一、酪氨酸激酶Jak3与核小体组装蛋白Nap1的相互作用（论文文献综述）
张志宏[1]（2021）在《锌指蛋白70在结肠炎相关结直肠癌发生发展及铃兰毒苷抗结直肠癌作用机制研究》文中研究表明背景:IL-1β是关键的促炎介质,对局部和全身炎症至关重要。NLRP3炎性小体及STAT3激活可促进巨噬细胞中IL-1β分泌。IL-1β等促炎因子可以促进炎症相关的癌症。STAT3的异常激活可促进结直肠癌细胞的存活,细胞增殖,迁移,侵袭和血管生成。ZNF70是锌指蛋白家族的成员,与癌症也有密切的联系。三萜类化合物铃兰毒苷具有抗癌的药理活性。目的:（1）本文探究锌指蛋白70ZNF70)是否通过调控THP-1巨噬细胞中NLRP3炎性小体和STAT3激活从而促进炎症相关结直肠癌发生发展。（2）本文探究铃兰毒苷是否通过调节结肠癌细胞中STAT3激活从而抑制结直肠癌的发生发展。方法:（1）在体外实验中,通过ELISA,RT-PCR,蛋白免疫印迹实验,免疫共沉淀,Duolink PLA技术检测,免疫荧光,EdU标记测定和集落形成实验研究ZNF70对上调THP-1巨噬细胞IL-1β分泌到促进HCT116细胞增殖的作用及潜在机制。在体内实验中,将AAV介导的ZNF70基因沉默遗传方法与AOM/DSS模型相结合探究ZNF70对结肠炎相关结直肠癌的影响。（2）在体外实验中,通过分子对接,荧光素酶报告基因实验,MTT测定,RT-PCR,蛋白免疫印迹实验和免疫荧光实验探究铃兰毒苷对HCT116细胞中STAT3活化的潜在机制。通过EdU标记测定,集落形成实验,流式细胞术,划痕实验,基质胶侵袭实验和小管形成实验探究铃兰毒苷对人结直肠癌HCT116细胞增殖,凋亡及人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移,侵袭和血管生成的影响。在体内实验中,将裸鼠移植瘤模型与免疫组织化学染色实验相结合检测铃兰毒苷的抗肿瘤活性。结果:（1）在LPS和ATP诱导的THP-1细胞中,我们发现ZNF70可激活NLRP3炎性小体,进而促进IL-1β分泌。有趣的是,我们发现ZNF70的Zn F结构域可以与NLRP3相互作用,并通过特异性抑制NLRP3上K48泛素链连接的泛素从而抑制NLRP3的泛素化。此外,ZNF70通过促进Src/STAT3信号通路从而促进Pro-IL-1β的表达。值得注意的是,我们发现ZNF70是巨噬细胞与结肠癌细胞之间连接的靶标。在经LPS和ATP处理THP-1巨噬细胞上清液培养的HCT116细胞中,ZNF70通过促进STAT3激活促进HCT116细胞增殖。ZNF70敲低可改善AOM/DSS诱导的结肠炎相关结直肠癌肿瘤的生长,抑制小鼠结肠组织中Pro-IL-1β,NLRP3炎性小体,p-STAT3（T705）,Ki67和F4/80蛋白水平表达并且抑制小鼠血清中IL-1β的分泌,进一步证实了体外观察。（2）铃兰毒苷抑制结肠癌细胞SW620和HCT116的细胞存活率。在HCT116细胞中,铃兰毒苷通过JAK1,JAK2和Src途径抑制STAT3在705位的酪氨酸发生磷酸化,并通过PI3K-AKT-mTOR-STAT3途径抑制STAT3在727位的丝氨酸发生磷酸化。有趣的是,我们在mTOR/STAT3和JAK/STAT3通路中发现mTOR和JAK2之间可发生相互串扰,共同调节STAT3激活,并且铃兰毒苷在其中扮演重要的角色。铃兰毒苷抑制涉及细胞存活（例如Survivin,Bcl-xl,Bcl-2）,增殖（例如Cyclin D1）,转移（例如MMP-9）和血管生成（例如VEGF）靶基因的表达。我们发现铃兰毒苷抑制内皮细胞的小管形成,迁移和侵袭,并抑制结肠癌细胞增殖。最后,铃兰毒苷对裸鼠移植瘤模型中肿瘤的抑制作用进一步证实了体外观察。结论:（1）ZNF70通过干预巨噬细胞中NLRP3炎性小体和STAT3信号通路从而促进HCT116增殖,并提示ZNF70可能是干预炎症相关结直肠癌有希望的治疗靶标。（2）目前的研究结果表明,在结直肠癌中,铃兰毒苷通过干预JAK2/STAT3（T705）和mTOR/STAT3（S727）信号传导通路之间的串扰,可促进细胞凋亡,并抑制增殖和血管生成,表明铃兰毒苷可能是结直肠癌治疗有价值的候选物。
韩卓[2]（2021）在《维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究》文中指出维生素C（Vitamin C,VitC）是人和动物必需的营养物质。科学界对于VitC功能几乎所有的认识都基于它作为电子供体,即作为天然还原剂的化学性质,主要表现在VitC能够清除细胞代谢过程中产生的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）,保护重要的生物大分子免于氧化损伤,维持细胞的正常功能。对VitC研究的一次重大突破,在于发现VitC是亚铁离子(ferrous ion,Fe2+)和2-氧戊二酸盐（2-oxoglutarate）依赖型双加氧酶(Fe2+-and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases,Fe2+/2OGDDs)家族关键的“辅因子”,维持Fe2+/2OGDDs在细胞内的活性。进一步研究揭示,VitC能作为辅因子调节Fe2+/2OGDDs家族中与表观修饰有关的酶的催化活性,其中包括DNA羟化酶TET（ten-eleven translocation（TET）family of DNA hydroxylases）和具有Jumonji-C结构域的组蛋白去甲基化酶（Jumonji-C domain-containing histone demethylases）。这一发现直接加速了VitC在干细胞和再生医学领域中的研究,越来越多的证据表明VitC能够通过调控表观修饰酶的活性来提升细胞重编程的效率和质量,也能参与调节干细胞的自我更新和定向分化。有研究曾提出,VitC作为辅因子的生物学功能,本质上依然以VitC固有的还原性为基础,但VitC对表观修饰酶功能调控的特殊性却暗示VitC很可能还存在其他的作用机制,说明我们目前对VitC功能的认识很可能还存在很大空白,大大限制了VitC的应用价值。2014年,本课题组研究发现,VitC通过激活Janus kinase（JAK）2/signal transducer and activator of transcription（STAT）2信号途径,在小鼠胚胎干细胞中诱导Nanog基因的表达。我们曾初步证实,钠离子依赖型VitC转运蛋白2（sodium-dependent vitamin C transporter 2,SVCT2）能够介导VitC对JAK2和STAT2的信号激活,并参与对下游基因的调控,提示VitC与细胞信号转导有关联。在此基础上,本研究以小鼠F9畸胎瘤干细胞系为主要研究对象,首次证明VitC具有“生物信号分子”的作用,完善了对VitC生物学功能的认知。研究可分为两大阶段,第一阶段揭示VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能;第二阶段研究VitC激活的JAK2信号传递途径具有的调控作用及其对VitC生物学功能的补充。主要的研究内容和结果列举如下:1.发现和探究VitC转运蛋白SVCT2的受体功能。首先,通过蛋白质免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）和免疫印迹,我们证明SVCT2特异性结合JAK2而不结合JAK1、JAK3和TYK2。然后,通过基序预测和突变体策略,研究SVCT2蛋白序列中介导JAK2结合和激活的关键结构基序。结果显示,位于SVCT2羧基末端的618-621位氨基酸序列以及连接第8～9号跨膜螺旋的胞质侧肽段中的418-422位氨基酸序列是负责结合JAK2的关键基序,介导VitC对JAK2的激活。通过磷酸化位点预测和突变体策略,研究JAK2对SVCT2潜在的磷酸化作用及其对招募STAT2的影响。结果显示,VitC激活的JAK2催化SVCT2羧基端Tyr626发生磷酸化,介导SVCT2对STAT2的招募,进一步诱导JAK2和STAT2的磷酸化。之后,通过双荧光素酶报告（Dual Luciferase Reporter）实验,我们还证明SVCT2响应VitC处理增强STAT2的转录因子活性,且依赖JAK2的激活。综上,本研究证实SVCT2是VitC的“受体样转运蛋白”,具有JAK2偶联受体的典型特征。此外,本研究还证明VitC对JAK2的激活与VitC在细胞内的积累无关。2.研究SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间的关联。通过co-IP和免疫印迹,研究SVCT2介导的VitC运输对JAK2激活的影响。结果显示,抑制SVCT2对VitC的运输作用会抑制SVCT2对JAK2的磷酸化激活。通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography）实验,研究SVCT2对JAK2的激活是否反过来影响SVCT2对VitC的运输。结果显示,抑制JAK2的激活也会削弱SVCT2对VitC的运输能力。这部分研究证明,SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间紧密偶联、不可分割,是一个完整的生物学事件。3.研究VitC激活JAK2与清除ROS之间的关系。首先,通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）和免疫印迹,研究VitC抑制ROS的作用对激活JAK2的影响。结果显示,VitC对JAK2的激活并不依赖对ROS的抑制。接下来,我们研究VitC激活的JAK2是否反过来影响VitC对ROS水平的调控。结果显示,VitC抑制细胞内ROS的水平且部分依赖JAK2的活性。随后的研究进一步证明,VitC激活的JAK2催化其固有底物脯氨酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase,PDHK1）发生磷酸化,活化的PDHK1又催化脯氨酸脱氢酶E1α亚基（E1 alpha subunit of pyruvate dehydrogenase,PDHA1）Ser232发生磷酸化,抑制PDHA1的活性,降低细胞氧化代谢效率,进而抑制ROS的产生。4.研究JAK2的激活对VitC表观调控功能的影响。通过免疫荧光、点杂交和免疫印迹,研究VitC激活的JAK2对5hm C水平的调控。结果显示,抑制JAK2的激活会抑制VitC对5hm C水平的促进。通过磷酸化位点预测和突变体策略,我们首次证明TET3是JAK2的激酶底物。VitC和SVCT2激活的JAK2直接催化TET3 Tyr1375发生磷酸化。后续研究证实Tyr1375的磷酸化增强了TET3的酶活性并影响其对靶基因的选择,表明VitC不仅仅以辅因子身份调控TET酶的功能。另外,VitC激活的JAK2催化其固有底物组蛋白H3第41位酪氨酸残基发生磷酸化,而后者有利于开放染色质状态的建立。通过微球菌核酸酶消化实验,我们证明VitC确实能够提高基因组DNA的可接近性,且依赖于JAK2的激活。5.研究JAK2的激活对VitC在细胞多能性和分化调控中的影响。通过碱性磷酸酶染色、表达谱m RNA测序和实时定量PCR,研究VitC激活的JAK2对F9细胞的多能性,以及对多能性和分化相关基因表达的影响。结果显示,在F9细胞中,VitC对细胞多能性没有明显影响,但倾向于促进分化发育相关基因（特别是与神经成熟相关基因）的表达,且依赖于JAK2的激活;只有在JAK2活性被抑制的条件下,VitC更倾向于促进细胞的多能性,并诱导一系列多能性相关基因（但不包括Nanog）的表达。进一步的研究发现,VitC激活的JAK2实际上通过两条作用相反的途径分别调控两类下游基因的表达,即通过依赖STAT2的途径调控少数特定多能性相关基因（比如Nanog）的表达;通过不依赖STAT2的途径调控与分化相关基因的表达。综上,本研究发现VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能,并证明激活JAK2是VitC发挥调控作用的重要途径。这是对VitC生物学作用突破性的发现,为其生理和药理功能的研究带来新的思考,对VitC在疾病治疗和再生医学等众多领域的应用具有一定的指导意义。
王明哲[3]（2021）在《固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究》文中研究表明背景:慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种以持续呼吸道症状和气流受限为特征的疾病,通常是由于明显暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和/或肺泡异常所致,其发病机制目前尚未完全阐明,临床疗效欠佳。目前对于COPD的治疗主要以对症治疗为主,治疗效果不理想且需要终身控制疾病的发展。中医以整体观念、辨证施治为纲,可以通过“扶正”、“固卫”起到未病先防,已病防变的作用,从而更好的预防和控制COPD的发生与发展。“固本止咳中药”源于国医大师、中医内科呼吸病专家晁恩祥教授多年诊治COPD的临床经验。晁恩祥教授十分重视人体正气在疾病发病和病情进展中的地位和作用,强调“正气存内,邪不可干”,提出“扶正固卫”理论,因而以经典方剂“玉屏风散”为基础,加减化裁创制固本止咳中药。前期临床研究表明,固本止咳中药在改善患者肺功能等方面有较好效果,并可通过调控T细胞亚群发挥调节人体免疫功能的作用。大量的前期动物实验表明,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠肺功能情况、呼吸道病理损伤及炎性因子的过度表达、并降低肺组织αβT细胞/γδT细胞比例、增加肺组织中KGF,KGFR蛋白和基因表达含量等。因此,进一步开展固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的疗效及作用机制研究具有一定的意义。目的:损伤修复是在各类细胞生长因子共同作用下的协调有序过程,分为炎症反应、细胞增殖、基质沉积及组织重塑四个时期。呼吸道损伤修复是COPD的主要发病机制之一,贯穿了慢阻肺疾病的全程。本研究从呼吸道的黏膜炎症损伤修复、呼吸道结构损伤修复及异常的呼吸道损伤修复这三个方面入手,研究固本止咳中药对于COPD呼吸道损伤修复的调控作用,从而更好的阐释中医“扶正固卫”、“肺主皮毛”的理论。方法:本研究将100只健康ICR小鼠按体重随机分为空白组（n=30）、模型COPD组（n=35）和固本止咳中药组（n=35）。除正常对照组以外,其余各组均被制成COPD模型。本研究采用被动吸烟加鼻腔滴入LPS的方法进行COPD小鼠造模。治疗组于第61天开始予固本止咳中药灌胃,空白对照组和模型对照组使用蒸馏水以同样方法灌胃,共28天。第一部分:体重监测和肺功能检测明确COPD模型小鼠的模型制备情况和固本止咳中药的药效。在固本止咳中药对COPD模型小鼠的呼吸道黏膜炎性损伤修复的调控作用研究方面,本研究首先通过抗体芯片法对小鼠呼吸道40种炎性因子进行系统检测,并采用免疫组化法对抗体芯片结果中COPD组明显变化和固本止咳中药组发挥明显调控作用的炎性因子进行验证。在固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道结构损伤修复的调控以及对异常的损伤修复的作用研究方面,本研究通过病理学评判、免疫组化法和透射电镜进行检测,以判断香烟烟雾暴露+LPS滴鼻对小鼠呼吸道结构、肺泡结构、细胞外基质和Ⅱ型上皮细胞的结构损伤情况以及固本止咳中药对COPD模型对相应结构损伤修复及异常的损伤修复的调控情况。第二部分:基于质谱技术,对固本止咳中药的成分分析研究,从固本止咳中药的化学成分入手,探讨其发挥损伤修复作用机制的原理。此外,本研究对各组小鼠肺组织进行label-free蛋白组学检测,明确固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的靶点及通路。阐释其对于COPD模型小鼠呼吸道损伤修复多成分-多靶点-多通路整体调控的机制。