一、NGN的研究进展(论文文献综述)
张露文[1](2021)在《Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2联合重编程犬脂肪MSCs成为IPCs的研究》文中认为糖尿病是一种在全世界范围内普遍存在的慢性代谢性疾病,对人们的健康以及医疗资源产生了严峻的影响。目前,胰岛移植有望治疗糖尿病,但由于胰岛供体短缺和免疫排斥问题而受限。因此,寻找其它来源的胰岛素分泌细胞(Insulin producing cells,IPCs)进行移植成为治疗糖尿病的有效途径。在近几年的研究中,虽然体外诱导干细胞分化为IPCs已初见成效,但IPCs的分化程度和胰岛素分泌量都很低。通过查找文献发现在胰岛的发育、成熟过程中,Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2都起着一定的作用,也有研究证明将这些基因单独转入干细胞对于诱导其向IPCs分化具有促进作用,只是分化效率不够稳定,IPCs的胰岛素分泌量低而且不随葡萄糖浓度变化而变化。本实验室之前通过测序分析筛选出可能在诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化过程中起作用的新基因Dll1,我们从研究Dll1基因在体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化中的作用入手,进一步研究Dll1与Pdx1、Ngn3、Pax4或Nkx2.2不同组合重编程犬脂肪MSCs为IPCs的效果。主要研究结果如下:1.为研究Dll1基因在体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化中的作用,我们在犬脂肪MSCs中过表达Dll1,以及通过si RNA将Dll1基因沉默,分别诱导Dll1基因过表达的MSCs株和Dll1基因沉默的MSCs株向IPCs分化。(1)RT-q PCR检测,过表达Dll1组Maf A、Nkx6.1和Ins基因表达量极显着高于(P<0.001)对照组(48.975±3.578 vs 33.975±3.453;55.156±6.267 vs 25.106±1.267;39.258±3.752 vs 21.533±2.401);Dll1沉默组Pdx1、Maf A、Pcsk2和Ins基因表达量极显着低于(P<0.001)对照组(4.388±0.898 vs15.997±1.660;9.365±1.356 vs 33.975±3.453;16.358±1.258 vs 27.538±2.935;12.397±0.369vs 21.533±2.401)。(2)双硫腙染色,过表达组细胞团呈显猩红色。(3)免疫荧光检测,过表达组细胞团分泌胰岛素。(4)高糖刺激下,过表达Dll1组胰岛素分泌量(160.25±10.35μIU/105个细胞)极显着高于(P<0.001)对照组的胰岛素分泌量(125.23±4.35μIU/105个细胞),Dll1沉默组胰岛素分泌量(101.367±5.367μIU/105个细胞)极显着低于(P<0.001)对照组的胰岛素分泌量;KCl刺激下,各个组合的胰岛素分泌量与高糖刺激下相似。过表达Dll1组的胰岛素刺激释放指数SI(2.70±0.05)显着高于(P<0.01)对照组SI(2.36±0.11),Dll1沉默后胰岛素刺激释放指数SI(2.16±0.08)极显着低于(P<0.001)对照组SI。2.构建三个组合腺病毒多基因共表达穿梭载体p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3、p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3-Pax4和p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2,验证正确后,将其分别与p Ad Easy-1重组,获得重组腺病毒多基因共表达载体p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3(组合一)、p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3-Pax4(组合二)和p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2(组合三),并进行了验证,感染293A细胞。(1)RT-q PCR显示,组合一(Pdx1 2000±100、Ngn3 1956±56和Dll1 1900±100),组合二(Pdx1 1966±66、Ngn31865±65、Dll1 2000±100和Pax4 1999±99)和组合三(Pdx1 1856±56、Ngn3 1799±99、Dll1 1823±100和Nkx2.2 1911±100)的m RNA均有平衡表达。(2)Western-blot检测,三个组合均可表达目的基因的蛋白。3.将三个组合的重组腺病毒毒液分别感染犬脂肪MSCs,重编程犬脂肪MSCs成为IPCs。(1)感染48h后三个组合均表达GFP,培养25 d后组合二的细胞成团数最多,每106个犬脂肪MSCs中约有121±6个细胞团,细胞团的直径约为100±9μm,每个细胞团中约有115±14个细胞(n=3)。(2)双硫腙染色,三个组合中的细胞团均呈现猩红色,但组合二颜色最深。(3)RT-q PCR检测,组合二Pdx1、Maf A基因表达水平显着高于组合一(29.785±2.155 vs 21.095±2.125;24.578±2.135 vs 15.888±1.105),组合二Nkx6.1、Pcsk2基因表达水平高于组合一(32.578±4.98 vs 19.888±5.036;18.268±3.175 vs 9.578±3.145)。组合二Pdx1、Maf A、Nkx6.1基因表达水平高于组合三(29.785±2.155 vs25.225±2.195;24.578±2.135 vs 20.018±2.175;32.578±4.98 vs 24.018±5.106)。(4)高糖刺激下,组合一胰岛素分泌量(58.51±3.64μIU/105个细胞),组合二胰岛素分泌量(135.97±4.26μIU/105个细胞),组合三胰岛素分泌量(113±3.26μIU/105个细胞),组合二的的分泌量均显着高于(P<0.01)组合一和组合二,但组合二分泌在高糖刺激下胰岛素分泌量极显着低于(P<0.001)胰岛细胞的胰岛素分泌量。组合二的胰岛素刺激释放指数SI(2.33±0.09)也均高于其他两组,但显着低于(P<0.01)胰岛细胞SI(2.71±0.08)。结果表明,Dll1基因表达对体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化具有促进作用;三个组合均能使MSCs重编程为IPCs,四基因组合的重编程效果都远远优于三基因组合,在四基因组合中,组合二的重编程效果优于组合三。
陈奕静[2](2021)在《Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx6.1重编程犬脂肪MSCs向IPCs分化的研究》文中进行了进一步梳理糖尿病,主要包括1型和2型两种,是全世界第三大严重威胁健康的疾病。胰岛移植是治疗糖尿病的有效策略。然而,胰岛来源是有限的,迫切需要生产更多胰岛素分泌细胞(Insulin producing cells,IPCs)。利用转基因技术诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞具有广阔的前景。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSCs)可以低风险大量获得,且具有更高的免疫调节能力,是理想的种子细胞来源。研究表明,单个基因转染诱导的效率并不高。因此,本试验首先验证了Hnf1b基因在体外诱导犬AMSCs向IPCs分化中的作用,在此基础上联合胰岛细胞发育过程中起关键作用的级联调控因子Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1,组成三种不同的多基因共表达腺病毒感染犬AMSCs,重编程其向IPCs分化,进行RT-q PCR、Western-blot、形态学观察、双硫腙染色、糖刺激胰岛素分泌试验等检测,通过对比筛选出最佳诱导组合。研究结果如下:1.构建腺病毒表达载体pAdEasy-Hnf1b,并设计Hnf1b的si RNA,分别转染犬AMSCs,同时配合诱导剂,25 d后结果显示,Hnf1b基因过表达组和沉默组均形成胰岛样细胞团,过表达组的直径大且数量多,双硫腙染色着色更深;过表达组在高糖刺激下分泌的胰岛素量为158.27±9.86μIU/105cells,极显着高于对照组(125.23±4.35μIU/105cells,P<0.001);过表达组中胰岛细胞发育相关基因Nkx6.1、Ins表达量较对照组极显着上调(P<0.001);沉默组在高糖刺激下分泌的胰岛素量为102.36±4.36μIU/105cells,极显着低于对照组(P<0.001);沉默组中胰岛细胞发育相关基因Pdx1、Maf A、Nkx6.1、Pcsk2、Ins表达量较对照组极显着下调(P<0.001);过表达组细胞免疫荧光结果显示分泌C肽和胰岛素。