,赵素萍,郭梦和[10]（2010）在《端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究》文中指出目的探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（hTERTp/tk）基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应。方法通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达。结果转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降。hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低。结论hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性。
二、自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.TK在鼻咽癌细胞中的构建及转染研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.TK在鼻咽癌细胞中的构建及转染研究（论文提纲范文）
（1）建立稳定表达融合自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 2结果 |
| 2.1融合启动子E6.BARF1p的测序结果 |
| 2.2融合基因序列CD/UPRT.UL49的测序结果 |
| 2.3 Western-blotting结果 |
| 3讨论 |
（2）组蛋白H3Ser10磷酸化在EB病毒LMP1诱导鼻咽癌变中的作用及调控通路的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 组蛋白H3Ser10磷酸化在LMP1诱导鼻咽癌变中的作用 |
| 前言 |
| 第一章 Ser10磷酸化组蛋白H3在鼻咽癌组织中的表达及其与LMP1表达的相关性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第二章 LMP1诱导CNE1细胞中组蛋白H3Ser10磷酸化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第三章 基因沉默组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第四章 过表达野生型和突变型组蛋白H3对LMP1促进CNE1细胞增殖和转化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 调控LMP1诱导的组蛋白H3 Ser10磷酸化的蛋白激酶信号通路 |
| 前言 |
| 第一章 蛋白激酶MSK1调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第二章 蛋白激酶MSK1在LMP1促进CNE1细胞增殖和转化中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第三章 TAK1通过激活p38/MSK1通路参与调控LMP1诱导的组蛋白H3Ser10磷酸化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 英文缩略词 |
| 附录2 个人简历、博士研究生期间发表的论文和参加的科研项目 |
| 致谢 |
（3）融合自杀基因对鼻咽癌细胞的体内杀伤作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和细胞 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 裸鼠荷瘤及实验分组 |
| 1.2.2 肿瘤组织中CD/UPRT.UL49基因的测序鉴定 |
| 1.2.3 肿瘤组织中CD/UPRT.UL49蛋白的测定 |
| 1.2.4 裸鼠肿瘤组织石蜡包埋及HE染色 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠移植瘤的生长观察 |
| 2.2 各组肿瘤组织中CD/UPRT.UL49基因的测序鉴定结果 |
| 2.3 鉴定融合自杀基因CD/UPRT.UL49在各组肿瘤组织中的表达 |
| 2.4 移植瘤组织治疗前后的病理学观察 |
| 2.4.1 对照组移植瘤组织切片HE染色 |
| 2.4.2 质粒瘤内注射+肿瘤局部照射5-Fc组移植瘤切片HE染色 |
| 3 讨论 |
（4）基于鼻咽癌潜在靶标的活体光学成像与靶向治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 鼻咽癌简介 |
| 1.2 鼻咽癌生物标志物的研究进展 |
| 1.3 仿HDL纳米颗粒的研究进展 |
| 1.4 可视化肿瘤动物模型的建立 |
| 1.5 选题背景及本文的主要研究内容 |
| 2 SR-B1为潜在的鼻咽癌生物标志物的确立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 HPPS抑制鼻咽癌生长的作用效应评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 HPPS装载chol-si-Bmi1的效率及其生物学效应评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 光学成像可视化鼻咽癌实验动物模型的建立 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 本文的研究内容和结论 |
| 6.2 本文的创新点和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间发表论文目录 |
（6）E6.BARF1p调控CD/UPRT.UL49的表达对鼻咽癌的靶向放射—基因治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 启动子报告基因载体的构建及启动子活性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 建立稳定表达自杀基因的鼻咽癌细胞株 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 E6.BARF1p调控自杀基因CD/UPRT.ULA9的表达对鼻咽癌细胞的体外杀伤效应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 前体药物/自杀基因系统对鼻咽癌放射增敏的原位基因治疗实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| REVIEW |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