第三部分:基于western-blot和RT-qPCR技术,对第一部分和第二部分结果富集出现的JAK-STAT信号通路进行验证研究,对通路中JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3和SOCS3的蛋白表达水平以及JAK1 mRNA,JAK2mRNA,JAK3mRNA,STAT1 mRNA,STAT3 mRNA,SOCS3mRNA的表达水平进行测定。结果:1)体重监测:固本止咳中药可改善COPD模型小鼠体重增长缓慢的情况。2)肺功能检测:COPD 组较空白组 FEV 0.05,FEV0.1,FEV0.2,PEF,Crs,Cst均明显下降（P<0.01）;Rrs,Ers,Rn均明显升高（P<0.01）;G,H均无统计学差异（P>0.05）。固本止咳中药组较COPD组FEV0.05,FEV0.1,FEV0.2,Crs均明显升高（P<0.05）;Rrs,Ers,Rn均明显下降（P<0.05）;PEF,G,H,Cst均无统计学差异（P>0.05）。3)病理形态学:HE染色结果表明,COPD组小鼠病理形态符合COPD的特征,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠50-100μm直径气道、呼吸性细支气管和肺泡的病理形态。透射电镜结果表明,COPD组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,嵴断裂或消失。固本止咳中药组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞部分板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,但程度与COPD组相比明显减轻。4)抗体芯片检测:在40个炎性因子中,COPD组与空白组相比,共有8个显着升高的炎性因子,分别为 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3,IL-17 和 IL-12p70（P<0.05）;固本止咳中药组与COPD组相比,共有7个显着降低的因子,分别为IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3 和 TCA-3（P<0.05）。5)免疫组化检测:与空白组相比,COPD组IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α 在肺组织中的表达均明显升高（P<0.05）。与 COPD 组相比,固本止咳中药组 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α在肺组织中的表达均明显下降（P<0.05）。空白组和COPD组,固本止咳中药组与COPD组之间Collegen 1均无统计学差异（P>0.05）。6)中药成分分析:共鉴定出固本止咳中药的41个成分,其中的多种成分被证明可通过抗炎、抗氧化、抑制气道重塑等参与呼吸道损伤修复的调控。7)label-free蛋白组学检测:在COPD组和空白组之间共发现287个差异蛋白,固本止咳中药组和COPD组之间共发现184个差异蛋白。通过对差异蛋白的GO富集分析、KEGG富集分析和REACTOME富集分析发现:固本止咳中药可通过中性粒细胞脱颗粒、补体通路、细胞外基质、JAK-STAT信号通路等多个途径以及多个参与COPD进展的生物标志物,从整体上参与COPD呼吸道损伤修复的调控。8)JAK-STAT信号通路的实验:本研究通过RT-PCR法对各组小鼠肺组织JAK1,JAK2,JAK3,STAT1,STAT3和SOCS3进行了测定,结果表明:与空白组相比,COPD模型小鼠肺组织中 JAK1 mRNA,JAK2 mRNA,JAK3 mRNA,STAT3 mRNA 和 SOCS3 mRNA表达均明显升高（P<0.05）,STAT1 mRNA两组间无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中JAK1 mRNA,STAT3 mRNA表达明显下降（P<0.05）,且 SOCS3 mRNA 表达明显升高（P<0.05）,JAK2mRNA,JAK3 mRNA,STAT1 mRNA与COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。本研究采用western-blot法对各组小鼠肺组织JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3,SOCS3进行测定。与空白组相比,COPD 模型小鼠肺组织中 p-JAK1,p-STAT3,p-JAK1/JAK1,p-STAT3/STAT3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,SOCS3与空白组相比均无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中p-JAK1,p-STAT3,p-STAT3/STAT3明显降低（P<0.05）,SOCS3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,P-JAK1/JAK1 与 COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。结论:1)固本止咳中药可通过减少COPD模型小鼠肺组织炎性因子的过度表达,发挥调控呼吸道黏膜炎症损伤修复的作用;并通过改善COPD模型小鼠呼吸道结构、肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构以及细胞外基质的损伤,发挥调控呼吸道结构损伤修复和减少异常的呼吸道损伤修复的作用。体现了中医扶正固卫,肺主皮毛的理论。2)固本止咳中药在COPD损伤修复机制的整体调控中具有多成分-多靶点-多通路的特点,体现了中医整体观念的特点。3)固本止咳中药可通过下调JAK1和STAT3的磷酸化水平,上调SOCS3的表达从而抑制JAK-STAT信号通路。是固本止咳中药基于扶正固卫、肺主皮毛理论调控呼吸道损伤修复在机制上的具体体现。
赵亚楠[4]（2021）在《NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究》文中研究指明第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究研究背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma,NHL）,占所有NHL的30-35%。利妥昔单抗联合化疗作为一线治疗手段显着提高了疗效,但仍有三分之一以上的患者难治或复发。90%的难治/复发病例不能通过常规挽救化疗和自体干细胞移植得到缓解。免疫疗法近年来在肿瘤治疗领域取得重要进展,例如免疫检查点阻断剂（ICB）、CAR-T疗法等,已在多种实体瘤中取得一定的疗效,但在DLBCL患者中反应欠佳。因此,探索DLBCL发病过程中调节免疫稳态的相关机制,评估高危因素,对于提高DLBCL的治疗效果十分重要。炎症反应是肿瘤发生的关键因素之一。炎症小体可介导炎性细胞因子释放,产生炎症级联反应,促进形成适合肿瘤细胞生长的炎性微环境。NLRP3炎性小体是研究最广泛的炎症小体,外来病原体入侵或体内细胞的损伤和死亡,可招募、组装并激活NLRP3炎症小体,活化caspase-1,切割IL-1β和IL-18前体,产生有活性的IL-1β和IL-18,从而介导机体的免疫应答,促进机体清除病原体和内源性损伤。此外,NLRP3炎症小体在肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。既往研究表明,NLRP3炎症小体在乳腺癌、纤维肉瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用,并且NLRP3及其效应细胞因子IL-1β和IL-18可促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,参与肿瘤的免疫逃逸。因此,NLRP3炎症小体诱导的免疫抑制可能是肿瘤发生的机制之一。本课题组前期研究发现,初诊NHL患者血清中IL-18升高,治疗缓解后降低;且淋巴瘤细胞株中的NLRP3炎症小体可被活化,伴随NLRP3炎症小体相关基因的表达升高。然而,NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用尚不清楚。肿瘤细胞可通过多种方式抑制机体的抗肿瘤免疫应答,逃逸宿主的免疫监视。免疫检查点是免疫细胞或肿瘤细胞上表达的调节免疫稳态的分子,对防止自身免疫反应过度激活起着重要作用。然而,肿瘤中过度表达的免疫检查点可使机体免疫功能受到抑制,导致肿瘤的免疫逃逸,例如肿瘤细胞表达的程序性细胞死亡配体1（PD-L1）,与活化T细胞上表达的程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）结合并传递抑制性信号,诱导肿瘤免疫耐受。免疫抑制也是淋巴系统恶性肿瘤发生发展的重要因素之一。研究表明,恶性B淋巴细胞可通过高表达PD-L1逃避免疫监视。另外,肿瘤免疫微环境还存在髓系来源的抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）及调节性T细胞（Tregs）等抑制免疫功能的细胞。研究证实,DLBCL中MDSCs可通过IL-10、S100A12及PD-L1介导T细胞功能抑制。近期研究报道,NLRP3炎症小体/IL-1β途径可促进头颈部鳞状细胞癌的肿瘤发生,阻断该途径延缓了肿瘤生长,并伴随着效应T细胞数量的增加和免疫抑制性细胞的减少。鉴于NLRP3炎症小体在肿瘤发生和免疫抑制中的重要作用,我们推测,DLBCL中NLRP3炎症小体异常活化通过介导肿瘤免疫逃逸促进淋巴瘤发生发展。目前,DLBCL中免疫抑制的调节机制尚不明确,对于DLBCL中NLRP3炎症小体的作用及免疫调节机制的深入认识,有助于识别新的生物标志物,逆转免疫抑制状态,并改善DLBCL患者免疫治疗反应。研究目的:本课题拟研究NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,分析其与临床特征和预后的相关性;体内验证NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠发病的影响;探讨NLRP3炎症小体对T细胞表型和功能的影响及其参与淋巴瘤免疫抑制的作用及机制;探索NLRP3抑制剂对免疫检查点阻断疗法的影响。预期目标的实现,将揭示NLRP3炎症小体介导的免疫失衡在DLBCL发生发展中的作用及机制,为DLBCL提供新的预后标志物和治疗靶点。研究方法:1.收集35例初诊DLBCL肿瘤组织和35例正常淋巴组织（14例扁桃体组织,7例腋窝淋巴结,7例支气管淋巴结和7例胃周淋巴结）,制备微阵列组织芯片。（1）免疫组化染色评估DLBCL肿瘤组织和正常组织中NLRP3炎症小体效应细胞因子（IL-1β、IL-18）的水平,分析NLRP3炎症小体活化与DLBCL临床特征的关系。（2）免疫组化染色检测PD-L1的水平,分析PD-L1的表达与临床特征的关系。（3）分析IL-1β或IL-18表达与PD-L1表达的关系。2.收集初诊、缓解和难治/复发阶段的DLBCL患者外周血标本,同时收集健康对照者及其他类型NHL患者外周血标本,分离外周血单个核细胞（PBMCs）。（1）检测DLBCL患者抗肿瘤免疫应答能力:流式细胞术检测外周血中T细胞和NK细胞比例,检测T细胞和NK细胞表面免疫检查点分子（TIM-3、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD160）的表达,检测T细胞分泌细胞因子能力（IFN-γ、TNF-α）及NK细胞脱颗粒能力（颗粒酶、穿孔素、CD107a）,判断T细胞和NK细胞功能是否受损。分析外周血T细胞表达免疫检查点水平与DLBCL临床特征和预后的关系。（2）流式细胞术检测外周血中MDSCs及其亚群（PMN-MDSCs、M-MDSCs）和Tregs的比例,判断免疫抑制性细胞在DLBCL中是否扩增。（3）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测NLRP3炎症小体相关基因（IL1B、IL18、NLRP3、ASC、CASP1、NFKB1）在PBMCs中的表达,比较DLBCL患者和健康对照中的表达差异。3.体外培养DLBCL细胞株（OCI-LY3、RC和DB）,对细胞株进行不同处理:①对照组:PBS处理;②活化组:利用脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）活化NLRP3炎症小体;③抑制组:在加入LPS和ATP同时,利用NLRP3抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体活化。（1）提取不同处理组细胞的总蛋白,Western Blot方法验证各组DLBCL细胞株NLRP3炎症小体活化状态。（2）将不同处理组的OCI-LY3和RC细胞株分别与健康志愿者的PBMCs进行间接共培养,分别共培养3、7、10天后,收集共培养体系的PBMCs,进行流式细胞术检测,分析T细胞的比例和表型。4.NLRP3炎症小体介导淋巴瘤免疫失衡的体内研究:（1）A20淋巴瘤小鼠模型构建:体外培养小鼠淋巴瘤细胞株A20细胞,接种于4周龄雌性BALB/c小鼠前肢背部皮下,设置:①对照组:腹腔注射无菌PBS;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950阻断NLRP3炎症小体活化。比较两组小鼠淋巴瘤生长情况,分析阻断NLRP3炎症小体活化对小鼠淋巴瘤生长的影响。（2）ELISA检测淋巴瘤小鼠肿瘤匀浆和血浆中IL-1β和IL-18的水平,Western Blot检测小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,评估体内应用MCC950是否能抑制小鼠NLRP3炎症小体活化。（3）WesternBlot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析抑制NLRP3炎症小体对PD-L1表达及相关信号通路的影响。（4）淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫应答检测:分离对照组和NLRP3抑制组小鼠PBMCs、脾细胞、腋窝/腹股沟淋巴结细胞和肿瘤细胞,流式细胞术检测不同部位T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,T细胞比例及其产生IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的能力,以及免疫抑制性细胞MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断NLRP3炎症小体活化后荷瘤小鼠体内免疫应答的变化。（5）对A20淋巴瘤小鼠分别注射anti-IL-1β和anti-IL-18抗体,观察抑制IL-1β和IL-18活性对小鼠淋巴瘤生长的作用。流式检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤等部位T细胞比例及其表面PD-1、TIM-3的表达,以及MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断IL-1β和IL-18活性对淋巴瘤小鼠免疫应答的影响。Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析阻断IL-1 β和IL-18活性对PD-L1表达的影响。（6）对A20淋巴瘤小鼠分别注射PD-L1抗体、NLRP3抑制剂MCC950,观测对小鼠淋巴瘤生长的抑制作用,分组如下:①PD-L1抗体组:腹腔注射抗小鼠PD-L1抗体;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950;③联合组:腹腔注射MCC950和PD-L1抗体;④对照组:腹腔注射等量IgG。比较各组小鼠抗肿瘤免疫应答的差异:流式检测外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤中T细胞的比例、表型和功能,以及免疫抑制性细胞的比例变化,分析NLRP3抑制剂和PD-L1抗体之间的相互作用。