2.构建pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3(A)、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Pax4(B)、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Nkx6.1(C)三种组合的多基因共表达腺病毒载体,转染293A细胞4 d后,RT-q PCR和Western-blot结果显示,各组合目的基因均有表达。感染犬AMSCs,25 d后,A组、B组、C组均形成胰岛样细胞团,且B组数量最多,双硫腙染色着色最深;高糖刺激下B组的胰岛素分泌量分别为为140.79±3.69μIU/105cells,极显着高于A组(64.84±5.36μIU/105cells)和C组(120.22±2.15μIU/105cells)(P<0.001);胰岛细胞发育相关基因表达量检测结果显示,除Nkx2.2基因,A组、B组、C组其余基因相对于空载体组显着升高(P<0.01);B组Pdx1基因m RNA表达量显着高于A组(P<0.01),高于C组(P<0.05);B组Pcsk1基因m RNA表达量极显着高于C组(P<0.001);B组Ins基因m RNA表达量高于A组(P<0.05),与C组无明显差异性。综上所述,Hnf1b基因对体外诱导犬AMSCs向IPCs分化具有促进作用,将Hnf1b与Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1构成三种不同组合,转染犬AMSCs诱导其向IPCs分化,通过对诱导结果的分析,表明Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4基因联合诱导效率最佳,为探究干细胞向IPCs分化的更高效方法提供了新的参考,为糖尿病临床治疗提供新思路。
王超群[3](2021)在《基于PDX-1通路研究补肾经方对GDM模型孕鼠胎鼠胰腺发育及胰岛素分泌细胞形成的影响》文中提出目的:通过体内动物实验,研究补肾经方母代干预对妊娠糖尿病(GDM)模型孕鼠胎鼠胰腺发育的影响;通过体外细胞诱导实验,研究补肾经方含药血清对小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的影响及其作用机制。方法:第一部分:通过雌雄大鼠2:1同笼合腹腔注射链脲佐菌素(STZ,正常对照组(N)注射生理盐水)的方法制备GDM孕鼠模型,将模型复制成功的孕鼠分为模型对照组(M)、门冬胰岛素组(MD)、六味地黄丸组(LW)、左归丸组(ZG)、右归丸组(YG)、肾气丸组(SQ),门冬胰岛素以20U·kg-1的剂量皮下注射;其余组分别按5g·kg-1的剂量灌胃,灌胃体积为20m L·kg-1,N组和M组以等体积的生理盐水灌胃,每日一次,灌胃至P16d。实验过程中,观察孕鼠的一般情况,并定时检测其随机血糖、体重、摄食量;实验结束后取材,ELISA法检测孕鼠血清胰岛素水平;HE染色观察孕鼠胰腺、胎盘病理结构;称取胎盘重量,免疫荧光法检测胎盘IGF2的表达;Real Time-PCR及Western-blot法分别检测胎鼠胰腺PDX-1、HNF-3β、Ngn3、Nkx6.1和Insulin的m RNA及蛋白表达;免疫荧光法检测胎鼠胰腺DNMT1、DNMT3a、USP7等甲基化酶的表达;MSP及BSP法检测胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3甲基化情况。第二部分:按照小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的方法,分别用补肾经方含药血清干预诱导,分为正常组(N)、左归丸诱导组(ZG)、六味地黄丸诱导组(LW)、右归丸诱导组(YG)、肾气丸诱导组(SQ),实验过程中每天观察细胞生长和诱导情况;分别于内胚层期、胰岛前体细胞期、胰岛内分泌前体细胞期、诱导结束后胰岛素分泌细胞期,检测各阶段标志物SOX17、FOXa2、PDX-1、Ngn3、Nkx6.1的m RNA和蛋白表达;细胞成熟后,双硫腙染色鉴定细胞诱导是否成功;检测Insulin的m RNA和蛋白表达;不同浓度葡萄糖刺激后,检测培养液中Insulin及C-肽的表达,测定细胞的分泌能力。结果:第一部分:(1)模型制备结束后,GDM模型组孕鼠出现明显的多饮、多食、多尿症状;胰腺组织出现胰岛体积缩小、胰岛细胞数量减少、空泡样改变以及炎性细胞浸润、明显出血点的病理变化;胎盘重量无变化,胎盘组织出现蜕膜区变窄、毛细血管扩张、滋养细胞溶解坏死、细胞胞质空泡样变化等病理改变;M组孕鼠随机血糖、摄食量明显高于N组(P<0.05),体重显着降低(P<0.05);M组胎盘IGF2、胎鼠胰腺PDX-1、HNF-3β、Ngn3、Nkx6.1及Insulin的m RNA和蛋白表达均较N组显着降低(P<0.05);胎鼠胰腺DNMT1、DNMT3A、USP7甲基化转移酶蛋白表达均显着降低(P<0.05);M组胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3甲基化率较正常组均显着降低(P<0.05),且其甲基化率与基因表达呈依赖性相关趋势。(2)补肾经方干预后,GDM孕鼠状态改善,胰腺及胎盘病理改变均有不同程度好转;与M组比较,MD与补肾经方组孕鼠血糖均显着降低,体重显着升高(P<0.05),但与MD组比较,补肾经方组孕鼠血糖显着升高,体重显着降低(P<0.05);与M组比较,MD组与ZG组胎盘IGF2、胎鼠胰腺PDX-1、HNF-3β、Ngn3、Nkx6.1及Insulin的m RNA及蛋白表达均显着升高(P<0.05),LW组PDX-1、Ngn3、Nkx6.1的m RNA表达无差异,HNF-3β表达较M组升高(P<0.05),Insulin的m RNA表达显着降低;YG组的Ngn3、Nkx6.1的m RNA表达显着升高(P<0.05),Insulin的表达显着降低(P<0.05),而PDX-1、HNF-3β的m RNA表达较M组无差异;SQ组的PDX-1、Ngn3、HNF-3β的m RNA表达较M组无差异,Nkx6.1的m RNA表达显着升高(P<0.05),Insulin表达显着降低(P<0.05);蛋白检测示,LW、SQ组各指标蛋白表达均较M组无差异,YG组HNF-3β、Ngn3蛋白表达较M组无差异,PDX-1、Nkx6.1蛋白表达显着升高(P<0.05),Insulin的蛋白表达显着降低(P<0.05);与M组比较,MD及补肾经方组DNMT1、DNMT3A、USP7甲基化转移酶蛋白表达均显着升高(P<0.05),与MD组比较,ZG组DNMT1、DNMT3A、USP7表达显着升高(P<0.05),其余组三者较MD组显着降低(P<0.05)或无差异;与M组比较,MD、ZG和LW组PDX-1、Ngn3甲基化率显着升高(P<0.05),YG及SQ组显着降低(P<0.05),与MD组比较,ZG组PDX-1甲基化率显着升高(P<0.05),其余无差异。第二部分:(1)内胚层阶期:与N组比较,ZG、LW组SOX17免疫组化光密度值无差异,YG及SQ组显着降低(P<0.05),ZG组FOXa2较N组显着增高(P<0.05);与N组比较,ZG组SOX17蛋白表达显着升高(P<0.05),其余组显着降低(P<0.05);补肾经方组FOXa2较N组显着降低(P<0.05),其余补肾经方组较ZG组显着降低(P<0.05);与N组比较,SOX17、FOXa2 m RNA表达无差异,其余组显着降低(P<0.05)。(2)胰岛前体细胞期:与N组比较,ZG组PDX-1 m RNA表达及基因甲基化率均显着升高(P<0.05),蛋白表达显着降低(P<0.05),其余三组PDX-1 m RNA、基因甲基化率及蛋白表达均较ZG组显着降低(P<0.05)。(3)内分泌前体细胞期:与N组比较,ZG组Ngn3 m RNA、基因甲基化率及蛋白表达均无差异,其余组Ngn3 m RNA、基因甲基化率及蛋白表达均较ZG组显着降低(P<0.05)。(4)胰岛素分泌细胞期:与N组比较,ZG组Nkx6.1、Insulin的m RNA及蛋白表达均显着升高(P<0.05),LW组Insulin m RNA表达显着升高(P<0.05),其余均较ZG组显着降低;各组双硫腙染色均呈红棕色阳性表达;不同浓度葡萄糖刺激下,与N组比较,ZG组Insulin及C-肽分泌量无差异或显着升高,且随着葡萄糖浓度的升高,其分泌量有升高趋势;而其余组在不同浓度葡萄糖刺激下,均较N组显着降低(P<0.05),且三组之间比较无差异。结论:(1)通过比较补肾经方对GDM胎鼠胰腺发育的影响作用发现,左归丸可以改善母代胰腺及胎盘的病理变化,并通过提升PDX-1、Ngn3的甲基化水平提升PDX-1通路上HNF-3β、PDX-1、Ngn3、Nkx6.1及Insulin的基因表达,整体促进GDM孕鼠胎鼠胰腺的发育,六味地黄丸、右归丸、肾气丸对胎鼠胰腺发育无明显促进作用。(2)通过比较补肾经方对小鼠胚胎干细胞定向诱导的作用发现,左归丸可以通过提升PDX-1、Ngn3的甲基化水平提升诱导各阶段标志物HNF-3β、PDX-1、Ngn3、Nkx6.1及Insulin的基因表达,促进小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞方向的诱导分化,六味地黄丸、右归丸及肾气丸对小鼠胚胎干细胞的诱导分化无促进作用。(3)左归丸对胎鼠胰腺发育及小鼠胚胎干细胞定向诱导分化的促进作用可能与其填补肾精的作用有关,反映出填补先天肾精对胚胎组织器官发育的重要性,从分子生物水平为中医“元精乃无形之水”、“精者,身之本也”等理论提供了科学依据。
