一、hEST2逆转录功能区片段与端粒酶活性相关性（论文文献综述）
赵兵[1]（2020）在《基于人胃黏膜端粒调控网络与衰老学说探讨固本通络汤治疗慢性萎缩性胃炎的机制》文中研究表明研究目的:端粒缩短是反应细胞衰老的生物学标志物,研究显示,慢性萎缩性胃炎（CAG）患者胃黏膜端粒长度较同龄正常人缩短,提示CAG或与胃黏膜衰老有关,然相关分子机制尚未阐明。既往临床研究证实,导师根据“胃天年”理论运用固本通络汤治疗CAG在临床上具有较好的疗效,然固本通络汤疗效发挥的机制尚不明确。本研究通过对CAG患者胃黏膜端粒长度与端粒结合蛋白TRF1、TRF2、POT1 mRNA及蛋白表达水平、细胞衰老通路关键因子p53mRNA表达水平的研究,从端粒调控网络与衰老角度探讨CAG的发病机制以及固本通络汤治疗CAG的机制。研究方法:（1）CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究采用病例对照研究的实验设计,收取30例CAG患者及30例CNAG患者作为对照组,所有患者均于中国中医科学院广安门医院行胃镜检查及病理活检,明确诊断。通过填写调查问卷以确定两组患者疾病发生的危险因素,通过检测患者胃窦部黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达以及细胞衰老通路关键因子p53mRNA表达,探讨人胃黏膜端粒调控网络及衰老与CAG的相关性,以进一步明确CAG发病的分子机制。（2）固本通络汤治疗CAG的机制研究采用自身前后对照的实验设计,回顾性的收取经固本通络汤治疗3个月后胃窦部黏膜病理至少改善一个等级的患者30例,对其治疗前后的胃窦部病理标本进行再切片,通过检测胃窦部黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达以及细胞衰老通路关键因子p53mRNA表达,探讨固本通络汤对端粒调控网络及细胞衰老通路关键基因p53的影响,从而明确固本通络汤疗效发挥的机制。研究结果:（1）CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究两组患者基线比较:性别、年龄组成无明显差异,基线一致,具有可比性。两组患者相关危险因素比较:与CNAG组相比,CAG患者中有Hp感染史者更多、病程更长,差异有统计学意义（P<0.05）;BMI、吸烟史、饮酒史、熬夜、暴饮暴食、喜食辛辣刺激、生冷及高盐饮食、胃癌家族史及现症感染Hp等危险因素差异均无统计学意义。两组患者病理情况比较:CAG组患者中,伴萎缩22例（占73.3%）、伴肠化29例（占96.7%）、伴异型增生1例（占3.3%）,两组患者胃黏膜病理积分有明显差异（t’=9.682,P<0.001）。两组患者胃黏膜端粒长度比较:两组患者胃黏膜相对端粒长度均不符合正态分布,CAG组相对端粒长度中位数为0.67,CNAG组相对端粒长度中位数为1.06,CAG组较CNAG组相对端粒长度短,差异有统计学意义（U=297.000,P=0.024）两组患者胃黏膜TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达水平的比较:胃黏膜TRF1mRNA在CNAG组高表达,但差异无统计学意义（t=0.788,P=0.434）;TRF2mRNA在CAG组高表达,但差异无统计学意义（t=1.969,P=0.054）;POT1mRNA在CNAG组高表达,但差异无统计学意义（t’=-1.225,P=0.226）;TRF1、TRF2、POT1蛋白在CAG组均高表达,与CNAG组比较差异显着,有统计学意义（P<0.01）。两组患者胃黏膜p53mRNA表达水平的比较:p53mRNA在CAG组高表达,但差异无统计学意义（t=0.260,P=0.796）。