（7）胃癌联合基因治疗的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 pcDNA3.1(-)shVEGF-yCDglyTK的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 shVEGF-yCDglyTK/5-FC治疗系统抗胃癌作用的体外研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 shVEGF-yCDglyTK/5-FC治疗系统抗胃癌作用的体内实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 基因联合治疗肿瘤的研究进展 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（8）超声介导携自杀基因微泡对卵巢癌细胞抗瘤效应的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与 I 型单纯 疱疹病毒胸苷激酶(HSV_1 TK)共表达载体的构建及其在卵巢癌细胞 SKOV_3的表达鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 携自杀基因微泡转染SKOV_3的超声参数及转染效率实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 超声介导微泡联合 HSV_1TK/GCV系统对卵巢癌细胞的抗瘤效应实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附图 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文、参研项目、参加学术会议目录 |
（9）新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗胃癌的实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 质粒及引物 |
| 1.3 纳米磷酸钙的制备及pcDNA、CMV、yCDg-lyTK载体构建 |
| 1.4 靶向性质粒表达载体pcDNA (3.1) CVyCDg-lyTK构建 |
| 1.4.1 CEA启动子的PCR扩增及克隆 |
| 1.4.2 CMV增强子的PCR扩增及克隆 |
| 1.4.3 CEA.CMV (CV) 融合启动子的PCR扩增及克隆 |
| 1.4.4 构建pc DNA (3.1) CVyCDglyTK质粒 |
| 1.5 细胞转染 |
| 1.6 免疫荧光法检测yCDglyTK基因在SGC7901、Hela细胞中表达 |
| 1.7 受感染细胞对5-FC敏感性检测 |
| 1.8 以纳米磷酸钙为载体介导自杀基因yCDg-lyTK体外治疗胃癌实验研究 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 靶向性质粒表达载体pcDNA 3.1 (-) CVy-CDglyTK的结构 |
| 2.2 CEA启动子, CMV增强子, 及融合启动子 (CV) 的扩增 |
| 2.3 免疫荧光法检测y CDglyTK基因的的表达 |
| 2.4 受感染细胞对5-FC敏感性 |
| 2.5 纳米磷酸钙为载体介导自杀基因yCDglyTK体外对胃癌细胞的影响 |
| 3 讨论 |
（10）端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 h TERTp和tk基因的构建 |
| 1.2.2 逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) |
| 1.2.3 MTT法 |
| 1.2.4 脂质体介导的瞬时转染 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 h TERTp及tk基因的鉴定 |
| 2.2 重组质粒构建的鉴定 |
| 2.3 RT-PCR检测转染细胞中tk基因、端粒酶、h TERT的表达 (图5) |
| 2.4 MTT结果 |
| 2.5 细胞形态学结果 |
| 3 讨论 |
四、自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.TK在鼻咽癌细胞中的构建及转染研究（论文参考文献）
- [1]建立稳定表达融合自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株[J]. 卿菁,赵素萍,蒋卫红,章华. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2014(03)
- [2]组蛋白H3Ser10磷酸化在EB病毒LMP1诱导鼻咽癌变中的作用及调控通路的研究[D]. 李彬彬. 郑州大学, 2013(04)
- [3]融合自杀基因对鼻咽癌细胞的体内杀伤作用[J]. 卿菁,赵素萍,蒋卫红,章华. 肿瘤学杂志, 2013(06)
- [4]基于鼻咽癌潜在靶标的活体光学成像与靶向治疗研究[D]. 郑英. 华中科技大学, 2012(08)
- [5]鼻咽癌基因治疗的实验研究[J]. 周文胜,张剑,李朝霞,文三立,江红群,朱亲耀. 南昌大学学报(医学版), 2010(10)
- [6]E6.BARF1p调控CD/UPRT.UL49的表达对鼻咽癌的靶向放射—基因治疗研究[D]. 卿菁. 中南大学, 2010(11)
- [7]胃癌联合基因治疗的实验研究[D]. 叶玲. 中南大学, 2010(11)
- [8]超声介导携自杀基因微泡对卵巢癌细胞抗瘤效应的实验研究[D]. 樊萍. 重庆医科大学, 2010(05)
- [9]新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗胃癌的实验研究[J]. 龚育凡,刘霆,陈选民,张鸽文,冷爱民,彭杰,张桂英. 中国现代医学杂志, 2010(08)
- [10]端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究[J]. 徐芳,文忠,邱元正,肖健云,赵素萍,郭梦和. 南方医科大学学报, 2010(04)