5.统计分析:使用SPSS 21和GraphPad Prism 7软件对数据进行分析。数据表示为平均值±标准差或中位数±数据范围或四分位数间距。所用数据为三次独立重复实验的结果。利用Student t检验和Mann-Whitney U检验评估P值,用Pearson相关系数检验相关性,P值小于0.05表示差异具有统计学意义。研究结果:1.IL-18在DLBCL肿瘤组织中显着升高且与PD-L1表达呈正相关。（1）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织IL-18表达水平明显升高,且与生发中心型DLBCL（GCB-DLBCL）相比,非GCB型（non-GCB）DLBCL具有更高水平的IL-18。进一步亚组分析发现,IL-18和IL-1β在CD10（-）和MUM1（+）的患者中表达水平更高。（2）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织PD-L1表达水平较正常淋巴组织明显上调,且PD-L1表达与DLBCL生存不良的独立预测因子Ki-67表达成正相关。而且,肿瘤微环境中PD-L1与IL-18的表达水平成正相关。（3）RT-qPCR结果显示,与健康对照相比,DLBCL患者PBMCs中的IL1B和IL18基因表达明显上调。2.流式细胞术检测发现,DLBCL患者抗肿瘤免疫应答受到抑制。（1）流式检测T细胞和NK细胞产生细胞因子水平,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血CD3+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的水平明显减少,NK细胞（CD3-CD56+）比例显着降低,NK细胞产生穿孔素和颗粒酶的水平明显下降。（2）流式检测免疫检查点分子表达,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中T细胞表面PD-1和TIM-3的阳性率明显上升,NK细胞表面TIM-3和BTLA的表达明显升高。进一步分析患者临床资料发现,PD-1+T细胞比例与血清乳酸脱氢酶（LDH）水平呈正相关。而且,T细胞表达PD-1和TIM-3水平与淋巴瘤Ann Arbor分期和国际预后指数（IPI）有关,Ann Arbor Ⅲ/Ⅳ期的DLBCL患者较Ⅰ/Ⅱ期的患者外周血中PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,IPI≥3分的患者较IPI0-2分的患者PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,提示DLBCL患者T细胞表面PD-1和TIM-3表达的增多与不良预后相关。（3）流式检测免疫抑制性细胞比例,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中MDSCs和Tregs细胞的比例明显增高,而治疗后缓解的DLBCL患者Tregs比例较初诊患者明显下降,难治/复发DLBCL患者Tregs比例较缓解患者明显升高。3.体外实验证实,DLBCL细胞株的NLRP3炎症小体可被活化并影响PD-L1表达。（1）WesternBlot结果显示:与对照组相比,LPS和ATP处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1蛋白水平明显升高;MCC950处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1表达明显下调。（2）体外活化或抑制RC或OCI-LY3细胞的NLRP3炎症小体,并与PBMCs共培养,流式结果显示:共培养7天后,RC细胞和OCI-LY3细胞的共培养体系中,NLRP3炎症小体活化组的CD8+T细胞比例均较对照组显着降低,而NLRP3炎症小体抑制组的CD8+T细胞比例较活化组显着升高。4.体内实验证实,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可抑制淋巴瘤生长,降低PD-L1表达。（1）我们通过向BALB/c小鼠皮下注射同系A20淋巴瘤细胞株建立了小鼠淋巴瘤模型,接种后7天左右,小鼠右侧斜肋部皮下出现肉眼可见的肿瘤,接种后14天左右,小鼠肿瘤负荷明显增加。至观察终点处死小鼠,ELISA结果显示,肿瘤组织匀浆中IL-1β和IL-18水平明显升高。（2）Western Blot结果证实:腹腔注射MCC950使小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体效应产物IL-1β和IL-18水平显着降低,并且显着下调淋巴瘤小鼠模型肿瘤中的PD-L1和磷酸化STAT3（pSTAT3）的蛋白水平。（3）分析NLRP3炎症小体与小鼠淋巴瘤生长的关系,发现观察终点时,NLRP3抑制组淋巴瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量明显低于对照组。5.流式结果显示,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可提高淋巴瘤小鼠的T细胞比例及其产生TNF-α的水平,减少PD-1+或TIM-3+T细胞比例,降低免疫抑制性细胞的水平。（1）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞明显增多,脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例明显升高,脾脏CD3+T细胞产生TNF-α的水平明显增加,而分泌IFN-γ的水平下降。（2）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠脾脏和淋巴结中CD3+T细胞表达PD-1和TIM-3的比例显着降低。（3）与对照组相比,NLRP3抑制组MDSCs和TAMs比例在小鼠肿瘤、外周血、脾脏中显着降低,Tregs细胞比例在肿瘤和脾脏中显着降低。6.体内中和IL-18可抑制淋巴瘤生长,降低免疫抑制性细胞比例。（1）将淋巴瘤小鼠分别注射IL-1β或IL-18中和抗体,发现观察终点时,anti-IL-1β组和anti-IL-18组小鼠淋巴瘤大小均显着低于对照组。（2）流式结果显示:与对照组相比,anti-IL-18组小鼠肿瘤、外周血和淋巴结中CD8+T细胞比例均显着增加;anti-IL-1β组小鼠淋巴结中CD8+T细胞比例增加,而外周血中CD8+T细胞比例降低。（3）流式检测T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,结果显示:anti-IL-18组小鼠外周血和淋巴结中CD8+T细胞表达PD-1降低,肿瘤、外周血和脾脏中CD4+T细胞表达PD-1的比例降低,且肿瘤浸润T细胞表达TIM-3降低;而anti-IL-1β组小鼠T细胞表达PD-1百分比无明显变化,肿瘤T细胞表面TIM-3表达升高。（4）流式检测免疫抑制性细胞的比例,发现:anti-IL-18小鼠外周血MDSCs和TAMs比例均明显低于对照组,且anti-IL-18组小鼠肿瘤和脾脏的Tregs比例较对照鼠显着降低;anti-IL-1 β组小鼠外周血MDSCs和TAMs也明显低于对照组,而Tregs比例无明显改变。（5）Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,发现anti-IL-18和anti-IL-1β组小鼠肿瘤组织中PD-L1和pSTAT3蛋白表达水平均较对照显着降低。7.NLRP3炎症小体抑制剂和PD-L1抗体对于抑制淋巴瘤生长具有拮抗作用。（1）在本研究中,我们分别用MCC950、anti-PD-L1抗体单一处理或MCC950联合anti-PD-L1抗体处理淋巴瘤小鼠模型,观察对小鼠淋巴瘤生长的影响,结果显示,单用MCC950或anti-PD-L1抗体均能减小淋巴瘤小鼠的肿瘤负荷,而联用MCC950和anti-PD-L 1抗体降低了肿瘤抑制效果。（2）流式分析发现,与对照相比,anti-PD-L1抗体能显着提高肿瘤浸润性CD8+T细胞和总T细胞的比例,并增加脾脏CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α产生;而联合MCC950后,肿瘤CD8+T细胞比例及脾脏CD8+T细胞产生IFN-γ和TNF-α的水平明显低于单用anti-PD-L1组。以上结果说明,NLRP3抑制剂会破坏由PD-L1抗体提高的CD8+T细胞比例和产生细胞因子能力。（3）流式分析发现,anti-PD-L1组小鼠脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞比例明显高于对照组和MCC950组,而联合组小鼠的脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞的百分比也明显高于单用MCC950组。此外,与MCC950组相比,anti-PD-L1组肿瘤浸润的MDSCs和TAMs的百分比均显着提高,而且联合用药组小鼠肿瘤中的MDSCs和TAMs比例也明显高于单用MCC950组。可见,PD-L1抗体在一定程度上破坏了由NLRP3抑制剂降低的免疫抑制因素。结论:1.DLBCL患者中NLRP3炎症小体异常活化,肿瘤组织中效应细胞因子IL-18表达上调,且与共抑制配体PD-L1表达成正相关。2.DLBCL患者体内抗肿瘤免疫应答受到抑制,肿瘤微环境中PD-L1表达增加,外周免疫抑制性细胞群体MDSCs、TAMs和Tregs明显扩增,T细胞表达PD-1和TIM-3增加,与DLBCL不良预后相关。3.阻断NLRP3炎症小体活化可显着抑制小鼠淋巴瘤进展,增强抗肿瘤免疫应答,降低免疫抑制性细胞数量。而且,NLRP3炎症小体主要通过效应因子IL-18介导淋巴瘤中免疫应答的调节。4.A20淋巴瘤小鼠模型体内阻断NLRP3炎症小体活化可拮抗PD-L1抗体对肿瘤的抑制作用。第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究研究背景胃粘膜相关淋巴组织（Mucosa-associated lymphoid tissue,MALT）淋巴瘤的发生发展与幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori,HP）感染导致的胃粘膜区域免疫稳态失衡密切相关。胃MALT淋巴瘤是慢性炎症转化为肿瘤的典型疾病类型。胃粘膜局部微环境中大量免疫细胞浸润、细胞因子产生等导致的免疫稳态失衡,在胃MALT淋巴瘤的发生发展中起重要作用,因此探究其潜在的免疫调节机制对于明确炎症-肿瘤转化的机制意义重大。髓系来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）由处于早期分化阶段的髓系细胞组成。生理状态下MDSCs处于静息状态,缺乏免疫抑制活性。在各种病理状态下,MDSCs被募集到淋巴器官或肿瘤组织中,通过细胞间接触或可溶性细胞因子的作用,产生广泛的免疫抑制作用。MDSCs主要通过抑制T细胞、NK细胞功能介导肿瘤免疫耐受。研究发现,MDSCs中高活性的精氨酸酶1（Arginase 1,Arg-1）消耗TCR合成的原料L-精氨酸,并抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D3、CDK4的表达,导致T细胞增殖阻滞。MDSCs通过诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）产生一氧化氮,诱导T细胞凋亡。除此之外,MDSCs还能通过促进调节性T细胞（Tregs）聚集发挥免疫抑制作用。由此可见,MDSCs在肿瘤免疫耐受中扮演重要角色。胃粘膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分,具有独特的结构和功能,其中γδT细胞的富集是胃粘膜区域免疫的重要特性。γδT细胞在胃肠道粘膜中含量丰富,对于维持胃粘膜微环境稳态、抵御外来微生物入侵及调节获得性免疫应答起重要作用。yδT细胞可分泌多种细胞因子,按功能不同可划分为分泌IFN-y的γδT1和分泌IL-17的γδT17,其中的T17的作用日益受到重视。γδT17在纤维肉瘤、皮肤癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的微环境中大量浸润,通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及诱导免疫耐受等发挥促癌作用。研究表明,HP感染相关的慢性胃炎可引起γδT细胞大量活化18,而且在胃MALT淋巴瘤微环境中存在IL-17的高表达19,20。然而,关于γδT17在胃MALT淋巴瘤中的作用尚不清楚,有待于进一步研究。近年研究显示,γδT17可通过募集和激活MDSCs来介导结直肠癌和肝细胞癌肿瘤微环境中的免疫耐受。在结肠癌微环境中,IL-23诱导γδT17细胞极化,分泌IL-17、IL-8、TNF-α和GM-CSF等细胞因子,招募并激活MDSCs。在肝癌微环境中,活化的γδT17产生大量IL-17,可促使肿瘤细胞分泌CXCL5,进而招募MDSCs;同时,MDSCs通过分泌IL-23和IL-1β促进γδT17极化,形成正反馈环路,进一步介导肿瘤免疫耐受。由此我们推测,HP感染引起胃粘膜局部慢性炎症,微环境免疫稳态失衡,γδT17被激活,通过分泌IL-17等细胞因子,募集MDSCs,介导肿瘤细胞免疫逃逸,参与胃MALT淋巴瘤发生发展。研究目的本项目拟以胃MALT淋巴瘤区域免疫微环境为切入点,研究γδT17、MDSCs及相关细胞因子在胃MALT淋巴瘤免疫失衡中的关键作用,探索胃MALT淋巴瘤从炎症向肿瘤转化过程中的免疫调节机制。研究方法1.利用H.felis给BALB/c小鼠灌胃,构建小鼠胃MALT淋巴瘤模型,利用快速尿素酶实验和PCR方法检测细菌定植情况,利用H&E染色和免疫组化鉴定小鼠胃粘膜病理特征,动态监测小鼠胃组织成瘤情况。2.H.felis感染后不同时间点（8、11、14、19月）分离小鼠的外周血、脾脏及胃组织,流式细胞术检测MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠中的比例。制备小鼠胃组织的石蜡切片,利用免疫荧光和免疫组化检测胃局部MDSCs（Gr-1+CD 11 b+）的数量及其产生Arg-1和iNOS的水平。3.在胃MALT淋巴瘤小鼠模型发病过程中,利用ELISA和RT-qPCR检测胃组织IL-17蛋白水平和Il17a基因表达的变化,通过流式细胞术分析产生IL-17的三种主要细胞γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例变化,比较γδT17细胞水平在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠之间的差异,以及随H.felis感染时间延长的变化趋势。4.比较胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠胃局部细胞因子和趋化因子的差异:RT-qPCR检测Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）、细胞因子及趋化因子的表达,ELISA检测IL-1β、IL-23等细胞因子的表达和水平,Western Blot检测NLRP3炎症小体是否在H.felis感染鼠胃组织活化,分析差异表达的细胞因子或趋化因子在胃MALT淋巴瘤小鼠发病中的作用。5.收集胃MALT淋巴瘤初诊患者和健康对照者的外周血标本,并制备胃MALT淋巴瘤组织和正常胃组织的石蜡组织切片。流式细胞术检测外周血中MDSCs（CD45+Lin-CD33+HLA-DR-CD11b+）、Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）、γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例,比较胃MALT淋巴瘤患者和健康志愿者之间的差异。