胃黏膜端粒长度与年龄的相关性分析:CAG组及CNAG组胃黏膜端粒长度与年龄均无相关性（CAG 组:r=-0.303,P=0.131;CNAG 组:r=-0.195,P=0.302）胃黏膜端粒长度与 TRF1、TRF2、POT1、p53mRNA 及 TRF1、TRF2、POT1蛋白表达的相关性分析:CAG组p53mRNA表达水平与胃黏膜端粒长度存在轻度负相关（r=-0.396,P=0.031）,回归方程Y=-0.321X+1.099（F=3.438,P=0.074）,提示该回归方程无统计学意义,因而不能用p53mRNA表达水平预测CAG胃黏膜端粒长度,CNAG组胃黏膜端粒长度与TRF1、TRF2、POT1及p53mRNA水平均无相关性;CAG组TRF2、POT1蛋白表达量与胃黏膜端粒长度呈负相关,其中TRF2蛋白表达量与端粒长度的线性回归方程为Y=-0.041X+1.249（F=1.741,P=0.198）,提示该回归方程无统计学意义,不能用TRF2蛋白表达量预测CAG胃黏膜端粒长度,POT1蛋白表达量与端粒长度的线性回归方程为Y=-0.103X+1.272（R2=0.206,F=7.249,P=0.012）,CNAG 组胃黏膜端粒长度与 TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量均无相关性。胃黏膜病理积分与胃黏膜相对端粒长度、TRF1、TRF2、POT1、p53mRNA表达水平及TRF1、TRF2、POT1蛋白表达水平的相关性:60例受试者胃黏膜病理积分与胃黏膜相对端粒长度呈负相关（r=-0.410,P=0.001）,线性回归方程为Y=-5.018X+11.54（R2=0.181,F=12.81,P<0.001）;胃黏膜病理积分与 TRF1mRNA表达水平无相关性（r=-0.054,P=0.682）,与TRF2mRNA表达水平呈正相关（r=0.339,P=0.008）,与 POT1mRNA 表达水平无相关性（r=0.052,P=0.695）,与p53mRNA表达水平亦无相关性（r=0.037,P=0.778）;胃黏膜病理积分与TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量均呈正相关,与TRF1蛋白表达量回归方程为Y=1.974X+0.534（R2=0.437,F=45.04,P<0.001）,与 TRF2 蛋白表达量回归方程为Y=0.848X-1.457（R2=0.138,F=9.312,P=0.003）,与POT1蛋白表达量回归方程为 Y=1.743X+0.814（R2=0.294,F=24.15,P<0.001）。CAG发病的多因素Logistic回归分析:TRF1与POT1蛋白表达阳性为CAG的独立危险因素,TRF1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的16.54倍（95%CI:1.84-149.03）,POT1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的9.11倍（95%CI:1.64-50.54）。（2）固本通络汤治疗CAG的机制研究治疗前后病理资料比较:萎缩、肠化、慢性炎症治疗前后的构成比差异显着,具有统计学意义（P<0.01）;萎缩、肠化治疗前后积分及治疗前后总积分差异显着,具有统计学意义（P<0.001）;慢性炎症治疗前后积分无明显差异（P>0.05）;异型增生病例数仅为1例,因而治疗前后差异无统计学意义。治疗前后胃黏膜端粒长度的比较:治疗前胃黏膜相对端粒长度为0.30±0.16,治疗后为0.32±0.19,治疗前后差值为-0.02±0.20,差异无统计学意义（t=-0.549,P=0.587）,无法证明固本通络汤对治疗前后的胃黏膜端粒长度有影响。治疗前后胃黏膜TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达水平比较:治疗前后TRF1表达水平较治疗前下降,差异有统计学意义（P<0.05）,治疗前后TRF2及POT1mRNA表达水平无差异,因此无法证明固本通络汤对TRF2及POT1mRNA表达有影响;治疗前后胃黏膜TRF1、TRF2及POT1蛋白表达量差异均无统计学意义（P>0.05）,无法证明固本通络汤对TRF1、TRF2及POT1蛋白表达有影响。治疗前后胃黏膜p53mRNA表达水平比较:治疗后p53mRNA的表达水平较治疗前下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:我们通过对CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究发现:（1）CAG患者胃黏膜端粒长度较CNAG患者缩短,端粒的缩短与CAG的发生密切相关。（2）CAG患者胃黏膜TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量显着高于CNAG患者;CAG患者胃黏膜TRF2、POT1蛋白表达量与胃黏膜端粒长度呈负相关,考虑CAG患者胃黏膜端粒缩短与TRF2、POT1蛋白的过表达有关。