李佳锴[4](2021)在《FoxA1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2重编程犬脂肪间充质干细胞成为胰岛素分泌细胞的研究》文中研究说明糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。目前临床上治疗糖尿病以注射外源胰岛素为主,但无法维持血糖长期稳定,并发症的风险依然存在。胰岛移植是解决这一难题的有效方法,但存在供体短缺、免疫排斥等问题。因此体外生成胰岛素分泌细胞(insulin producing cells,IPCs)代替胰岛移植成为研究热点。脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)来源广泛,取材方便,免疫原性低,具有多向分化潜能,是新生IPCs比较理想的种子细胞。研究表明,ADSCs能够在体外诱导条件下分化为IPCs,但存在分化效率低,胰岛素分泌量少等缺点。在本实验室前期研究工作中,通过绝对定量转录组测序,筛选出体外诱导犬ADSCs向IPCs分化过程中新的差异表达基因FoxA1。为了验证FoxA1基因对体外犬ADSCs向IPCs分化的影响,本研究构建了FoxA1重组腺病毒表达载体,在293A细胞中包毒后,感染犬ADSCs,得到FoxA1基因过表达的ADSCs细胞株,结合体外诱导犬ADSCs向IPCs分化的程序,探究FoxA1基因过表达对体外犬ADSCs向IPCs分化的影响;通过构建FoxA1基因的siRNA载体,转染犬ADSCs,得到FoxA1基因干扰的ADSCs细胞株,结合体外诱导犬ADSCs向IPCs分化的程序,探究FoxA1基因干扰对体外犬ADSCs向IPCs分化的影响。胰腺发育级联调控关键基因(Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2)单独或联合转入ADSCs,可诱导分化为IPCs,但往往分化效率不高,分化形成的IPCs不成熟。为进一步探究多基因联合转入犬ADSCs向IPCs分化的效率和分化形成的IPCs成熟度,本研究将FoxA1与Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx2.2基因构成不同的组合,分别为组合A:FoxA1+Pdx1+Ngn3、组合B:FoxA1+Pdx1+Ngn3+Pax4和组合C:FoxA1+Pdx1+Ngn3+Nkx2.2。在各基因序列后加入不同的2A肽序列,使用同源重组技术连接,构建多基因重组腺病毒载体,在293A细胞中包毒后,感染犬ADSCs,只经连续细胞培养,探究重编程犬ADSCs成为IPCs的最佳组合。主要结果如下:1、分别对FoxA1基因过表达和干扰的犬ADSCs诱导后细胞进行葡萄糖刺激分泌胰岛素试验和RT-qPCR检测胰岛β细胞相关基因的表达。发现与单纯诱导组细胞相比,FoxA1基因过表达组的细胞低糖刺激分泌胰岛素的量显着升高(p<0.05),高糖和KCl刺激分泌胰岛素的量均极显着升高(p<0.01),Pdx1、Mafa、Nkx6.1、Nkx2.2和Ins基因的表达极显着升高(p<0.01);FoxA1基因干扰组高糖和KCl刺激分泌胰岛素的量均极显着降低(p<0.01),Pdx1、Mafa、Nkx6.1、Pax4、Pcsk1、Pcsk2和Ins的表达极显着降低(p<0.01)。因此,FoxA1基因的表达促进体外犬ADSCs向IPCs的分化。2、分别对各组合联合转入犬ADSCs诱导向IPCs分化后的细胞进行成团数比较、双硫腙染色、葡萄糖刺激分泌胰岛素试验和RT-qPCR检测胰岛β细胞相关基因的表达。发现组合B和组合C的成团数显着高于组合A(p<0.05);组合B的低糖、高糖和KCl刺激分泌胰岛素的量均极显着高于组合A和组合C(p<0.01);组合B和组合C的Pdx1、Mafa、Nkx6.1、Pcsk2和Ins I基因的表达均极显着高于组合A(p<0.01)。因此,FoxA1、Pdx1、Pax4和Ngn3重编程犬ADSCs成为IPCs的效率最高,分化形成的IPCs最成熟。综上所述,FoxA1基因的表达促进体外犬ADSCs向IPCs的分化,FoxA1、Pdx1、Pax4和Ngn3可重编程犬ADSCs成为IPCs。
孔吟皓[5](2020)在《Ngn3过表达对诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响》文中提出目的:探讨神经元素3(neurogenin3,Ngn3)的过表达能否促进人脐带间充质干细胞(human umbilical-cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)向胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs)的诱导分化。方法:分离培养hUCMSCs,通过流式细胞术鉴定CD90,CD105,CD45,CD34的表达情况,通过成脂、成骨诱导分化鉴定细胞的多向分化潜能。使用分阶段联合诱导法诱导hUCMSCs分化为IPCs,诱导过程包括10天的低糖诱导(含EGF)和11天的高糖诱导(含激活素A和尼克酰胺)。在此基础上,分别尝试在不同时间感染Ngn3过表达慢病毒载体,确定最佳感染时间;按照确定的时间,在分阶段联合诱导过程中感染病毒,Western blot法检测Ngn3过表达情况。同时进行分阶段诱导和Ngn3过表达的诱导细胞作为实验组,仅进行分阶段诱导的细胞作为对照组。21天诱导完成后,透射电镜观察诱导前后两组细胞的结构变化;收集两组细胞的mRNA和蛋白质,通过Real-Time PCR和Western blot法比较诱导后两组细胞的胰岛素和MafA表达情况;收集培养上清液,ELISA法测定C肽分泌量。结果:成功分离hUCMSCs,细胞具有成脂、成骨分化潜能,细胞高表达CD90、CD105,低表达CD34、CD45。通过分阶段联合诱导法成功将hUCMSCs诱导为IPCs。在诱导开始前过表达Ngn3细胞出现凋亡;在诱导的第1周末,病毒载体进入细胞且Ngn3成功过表达,细胞活性稳定(该组确定为实验组);在诱导第2周末病毒载体感染失败。电镜观察实验组诱导细胞结构较对照组更为成熟;Real-Time PCR和Western blot结果显示实验组细胞阳性表达胰岛素和MafA且表达量明显高于对照组;ELISA结果显示实验组细胞在诱导中后期C肽分泌量一直略高于对照组且在诱导21天出现明显上升。结论:在分阶段诱导第1周末感染Ngn3过表达慢病毒,可促进hUCMSCs向IPCs的诱导分化。
张霞[6](2020)在《Pdx1、Ngn3、Isl1、Nkx6.1和Pax4不同组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究》文中研究指明糖尿病是威胁人类与伴侣动物健康的重要疾病,目前糖尿病的临床治疗除胰岛素控制和药物外,胰岛移植最有效,但胰岛移植的供体匮乏且免疫排斥严重,急需探索糖尿病治疗新方法。将多潜能干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞(Insulin producing cells,IPCs),能够从根源替换受损的胰岛β细胞,有望成为糖尿病治疗新思路。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)易分离,无伦理问题,因此本研究选择犬ADSCs作为转染对象。在胰岛β细胞发育及功能重要调控基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1的基础上,引入经过功能验证的Isl1基因,组成不同的多基因组合,用腺病毒介导转染诱导犬ADSCs,探究其对犬ADSCs向IPCs分化的影响,通过对比诱导效果得出最佳组合。主要研究结果如下:1. 比较得到腺病毒在转染效率方面明显优于真核表达载体,Isl1是Isl1、Sox8、HADH三个基因中诱导犬ADSCs向IPCs分化效率最高的基因。2. 