免疫荧光检测MD S C s（CD33+CD11b+）和γδT17（TCRγδ+IL-17+）在胃MALT淋巴瘤肿瘤组织中的浸润,免疫组化检测Arg-1、iNOS、IL-1β和IL-23的表达。6.统计分析:本研究数据以平均数±标准差或中位数±四分位数间距表示,用Student t检验或Mann-Whitney检验评估,使用 SPSS 21 和GraphPad Prism 7对数据进行分析。P值小于0.05差异具有统计学意义。结果1.胃MALT淋巴瘤小鼠模型鉴定:H&E染色结果显示,从灌胃后8个月开始,H.felis感染鼠胃黏膜出现以淋巴细胞聚集为主的淋巴滤泡,且随感染时间延长,H.felis感染鼠胃黏膜的病理损害逐渐加剧;感染后14个月,淋巴细胞明显破坏粘膜肌层,甚至粘膜全层,形成淋巴上皮损害（LEL）,这是胃MALT淋巴瘤的典型特征。免疫组化证实,H.felis感染鼠胃黏膜聚集的淋巴组织主要由CD20+的B淋巴细胞组成。以上结果证实,长期的H.felis感染会导致BALB/c小鼠胃黏膜病理损害,先后出现炎症、淋巴组织增生、淋巴滤泡形成和LEL,此病程演变与人的胃MALT淋巴瘤的形成过程高度一致。2.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中MDSCs浸润增多。流式结果显示,H.felis感染早期胃部病变较轻时,感染鼠外周血中MDSCs的比例较对照鼠无明显变化;H.felis感染中后期,胃MALT淋巴瘤小鼠模型的外周血中MDSCs的比例较对照鼠明显升高。免疫荧光和免疫组化证实,与对照鼠相比,Gr-1+CD11b+的MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织浸润显着增多,而且胃组织局部的Arg-1分泌明显增多。3.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中γδT17大量聚集。RT-qRCR和ELISA结果显示,H.felis感染鼠胃组织IL-17在mRNA和蛋白水平均显着高于对照鼠。同时,免疫组化也证实了 IL-17在胃MALT淋巴瘤小鼠模型淋巴滤泡形成部位的高表达。流式数据显示:与对照鼠相比,H.felis感染后8个月小鼠脾脏γδT细胞的比例明显升高,而CD4+T和CD8+T细胞比例无明显差异;而且,胃MALT淋巴瘤小鼠的脾脏中γδT17在产生IL-17的T淋巴细胞中的比例显着升高,而Th17和Tc17比例在两组小鼠之间无明显变化,提示γδT17是胃MALT淋巴瘤发展过程中调节免疫稳态的主要细胞群体。进一步研究发现,γδT17的比例随着H.felis感染时间的延长逐渐升高,提示的T17与疾病进展的相关性。4.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜病变部位参与γδT17极化和募集的细胞因子和趋化因子表达增加。RT-qPCR结果显示,与对照鼠相比,Tlr2、Tlr7和Tlr9基因在H.felis感染后的小鼠胃组织中表达明显升高。Western Blot结果显示,NLRP3炎症小体的活化产物cleaved caspase-1的蛋白水平在H.felis感染后的小鼠胃组织明显增加。ELISA评估小鼠胃组织匀浆中细胞因子的水平,发现与对照鼠相比,IL-1β和IL-23在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织中显着升高。同时RT-qPCR检测发现,Ccr6和Ccl20在胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃组织的表达显着高于对照鼠。5.胃MALT淋巴瘤临床标本检测结果:流式检测发现,与健康志愿者相比,胃MALT淋巴瘤患者外周血中MDSCs和Tregs的比例显着升高。免疫荧光和免疫组化证明,胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中MDSCs和γδT17细胞水平较正常胃组织显着升高,且Arg-1和iNOS在肿瘤微环境中的表达显着上调,同时细胞因子IL-1β和IL-23的表达明显上调。结论1.持续性的H.felis感染可导致小鼠胃组织从胃炎进展到胃MALT淋巴瘤,病理发病过程与人胃MALT淋巴瘤的发生发展高度相似。2.MDSCs在H.felis感染小鼠胃部病变组织和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中大量浸润,参与炎症向淋巴瘤的转化。3.胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃部病变和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中,IL-17分泌增多,γδT17大量聚集,IL-1β、IL-23的激活和CCL20-CCR6的趋化作用可能参与γδT17在病变部位的浸润。γδT17随感染时间延长逐渐增多,可能通过募集MDSCs参与胃MALT淋巴瘤的进展。总之,胃局部免疫稳态失衡是胃MALT淋巴瘤发生发展的重要因素。
王强[5]（2021）在《TCGA和ACRG分型在河北省胃癌人群中应用价值的研究》文中指出胃癌（gastric cancer,GC）是源于胃的恶性肿瘤,是全世界最常见的恶性肿瘤之一,也是癌症相关死亡主要原因。胃癌作为最常见的癌症之一,每年男性发病率为每100000人中有18例,女性发病率为每100000人中有9例。胃癌的形成机制复杂,主要涉及基因修复功能异常、细胞生长、死亡和凋亡基因的功能紊乱等,相关研究发现不同类型的胃癌存在不同发展机制、检测标记物、临床病理特征。为了明确胃癌的发展机制,为胃癌的治疗提供新的证据和方向,改善患者预后,研究胃癌分类的相关分子机制至关重要。TCGA分型和ACRG分型是近些年学者们提出的新的胃癌相关的分子分型方法,该分型方法的提出可以弥补传统病理分型的不足,为胃癌个体化治疗奠定基础。TCGA分型主要来源于欧洲人群,而ACRG分型来源于亚洲人群,主要来自日本和韩国,这两种分型在基因扩增、基因突变、临床特征、预后等各个方面均有显着的研究价值,对于临床的精准个体化治疗有重要意义。然而,TCGA分型和ACRG分型在河北省人群中的临床特征及其与临床参数和预后的关系尚不清楚。本研究旨在通过使用免疫组织化学（IHC）和二代测序（NGS）进行肿瘤分型,探讨两种分型方法和胃癌的临床病理特征、预后的关系,并通过大数据深入挖掘研究胃癌发生发展的分子机制,为胃癌研究提供新的方向和实验理论。第一部分 ACRG分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义目的:研究ACRG分型在GC组织中的表达情况,探讨胃癌分子分型、临床病理特征与预后的关系。进一步明确ACRG分型是否适用于河北人群,探讨ACRG分型对预后的影响。方法:1.采用免疫组化染色法检测65例患者GC组织中MDM2,P21,E-钙粘蛋白和波形蛋白表达水平。2.分析相关蛋白的表达水平与GC患者临床病理特征的相关性。结果:1.IHC染色显示MLH1,MDM2和P21蛋白主要位于细胞核中,而E-钙粘蛋白和波形蛋白则主要在肿瘤细胞的细胞质和膜中表达。2.不同年龄段（≤60岁和>60岁）胃癌病人的MLH1和MDM2表达水平有统计学差异（P<0.05）。3.E-钙粘蛋白和波形蛋白在不同位置的表达水平有统计学差异（P<0.05）。4.四种ACRG分子分型的GC患者在性别、年龄、肿瘤位置、Lauren分型或术后辅助治疗类型上均无明显差异（P>0.05）。5.MSS/TP53+胃癌在胃食管结合部（EGJ）（10.3%）显示出低频率,而大多数MSS/TP53-胃癌存在于远端胃（41.7%）。6.MSS/EMT GC患者倾向为弥漫型（53.8%）,而MSS/TP53-GC患者为肠型（57.1%;MSS/TP53-GC患者倾向于肠型）。7.MSI与MSS/EMT预后明显不同（P<0.001）,MSS/EMT与MSS/TP53-预后明显不同（P<0.001）。MSS/EMT预后最差,其次为MSS/TP53-、MSS/TP53+、MSI。8.ACRG分子分型（P=0.045）、Lauren分型（P=0.001）和辅助治疗（P=0.013）与GC的总生存率（OS）相关。小结:1.MLH1和MDM2蛋白与年龄显着相关。2.E-钙粘蛋白和波形蛋白与肿瘤的位置显着相关。3.MSS/EMT胃癌患者倾向为弥漫型,而MSS/TP53-胃癌患者则倾向为肠型。大多数MSS/TP53-胃癌存在于远端胃。4.在所有ACRG分型中,MSI的OS最好,复发率最低。第二部分 TCGA分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义目的:采用二代测序对胃癌进行综合分析,根据TCGA分型对65例胃癌患者进行分类。探讨胃癌分子分型、临床病理特征与预后的关系。进一步明确TCGA分型是否适用于河北人群,评价TCGA胃癌分子分型对预后的影响。方法:1.采用二代测序方法对65例患者GC组织的基因突变进行筛选和注释。2.应用相关统计学分析TCGA与GC患者OS之间的关系。结果:1.NGS测序结果显示在65例GC病例中,EBV+为6例（9.2%）,MSI为15例（23.1%）,GS为14例（21.5%）,CIN为30例（46.2%）2.MSI在女性中更为常见（53.3%）,而EBV+在男性中更为常见（83.3%）。3.65例胃癌中,TP53的突变率为80.0%,扩增百分比CCNE1为20.0%4.弥漫型、GS分子、MSS/EMT和接受XELOX辅助化疗患者的预后最差。5.Kaplan-Meier图显示多基因突变患者的预后较差。单变量和多变量分析表明TP53突变的患者（危险比=4.193,95%置信区间=1.260-13.945）的预后较差。小结:1.MSI和EBV+发生的概率有性别差异;2.GS和MSI在不同的年龄段发生概率有差异;3.CIN胃癌在胃食管连接处更为常见;4.弥漫型、GS分子、MSS/EMT和接受XELOX辅助化疗的患者的预后最差;5.突变率最高的基因是TP53,扩增百分比最高的是CCNE1;6.多基因突变患者的预后较差;7.TP53突变是GC的独立预后指标。第三部分 ACRG亚型MSI和EMT存在预后差异的分子机制探索目的:利用来自NCBI的基因表达数据库（GEO）、癌症基因组的大型公共数据集数据库（TCGA）研究ACRG分型的生物信息分析,并探讨其在胃癌中的临床意义,对MSI和EMT突变频率进行分析,探讨MSI和EMT相关的差异表达基因,并进行GO富集分析和KEGG分析,对MSI和EMT相关基因和通路进行分类。从基因层面探讨MSI和EMT型胃癌的影响因素。方法:1.利用TCGA数据库和来源于NCBI的GEO数据库中的数据,分析比较TCGA数据库与GSE62254数据集中MSI和EMT表达水平的差异,探讨GC患者预后。2.对MSI和EMT相关的差异表达基因进行GO富集分析和KEGG分析。3.单变量Cox风险回归分析来探讨差异基因与胃癌患者预后的关系。结果:1.对GSE62254胃癌数据集和TCGA数据库的综合分析显示,EMT阳性与不良总体存活显着相关,且MSI的总体生存显着优于EMT。2.MSI的突变频率明显高于EMT。3.8个基因与胃癌患者EMT和MSI分型显着相关,分别是THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3。4.THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3在EMT患者中表达量显着高于MSI,且有统计学差异。小结:1.MSI的突变频率明显高于EMT;2.MSI患者的总体生存显着优于EMT;3.通过生物信息学分析发现THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3与胃癌患者的分类及预后显着相关;4.THBS4、CPE、RSPO3、APOD、CRISPLD1、GHR、SFRP4、NAP1L3在EMT患者中表达量显着高于MSI,且有统计学差异。
贾阳杰[6]（2021）在《蛋白质组和转录组联合分析探索内嗅皮层参与阿尔茨海默病的机制》文中研究表明背景:阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是最常见的神经退行性疾病,其临床特征是进行性记忆丧失和认知功能障碍,给社会和家庭带来沉重的经济负担。AD的主要病理改变包括β淀粉样蛋白沉淀、神经纤维缠结、神经元丢失、突触功能障碍和神经炎症等。尽管近年来基础和临床研究取得了很大进步,但目前尚无一种治疗方法能够阻止或逆转AD的进展,因此仍需充分阐明这种疾病的病因。内嗅皮层（Entorhinal Cortex,EC）是大脑皮层与海马相互作用的重要纽带,也是AD中最易受到影响的区域,对记忆的形成和提取起着至关重要的作用。因此研究EC改变的分子机制对AD的预防和治疗具有潜在的重要价值。方法:在本研究中,我们使用来源于国家发育和功能人脑组织资源库、经过规范化取材和标准化神经病理检测的AD和对照冰冻人脑EC组织,利用TMT标记的蛋白质组学和RNA-seq转录组学来分析人脑EC组织中蛋白和基因的表达谱。并运用免疫组织化学（IHC）和label-free蛋白质组学方法验证了蛋白表达。通过对转录组和蛋白质组学数据进行联合分析,得到这两套组学中共有的差异表达基因和差异表达蛋白,并进行功能分析。利用Western Blot和实时荧光定量PCR方法探讨了组学研究中发现的Hub基因CACNG3在神经元中的功能以及在AD中可能的作用机制。结果:通过AD和对照组的对比分析,在转录组学和蛋白质组学中分别鉴定到534个差异表达基因（上调107个,下调427个）和1,489个差异表达蛋白（上调372个,下调1,117个）。GO富集分析显示转录组和蛋白质组在细胞成分、分子功能和生物过程方面具有相似性。在细胞成分中,差异表达基因/蛋白主要富集在细胞膜以及突触结构;在生物过程中,差异表达基因/蛋白主要参与神经突触的可塑性,突触囊泡循环等过程;在分子功能中主要参与结合过程,催化活性,分子功能的调节以及转运活性等功能。通过对转录组和蛋白质组学数据进行联合分析,发现两套组学共有的、表达趋势一致的差异表达基因/蛋白51个。我们进一步对51个共有的差异表达基因/蛋白进行了深入的分析,发现排名前6的Hub基因（GABRG2,CACNG3,CACNB4,GABRB2,SLC1 7A6,GRIK2）的功能均与离子转运有关,并且它们的mRNA和蛋白表达量均与AD病理改变呈负相关。因此,我们推测AD人脑的EC中离子转运失调可能是引起突触功能障碍的关键因素,并可能是引发AD病理的关键信号通路。为了进一步研究Hub基因在AD中的作用机制,首先研究了 Hub基因在细胞水平的改变是否与人源数据结果一致,发现N2aAPP细胞中仅Hub基因CACNG3的蛋白表达水平降低,与人源组学数据和IHC结果一致。接着我们发现Aβ能够降低CACNG3的mRNA和蛋白的含量。用siRNA敲低CACNG3之后,c-Fos、CaMKIIβ等突触可塑性相关基因的含量降低,推测Aβ可能通过调控CACNG3引起突触可塑性功能障碍。用siRNA敲低CACNG3之后,NLRP3和MAPT基因的转录水平升高,推测CACNG3可能通过NLRP3信号通路影响AD病理改变。我们的研究结果初步解释了CACNG3在突触功能障碍和AD病理改变中的作用机制,为AD的预防和治疗提供了潜在的新靶点。结论:1.AD内嗅皮层神经元中离子转运相关基因（GABRG2,CACNG3,CACNB4,GABRB2,SLC1 7A6,GRIK2）的mRNA水平和蛋白水平均明显下调,可能是引起突触功能障碍的关键因素。2.离子转运相关基因的表达水平与AD病理改变呈负相关。这些基因可能参与引起AD病理改变的关键信号通路。3.CACNG3可能通过影响突触可塑性相关基因的表达调控突触的可塑性并可能通过NLRP3信号通路影响AD病理改变。