（3）CAG患者的p53mRNA表达水平与胃黏膜端粒长度存在轻度负相关,CAG患者中端粒长度缩短伴随着p53mRNA表达增高,初步考虑为p53通路的激活以介导细胞衰老,防止端粒过短被识别为DNA损伤,引起染色体不稳定而发生癌变,有待进一步研究证实。（4）本研究60例受试者胃黏膜病理积分与胃黏膜相对端粒长度呈负相关,与TRF2mRNA表达水平及TRF1、TRF2及POT1蛋白表达量均呈正相关,且有统计学意义,因此胃黏膜端粒长度、TRF2mRNA表达水平、TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量均可以预测胃黏膜的病变程度。（5）TRF1和POT1蛋白表达阳性是CAG的独立危险因素,TRF1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的16.54倍,POT1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的9.11倍。临床上对胃黏膜TRF1及POT1蛋白的免疫组化检测可作为CAG诊断和预后的参考指标。通过对固本通络汤治疗后胃黏膜病理改善者的自身前后对照研究发现:（1）固本通络汤治疗前后胃黏膜相对端粒长度无明显差异,尚不能说明固本通络汤对胃黏膜端粒长度有影响。（2）固本通络汤可以下调TRF1mRNA的表达水平。（3）固本通络汤治疗前后TRF1、TRF2、POT1蛋白表达无明显差异,尚不能说明固本通络汤对TRF1、TRF2、POT1蛋白表达有影响。（4）固本通络汤可以下调p53mRNA表达水平,初步考虑固本通络汤可能是通过延缓端粒缩短的速度,为DNA损伤修复机制提供机会,阻断p53介导细胞衰老通路的激活,从而达到延缓胃衰老、逆转CAG的作用,然其机制尚有待于进行细胞体外和动物体内实验做进一步的验证。
王菲[2]（2012）在《hTERT pre-mRNA选择性剪接在调控胶质瘤端粒酶活性中作用的研究》文中研究表明研究目的:端粒是控制细胞增殖与衰老凋亡的生物钟,分化成熟的正常人体细胞不表达端粒酶,因次端粒随细胞分离次数增加逐渐缩短。端粒酶异常再表达及活化与细胞恶性转化密切相关,约90%以上恶性肿瘤有端粒酶再表达及活化。人端粒酶逆转录酶（hTERT）是人端粒酶的催化亚单位及决定其活性的关键因素。hTERT对端粒酶活性的调控分为转录水平调控和hTERT pre-mRNA选择性剪接调控,即转录后水平调控。α和β两个位点的缺失是目前hTERT pre-mRNA剪接调控中研究较多的位点。hTERT pre-mRNA序列上存在着外显子剪接增强子（ESE）序列,反义寡核苷酸与之相结合可诱导外显子跳跃,改变选择性剪接模式。本研究应用反义寡核苷酸与hTERT pre-mRNA中的外显子剪接增强子结合,调控其剪接模式,减少全长型hTERT mRNA的表达,抑制端粒酶活性,从而影响胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭。旨在探讨hTERT pre-mRNA的选择性剪接对端粒酶活性的调节作用,为新一代端粒酶抑制剂研发提供新思路及参考依据。研究方法:第一部分:以胶质瘤细胞系和胶质瘤组织标本为研究对象,采用RT-PCR方法检测hTERT选择性剪接变异体,用TRAP方法检测端粒酶活性,分析hTERT选择性剪接变异体和端粒酶活性的关系。第二部分:应用ESEfinder3.0软件分析hTERT pre-mRNA序列上外显子剪接增强子（ESE）的位点,特别是对外显子5～外显子9之间的序列进行预测分析,以获得分值较高,即ESE概率较大的位点。根据ESE序列设计并合成与其互补的反义寡核苷酸,将其转染U251胶质瘤细胞,探讨不同化学修饰结构对胶质瘤细胞端粒酶活性及端粒长度的影响。第三部分:应用TRAP法、TRF法检测经反义寡核苷酸长时程处理后U251细胞的端粒酶活性及端粒长度;应用MTT法、平板克隆形成实验、PI染色细胞周期测定、单细胞凝胶电泳、DNALadder实验、Annexin V/PI双染色细胞凋亡检测法、2DMatrigel实验、3DMatrigel实验、Transwell实验等,分析经反义寡核苷酸长时程处理后U251细胞的增殖、凋亡和侵袭能力的变化;应用Western blot技术检测与肿瘤细胞恶性表型相关的蛋白表达变化情况;观察经反义寡核苷酸长时程处理后U87细胞干细胞神经球的形成情况,及用TRAP法、TRF法检测U87干细胞的端粒酶活性及端粒长度。