以带有同源臂的引物与合成的目的基因模板扩增得到目的基因片段,利用同源重组克隆技术成功构建多基因共表达腺病毒载体:A组合pAd Track-Pdx1-Ngn3-Isl1-Ad Easy,B组合p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Pax4-Isl1-Ad Easy,C组合p Ad Track-Ngn3-Nkx6.1-Isl1-Pdx1-Ad Easy,D组合p Ad Track-Ngn3-Nkx6.1-Pax4-Pdx1-Ad Easy,E组合p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Ad Easy,将载体在293A细胞中成功包装,获得感染性高滴度腺病毒毒液,感染犬ADSCs后4 d,每个组合的不同目的基因在m RNA水平和蛋白水平检测到不同程度的表达。3. 多基因共表达腺病毒毒液感染犬ADSCs后25 d,A、B、E组合的胰岛样细胞团双硫腙染色显示猩红色、间接免疫荧光染色胰岛素检测阳性;四基因组合中,B组合诱导效率最高,所检测的13个基因表达量相对于Negative组均上调,在高糖刺激下,上清液中检测到的胰岛素分泌量为91.26±10.59μIU/105 cells,细胞裂解液中检测到的胰岛素及胰岛素原含量为99.82±11.28μIU/105 cells,上清液和细胞裂解液中胰岛素刺激释放指数分别为2.07±0.24、2.04±0.35。综上所述,本研究通过腺病毒介导Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1、Isl1等构成的不同目的基因组合在犬ADSCs中的过表达,四基因组合中筛选出诱导效率最高的B组合Pdx1+Ngn3+Isl1+Pax4,为转基因诱导干细胞分化为IPCs提供新的研究参考,为动物糖尿病的临床治疗提供新方法,为人类糖尿病治疗提供更多的研究资料。
阮晨梅[7](2020)在《Pdx1、Ngn3、Mnx1、Mafa和Pax4组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究》文中认为目前,通过对胰岛β细胞发育调控基因重编程使脂肪间充质干细胞具有胰岛素分泌功能,从而代替胰岛β细胞用于糖尿病治疗已成为一大研究热点。基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Mafa等是胰腺发育的主要调控基因,它们的突变缺失都会严重破坏胰腺内分泌细胞的发育。通过转基因技术使这些基因在干细胞中过表达,但结果发现单基因转染的定向诱导作用并不明显,要实现干细胞向胰岛素分泌阳性细胞的定向分化还需要其他基因的配合,进而筛选最佳基因组合并通过多基因共表达实现干细胞向胰岛素分泌细胞分化具有重要意义。前期本研究小组已通过绝对定量转录组测序分析筛选出在犬ADSCs向胰岛素分泌阳性细胞分化中可能起作用的新表达调控基因Foxa2、Insm1和Mnx1。因此,本试验前期构建了基因Foxa2、Insm1和Mnx1的真核过表达载体和腺病毒过表达载体,并对其在犬ADSCs中的过表达功能进行验证,对比筛选出功能最佳的新表达调控基因Mnx1。此外,试验中发现真核表达载体筛选周期长,筛选效率低,而腺病毒过表达载体操作简单,感染效率高。因此后期实验中,将基因Mnx1与级联调控关键基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Mafa以2A肽连接,以不同的排列形式构建5组腺病毒介导的多基因共表达载体,包装扩增为高滴度的腺病毒毒液后感染犬脂肪间充质干细胞并对分化效果进行监测。研究结果如下:1. 成功构建重组真核过表达载体pIRES2-EGFP-Foxa2、pIRES2-EGFP-Insm1、pIRES2-EGFP-Mnx1和重组腺病毒过表达载体pAd-Foxa2、pAd-Insm1、pAd-Mnx1,并经PCR鉴定和双酶切鉴定。分别感染犬ADSCs后对比各时间段胰岛β细胞发育调控基因m RNA表达量,显示腺病毒介导的基因Mnx1过表达可显着提高胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4在犬ADSCs中的表达水平,并发现腺病毒的感染效率明显高于真核过表达载体。2. 成功构建五组多基因共表达腺病毒载体pAd-Pdx1-E2A-Ngn3、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mafa-F2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Pax4-E2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mafa-F2A-Pax4。经过酶切、PCR鉴定和测序正确。通过RT-q PCR和Western blot检测发现各组合中目的基因在m RNA水平和蛋白水平都有明显表达。3. 五组多基因共表达腺病毒载体包装扩增后感染犬ADSCs,荧光定量PCR结果显示组合三中基因Pdx1、Ngn3、Mafa和Mnx1共表达后,胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Mafa、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4、Ins、Pcsk2、Slc30a8、Abcc8、Ksnj8、G6pc2表达量显着提高,与其他组合相比差异性显着。感染25 d后形成的类圆形细胞团双硫腙染色后呈现红棕色,提示有胰岛素分泌。组合三腺病毒感染的犬ADSCs在高糖(25 mmol/L)和低糖(5 mmol/L)刺激下,上清液中胰岛素分泌量分别是101.810±4.39μIU/105cells和49.439±2.5μIU/105cells,其胰岛素刺激释放指数(Stimulation Index,SI)为2.059±0.175,与其他几组呈现显着性差异。结果表明,基因Mnx1过表达可显着提高胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4在犬ADSCs中的表达水平。腺病毒的感染效率明显高于真核过表达载体。腺病毒介导基因Pdx1、Ngn3、Mafa和Mnx1在犬脂肪间充质干细胞中共表达,可高效调控其向胰岛素分泌阳性细胞分化,为进一步探究糖尿病的干细胞替代疗法奠定了基础。
高登科[8](2020)在《Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2不同组合重编程犬ADSCs成为IPCs的研究》文中认为糖尿病是全球最普遍的全身性代谢病之一,传统的药物疗法和胰岛素注射疗法不能从根本上治疗糖尿病。胰岛移植能够有效的控制血糖变化,避免并发症的发生,然而由于供体不足和免疫排斥,使其应用受到限制。在细胞水平上通过定向诱导的方法,将多潜能性干细胞向具有胰岛素分泌功能的细胞进行诱导分化,为糖尿病治疗研究提供新方法。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)易于分离培养,且较少涉及到医学伦理问题,并且具有抑制受体淋巴细胞增殖和保护胰岛β细胞免受自体免疫破坏的独特优势,是治疗糖尿病的理想种子细胞。Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2作为级联调控关键基因,在胰腺、胰岛细胞发育和成熟过程中起重要调控作用。将这些基因分别单独转入ADSCs,可诱导其向胰岛素分泌细胞(Insulin producing cells,IPCs)分化,但所分泌的胰岛素含量不随糖浓度而变化,不具有功能性胰岛β细胞的性质,通过其他基因配合组成多基因组合联合转染,为重编程ADSCs的转分化研究提供了新思路。因此,本试验在这些级联调控关键基因的基础上引入经过功能验证的Sox9基因,探究这五种基因组成的不同多基因重组腺病毒感染犬ADSCs后,对犬ADSCs向IPCs分化的影响。主要研究结果如下:1、成功构建了Sox9、Fev、Gata4单基因真核过表达载体和腺病毒过表达载体,用它们分别感染犬ADSCs,通过对感染后细胞的形态学观察结果和胰岛发育相关基因m RNA表达水平进行对比筛选,发现真核过表达载体转染效率过低,不能满足试验要求;而腺病毒过表达载体具有较好的转染效率,是基因治疗中较理想的转染工具,且Sox9基因过表达腺病毒的诱导效果最佳。2、成功构建五组多基因共表达腺病毒载体,分别为A组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Ad Easy;B组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Sox9-Ad Easy;C组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Pax4-Sox9-Ad Easy;D组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2-Sox9-Ad Easy;E组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2-Pax4-Ad Easy,并将它们成功包装为具有感染性的腺病毒。感染犬ADSCs后第4天,通过RT-q PCR和Western blot检测发现各组合不同外源目的基因均实现过表达。3、通过对感染犬ADSCs后第30天的细胞进行形态学观察、双硫腙染色、糖刺激胰岛素分泌试验、细胞免疫荧光及RT-q PCR等检测,对比筛选得到最佳诱导组合E组合(p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2-Pax4-Ad Easy)。该组合重组腺病毒感染细胞在高糖(25 mmol/L)刺激下,胰岛素分泌量和细胞内胰岛素含量分别可达到100.94±3.70和109.08±4.88μIU/105 cells。综上所述,本研究成功构建了携带有Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2基因的五组不同的多基因共表达腺病毒载体,包装为腺病毒毒液感染犬ADSCs后进行诱导分化效果检测,结果发现Pdx1、Ngn3、Nkx2.2和Pax4基因联合转染组诱导效果最佳,为进一步探究犬ADSCs向IPCs诱导分化的更高效方案奠定了基础。