李欢[7]（2020）在《肿瘤坏死因子α上调朊蛋白的水平促进肿瘤细胞迁移的分子机制》文中研究表明肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNFα）是一种重要的前炎症因子,在免疫,炎症,细胞的增殖,分化和凋亡的过程中具有重要的意义,可以调节肿瘤微环境,但是炎症促进癌症细胞迁移和转移的具体机制尚不清楚。因此从细胞分子水平探究上述机理对于癌症的治疗具有重要意义。第一章为研究背景的介绍。我们首先对黑色素瘤和肺癌相关情况进行说明,其次阐述了炎症因子TNFα的功能以及与癌症发生发展的关系,随后介绍了细胞中主要存在的两种降解系统,最后阐述文中涉及的叉头型转录因子3（Forkhead box protein P3,FOXP3）,突触相关蛋白29（Synaptosomal-associated protein 29,SNAP29）,朊蛋白（prion protein,Pr P）等相关蛋白的结构,功能以及在癌症中的作用。第二章为论文的主要研究内容,在黑色素瘤细胞系M2以及肺腺癌细胞系A549中,加入TNFα刺激后,肿瘤细胞迁移加快,Pr P表达升高。但是在敲除或敲降Pr P的细胞系中,癌症细胞的迁移速度不变,此现象是可回补的,所以Pr P是炎症促进癌症细胞迁移的重要分子。同时在迁移加快的细胞中发现Pr P的表达升高。但是在TNFα刺激下,Pr P的转录水平并没有发生变化,所以TNFα很可能改变了细胞降解水平,在M2和A549细胞系中,Pr P的降解主要通过自噬途径,那么TNFα是否改变癌症细胞的降解途径导致Pr P的表达升高?在TNFα作用下,自噬标志性蛋白微管相关蛋白1A/1B轻链3B（Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3B）和死骨片蛋白1（Sequestosome-1,SQSTM1/P62）升高,说明自噬体和溶酶体的融合受到抑制,双荧光质粒m Cherry-GFP-LC3转染这两种肿瘤细胞,黄色点状明显增加,同时证明此结论。TNFα使得自噬体和溶酶体过程的关键性蛋白SNAP29降低,主要机制为抑制此蛋白的转录水平。在M2和A549细胞系中敲除或敲降SNAP29,TNFα刺激不改变癌症细胞的迁移速度。FOXP3是重要的转录因子,维持免疫系统的内环境稳态方面具有重要的作用。启动子结合实验证明FOXP3是SNAP29的潜在转录因子,TNFα刺激激活核转录因子kappa b（nuclear factor kappa B,NF-κb）信号,降低FOXP3的表达,使得SNAP29蛋白表达减少。依据上述结论本文得出TNFα刺激抑制自噬体与溶酶体的融合,增加Pr P的表达,促进癌症细胞的迁移,因此干扰下述信号途径:TNFα-NF-κb-FOXP3-SNAP29可能提供一种抑制肿瘤细胞迁移的有效方法。第三章是对论文内容的总结以及讨论,TNFα刺激肿瘤细胞降低FOXP3的表达,抑制Pr P的降解,加快肿瘤细胞的迁移,但TNFα调控FOXP3的具体机制以及Pr P如何调控癌症细胞迁移的机制有待进一步的探究。
钱学红[8]（2020）在《STYK1调控自噬复合体形成促进自噬发生》文中认为细胞自噬（autophagy）是细胞自我吞噬的过程,通过自噬体-溶酶体降解途径,清除胞内受损或衰老失活的蛋白质和细胞器等底物,以维持细胞内环境稳态。细胞自噬的调控过程高度复杂且精细,目前已鉴定41种自噬相关基因（ATG）参与调控过程。其中,有超过30多种自噬相关基因对于自噬小体的形成（自噬发生核心起始过程）至关重要,但是关于自噬起始过程的调控机制仍不十分清楚,尤其是以自噬特异性三类磷脂酰肌醇激酶复合物PtdIns3K-C1所介导的自噬小体形成。在本课题中,我们通过免疫印迹实验,检测自噬标志物LC3及自噬底物p62的蛋白表达水平,发现在Hep G2肺癌细胞系中特异性敲低或外源过表达酪氨酸蛋白激酶STYK1,自噬水平受到了抑制或促进。免疫荧光实验显示在敲低STYK1蛋白表达的Hep G2细胞系中,LC3蛋白的点状聚集物减少,自噬体与自噬溶酶体的形成受到抑制,并且在Hela细胞系中敲低STYK1蛋白表达水平,自噬泡形成受到明显的抑制。这些现象表明STYK1促进了细胞自噬过程。免疫共沉淀、GST-pull down结果表明,在Hela细胞系中STYK1蛋白结合PtdIns3K-C1复合物相关蛋白（ATG14-BECN1-PI3KC3-PIK3R4）,免疫荧光也显示在Hela细胞中,STYK1蛋白与ATG14-BECN1-PI3KC3-PIK3R4蛋白复合体及PtdIns3K-C1复合物下游关键效应因子ZFYVE1和WIPI1蛋白发生共定位,并且过表达STYK1蛋白会促进ATG14、ZFYVE1、WIPI1蛋白的点数量,证实STYK1蛋白定位在自噬体上并通过刺激自噬小体的形成促进自噬。最后我们还发现在Hela细胞系中过表达STYK1蛋白,增强蛋白PI3KC3与ATG14、BECN1之间的相互作用,抑制BECN1蛋白与自噬负调控因子RUBCN、BCl2之间的相互作用;而在Hela细胞系中敲低STYK1蛋白抑制PtdIns3P的活性,进一步证实STYK1蛋白通过特异性促进ATG14-BECN1-PI3KC3蛋白复合物的组装和PtdIns3P激酶活性进而促进自噬。综上所述,本研究揭示了受体酪氨酸激酶（RTKs）家族的成员STYK1蛋白（丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶1）作为自噬正调节因子,通过调节PtdIns3K-C1复合物的组装与功能,促进细胞自噬的发生,加深了对PI3K信号通路功能调控的认识,并从RTK信号调控角度为自噬诱导提供了新的思路。
曲骞[9]（2020）在《中医药干预常规治疗失败晚期结直肠癌队列研究及预后基因差异分析》文中进行了进一步梳理研究一 中医药干预406例常规治疗失败晚期结直肠癌前瞻性队列研究[目的]1.通过前瞻性队列研究对常规治疗失败晚期结直肠癌中医药治疗的临床疗效进行评价,对中医药在晚期结直肠癌治疗的作用和地位进行验证与论述。2.对中医药治疗获益的优势人群临床特征进行归纳,对影响生存的预后因素进行分析。[方法]本试验采用前瞻性、多中心、队列研究方法,在9家大型中医及西医诊疗中心同时展开,纳入常规治疗失败的晚期结直肠癌患者,入组时按患者治疗意愿将其分为中医组、中西医结合组和西医组3组队列。每3个月为1周期,将从患者入组开始随访直至患者死亡或研究终止。主要评价指标为患者总生存期（OS）,次要疗效评价指标为无进展生存期（PFS）。[结果]1.一般资料本次数据分析截止时间为2019年11月30日,共纳入分析406例患者,经统计最终形成队列为西医组139人,中西医结合组155人,中医组112人。中位随访时间:西医组19.67个月,中西医结合组20.47个月,中医组20.4个月。中西医结合组中位中药暴露时间为6.43个月,最长暴露时间为29.73个月。中医组中位中药暴露时间为3.73个月,最长暴露时间为33个月。在人口信息、及肿瘤基本情况三组基本均衡。2.生存分析2.1总体中位生存期分析总体中位生存期（mOS,median Overall Survival）,西医组的mOS为11.37个月,中西医结合组的mOS为14.03个月,中医组的mOS为6.33个月（P<0.001）中西医结合组vs西医组降低死亡风险约为26%（HR=0.74,95%CI 0.55-0.98,P=0.038）。中西医结合vs中医组,死亡风险降低约为49%（HR=0.51,95%CI 0.38-0.69,P<0.001）。西医组 vs 中医组,降低死亡风险约 47%（HR=1.47,95%CI 1.09-1.99,P=0.012）。2.2总体无进展生存期分析通过对总体无进展生存期（PFS,progression-free survival）进行分析发现,西医组的PFS为5.37个月,中西医结合组的PFS为5.8个月,中医组的PFS为5.03个月（P>0.05）,死亡风险的两两比较各组间也均未见明显统计学差异（/>0.05）。2.3中西医结合组与西医组亚组生存分析中西医结合组较西医组在女性、KPS评分≥80分、转移器官≥2处、KRAS突变、既往抗肿瘤治疗≥3线组显着延长OS（P<0.05）并降低死亡风险（P<0.05）。2.4西医组与中医组亚组生存分析西医组在男性、年龄≥65岁、右半结肠、确诊Ⅳ期时间<18个月、既往抗肿瘤治疗≤2线、转移器官数目≥2处、肝转移、KRAS突变、BRAF状态未知、既往接受靶向治疗、中医证型为脾肾两虚、瘀毒内阻证型的患者较中医组在OS上显着延长（P<0.05）,并且显着降低死亡风险（P<0.05）。2.5中西医结合组与中医组亚组生存分析中西医结合组在不论性别、年龄、左、右半结肠、确诊Ⅳ期时间长短、是否发生肝转移、既往是否接受靶向治疗均可较中医组显着延长生存时间（P<0.05）,并降低病人死亡风险（P<0.05）;对于KPS评分<80分、KRAS突变、BRAF野生及未知状态、既往抗肿瘤治疗≤2线、中药低暴露组、脾肾两虚证型亚组中能够显着延长OS及降低死亡风险（P<0.05）。2.6末次评价状态生存亚组分析进展的亚组生存分析中,中西医结合组较中医组显着延长生存（13.10个月vs6.87个月P=0.006）,而中西医结合组与西医组、中医组与西医组在对末次评价为进展的患者生存延长均不具有统计学意义（P>0.05）。不耐受的生存亚组分析显示,中西医结合组较中医组、西医组较中医组均显着延长生存（P<0.05）,但西医组与中西医结合组生存差异不具有统计学意义（P>0.05）。3.COX多因素回归分析3.1总体人群多因素分析结果肿瘤原发部位、KPS评分、既往靶向治疗为预后独立危险因素,右半结肠较左半结肠患者死亡风险增加约1.4倍,KPS评分<80分的死亡风险增加约1.96倍,既往未接受靶向治疗的患者死亡风险也会增加1.38倍;中医药暴露（HR=0.718,95%CI 0.535-0.962,P=0.0267）、西医抗肿瘤治疗（HR=0.55,95%CI 0.402-0.751,P<0.001）为独立的保护因素,可以降低患者死亡风险。3.2亚组人群多因素分析a.中西医结合组与西医组KPS<80分、既往抗肿瘤治疗线数≥3线为影响生存的独立危险因素;Ⅳ期确诊时间>18个月、中西医结合治疗为影响生存的独立保护因素。b.中西医结合组与中医组中西医结合组与中医组亚组人群多因素分析:KPS<80分、既往未进行靶向治疗是影响患者生存的独立危险因素,而接受中西医结合治疗、中医药暴露量是影响患者生存的独立保护因素。c.中医组与西医组KPS评分<80分、肿瘤原发部位为右半结肠及既往抗肿瘤治疗的线数≥3线都是独立的危险因素。4、生活质量评价a、FACT-C（V4.0）从患者入组后得分来看,中医组得分最低,中西医结合组最优、西医组次之,三组间差异具有统计学意义P=0.0003。1周期后试验结局指数,依然是中西医结合组占优势。b、中医症状分级量表中医症状改善有效率方面中西医结合组优势显着为24,70%,西医组为13%,中医组为 9.5%。[结论]1.三种治疗方式对于常规治疗失败晚期结直肠癌的PFS改善无显着性差异。2.三组在人口学信息、肿瘤原发部位、病理类型、分化程度等方面三组均基本一致的前提下,中西医结合治疗较西医治疗及中医治疗显着延长患者总体中位OS,并改善患者的生活质量。3.亚组分析中对于临床中疾病进程长、经过较多线治疗效果不佳、瘤体负荷重,基因状态预后不佳这些治疗难点的晚期结直肠癌患者,中西医结合治疗较单纯西医治疗仍然取得了较好的临床获益。4.单纯的中医治疗面对肿瘤负荷重、既往抗肿瘤治疗不规范的晚期患者在多个强烈预后不良的因素方面难以比肩西医治疗。化疗无法耐受的患者应该选择中西医结合的治疗方法,减毒增效,才能使生存预后最大的获益。5.总体预后因素中右半结肠、KPS评分<80分、既往未进行靶向治疗为预后独立危险因素,中医药暴露量、西医抗肿瘤治疗为预后独立保护因素,中西医结合治疗为亚组独立保护因素。研究二83例中医药干预常规治疗失败晚期结直肠癌ctDNA状态与预后相关性探索[目的]通过对中医药干预常规治疗失败晚期结直肠癌患者的ctDNA检测,对其突变基因状态及与预后相关性进行探索。[方法]纳入中医药干预连续3个月以上的常规治疗失败晚期结直肠癌患者,抽取外周血10ml。由临床检测中心提供的方案,进行外周血ctDNA肿瘤相关突变基因检测,定制的NGS检测面板覆盖416个肿瘤相关基因。[结果]1.一般资料共纳入了来自4家中心共83例患者,其中年龄≥65岁者29人（34.94%）,<65岁有54人(65.05%,男性48人（57.83%）,女性35人（42.17%）。中医组37例,中西医结合组46例。2.外周血细胞肿瘤基因突变情况在83例患者中,有54例（65.06%）血浆中检测出肿瘤相关突变基因,共152个基因419个突变位点,有29例（34.94%）未检测出肿瘤相关突变,根据突变频率筛选出TOP20 的基因为 APC、TP53、KRAS、PIK3CA、FBXW7、SMAD4、LRP1B、PTPN13、EGFR、CTNNB1、ROS1、PKHD1、EPHA3、SMARCA4、FAT1、HDAC9、PREX2、NOTCH1、SMAD3、SF3B1。另外有6例患者存在胚系基因突变,分别为APC（46.49%）、RAD51C（42.93%）、PDE11A、ABCB1、TTF1,其中APC、RAD51C为已知的致病性基因。3.突变基因的生物信息学分析突变基因蛋白质互作的功能集中在蛋白质自磷酸化、FLT3信号、白细胞介素信号、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰、DNA完整性检查点、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、细胞对有毒物质的反应以及蛋白激酶B信号转导通路生物过程及通路上。4.ctDNA突变与预后关系ctDNA高突变组预后优于低突变组（17.47个月vs8.57个月,P=0.033）。受试者的肿瘤组织的突变负荷（tumor mutational burden,TMB）高低两组在中位OS上存在显着差异（16.63个月vs10.00个月P=0.007）,KRAS状态显着影响患者预后,突变型更差（8.57个月vs16.63个月P=0.047）,同样突变型的PIK3CA患者生存要显着缩短（6.97个月vs15.80个月P=0.045）。本次研究APC、TP53的基因状态未发现与预后的显着相关性（P>0.05）。5.基因突变与临床因素分析在ctDNA等位基因突变频率与临床因素亚组分析中是否存在肝转移（P=0.014）,以及中医证型存在显着相关性（P=0.037）;肿瘤突变负荷TMB与临床因素的亚组分析中是否存在肝转移（P=0.007）、肺转移（P=0.049）、中医证型（P=0.012）、八纲辨证（P=0.044）与之存在显着相关性。KRAS突变与肝转移、淋巴结转移存在显着相关性（P<0.05）;PIK3CA基因突变与年龄、淋巴结转移存在显着相关性（P<0.05）。TP53基因突变与肝转移、中医证型脾肾两虚型显着相关（P<0.05）,而APC基因突变情况未找到与之显着相关的临床因素。[结论]1.酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶等蛋白酶相关生物途径及通路可能与晚期结直肠癌常规治疗失败的不良预后相关机制关联,需要后期进行相关机制研究加以验证。2.中医药治疗常规治疗失败后晚期结直癌患者ctDNA突变频率、TMB、KRAS、PIK3CA基因与预后相关,肝转移与基因不良突变相关。3.中医药健脾补肾治疗对降低ctDNA突变频率、减少抑癌基因突变存在相关性;八纲辨证为阴证的患者TMB负荷较低,可能难以从免疫治疗中获益。研究三常规治疗失败晚期结直肠癌疗效差异表达基因的生信分析[目的]对常规治疗失败晚期结直肠癌疗效差异机制进行研究,探索可能的对预后有影响的分子靶标及相关的通路,将对其临床治疗提供可能的新思路、新角度。[方法]本研究筛选常规治疗失败的晚期结直肠癌对比常规治疗病灶完全缓解的疗效差异基因,GO（Gene Ontology 基因本体论）分析和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因组百科全书）分析是在筛选的差异基因上进行,功能集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）是利用样本所有基因更全面的分析基因的功能及生物过程,利用蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction,PPI）网络筛选出关键的Hub基因。并分析Hub基因与结直肠癌预后的关系,以期对晚期结直肠癌常规治疗失败的疗效差异机制进行初步探索。[结果]1.一般资料检索GEO公共基因数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）,获得GSE72970数据集,其中包含12个常规治疗失败的晚期结直肠癌样本,和7个常规治疗完全缓解的晚期结直肠癌样本的基因数据。