结果:第一部分:胶质瘤组织中及胶质瘤细胞系内均存在hTERT选择性剪接变异体表达。端粒酶活性和全长型hTERTmRNA表达相对量存在相关性,而总hTERT mRNA与端粒酶活性无相关性。第二部分:设计合成的2’-氧-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸可调节hTERT pre-mRNA的剪接作用,产生外显子跳跃;使hTERT外外显子7和外显子8丢失,减少了全长型hTERT mRNA的表达,而增加了 β缺失型hTERT mRNA的表达;降低了 U251胶质瘤细胞的端粒酶活性。第三部分:经反义寡核苷酸长时程处理的U251细胞端粒酶活性降低,端粒长度缩短,增殖活性受到抑制,细胞凋亡显着增加,侵袭能力明显减弱,肿瘤细胞恶性表型相关的蛋白表达明显下调;经反义寡核苷酸长时程处理的U87细胞干细胞神经球形成不良,干细胞的端粒酶活性降低,端粒长度缩短。结论:1.hTERT pre-mRNA存在选择性剪接现象,可生成多种剪接变异体。总hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性并不是一一对应的关系,只有全长型hTERT蛋白具有促端粒酶活性。2.hTERT pre-mRNA序列上存在ESE位点,与之互补的2’-氧甲基硫代磷酸酯反义寡核苷酸可调控hTERT pre-mRNA选择性剪接模式,介导hTERT pre-mRNA外显子跳跃,减少全长型hTERT mRNA的表达,增加β缺失型hTERT mRNA的表达,从而抑制胶质瘤细胞的端粒酶活性。3.反义寡核苷酸通过改变hTERT pre-mRNA的选择性剪接模式抑制端粒酶活性,缩短端粒长度,使细胞增殖能力减弱,使肿瘤细胞凋亡明显,抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力。使胶质瘤干细胞的增殖能力减弱,端粒酶活性降低、端粒长度变短。4.本研究可为新一代端粒酶抑制剂研发提供新思路及参考依据,为胶质瘤基因治疗提供新的靶点及重要线索,可能成为将来胶质瘤治疗的有效策略之一。
唐斌[3]（2012）在《TNKS1基因在人脑星形细胞瘤中的表达、作用及机制研究》文中认为第一章TNKS1在人脑星形细胞瘤中的表达及临床意义目的：探讨端锚聚合酶Tankyrase1（TNKS1）在人脑星形细胞瘤中的表达及临床意义。方法：应用免疫组化SP法、RT-PCR法及Western blot法,检测51例新鲜人脑各级别星形细胞瘤和6例正常脑组织中TNKS1mRNA和蛋白的表达,并分析其与临床病理资料之间的关系。结果：与正常脑组织相比,星形细胞瘤中TNKS1mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）,并且TNKS1mRNA和蛋白的表达水平显着正相关（r=0.958,P<0.01）。随着星形细胞瘤病理级别的升高,TNKS1在mRNA和蛋白表达的水平均逐渐升高,各级别之间比较存在差异,具有统计学意义（P<0.01）,但TNKS1mRNA和蛋白表达水平在不同性别及年龄组间无显着性差异（P>0.05）。结论：TNKS1mRNA和蛋白在人脑星形细胞瘤中呈高水平表达,且随着星形细胞瘤病理级别的升高,其表达水平逐渐升高,提示TNKS1可能作为一癌基因参与了星形细胞瘤的发生发展过程,TNKS1有可能作为评价人脑星形细胞瘤恶性程度的新指标之一。第二章siRNA特异性沉默U251细胞中TNSK1基因的表达目的：设计合成并筛选出特异性沉默人TNKS1基因表达的siRNA序列,为进一步体外研究TNKS1基因沉默对U251细胞生物学行为的影响提供材料。方法：以人脑星形细胞瘤U251细胞株为研究对象,首先体外培养U251细胞,并RT-PCR法检测’TNKS1mRNA在U251细胞中的表达。再针对TNKS1基因设计3个不同靶点的siRNA干扰序列,通过脂质体法转染入U251细胞,荧光倒置显微镜观察转染效率,实时荧光定量PCR法和Western blot法筛选沉默效率最高的siRNA序列,再将筛选出的TNKS1siRNA序列转染入U251细胞,Western blot法检测其对TNKS1蛋白的抑制作用。结果：TNKS1在U251细胞中表达。脂质体转染siRNA入U251细胞后,荧光倒置显微镜观察转染效率为（84.53±4.39）%。