许云林,戴超,王丽丽,贾志鹏[9](2014)在《FTS技术及其在未来NGN中的应用研究》文中认为技术的快速进步和社会需求的不断发展,推动着网络技术研究的创新与革命。本文在分析当前下一代网络(Next Generation Network,NGN)和下一代互联网(Next Generation Internet,NGI)研究现状的基础上,重点介绍了一种基于全业务的固定网转移业务(Fixednetwork Transfer Service,FTS),并从FTS网络的多维可扩展性、控制与管理、可信性三个方面对FTS在未来NGN中的应用进行了讨论。
ITU-T SG13中国专家组[10](2007)在《ITU-T SG13研究组2007年第1次会议总结》文中认为ITU-T第13研究组于2007年4月16~27日在日内瓦召开了本研究期(2005~2008)第6次会议。本文主要介绍了本次会议的主要技术进展,包括下一代网络(NGN)研究,IPQoS技术研究,公用网中实施IP业务的机制,网络互通,网络管理以及OAM,新网络环境下的应急通信,卫星与区域网互通,数据网络的内容。
二、NGN的研究进展(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NGN的研究进展(论文提纲范文)
(1)Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2联合重编程犬脂肪MSCs成为IPCs的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 糖尿病的研究进展 |
1.1.1 糖尿病概述 |
1.1.2 糖尿病传统治疗 |
1.2 干细胞治疗糖尿病的研究进展 |
1.2.1 胚胎干细胞与糖尿病 |
1.2.2 诱导多能性干细胞与糖尿病 |
1.2.3 间充质干细胞与糖尿病 |
1.3 胰岛 β 细胞发育过程及相关转录因子的研究进展 |
1.3.1 胰岛β细胞发育过程 |
1.3.2 胰岛β细胞相关转录因子 |
1.4 转基因技术的研究进展 |
1.5 多基因共表达载体构建的研究进展 |
1.6 本研究的目的和意义 |
第二章 Dll1 在体外诱导犬脂肪MSCs向 IPCs分化中的作用 |
2.1 材料 |
2.1.1 菌株、质粒和细胞 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.2 方法 |
2.2.1 犬脂肪MSCs的复苏培养 |
2.2.2 Dll1 插入片段的获得 |
2.2.3 Dll1 过表达腺病毒载体的构建及包装 |
2.2.4 构建Dll1 过表达犬脂肪MSCs株并体外诱导其向IPCs分化 |
2.2.5 构建Dll1 沉默犬脂肪MSCs株并体外诱导其向IPCs分化 |
2.2.6 诱导分化效果的检测 |
2.3 结果 |
2.3.1 犬Dll1 基因的PCR扩增结果 |
2.3.2 重组腺病毒载体的构建及包装结果 |
2.3.3 Dll1 过表达犬脂肪MSCs株的荧光表达情况 |
2.3.4 Dll1 沉默犬脂肪MSCs株的荧光表达情况、沉默效果及诱导后细胞形态 |
2.3.5 诱导分化效果的检测 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 重组腺病毒多基因共表达载体的构建 |
3.1 材料 |
3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 主要仪器 |
3.2 方法 |
3.2.1 目的基因的合成和扩增 |
3.2.2 重组腺病毒多基因共表达载体的构建及包装 |
3.2.3 重组腺病毒多基因共表达载体的表达鉴定 |
3.3 结果 |
3.3.1 目的基因的PCR扩增结果 |
3.3.2 重组腺病毒多基因共表达载体的构建结果 |
3.3.3 重组腺病毒多基因共表达载体的表达鉴定结果 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2 联合重编程犬脂肪MSCs为 IPCs |
4.1 材料 |
4.1.1 菌株、质粒和细胞 |
4.1.2 主要试剂 |
4.1.3 主要仪器 |
4.2 方法 |
4.2.1 多基因重组腺病毒感染犬脂肪MSCs |
4.2.2 双硫腙染色 |
4.2.3 RT-q PCR检测胰岛β细胞发育相关基因的表达 |
4.2.4 葡萄糖刺激试验 |
4.3 结果 |
4.3.1 多基因重组腺病毒感染犬脂肪MSCs后 GFP表达情况及细胞成团情况 |
4.3.2 双硫腙染色结果 |
4.3.3 胰岛β细胞发育相关基因的表达结果 |
4.3.4 胰岛素分泌量的检测结果 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
结论 |
附录 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(2)Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx6.1重编程犬脂肪MSCs向IPCs分化的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 糖尿病概述 |
1.2 IPCs的干细胞来源 |
1.2.1 胚胎干细胞(ESCs) |
1.2.2 诱导多能干细胞(iPSCs) |
1.2.3 间充质干细胞(MSCs) |
1.3 胰腺发育过程中相关调控转录因子的研究进展 |
1.3.1 胰腺十二指肠同源盒基因1(Pdx1) |
1.3.2 神经元素3(Ngn3) |
1.3.3 NK转录因子相关同源盒基因家族6 基因座位1(Nkx6.1) |
1.3.4 配对盒同源基因4(Pax4) |
1.3.5 肝细胞核因子1-β(Hnf1b) |
1.4 利用转基因技术诱导干细胞向IPCs方向分化的研究进展 |
1.5 本研究目的和意义 |
第二章 Hnf1b在体外诱导犬AMSCs向IPCs分化中的作用 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 载体、菌株与细胞 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 犬AMSCs的复苏与传代培养 |
2.2.2 Hnf1b基因过表达腺病毒载体的构建 |
2.2.3 重组腺病毒感染犬AMSCs并体外诱导其向IPCs分化 |
2.2.4 Hnf1b基因过表达时犬AMSCs向IPCs体外诱导分化效果检测 |
2.2.5 Hnf1b基因siRNA的合成 |
2.2.6 Hnf1b基因siRNA转染犬AMSCs并体外诱导其向IPCs分化 |
2.2.7 Hnf1b基因沉默时犬AMSCs向IPCs体外诱导分化效果检测 |
2.3 试验结果 |
2.3.1 Hnf1b基因过表达腺病毒载体的构建及验证结果 |
2.3.2 重组腺病毒感染犬AMSCs及体外诱导其向IPCs分化效果 |
2.3.3 Hnf1b基因siRNA转染犬AMSCs及体外诱导其向IPCs分化效果 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx6.1重编程犬AMSCs向IPCs分化 |
3.1 试验材料 |
3.2 试验方法 |
3.2.1 多基因共表达腺病毒载体的构建 |
3.2.2 多基因共表达腺病毒感染犬AMSCs诱导其向IPCs分化 |
3.2.3 犬AMSCs向IPCs分化效果检测 |
3.3 结果 |
3.3.1 多基因共表达腺病毒载体的构建及验证结果 |
3.3.2 多基因共表达腺病毒感染犬AMSCs诱导其向IPCs分化效果 |
3.4 讨论 |