2.常规治疗失败晚期结直肠癌的疗效DEGs利用GE02R平台在线工具筛选GSE72970数据集中常规治疗失败晚期结直肠癌对比完全缓解的DEGs。筛选结果:常规治疗失败CRC对比完全缓解基因样本共获得323个DEGs,其中上调的有97个,下调的有226个。3.疗效DEGs的GO分析和KEGG分析对常规治疗失败mCRC对比完全缓解的mCRC的DEGs进行GO分析与KEGG分析。3.1 GO分析结果:DEGs富集到的Top6的细胞学组件（Cellular component CC）有:内质网、突触前活动区、染色质可及性复合体、Epsilon DNA聚合酶复合物、RNA聚合酶I转录因子复合物、染色质周围纤维。DEGs富集到的Top6的分子功能（Molecular function MF）有:蛋白酶抑制剂活性、分子功能未知、硫转移酶活性、半乳糖基转移酶活性、抗原结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性。DEGs富集到的Top6生物学过程（Biological process BP）有:新陈代谢、能量途径、未知的生物过程、细胞凋亡、细胞周期调控、神经递质转运。3.2 KEGG分析结果:DEGs显着富集到的Top6生物途径有:有丝分裂前中期、鸟苷核苷酸从头生物合成、M相、着丝粒处新的含CENPA核小体的沉积、核小体组装、有丝分裂M-M/G1期。4.GSEA分析富集到的Top6的功能集:伴侣蛋白介导的自噬作用、儿茶酚胺代谢过程、T细胞介导的细胞毒性调控、选择胸腺内T细胞、共转录蛋白对膜的靶向作用、抗原受体介导的信号通路的阳性调控。5.PPI网络的构建及Hub基因筛选筛选到的疗效DEGs被借助STRING工具用于构建PPI网络,并使用Cytoscape的cyto Hubba 插件筛选 Top20Hub 基因,它们分别是:SPC25、CENPH、CENPK、SPDL1、CENPQ、PPP2CA、DSN1、KIF14、CDC6、UBE2V2、CDC23、HACE1、SMURF2、KBTBD6、KBTBD7、TRIP13、SHCBP1、CLCA1、NIP7、CLCA4。6.Hub基因预后分析利用GEPIA网站分析Hub基因对化疗失败mCRC的预后的影响。结果发现CLCA1基因表达量与患者OS相关（P=0.012）,CLCA1高表达患者生存预后优于低表达。同时CLCA1（P=0.041）、TRIP13（P=0.038）基因的表达量与CRC患者的DFS密切相关。[结论]1.富集到的蛋白酶作用包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PKB/AKT）、酪氨酸激酶在内的相关通路,细胞凋亡自噬、细胞周期调控、蛋白转录修饰、靶基因PIK3CA、TP53,P53路径激活等生物过程与第二部分外周血ctDNA突变基因富集通路与生物过程相吻合,常规治疗失败难治性结直肠癌的相关通路机制探索得到初步验证。2.CLCA1、TRIP13的表达量与晚期结直肠癌预后相关,今后可能为潜在的预后生物标志物。
刘利艳[10]（2020）在《坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究采用细胞生物学试验观察、网络药理学分析寻找、细胞蛋白质组学筛选、蛋白印迹法检测和整体动物试验验证,探寻巴西甘菊花中抗结肠癌作用的活性单体成分及其作用机制。方法:①MTT法探寻巴西甘菊花中抗结肠癌活性单体成分:巴西甘菊花经化学提取、分离和纯化研究,获得6个含量较多的单体成分,采用MTT法观察单体成分对结肠癌细胞HT-29增殖情况,获取具有抗结肠癌活性的单体作为研究对象。②细胞生物学试验观察确定坡模酸（PA）及其吡喃葡萄糖酯（PAO）的抗结肠癌作用:采用MTT法检测PA抗HT-29细胞增殖情况,倒置显微镜下观察细胞形态变化,细胞计数仪直接读取HT-29细胞存活率;采用Honest 33342染色、AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI流式细胞术观察细胞凋亡情况,PI单染流式细胞术测定细胞周期变化;采用划痕试验观察HT-29细胞迁移情况。③网络药理学分析寻找PA和PAO的作用靶点:利用大数据平台收集PA和PAO潜在作用的靶点以及筛选结肠癌疾病靶点,并将两者预测靶点进行交集,建立预测靶点蛋白相互作用网络;采用富集分析得到靶点生物学功能以及涉及通路情况,最后将PA和PAO分子与核心靶点进行对接来初步确定寻找到的作用靶点。④细胞蛋白质组学探讨PA和PAO可能作用靶点:通过细胞蛋白提取、烷基化、酶解、脱盐、LC-MS上样和差异蛋白初筛等处理,得到差异蛋白,并对差异蛋白进行生物学功能分析和通路分析,最后筛选出与癌症、细胞凋亡和周期相关的差异蛋白。⑤蛋白印迹法检测验证:综合上述体外细胞实验、网络药理学以及蛋白质组学试验结果,采用蛋白印迹法检测PA和PAO对蛋白Bax、Bc12、Caspase 3、Jak1、Stat3、p-stat3和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的蛋白相对表达量。⑥整体动物试验验证:采用结肠癌HT-29细胞混悬液皮下注射裸鼠右前肢成瘤作为瘤源,取第二代瘤源进行瘤块接种从而构建异种异位移植瘤模型,第二代肿块接种后第三天开始灌胃给药,每天一次,连续给药21天后,颈椎脱臼处死动物,测定肿瘤体积和肿瘤重量,取肿瘤组织、肝脏组织HE染色,观察其病理变化情况。结果:①从巴西甘菊花分离出的单体成分坡模酸、1-（2-甲基丁酮）-3-异戊烯-间苯三酚、熊果酸和槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷在实验浓度下对HT-29细胞增殖有抑制作用,其中PA抗结肠癌细胞增殖作用最强。②PA和PAO均能呈时间-剂量依赖性抑制HT-29细胞增殖;与对照组相比,给药组HT-29细胞密度更稀疏,排列不紧凑,细胞体型更细长;PA组细胞存活率显着降低;PA和PAO均能显着促进HT-29细胞凋亡,并使HT-29细胞大量阻滞于G0/G1期;均能显着降低细胞迁移率。③网络药理学分析显示PA和PAO的核心靶点分别为ERBB2、PPARG、PTGS2和TNF;MAPK3、STAT3和MTOR,进一步经对接结果显示,PA能与ERBB2、PTGS2、TNF稳定结合;PAO与MAPK3和STAT3稳定结合。初步说明ERBB2、PPARG、PTGS2和TNF;MAPK3、STAT3分别为上述物质作用靶点。④蛋白质组学研究显示PA和PAO作用HT-29细胞后,PA共得到1 1个差异蛋白,其中上调蛋白6个,下调蛋白5个。PAO组得到13个差异蛋白,其中上调蛋白为1个,下调蛋白为12个。两者表达一致的蛋白共有5个,分别为GSTP1、MCM7、mTOR、TAB2和XPO1。这些靶点分别涉及mTOR、自噬相关、细胞周期等信号通路。⑤蛋白印迹实验显示,PA能升高Bax/Bcl2比值,上调Caspase3、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和p62蛋白相对表达量;对蛋白Jak1表达量无影响,下调Stat3蛋白表达,但无统计学差异,下调p-stat3蛋白相对表达量。PAO亦能升高Bax/Bcl2比值,上调p62蛋白相对表达量;上调Jak1蛋白表达量,下调Stat3、p-stat3蛋白相对表达量。⑥整体动物实验显示,PA和PAO组能显着抑制移植瘤的体积和重量,但不影响瘤重指数和脾脏指数;HE染色显示PA和PAO组肿瘤组织核分裂更不活跃,且存在较多的坏死、肉芽组织和纤维化等炎性改变,但这些病理学结果均无统计学差异。肝组织病理显示均未见模型组和受试药组发生肿瘤肝转移。结论:PA为巴西甘菊花中抗结肠癌细胞增殖的最强的单体成分之一,其抗结肠癌的作用机制可能与上调Bax/Bcl2、Caspase 3的蛋白相对表达量,导致细胞凋亡;上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和p62蛋白相对表达量,促进自噬的发生从而导致细胞死亡有关;PAO抗结肠癌的作用机制与增加Bax/Bcl2、下调Stat3蛋白相对表达量有关。
二、酪氨酸激酶Jak3与核小体组装蛋白Nap1的相互作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、酪氨酸激酶Jak3与核小体组装蛋白Nap1的相互作用（论文提纲范文）
（1）锌指蛋白70在结肠炎相关结直肠癌发生发展及铃兰毒苷抗结直肠癌作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 锌指蛋白70通过调控THP-1巨噬细胞中NLRP3炎性小体和STAT3激活并促进炎症相关结直肠癌发生发展 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要使用仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 过表达质粒和Si-RNA转染 |
| 2.3.3 ELISA技术(酶联免疫吸附测定) |
| 2.3.4 蛋白免疫印记实验 |
| 2.3.5 免疫荧光实验 |
| 2.3.6 RT-PCR实验 |
| 2.3.7 免疫共沉淀实验 |
| 2.3.8 Duolink PLA技术 |
| 2.3.9 EdU实验 |
| 2.3.10 细胞集落形成实验 |
| 2.3.11 AAV9-GFP的构建和尾静脉注射 |
| 2.3.12 AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型 |
| 2.3.13 免疫组织化学实验 |
| 2.3.14 统计学分析方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 ZNF70在LPS/ATP诱导的THP-1细胞中上调Pro-IL-1β和成熟IL-1β的表达 |
| 2.4.2 ZNF70在LPS/ATP诱导的THP-1细胞中促进NLRP3炎性小体成分的表达 |
| 2.4.3 ZNF70通过NLRP3炎性小体促进LPS和ATP诱导的THP-1细胞IL-1β分泌 |
| 2.4.4 ZNF70在LPS/ATP诱导的THP-1细胞中促进NLRP3炎性小体复合物的装配 |
| 2.4.5 ZNF70与NLRP3相互作用 |
| 2.4.6 ZNF70促进NLRP3上连接的K48去泛素化 |
| 2.4.7 ZNF70在LPS和ATP诱导的THP-1细胞中通过激活STAT3促进pro-IL-1β的合成 |
| 2.4.8 ZNF70在L+A-MΦCM条件培养基培养的HCT116细胞中促进STAT3激活 |
| 2.4.9 ZNF70在L+A-MΦCM条件培养基培养的HCT116细胞中通过介导STAT3的激活促进细胞增殖 |
| 2.4.10 ZNF70敲低可改善AOM/DSS诱导的炎症相关结直肠癌模型 |
| 2.4.11 AAV介导的ZNF70敲低可抑制AOM/DSS小鼠NLRP3炎性小体和STAT3的激活 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 铃兰毒苷通过调控结直肠癌中JAK2/STAT3(T705)和mTOR/STAT3(S727)信号通路之间的串扰促进HCT116细胞凋亡并抑制增殖和血管生成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 荧光素酶报告基因实验 |
| 3.3.3 MTT实验 |
| 3.3.4 蛋白免疫印迹实验 |
| 3.3.5 RT-PCR实验 |
| 3.3.6 免疫荧光实验 |
| 3.3.7 EdU实验 |
| 3.3.8 细胞凋亡实验 |
| 3.3.9 细胞周期实验 |
| 3.3.10 集落形成实验 |
| 3.3.11 小管形成实验 |
| 3.3.12 侵袭实验 |
| 3.3.13 划痕实验 |
| 3.3.14 分子对接实验 |
| 3.3.15 裸鼠异种移植瘤实验 |
| 3.3.16 免疫组织化学实验 |
| 3.3.17 Si-RNA转染 |
| 3.3.18 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 铃兰毒苷抑制结直肠癌细胞的存活率 |
| 3.4.2 铃兰毒苷抑制STAT3的激活 |
| 3.4.3 铃兰毒苷抑制JAK1,JAK2和Src的激活 |
| 3.4.4 铃兰毒苷抑制PI3K/AKT/mTOR/STAT3信号通路 |
| 3.4.5 铃兰毒苷通过干扰JAK2和mTOR之间的串扰抑制STAT3激活 |
| 3.4.6 铃兰毒苷抑制STAT3调控的下游靶基因的表达 |
| 3.4.7 铃兰毒苷抑制HCT116细胞增殖 |
| 3.4.8 铃兰毒苷促进HCT116细胞凋亡 |
| 3.4.9 铃兰毒苷抑制内皮细胞的血管生成 |
| 3.4.10 铃兰毒苷抑制人结肠癌细胞HCT116裸鼠异种移植瘤的生长 |
| 3.4.11 铃兰毒苷抑制人结肠癌细胞HCT116裸鼠异种移植瘤组织中STAT3及STAT3相关基因的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (在读期间发表论文目录) |
（2）维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 维生素C性质及其生物学功能的研究进展 |
| 1.1.1 维生素C的发现、生物合成及利用 |
| 1.1.2 维生素C的运输及机体稳态调节 |
| 1.1.3 维生素C的抗氧化性 |
| 1.1.4 维生素C是二价铁离子和α-氧戊二酸盐依赖性双加氧酶家族蛋白的关键辅因子 |
| 1.1.5 维生素C促进细胞重编程 |
| 1.1.6 维生素C是一个低甲基化诱导因子 |
| 1.1.7 维生素C的潜在抗癌机制 |
| 1.1.8 维生素C与其他疾病的关系及潜在治疗作用 |
| 1.1.9 维生素C在调控细胞信号通路方面的初探索 |
| 1.1.10 维生素C已知的生物学功能具有两面性 |
| 1.2 钠离子依赖型维生素C转运蛋白SVCTs的研究进展 |
| 1.2.1 SVCTs的结构、定位和运输作用 |
| 1.2.2 SVCT1和SVCT2 表达和功能的调控 |
| 1.2.3 SVCT2 在调控细胞分化和细胞功能成熟中的作用 |
| 1.3 非受体型酪氨酸激酶JAK2 的研究进展 |
| 1.3.1 JAK激酶家族蛋白的结构和功能简介 |
| 1.3.2 JAK2 激酶活性的调控 |
| 1.3.3 非经典细胞核内JAK2 信号转导途径研究进展 |
| 第二章 维生素C转运蛋白SVCT2 受体功能的探究 |
| 2.1 材料、试剂与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 2.1.6 细胞培养 |
| 2.1.7 真核表达载体构建 |
| 2.1.8 细胞转染 |
| 2.1.9 免疫印迹 |
| 2.1.10 蛋白质免疫(共)沉淀(Immunoprecipitation (IP)/co-Immunoprecipitation (co-IP)) |
| 2.1.11 总RNA提取、反转录和实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR) |
| 2.1.12 双荧光素酶报告实验(Dual Luciferase Reporter Assay,DLR) |
| 2.1.13 细胞内VitC含量测定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SVCT2 响应VitC处理特异性激活JAK2和STAT2 |
| 2.2.2 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导与JAK2 的互作 |
| 2.2.3 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导对JAK2 的磷酸化激活 |
| 2.2.4 VitC对 JAK2 的激活与VitC的胞内积累无关且呈现振荡性 |