实时荧光定量PCR法和Western blot法检测到组4（TNKS1-siRNA-2239）的TNKS1mRNA和蛋白表达水平分别为较组1（空白对照组）、组2（阴性对照组）、组3（TNKS1-siRNA-3224）、组5（TNKS1-siRNA-1530）明显下降,存在显着性差异（P<0.01）。转染筛选出的siRNA进入U251细胞,Western blot法定量检测发现TNKS1蛋白表达水平为0.175±0.020,明显低于空白对照组（0.667±0.015）和阴性对照组（0.630±0.024）,具有显着性差异（P<0.01）。结论：筛选出沉默效率最佳的TNKS1siRNA干扰序列,并在U251细胞中成功抑制TNKS1基因的表达,为进一步体外研究TNKS1基因沉默对U251细胞生物学行为的影响提供基础。第三章siRNA沉默TNKS1基因表达对U251细胞生物学行为的影响目的：探讨siRNA沉默TNKS1基因表达对U251细胞生物学行为的影响,以明确其在星形细胞瘤肿瘤形成过程中的可能作用。方法：实验分为3组：空白对照组（未予任何干扰因素的U251细胞株）,阴性对照组（加入非特异性siRNA/Lipofectamine的U251细胞株）,siRNA干扰实验组（TNKS1-siRNA-2239-脂质体转染的U251细胞株）,分别使用MTT法、Transwell法、流式细胞仪PI染色法、Annexin V/PI双标法检测siRNA沉默TNKS1基因表达对U251细胞增殖、侵袭、凋亡等生物学行为的影响。结果：1、MTT法检测到在相同时间点,siRNA干扰组细胞生长增殖速度较空白对照组和阴性对照组显着降低（P<0.01）；2、细胞侵袭实验证实siRNA干扰组U251细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数明显减少,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）；3、流式细胞仪PI染色法结果示siRNA干扰组Anterior G0/G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少（P<0.05）；4、Annexin V/PI双标法结果示siRNA干扰组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率较对照组明显增加（P<0.01）。在上述实验中,空白对照组和阴性对照组均无明显差异（P>0.05）。结论：siRNA沉默TNKS1基因表达后,可有效抑制U251细胞的生长增殖,减低其侵袭能力,诱导肿瘤细胞凋亡。第四章TNKS1在人脑星形细胞瘤中的相关作用机制的初步研究目的：初步探讨TNKS1基因在人脑星形细胞瘤中的相关作用机制。方法：1、选取端粒酶的核心成分端粒酶催化亚单位（hTERT）和端粒重复单位结合因子（TRF1）作为研究对象,Western blot法分析在U251细胞中下调TNKS1对hTERT和TRF1表达水平的影响。2、选取Wnt/β-catenin信号通路的核心成分β-catenin作为研究对象,通过免疫组化分析β-catenin在人脑星形细胞瘤中的表达,并研究其与TNKS1表达的相关性。结果：1、siRNA干扰组hTERT蛋白表达相对水平为0.182±0.031,较空白对照组（0.352±0.026）和阴性对照组（0.347±0.046）明显降低（P<0.01）；siRNA干扰组TRF1蛋白表达相对水平为0.271±0.056,较空白对照组（0.094±0.023）和阴性对照组（0.133±0.037）明显升高（P<0.01）,两对照组hTERT、TRF1蛋白表达相对水平比较无统计学意义（P>0.05）。2、与正常脑组织对比,β-catenin在星形细胞瘤中阳性表达,且在高级别星形细胞瘤组中表达明显强于低级别星形细胞瘤,具有显着差异性（P<0.01）,相关性分析显示TNKS1蛋白IRS和β-catenin蛋白IRS显着正相关（r=0.848,P<0.01）。结论：1、U251细胞中siRNA沉默TNKS1基因表达可导致hTERT表达下降,TRF1表达升高,TNKS1在U251细胞的端粒长度维持机制中起重要作用。2、星形细胞瘤中TNKS1和β-catenin蛋白表达正相关,TNKS1可能作为经典的Wnt/β-catenin信号通路的正向调控因子在星形细胞瘤中起重要作用。