3.4.1 多基因共表达腺病毒载体的构建 |
3.4.2 多基因共表达腺病毒感染犬AMSCs诱导分化效果 |
3.5 小结 |
结论 |
附录 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(3)基于PDX-1通路研究补肾经方对GDM模型孕鼠胎鼠胰腺发育及胰岛素分泌细胞形成的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
前言 |
第一部分 基于PDX-1 通路探究补肾经方对GDM模型孕鼠胎鼠胰腺发育的影响 |
1 材料 |
1.1 动物 |
1.2 药物 |
1.3 试剂 |
1.4 仪器 |
2 方法 |
2.1 主要试剂和溶液的配制 |
2.1.1 柠檬酸缓冲液(p H4.4)的配制 |
2.1.2 链脲佐菌素注射液的配制 |
2.2 GDM孕鼠模型的制备 |
2.3 孕鼠分组及给药 |
2.4 样本采集及指标检测 |
2.4.1 孕鼠一般状态观察 |
2.4.2 孕鼠血清胰岛素的检测 |
2.4.3 孕鼠胰腺组织病理结构观察 |
2.4.4 孕鼠胎盘组织病理结构观察 |
2.4.5 胎鼠胰腺组织PDX-1 通路相关因子的m RNA表达 |
2.4.6 胎鼠胰腺组织PDX-1 通路相关因子的蛋白表达 |
2.4.7 胎鼠胰腺组织甲基化转移酶的表达 |
2.4.8 胎鼠胰腺组织PDX-1 通路因子的甲基化表达 |
2.4.8.1 MSP法检测胎鼠胰腺组织PDX-1、Ngn3的甲基化情况 |
2.4.8.2 BSP法检测胎鼠胰腺组织PDX-1、Ngn3 的甲基化率 |
2.5 统计学分析 |
3 结果 |
3.1 孕鼠一般状态观察 |
3.1.1 孕鼠一般状况观察 |
3.1.2 对孕鼠随机血糖的影响 |
3.1.3 对孕鼠体重的影响 |
3.1.4 对孕鼠胎盘重量的影响 |
3.1.5 对孕鼠平均摄食量的影响 |
3.2 对孕鼠胰腺病理结构的影响 |
3.3 对孕鼠胎盘病理结构及IGF2 表达的影响 |
3.3.1 对孕鼠胎盘组织病理结构的影响 |
3.3.2 对孕鼠胎盘组织IGF2 蛋白表达的影响 |
3.4 对胎鼠胰腺PDX-1 通路因子表达的影响 |
3.4.1 对胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 mRNA表达的影响 |
3.4.2 对胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 蛋白表达的影响 |
3.4.3 对胎鼠胰腺HNF-3β、Nkx6.1、Insulin mRNA表达的影响 |
3.4.4 对胎鼠胰腺HNF-3β、Nkx6.1、Insulin蛋白表达的影响 |
3.5 对胎鼠胰腺甲基化转移酶表达的影响 |
3.5.1 对胎鼠胰腺DNMT1 表达的影响 |
3.5.2 补肾经方对胎鼠胰腺DNMT3a表达的影响 |
3.5.3 补肾经方对胎鼠胰腺USP7 表达的影响 |
3.6 对胎鼠胰腺PDX-1 通路因子甲基化的影响 |
3.6.1 MSP定性检测胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 甲基化的影响 |
3.6.2 BSP法定量检测胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 甲基化率的表达 |
3.7 PDX-1、Ngn3 甲基化率与m RNA表达线性关系分析 |
4 讨论 |
4.1 对孕鼠整体状态的影响 |
4.1.1 对孕鼠一般状态的影响 |
4.1.2 对孕鼠随机血糖的影响 |
4.1.3 对孕鼠胰腺病理结构的影响 |
4.1.4 对孕鼠胎盘病理结构及IGF2 表达的影响 |
4.2 对胎鼠胰腺PDX-1 通路相关指标甲基化的影响 |
4.2.1 对胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 甲基化的影响 |
4.2.2 对胎鼠胰腺甲基化转移酶表达的影响 |
4.3 对胎鼠胰腺PDX-1 通路相关指标表达的影响 |
4.3.1 对胎鼠胰腺HNF-3β表达的影响 |
4.3.2 对胎鼠胰腺PDX-1 表达的影响 |
4.3.3 补肾经方对胎鼠胰腺Ngn3 表达的影响 |
4.3.4 对胎鼠胰腺Nkx6.1 表达的影响 |
4.3.5 补肾经方对胎鼠胰腺Insulin表达的影响 |
5 小结 |
第二部分 补肾经方含药血清干预对小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的影响 |
1 材料 |
1.1 细胞系 |
1.2 动物 |
1.3 试剂 |
1.4 仪器 |
2 方法 |
2.1 含药血清的制备 |
2.2 MEF细胞的培养 |
2.2.1 MEF细胞的复苏 |
2.2.2 MEF细胞的传代 |
2.2.3 MEF细胞的冻存 |
2.3 ES-E14 细胞饲养层的制备 |
2.4 ES-E14 细胞的培养 |
2.4.1 ES-E14 细胞的复苏 |
2.4.2 ES-E14 细胞的传代 |
2.4.3 ES-E14 细胞的冻存 |
2.5 含药血清浓度的确定 |
2.6 ES-E14 细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化 |
2.6.1 诱导培养基的配制 |
2.6.2 小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞方向的诱导过程 |
3 指标检测 |
3.1 细胞形态学观察 |
3.1.1 观察各阶段细胞的形态学变化 |
3.1.2 DTZ染色鉴定胰岛素分泌细胞的成熟 |
3.2 MTT法检测细胞增值率 |
3.3 内胚层期SOX17、Foxa2 的蛋白表达 |
3.4 细胞诱导分化各阶段标志物的mRNA表达 |
3.5 细胞诱导分化各阶段标志物蛋白的表达 |
3.6 不同浓度葡萄糖刺激下Insulin及 C-肽的表达 |
3.7 PDX-1、Ngn3 的甲基化情况检测 |
3.8 统计学分析 |
4 结果 |
4.1 细胞形态学观察 |
4.1.1 细胞一般生存状态观察 |
4.1.2 细胞诱导分化各阶段形态学变化 |
4.2 补肾经方含药血清浓度的确定 |
4.2.1 ES-E14 细胞在不同浓度含药血清干预24h的增殖情况 |
4.3 对细胞诱导分化不同阶段标志物表达的影响 |
4.3.1 对内胚层期SOX17、Foxa2 蛋白表达的影响 |
4.3.2 对胰腺前体细胞期PDX-1 表达的影响 |
4.3.3 对胰腺内分泌前体细胞期标志物Ngn3 表达的影响 |
4.3.4 对胰岛素分泌细胞期Nkx6.1及Insulin表达的影响 |
4.4 对PDX-1、Ngn3 甲基化率的影响 |
4.4.1 胰岛前体细胞期PDX-1 甲基化率的结果 |
4.4.2 胰岛分泌前体细胞期Ngn3 甲基化率的结果 |
4.5 甲基化率与其mRNA表达的线性关系分析 |
4.6 对胰成熟胰岛素分泌细胞Insulin、C-肽分泌量的影响 |
4.6.1 不同浓度葡萄糖刺激后Insulin分泌量 |
4.6.2 不同浓度葡萄糖刺激后C-肽分泌量 |
5 讨论 |
5.1 对细胞诱导分化形态的影响 |
5.2 对诱导分化各阶段标志物表达的影响 |
5.2.1 对内胚层期标志物SOX17、FOXa2 表达的影响 |
5.2.2 对胰岛素前体细胞阶段PDX-1 表达的影响 |
5.2.3 对胰腺内分泌细胞前期Ngn3 表达的影响 |
5.2.4 对胰岛素分泌细胞期Nkx6.1 表达的影响 |
5.3 对胰岛素分泌细胞分泌功能的影响 |
6 小结 |
结语 |
问题与展望 |
参考文献 |
附录 综述 娠糖尿病发病机制及治疗方法的研究进展 |
参考文献 |
在校期间公开发表的学术论文 |
致谢 |
(4)FoxA1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2重编程犬脂肪间充质干细胞成为胰岛素分泌细胞的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
文献综述 |
第一章 胰腺发育调控与间充质干细胞治疗糖尿病 |
1.1 胰岛β细胞发育调控研究进展 |
1.1.1 调节胰岛β细胞发育的转录因子 |
1.1.2 调节胰岛β细胞发育的信号通路 |
1.2 MSCs治疗糖尿病研究进展 |
1.2.1 MSCs概述 |
1.2.2 体外诱导MSCs向 IPCs分化研究进展 |
1.2.3 MSCs治疗糖尿病的问题与展望 |
1.3 本研究的目的与意义 |
试验研究 |
第二章 FoxA1 对体外诱导犬ADSCs向 IPCs分化的影响 |
2.1 材料和试剂 |
2.1.1 主要材料 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.1.4 主要溶液的配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 FoxA1 的合成、扩增和纯化回收 |