| 2.2.5 VitC诱导SVCT2 Tyr~(626)发生磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.6 SVCT2 Tyr626的磷酸化介导对 STAT2 的招募 |
| 2.2.7 SVCT2 响应VitC处理增强STAT2 的转录因子活性 |
| 2.2.8 SVCT2对JAK2 的激活依赖对VitC的运输 |
| 2.2.9 SVCT2对VitC的充分运输依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.10 DHA和 GLUT1/3 不能激活JAK2/STAT2 信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 VitC激活的JAK2 信号途径调节细胞内ROS的水平 |
| 3.1 材料、试剂与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与耗材 |
| 3.1.4 主要试剂配方 |
| 3.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 3.1.6 细胞培养 |
| 3.1.7 细胞转染 |
| 3.1.8 免疫印迹 |
| 3.1.9 细胞内ROS含量测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VitC对 JAK2 的激活与对 ROS的抑制无关 |
| 3.2.2 VitC抑制ROS的水平且部分依赖JAK2 的激活 |
| 3.2.3 激活JAK2 有助于SVCT2对ROS的抑制 |
| 3.2.4 VitC诱导PDHK1和PDHA1 的磷酸化且依赖JAK2 的活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞表观调控 |
| 4.1 材料、试剂与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与耗材 |
| 4.1.4 主要试剂配方 |
| 4.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 4.1.6 细胞培养 |
| 4.1.7 真核表达载体构建 |
| 4.1.8 细胞转染 |
| 4.1.9 免疫印迹 |
| 4.1.10 IP/co-IP |
| 4.1.11 5mC和5hmC免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)实验 |
| 4.1.12 点杂交(dot blot,DB)实验 |
| 4.1.13 微球菌核酸酶消化实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 VitC诱导F9 细胞基因组5hm C的积累且部分依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.2 VitC激活的JAK2 催化 TET3 Tyr~(1375)发生磷酸化 |
| 4.2.3 Tyr~(1375)的磷酸化提高TET3 的酶活性 |
| 4.2.4 VitC诱导组蛋白H3 Tyr~(41)的磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.5 VitC提高F9 细胞DNA的可接近性且依赖JAK2 的激活 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞多能性和分化调控 |
| 5.1 材料、试剂与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与耗材 |
| 5.1.4 主要试剂配方 |
| 5.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 5.1.6 细胞培养 |
| 5.1.7 细胞转染 |
| 5.1.8 免疫印迹 |
| 5.1.9 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色实验 |
| 5.1.10 总RNA提取、反转录和RT-q PCR |
| 5.1.11 表达谱m RNA测序及数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 VitC和 JAK2 抑制剂处理下F9 细胞表达谱m RNA测序分析 |
| 5.2.2 VitC在 JAK2 活性抑制的条件下促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.3 激活JAK2 不利于VitC促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.4 VitC诱导多能性相关基因Nanog、Esrrb、Prdm14和Prdm16 的表达且依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.5 VitC诱导神经成熟相关基因的表达且严格依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.6 VitC激活的JAK2 分别通过依赖 STAT2 和不依赖 STAT2 的途径诱导多能性相关基因和分化相关基因的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 研究有待改进之处 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 扶正固卫、肺主皮毛理论与慢性阻塞性肺疾病呼吸道损伤修复 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蛋白质组学在中医药中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 固本止咳中药对COPD模型小鼠的治疗作用和调控呼吸道损伤修复作用研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制的整体研究 |
| 前言 |
| 实验一 基于质谱技术的固本止咳中药成分分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 基于蛋白组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠损伤修复机制研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 基于JAK-STAT信号通路的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 文献综述 炎症、肿瘤和免疫: 微环境中的密切交流 |
| 一、肿瘤中炎症的类型 |
| 二、炎症与肿瘤的发生发展 |
| 三、炎症反应的关键信号通路与肿瘤 |
| 四、炎症和肿瘤免疫 |
| 五、靶向炎症反应和肿瘤治疗 |
| 六、总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论着 |
（5）TCGA和ACRG分型在河北省胃癌人群中应用价值的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 ACRG分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TCGA分型在河北省胃癌人群中的临床特征及预后意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ACRG亚型MSI和EMT存在预后差异的分子机制探索 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TCGA和ACRG相关检测指标在胃癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）蛋白质组和转录组联合分析探索内嗅皮层参与阿尔茨海默病的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照与缩略词表 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验方法与材料 |
| 2.1 试剂材料 |
| 2.2 主要溶液配方 |
| 2.3 脑组织取材 |
| 2.4 认知功能评价 |
| 2.5 免疫组化实验 |
| 2.6 Garvey(改良Bielschowsky)银染 |
| 2.7 AD神经病理学诊断-ABC评分 |
| 2.8 蛋白质组学实验 |
| 2.9 siRNA的转染 |
| 2.10 细胞增殖实验 |
| 2.11 Western blot |
| 2.12 RNA的提取及实时荧光定量PCR |
| 2.13 RNA测序 |
| 2.14 统计 |
| 3. 结果 |
| 3.1 课题构思和实验设计 |
| 3.2 转录组学数据分析 |
| 3.2.1 数据预处理 |
| 3.2.2 差异表达基因筛选 |
| 3.2.3 差异表达基因中特异性细胞类型的分析 |
| 3.2.4 差异表达基因的GO功能富集分析 |
| 3.3 蛋白质组学数据分析 |
| 3.3.1 差异表达蛋白的筛选 |
| 3.3.2 差异表达蛋白中细胞特异性标志物的分析 |
| 3.3.3 差异表达蛋白中特异性细胞类型的分析 |
| 3.3.4 差异表达蛋白GO功能富集分析 |
| 3.4 转录组学和蛋白质组学数据的综合分析 |
| 3.4.1 转录组和蛋白质组学数据的相关性分析 |
| 3.4.2 转录组和蛋白质组学数据的筛选 |
| 3.4.3 转录组和蛋白质组学数据的GO功能富集分析 |
| 3.5 验证组学结果 |
| 3.5.1 IHC验证组学实验结果 |
| 3.5.2 Label Free技术方法验证组学实验结果 |
| 3.6 Hub基因与AD病理改变的关系 |
| 3.6.1 Hub基因的蛋白表达量与AD病理改变的关系 |
| 3.6.2 Hub基因mRNA表达量与AD病理改变的关系 |
| 3.6.3 Hub基因mRNA表达量与其蛋白表达水平间的关系 |
| 3.6.4 Hub基因的logistic回归分析 |
| 3.7 在N2aAPP细胞系上验证Ap对Hub基因的影响 |
| 3.8 Hub基因CACNG3在AD中作用机制的研究 |
| 3.8.1 Ap对CACNG3表达的影响 |
| 3.8.2 CACNG3基因的功能研究 |
| 3.8.2.1 CACNG3对SH-SY5Y细胞中突触可塑性相关基因表达的影响 |
| 3.8.2.2 CACNG3对SH-SY5Y细胞中AD病理相关蛋白的影响 |
| 3.8.2.3 在N2a细胞中验证CACNG3对细胞基因表达的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 突触功能障碍在阿尔茨海默病发生发展中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）肿瘤坏死因子α上调朊蛋白的水平促进肿瘤细胞迁移的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 黑色素瘤概述 |
| 1.2 肺癌概述 |
| 1.3 炎症因子TNFα概述 |
| 1.3.1 炎症简介 |
| 1.3.2 TNFα的信号转导 |
| 1.3.3 TNFR1信号 |
| 1.3.4 TNFR2信号 |
| 1.3.5 TNFα与癌症的关系 |
| 1.4 细胞中的蛋白降解体系 |
| 1.4.1 自噬分类与分子机制 |
| 1.4.2 泛素蛋白酶体系统的组成以及分子机制 |
| 1.4.3 自噬信号通路 |
| 1.4.4 自噬与癌症治疗 |
| 1.4.5 TNFα与自噬的关系 |
| 1.5 SNAP29的结构与功能 |
| 1.6 FOXP3的结构、表达调控以及功能 |
| 1.7 细胞型朊蛋白的概述 |
| 1.7.1 细胞型朊蛋白结构 |
| 1.7.2 PrP在癌症细胞中的生理功能 |
| 1.7.3 PrP的降解途径 |
| 1.8 细胞迁移 |
| 1.8.1 细胞骨架动力学 |
| 1.8.2 细胞迁移的调控因子 |
| 第二章 TNFα抑制SNAP29依赖的自噬溶酶体的形成增加朊蛋白的表达促进癌症细胞的迁移 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒和抗体 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 培养基配方 |
| 2.1.4 试剂及配方 |
| 2.1.5 重组质粒构建及试剂 |
| 2.1.6 细胞实验试剂制备 |
| 2.1.7 免疫印迹实验试剂 |
| 2.1.8 免疫荧光试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 RNA提取,反转录以及QPCR实验 |
| 2.2.3 稳定表达细胞株构建 |
| 2.2.4 蛋白质表达检测 |
| 2.2.5 数据统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 敲降PRNP影响癌细胞迁移 |
| 2.3.2 TNFα刺激增加肿瘤细胞的迁移速度与侵袭能力并且依赖于Pr P的表达 |
| 2.3.3 TNFα刺激增加肿瘤细胞PrP的表达,但是不改变Pr P的 m RNA水平。 |
| 2.3.4 TNFα激活NF-κb信号通路增加PrP的表达。 |
| 2.3.5 TNFα抑制肿瘤细胞中自噬溶酶体的形成。 |
| 2.3.6 TNFα刺激肿瘤细胞降低SNAP29蛋白的表达。 |
| 2.3.7 在肿瘤细胞中,敲除 SNAP29,影响自噬体与溶酶体的融合,增加细胞的迁移速度 |
| 2.3.8 TNFα刺激降低FOXP3的表达,增加肿瘤细胞的迁移能力。 |
| 第三章 结论与讨论 |
| 3.1 本文结论 |
| 3.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩写表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）STYK1调控自噬复合体形成促进自噬发生（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 细胞自噬通路 |
| 1.1.1 细胞自噬的分类 |
| 1.1.2 细胞自噬的过程与分子机制 |
| 1.1.2.1 细胞自噬的基本形成过程 |
| 1.1.2.2 细胞自噬的分子机制 |
| 1.1.3 自噬过程的蛋白修饰调控 |
| 1.1.4 细胞自噬的生理功能 |
| 1.2 酪氨酸激酶蛋白与功能 |
| 1.2.1 受体型酪氨酸激酶(RTKs)与非受体型酪氨酸激酶(NRTKs) |
| 1.2.1.1 受体型酪氨酸激酶(RTKs) |
| 1.2.1.2 非受体型酪氨酸激酶(NRTKs) |
| 1.2.2 酪氨酸激酶受体信号转导途径在肿瘤中的意义 |
| 1.2.3 作用于酪氨酸激酶信号转导途径的抗肿瘤药物 |
| 1.3 STYK1酪氨酸蛋白激酶研究进展 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用细胞 |
| 2.1.2 实验用菌株 |
| 2.1.3 实验用质粒 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 主要试剂和药品 |
| 2.1.6 抗体(一抗)以及使用浓度 |
| 2.1.7 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的构建 |
| 2.2.1.1 质粒的转化及提取 |
| 2.2.1.2 重组质粒的构建 |
| 2.2.1.3 突变质粒的构建 |
| 2.2.2 细胞培养方法 |
| 2.2.2.1 细胞培养及准备工作 |
| 2.2.2.2 细胞复苏 |
| 2.2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.3 质粒瞬时转染和荧光观察检测转染效率 |