卢钧雄[4]（2012）在《端粒酶逆转录酶C端重组质粒构建与表达及对细胞增殖和活力的影响》文中研究说明研究背景和目的端粒存在于真核生物线性染色体末端,其主要生物学功能是保护染色体末端,避免染色体末端被核酸酶降解,并有效防止染色体之间融合、重组和降解,在维持基因组的结构完整性和稳定性上起到重要作用。在正常人体细胞中,端粒可随着细胞分裂而逐渐缩短,随着分裂次数增加,分裂多次的细胞染色体端粒越来越短。当缩短到一定程度时,染色体DNA将变得不再稳定,细胞进入增殖衰竭期,螺旋解开,细胞继续存活但不能再分裂,最终走向自然衰老或死亡。人端粒酶是由人端粒酶RNA组分（hTR）,人端粒酶相关蛋白和人端粒酶逆转录酶（hTERT）三部分组成的蛋白质复合物。它能在缺少DNA模板的情况下,以自身RNA为模板通过逆转录不断合成新的端粒重复序列,并连接到染色体端粒3,末端,弥补端粒丢失,从而阻止端粒的缩短,并可能使得细胞最终逃脱程序性死亡,获得无限增殖能力,即细胞永生化。在大部分的肿瘤组织中均检测到端粒酶活性,端粒酶活性与恶性肿瘤有着密切关系。这表明端粒酶的激活可能是肿瘤发生过程中的关键因素。90%以上的恶性肿瘤细胞因为激活端粒酶,能把端粒缩短的部分补上,细胞分裂后端粒并不缩短,这是肿瘤细胞永生化的重要前提条件,也使得端粒酶成为识别肿瘤细胞和正常细胞的6个重要标志之一。进一步的研究表明.端粒酶的表达水平与恶性肿瘤的发生、发展、转移及预后有着高度相关性。人端粒酶逆转录酶（hTERT）作为人端粒酶的重要组成部分之一。hTERTmRNA与端粒酶活性相一致,所以hTERT是控制细胞端粒酶活性的限制酶之一,对维持肿瘤细胞的生长非常重要,抑制端粒酶活性可以使细胞内的端粒正常地缩短长度。hTERT对端粒的延伸作用,乃至肿瘤的发生过程,不仅仅是简单地激活端粒酶,而且还包括hTERT蛋白在胞浆和核仁之间的穿梭运输机制。研究中证实hTERT C-端第965-981氨基序列所编码的蛋白是介导hTERT核仁定位的一个必须的核仁定位信号。进一步研究中发现,第965-981氨基酸序列中富含保守的碱性氨基酸,该区域是决定hTERT核仁定位的关键信号。hTERT通过相关蛋白的作用与端粒DNA3’悬突端结合,使端粒引物末端刚好位于端粒酶RNA（TR）模板区的起始端,是使端粒不断延伸的关键步骤。hTERT与端粒的结合部位主要是端粒DNA3’悬突端重复的（TTAGGG）n基因序列。有研究显示hTERT C-端中的第963-972氨基酸序列、第993-1002氨基酸序列、第1047-1056氨基酸序列、第1077-1086氨基酸序列和第1108-1117氨基酸序列所编码的五个蛋白与端粒DNA3’悬突端重复序列存在蛋白结合活性,能够与（TTAGGG）n重复序列形成蛋白质-DNA结合物。本文拟在hTERT C-端截取编码第936-1132氨基酸的碱基序列,并命名为hTERT C197,该基因序列包括核仁定位信号（第965-981氨基酸）和与端粒DNA3’悬突端结合的氨基酸序列（第963-972、993-1002、1047-1056、1077-1086、1108-1117氨基酸）。将hTERT C197通过构建原核重组质粒和真核重组质粒,并分别在原核表达系统和真核表达系统表达该片段蛋白,为了探讨hTERT在人类细胞内的定位与结合的情况提供前期的研究基础。为了初步研究hTERT C197对人类癌细胞和永生化细胞的作用,将构建的真核重组质粒分别转染人子宫癌Hela细胞和永生化的人胚肾293T细胞,采用MTT比色法检测细胞增殖和细胞活力。方法和内容：1. hTERT C197原核重组质粒构建与表达1.1外源基因片段的获取通过引物设计软件和原核表达载体多克隆位点区的特点设计PCR扩增引物,引物两端分别引入特异性酶切位点BamHI和XhoI,以hTERT cDNA为模板扩增外源基因序列,并经过回收纯化得到外源基因片段。1.2重组质粒的构建原核表达载体pEGX-4T-1和外源基因片段通过特异性内切酶BamHI和XhoI双酶切,将得到的酶切产物通过T4连接酶系统进行连接反应,所得连接产物转化入大肠杆菌DH5α,构建转化菌。提取原核重组质粒pEGX-4T-1-hTERT C197,并进行一系列鉴定,确定原核重组质粒的成功构建。1.3目的蛋白的诱导表达将成功构建的原核重组质粒转化入宿主菌BL21（DE3）,并进行一系列鉴定确定工程菌的成功构建。