2.2.2 FoxA1 腺病毒穿梭载体的构建 |
2.2.3 重组腺病毒载体的构建和鉴定 |
2.2.4 重组腺病毒载体的包装、扩增和滴度测定 |
2.2.5 RT-qPCR和 Western blot检测FoxA1 基因过表达 |
2.2.6 犬ADSCs的复苏和传代 |
2.2.7 重组腺病毒感染犬ADSCs |
2.2.8 诱导效果检测 |
2.2.9 siRNA表达载体的构建和转染 |
2.2.10 FoxA1 干扰后诱导分化及效果检测 |
2.3 结果 |
2.3.1 FoxA1 的克隆和p Ad Track-CMV的双酶切 |
2.3.2 FoxA1 重组腺病毒载体的鉴定 |
2.3.3 腺病毒载体在293A细胞中的包装 |
2.3.4 RT-qPCR和 Western blot检测293A细胞中FoxA1 基因的表达 |
2.3.5 腺病毒感染犬ADSCs |
2.3.6 双硫腙染色及免疫荧光 |
2.3.7 FoxA1 过表达组诱导后糖刺激试验 |
2.3.8 siRNA转染及效果检测 |
2.3.9 FoxA1 干扰组诱导后糖刺激试验 |
2.3.10 过表达组和干扰组诱导后RT-qPCR检测β细胞相关基因表达 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 FoxA1、Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2 不同组合重编程犬ADSCs成为IPCs的研究 |
3.1 材料和试剂 |
3.2 方法 |
3.2.1 FoxA1、Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2 的合成、扩增与纯化回收 |
3.2.2 多基因重组腺病毒载体的构建 |
3.2.3 多基因重组腺病毒的包毒、扩增和滴度测定 |
3.2.4 多基因重组腺病毒感染犬ADSCs |
3.2.5 重编程效果检测 |
3.3 结果 |
3.3.1 各基因的克隆和pAd Track-CMV的双酶切 |
3.3.2 多基因重组腺病毒载体的鉴定 |
3.3.3 多基因重组腺病毒载体在293A细胞中的包装和鉴定 |
3.3.4 多基因重组腺病毒感染犬ADSCs |
3.3.5 重编程后细胞双硫腙染色 |
3.3.6 重编程后细胞糖刺激试验和定量检测β细胞相关基因表达 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
全文结论 |
附录 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(5)Ngn3过表达对诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩略词表 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述:β细胞再生研究现状 |
参考文献 |
作者简历 |
致谢 |
学位论文数据集 |
(6)Pdx1、Ngn3、Isl1、Nkx6.1和Pax4不同组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究(论文提纲范文)
基金 |
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 糖尿病 |
1.1.1 糖尿病的病因及流行病学 |
1.1.2 糖尿病的临床治疗及相关研究 |
1.2 干细胞介导治疗糖尿病 |
1.2.1 胚胎干细胞和诱导多能性干细胞 |
1.2.2 间充质干细胞 |
1.3 胰岛β细胞的发育过程及相关转录因子的研究进展 |
1.3.1 胰岛β细胞的发育过程 |
1.3.2 胰岛β细胞发育调控转录因子的研究进展 |
1.4 转基因诱导干细胞分化为胰岛β细胞的研究进展 |
1.4.1 转基因技术 |
1.4.2 多基因共表达载体的构建 |
1.4.3 转基因技术介导干细胞向胰岛β细胞方向分化 |
1.5 小结 |
第二章 Isl1/Sox8/HADH诱导犬ADSCs向 IPCs分化 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 试验材料 |
2.1.2 试验方法 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 真核重组表达载体的验证 |
2.2.2 感染性腺病毒的验证 |
2.2.3 体外诱导犬ADSCs向 IPCs方向分化效果 |
2.3 讨论 |
2.3.1 p Ad Track-CMV与 p IRES2-EGFP的比较 |
2.3.2 Isl1/Sox8/HADH诱导犬ADSCs向 IPCs分化的效率 |
2.4 小结 |
第三章 多基因共表达腺病毒的制备 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 试验材料 |
3.1.2 试验方法 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 目的基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1、Isl1 的克隆 |
3.2.2 多基因腺病毒穿梭载体的验证 |
3.2.3 多基因共表达腺病毒载体的验证 |
3.2.4 多基因共表达腺病毒的包装与滴度检测结果 |
3.2.5 多基因共表达腺病毒毒液感染犬ADSCs的最佳MOI |
3.2.6 犬ADSCs中外源性目的基因的检测结果 |
3.3 讨论 |
3.3.1 腺病毒的包装 |
3.3.2 基于2A肽构建多基因共表达载体的优势 |
3.4 小结 |
第四章 多基因共表达腺病毒感染犬ADSCs诱导其向IPCs方向分化 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 试验材料 |
4.1.2 试验方法 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 形态学观察结果 |
4.2.2 双硫腙染色结果 |
4.2.3 糖刺激胰岛素分泌试验结果 |
4.2.4 犬ADSCs向 IPCs诱导分化中胰岛β细胞发育调控基因的表达 |
4.2.5 细胞免疫荧光染色结果 |
4.3 讨论 |
4.3.1 多基因共表达腺病毒诱导犬ADSCs向 IPCs分化效果比较 |
4.3.2 多基因共表达诱导方案的优化 |
4.4 小结 |
第五章 结论 |
附录 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(7)Pdx1、Ngn3、Mnx1、Mafa和Pax4组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 糖尿病概况 |
1.2 干细胞与糖尿病治疗 |
1.2.1 胚胎干细胞 |
1.2.2 诱导多能干细胞 |
1.2.3 间充质干细胞 |
1.3 胰岛β细胞发育调控基因的研究进展 |
1.3.1 Pdx1 |
1.3.2 Foxa2 |
1.3.3 Insm1 |
1.3.4 Ngn3 |
1.3.5 Mafa |
1.3.6 Mnx1 |
1.3.7 Pax4 |
1.4 干细胞体外定向分化为胰岛β细胞的研究进展 |
1.4.1 诱导剂法 |
1.4.2 联合培养法 |
1.4.3 转基因法 |
1.5 小结 |
第二章 基因Foxa2、Insm1、Mnx1 的功能验证及筛选 |
2.1 材料 |
2.1.1 菌株、质粒和细胞 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.2 方法 |
2.2.1 基因Foxa2、Insm1、Mnx1 的合成与体外扩增 |
2.2.2 目的序列PCR扩增 |
2.2.3 目的序列的鉴定与回收 |
2.2.4 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
2.2.5 重组腺病毒穿梭载体双酶切鉴定及二次转化扩增 |
2.2.6 重组腺病毒载体的构建和PacⅠ酶切鉴定 |
2.2.7 重组腺病毒的包装、扩增、滴度测定 |
2.2.8 感染犬脂肪间充质干细胞 |
2.2.9 荧光定量PCR检测胰岛β细胞发育调控基因表达 |
2.3 结果 |
2.3.1 含目的基因的真核过表达载体的构建及鉴定 |
2.3.2 含目的基因的腺病毒过表达载体的构建及鉴定 |
2.3.3 荧光定量PCR检测胰岛β细胞发育调控基因表达水平 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 多基因共表达重组腺病毒载体的构建 |
3.1 材料 |
3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 主要仪器 |
3.2 试验方法 |
3.2.1 目的基因的合成和体外扩增 |