| 2.2.4 RNAi实验 |
| 2.2.5 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.5.1 Western Blot实验 |
| 2.2.5.2 蛋白样品制备 |
| 2.2.5.3 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.6 免疫沉淀 |
| 2.2.6.1 免疫沉淀(IP)蛋白样品制备 |
| 2.2.6.2 免疫共沉淀Co-IP(Co-Immunoprecipitation) |
| 2.2.7 GST融合蛋白的诱导表达、纯化以及GST pull-down |
| 2.2.7.1 GST融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2.7.2 GST融合蛋白的纯化 |
| 2.2.7.3 GST pull-down实验 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 第3章 实验结果与讨论 |
| 3.1 STYK1蛋白促进细胞自噬过程 |
| 3.1.1 STYK1 蛋白促进LC3 蛋白的酯酰化 |
| 3.1.2 STYK1蛋白促进自噬体的形成 |
| 3.1.3 本节小结 |
| 3.2 STYK1蛋白共定位于自噬体 |
| 3.2.1 STYK1 蛋白不影响PtdIns3K-C1 复合物相关蛋白表达水平 |
| 3.2.2 STYK1蛋白定位于自噬体 |
| 3.2.3 本节小结 |
| 3.3 STYK1 蛋白结合ATG14-BECN1-PI3KC3 复合物并促进其组装及功能 |
| 3.3.1 STYK1 蛋白结合 ATG14-BECN1-PIK3C3 并与其发生共定位 |
| 3.3.2 STYK1 蛋白促进PtdIns3K-C1 复合物组装 |
| 3.3.3 本节小结 |
| 第4章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及研究成果 |
（9）中医药干预常规治疗失败晚期结直肠癌队列研究及预后基因差异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 常规治疗失败后晚期结直肠癌的选择与前景 |
| 1. 化疗进展 |
| 2. 靶向治疗 |
| 3. 免疫治疗 |
| 4. 其他免疫治疗方法 |
| 综述二 中医药治疗晚期结直肠癌的临床研究现状 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 小结 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 中医药干预406例常规治疗失败晚期结直肠癌前瞻性队列研究 |
| 1. 资料及方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 生存分析 |
| 2.3 Cox多因素回归分析 |
| 2.4 生活质量评价 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 生存分析 |
| 3.2 Cox回归分析预后因素探讨 |
| 3.3 生活质量改善分析 |
| 3.4 中医药治疗晚期结直肠癌的优势与思考 |
| 3.5 脾肾两虚证型、瘀毒内阻证型预后的探讨 |
| 第三部分 83例中医药干预常规治疗失败晚期结直肠癌ctDNA状态与预后相关性探索 |
| 1. 资料及方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 外周血细胞肿瘤基因突变情况 |
| 2.3 突变基因的生物信息学分析 |
| 2.4 ctDNA突变基因与预后相关性分析 |
| 2.5 基因突变与临床因素的关系 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 中医药干预常规治疗失败后晚期结直肠癌常见突变基因 |
| 3.2 突变基因蛋白作用生物过程及通路分析 |
| 3.3 ctDNA突变频率与预后的关系 |
| 3.4 肿瘤突变负荷(TMB)与预后的关系 |
| 3.5 ctDNA突变基因的分布特征及与预后的关系 |
| 3.6 基于中医理论探讨证型、八纲辨证与ctDNA的关系 |
| 4. 结论 |
| 第四部分 常规治疗失败晚期直肠癌疗效差异表达基因的生信分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 微矩阵数据的获取 |
| 1.2 差异基因(DEGs)的筛选 |
| 1.3 GO分析与KEGG分析 |
| 1.4 功能集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis GSEA) |
| 1.5 PPI(Protein-protein Interaction)网络的构建和Hub基因的筛选 |
| 1.6 Hub基因生存分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 常规治疗失败晚期结直肠癌的疗效DEGs |
| 2.2 DEGs的GO分析和KEGG分析 |
| 2.3 GSEA分析 |
| 2.4 PPI网络的构建及Hub基因筛选 |
| 2.5 生存分析结果 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 基因富集分析 |
| 3.2 PPI网络的构建、Hub基因的筛选及其临床意义 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（10）坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 注释表 |
| 引言 |
| 第1章 坡模酸的获取及抗结肠癌活性探讨 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂与耗材 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 细胞系 |
| 1.1.4 受试药 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 巴西甘菊花单体成分的获取 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 巴西甘菊花单体成分(L1-L6)抗结肠癌活性筛选 |
| 1.2.4 坡模酸的获取 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 巴西甘菊花单体成分的获取 |
| 1.3.2 巴西甘菊花单体成分(L1-L6)抗结肠癌活性筛选 |
| 1.3.3 坡模酸的获取 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 坡模酸及其吡喃葡萄糖酯对结肠癌HT-29细胞的作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂与耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 细胞系 |
| 2.1.4 受试药 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT法测定HT-29细胞活力 |
| 2.2.3 细胞存活率测定 |
| 2.2.4 细胞形态的观察 |
| 2.2.5 Hoechst 33342染色测定细胞凋亡 |
| 2.2.6 吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色测定细胞凋亡 |
| 2.2.7 AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 PI单染测定对HT-29周期的影响 |
| 2.2.9 细胞迁移(划痕)实验 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 对HT-29细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 细胞存活率的测定 |
| 2.3.3 细胞形态的观察 |
| 2.3.4 Hoechst 33342染色测定细胞凋亡 |
| 2.3.5 吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色测定细胞凋亡 |
| 2.3.6 AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞凋亡分析 |
| 2.3.7 PI单染测定细胞周期的变化 |
| 2.3.8 细胞划痕实验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 基于网络药理学和分子对接技术探索坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 数据库 |
| 3.1.2 软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 坡模酸、坡模酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯潜在作用靶点收集 |
| 3.2.2 疾病靶点的筛选 |
| 3.2.3 药物成分-预测靶点网络的构建 |
| 3.2.4 PPI网络的建立 |
| 3.2.5 结肠癌靶点生物学功能分析和通路分析 |
| 3.2.6 活性成分与关键靶点的分子对接验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 药物和疾病靶点筛选 |
| 3.3.2 药物成分-预测靶点网络的构建 |
| 3.3.3 PPI网络的建立 |
| 3.3.4 结肠癌靶点生物学功能分析和通路分析 |
| 3.3.5 活性成分与关键靶点的分子对接验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 基于蛋白组学测定坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用的分子机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂与耗材 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 细胞系 |
| 4.1.4 受试药 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 蛋白收集 |
| 4.2.3 蛋白处理 |
| 4.2.4 上样 |
| 4.2.5 蛋白质组数据分析 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 标准曲线的绘制 |
| 4.3.2 蛋白质LC-MS图 |
| 4.3.3 差异蛋白筛选 |
| 4.3.4 GO富集功能分析 |
| 4.3.5 差异蛋白所参与的通路 |
| 4.3.6 筛选出目的差异蛋白 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 网络药理学和蛋白质组学的整合分析和实验验证 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试剂与耗材 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 细胞系 |
| 5.1.4 受试药 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 蛋白印迹实验 |
| 5.2.3 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 蛋白标准曲线的绘制 |
| 5.3.2 坡模酸、坡模酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯对HT-29细胞凋亡蛋白Bax、Bcl2和Caspase 3表达的影响 |
| 5.3.3 坡模酸、坡模酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯对HT-29细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 5.3.4 坡模酸、坡模酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯对HT-29细胞Jak/Stat3通路的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 坡模酸及其吡喃葡萄糖酯对小鼠异种移植瘤的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 试剂与耗材 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 细胞系和实验动物 |
| 6.1.4 受试药 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 动物喂养 |
| 6.2.2 细胞培养及肿瘤模型制备 |
| 6.2.3 肿瘤模型的制备 |
| 6.2.4 动物分组与处理 |
| 6.2.5 组织病理学观察 |
| 6.2.6 统计学分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 移植瘤小鼠体重和瘤体积生长曲线图 |
| 6.3.2 肿瘤体积大小、瘤重指数和脾脏指数的变化情况 |
| 6.3.3 结肠癌裸鼠皮下移植瘤大体标本观察 |
| 6.3.4 肿瘤组织病理切片观察(HE染色) |
| 6.3.5 肝脏组织病理切片观察(HE染色) |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 尚待深入内容 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
四、酪氨酸激酶Jak3与核小体组装蛋白Nap1的相互作用（论文参考文献）
- [1]锌指蛋白70在结肠炎相关结直肠癌发生发展及铃兰毒苷抗结直肠癌作用机制研究[D]. 张志宏. 延边大学, 2021(02)
- [2]维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究[D]. 韩卓. 西北农林科技大学, 2021
- [3]固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究[D]. 王明哲. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究[D]. 赵亚楠. 山东大学, 2021(11)
- [5]TCGA和ACRG分型在河北省胃癌人群中应用价值的研究[D]. 王强. 河北医科大学, 2021(02)
- [6]蛋白质组和转录组联合分析探索内嗅皮层参与阿尔茨海默病的机制[D]. 贾阳杰. 北京协和医学院, 2021(02)
- [7]肿瘤坏死因子α上调朊蛋白的水平促进肿瘤细胞迁移的分子机制[D]. 李欢. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [8]STYK1调控自噬复合体形成促进自噬发生[D]. 钱学红. 湖北工业大学, 2020(04)
- [9]中医药干预常规治疗失败晚期结直肠癌队列研究及预后基因差异分析[D]. 曲骞. 中国中医科学院, 2020(01)
- [10]坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用及机制研究[D]. 刘利艳. 江西中医药大学, 2020(01)
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