采用IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,提取细菌蛋白后,通过蛋白电泳和免疫印迹法检测和鉴定目的蛋白表达情况。2. hTERT C197真核组质粒构建与表达2.1外源基因片段的获取通过引物设计软件和原核表达载体多克隆位点区的特点设计PCR扩增引物,引物两端分别引入特异性酶切位点KpnI和Xbal,以hTERT cDNA为模板扩增外源基因序列,并经过回收纯化得到外源基因片段。2.2重组质粒的构建真核表达载体pcDNA3.1-HisA和外源基因片段通过特异性内切酶KpnI和XbaI双酶切,将得到的酶切产物通过T4连接酶系统进行连接反应,所得连接产物转化入大肠杆菌DH5α,构建转化菌。提取真核重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT C197,并进行一系列鉴定确定真核重组质粒的成功构建。2.3细胞转染与蛋白表达采用脂质体转染法将真核重组质粒转染入人子宫癌Hela细胞和人胚肾293T细胞,转染后48小时提取各自细胞的细胞核蛋白。通过免疫印迹法鉴定目的蛋白的表达情况。3. hTERT C197对Hela和293T细胞的细胞增殖及细胞活力的影响3.1细胞培养与转染按常规细胞培养方法对Hela细胞和293T细胞进行复苏、传代等操作。选择96孔培养板接种细胞,将Hela细胞和293T细胞分别按1×104个/孔和1.1×104个/孔的细胞量各转接于培养板。Hela细胞和293T细胞各转接7块96孔板,每块培养板中铺45个孔,待细胞贴壁后进行实验干预。3.2细胞增殖及细胞活性影响的统计学比较。实验干预后每隔24h取出Hela细胞和293T细胞各一块培养板,MTT法测量所有实验孔OD值,空白组、空载体组和重组质粒组各有3×5=15个单独样本。采用SPSS13.0统计软件,使用析因分析法和单因素方差分析法进行统计分析,分析是否具有显着性差异。依照公式：抑制率（%）=（1-重组质粒组OD值／空载体组OD值）×100%,计算每天的抑制率,从而得出hTERT C197对Hela和293T细胞的细胞增殖及细胞活力的影响。结果：1.外源基因片段可以通过PCR的方法扩增。2. hTERT C197可以与原核载体pEGX-4T-1构建原核重组质粒。3.原核重组质粒pEGX-4T-1-hTERT C197可以在宿主菌BL21中通过IPTG诱导融合蛋白表达,并通过免疫印迹法证明其表达。4. hTERT C197可以与真核载体pcDNA3.1-HisA构建真核重组质粒。5.真核重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT C197可以通过脂质体转染Hela细胞和293T细胞,并通过免疫印迹法证明,该蛋白能在细胞核内被检测。6.依照单因素方差分析结果显示,在实验干预后七天内,每天的空白组与空载体均无显着性差异（P>0.05）；每天的空白组与重组质粒组均有显着性差异（P<0.001）；每天的空载体组与重组质粒组均有显着性差异（P<0.001）。即转染载体pcDNA3.1-HisA对Hela细胞和293T细胞的增殖和活力无影响,而转染重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT C197对Hela细胞和293T细胞的增殖和活力有影响。7.通过统计学分析证明hTERT C197可以抑制Hela细胞和293T细胞的细胞增殖及细胞力性。hTERT C197对Hela细胞最大抑制出现在第五天,抑制率为33.07±0.229（%）;hTERTC197对293T细胞最大抑制出现在第五天,抑制率为33.92±0.114（%）。结论1.成功构建原核重组质粒pEGX-4T-1-hTERT C197,并成功在原核表达系统中表达融合蛋白。2.成功构建真核重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT C197,并成功在真核表达系统中表达融合蛋白。3. hTERT C197对Hela细胞和293T细胞的细胞增殖及细胞活力具有显着性的抑制作用。本实验的创新之处：目前国际上对于恶性肿瘤发生机制已有多方面的研究。本课题首次构建包含hTERT936-1132编码序列（即hTERT C197）的原核重组质粒和真核重组质粒,并成功通过原核表达系统和真核表达系统表达蛋白。为下一步研究hTERT C端在肿瘤组织细胞内定位与结合提供了关键的实验材料。通过进一步的研究证实hTERTC197对Hela细胞和293T细胞的细胞增殖及细胞活力具有抑制作用,为抗肿瘤药物的研制提供新的思路。