3.2.2 目的序列的PCR扩增与鉴定 |
3.2.3 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
3.2.4 重组腺病毒穿梭载体的PCR、双酶切鉴定及二次转化扩增 |
3.2.5 重组腺病毒载体的构建 |
3.2.6 重组腺病毒载体的鉴定和二次转化扩增 |
3.2.7 重组腺病毒载体的包装、扩增、滴度测定 |
3.2.8 目的基因表达水平的检测 |
3.3 结果 |
3.3.1 目的基因扩增及重组腺病毒穿梭载体PCR鉴定 |
3.3.2 重组腺病毒穿梭载体的双酶切鉴定 |
3.3.3 重组腺病毒载体的PacⅠ酶切鉴定 |
3.3.4 多基因共表达腺病毒的包装与扩增 |
3.3.5 病毒滴度 |
3.3.6 目的基因表达水平 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 多基因重组腺病毒载体感染犬ADSCs诱导其向IPCs分化 |
4.1 材料 |
4.1.1 细胞 |
4.1.2 主要试剂 |
4.1.3 主要仪器 |
4.2 试验方法 |
4.2.1 重组腺病毒感染犬ADSCs |
4.2.2 诱导阶段细胞形态学观察及双硫腙染色 |
4.2.3 荧光定量PCR检测胰岛β细胞发育调控基因表达 |
4.2.4 葡萄糖刺激胰岛素分泌试验 |
4.3 结果 |
4.3.1 诱导阶段细胞形态学观察及双硫腙染色 |
4.3.2 胰岛β细胞发育调控基因表达水平 |
4.3.3 葡萄糖刺激胰岛素分泌水平 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第五章 结论 |
附录 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(8)Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2不同组合重编程犬ADSCs成为IPCs的研究(论文提纲范文)
基金项目 |
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 糖尿病研究现状 |
1.2 干细胞治疗与糖尿病 |
1.2.1 胚胎干细胞与糖尿病 |
1.2.2 胰腺干细胞与糖尿病 |
1.2.3 肝脏干细胞与糖尿病 |
1.2.4 间充质干细胞与糖尿病 |
1.3 胰岛β细胞发育相关基因的研究进展 |
1.3.1 胰十二指肠同源盒基因1(Pdx1) |
1.3.2 神经元素3(Ngn3) |
1.3.3 SRY盒基因9(Sox9) |
1.3.4 配对盒同源基因4(Pax4) |
1.3.5 NK转录因子相关同源盒基因家族2基因座位2(Nkx2.2) |
1.3.6 ETS癌基因转录因子家族Fev基因(Fev) |
1.3.7 GATA结合蛋白4 基因(Gata4) |
1.3.8 其他胰岛β细胞发育相关基因 |
1.4 多基因共表达载体的研究进展 |
1.5 外源基因转染细胞技术的研究进展 |
1.6 研究的目的意义 |
第二章 Sox9、Fev和 Gata4 分别转染诱导犬ADSCs分化效果的比较 |
2.1 材料 |
2.1.1 主要试剂、菌株及仪器 |
2.1.2 试剂配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 犬脂肪间充质干细胞的复苏 |
2.2.2 犬Sox9、Fev和 Gata4 基因的获取 |
2.2.3 Sox9、Fev和 Gata4 过表达真核载体的构建及转染 |
2.2.4 Sox9、Fev和 Gata4 过表达腺病毒载体的构建及转染 |
2.3 结果 |
2.3.1 犬脂肪间充质干细胞的复苏结果 |
2.3.2 犬Sox9、Fev和 Gata4 基因的PCR扩增结果 |
2.3.3 Sox9、Fev和 Gata4 过表达真核载体的构建及转染结果 |
2.3.4 Sox9、Fev和 Gata4 过表达腺病毒载体的构建及转染结果 |
2.4 讨论 |
2.4.1 真核表达载体与腺病毒表达载体效果比较 |
2.4.2 Sox9、Fev和 Gata4 基因过表达诱导效果比较 |
2.5 小结 |
第三章 多基因共表达腺病毒载体的构建 |
3.1 材料 |
3.1.1 主要试剂、菌株及仪器 |
3.1.2 试剂配制 |
3.2 方法 |
3.2.1 犬Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2 基因的获取 |
3.2.2 腺病毒表达载体p Ad Track-CMV的扩增及双酶切 |
3.2.3 腺病毒穿梭载体的构建及鉴定 |
3.2.4 腺病毒骨架载体的构建与鉴定 |
3.2.5 腺病毒载体在293A细胞中的包装及过表达效果检测 |
3.2.6 腺病毒感染犬ADSCs后外源基因的表达效果检测 |
3.3 结果 |
3.3.1 目的基因PCR扩增结果 |
3.3.2 腺病毒穿梭载体重组克隆产物的鉴定结果 |
3.3.3 腺病毒骨架载体重组克隆产物的鉴定结果 |
3.3.4 腺病毒载体在293A细胞中的包装及过表达效果检测 |
3.3.5 腺病毒感染犬ADSCs后外源基因的表达效果检测 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 多基因共表达腺病毒感染犬ADSCs的诱导效果比较 |
4.1 材料 |
4.1.1 实验动物 |
4.1.2 主要试剂、菌株及仪器 |
4.1.3 试剂配制 |
4.2 方法 |
4.2.1 犬胰岛的分离培养与鉴定 |
4.2.2 多基因共表达腺病毒感染犬ADSCs后的诱导效果检测 |
4.3 结果 |
4.3.1 犬胰岛双硫腙染色鉴定结果 |
4.3.2 多基因共表达腺病毒感染犬ADSCs后的诱导效果检测 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
个人简历 |
(9)FTS技术及其在未来NGN中的应用研究(论文提纲范文)
0前言 |
1 当前NGN发展趋势研究 |
1.1 ITU-T关于NGN的研究现状 |
1.2 美国关于NGI的研究现状 |
1.3 欧盟的FIRE (Future Internet Research and Experimentation) 项目[14] |
1.4 我国关于NGI的研究现状 |
2 FTS技术简介 |
2.1 FTS方法及系统介绍[22] |
2.2 FTS网络架构[22] |
3 FTS技术在NGN中的应用 |
3.1 FTS网络的多维可扩展性 |
3.2 FTS网络的控制与管理[22] |
3.3 FTS网络的可信性 |
4 结束语 |
四、NGN的研究进展(论文参考文献)
- [1]Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2联合重编程犬脂肪MSCs成为IPCs的研究[D]. 张露文. 西北农林科技大学, 2021
- [2]Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx6.1重编程犬脂肪MSCs向IPCs分化的研究[D]. 陈奕静. 西北农林科技大学, 2021
- [3]基于PDX-1通路研究补肾经方对GDM模型孕鼠胎鼠胰腺发育及胰岛素分泌细胞形成的影响[D]. 王超群. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [4]FoxA1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2重编程犬脂肪间充质干细胞成为胰岛素分泌细胞的研究[D]. 李佳锴. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]Ngn3过表达对诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响[D]. 孔吟皓. 贵州医科大学, 2020(04)
- [6]Pdx1、Ngn3、Isl1、Nkx6.1和Pax4不同组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究[D]. 张霞. 西北农林科技大学, 2020
- [7]Pdx1、Ngn3、Mnx1、Mafa和Pax4组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究[D]. 阮晨梅. 西北农林科技大学, 2020
- [8]Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2不同组合重编程犬ADSCs成为IPCs的研究[D]. 高登科. 西北农林科技大学, 2020
- [9]FTS技术及其在未来NGN中的应用研究[J]. 许云林,戴超,王丽丽,贾志鹏. 中国无线电, 2014(09)
- [10]ITU-T SG13研究组2007年第1次会议总结[J]. ITU-T SG13中国专家组. 电信网技术, 2007(09)