陈陵[5]（2011）在《hTERT调控相关miRNA的鉴定及功能研究》文中研究指明研究背景:国外及我们前期工作表明,体细胞端粒酶的激活是肿瘤细胞恶性转化并无限增殖的一个重要条件,端粒酶在85%以上的癌组织中表达,而正常体细胞内不表达或低表达。端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）是端粒酶的限速亚单位,直接决定端粒酶的活性。hTERT的表达水平与端粒酶活性呈平行关系,hTERT变化可准确反映细胞中端粒酶活性的变化。因此,端粒酶,更为准确地说,端粒酶亚单位hTERT活化导致端粒酶激活是肿瘤发生发展的重要环节。以往有关hTERT的调控研究多集中于转录水平,很少涉及转录后调控。miRNA是基因转录后调控的重要因素。至今已发现7百多条miRNA,约调控着1/3的蛋白编码基因。一些miRNA被证实在很多生理及病理过程中起着重要的作用,包括肿瘤的发生发展与转移。目前仅发现一条miRNA（miR-138）参与了hTERT的转录后调控。靶基因的转录后调控一般多有数条miRNA参与,因此我们推测还有其它miRNA参与hTERT转录后调控。研究方法:（1）采用生物信息学技术预测可能调控hTERT的miRNA;（2）采用miRNA芯片技术筛选可能参与调控hTERT的miRNA;（3）采用荧光实时定量PCR技术（real-time PCR）验证筛选的hTERT调控相关的miRNA;（4）采用特异的miRNA前体RNA序列（miRNA mimics）转染细胞,或负载miRNA表达序列的慢病毒感染细胞,上调细胞内miRNA的表达丰度;（5）采用Western blot和RT-PCR方法验证miRNA对靶基因hTERT的调控作用;（6）采用双荧光素酶实验验证miRNA对hTERT的靶向调控机制;（7）采用MTT实验及Transwell实验对hTERT调控相关的miRNA进行功能分析,观察这些hTERT调控相关的miRNA在体外对胃癌细胞株生物学行为的影响。研究结果:（1）利用生物信息学软件预测,发现57条miRNA可能调控hTERT的表达,并采用miRNA基因芯片技术,检测hTERT阳性的胃癌组织以及hTERT阴性的癌旁组织miRNA的差异,结合生物信息学预测结果,初步筛选到14条可能调控hTERT的miRNA;进一步采用real-time PCR进行验证,发现这14条miRNA中有9条可能在转录后水平调控hTERT表达;（2）采用负载相应miRNA的慢病毒感染人胃腺癌SGC-7901细胞后,Western blot结果显示有5条miRNA可下调hTERT的表达丰度,分别是hsa-miR-1266, 1182, 491-5p, 138, 1207-5p;（3）采用双荧光素酶实验及点突变实验证实上述5条miRNA可与hTERT mRNA 3’UTR结合,从而发挥对hTERT靶基因转录后翻译的抑制作用;（4） MTT实验表明以上5条miRNA在体外可有效抑制人胃癌细胞株SGC-7901的增殖,Transwell实验显示以上5条miRNA在体外可有效抑制人胃癌细胞株SGC-7901的侵袭能力。研究结论: （1）与hsa-miR-138一样,hsa-miR-491-5p、1266、1207-5p和1182等4条miRNA在转录后水平抑制其共同的靶基因hTERT的表达水平;其作用机制是通过结合于hTERT 3’UTR上互补序列而干扰hTERT mRNA的正常翻译;（2）与hsa-miR-138一样,hsa-miR-491-5p、1266、1207-5p和1182等4条miRNA对hTERT蛋白在转录后水平的调控是微调作用,只能有限下调hTERT表达丰度而不能完全抑制hTERT蛋白的表达;（3） hTERT调控相关的miRNA在体外可有效抑制人胃腺癌SGC-7901细胞株的增殖与迁移、侵袭能力,其机制可能是通过抑制hTERT的表达。综上所述,本研究新发现的4条hTERT调控相关的miRNAs,即miR-491-5p、1266、1207-5p和1182,丰富了hTERT调控的理论体系,为胃癌的防治研究提供了新的靶点。
杨胜辉[6]（2010）在《载有hTERT基因逆转录病毒感染日本血吸虫童虫的研究》文中提出迄今为止,应用于血吸虫病防治实践的技术仍存在许多不足,尤在控制日本血吸虫病流行与传播方面尚无理想方法。30年前有学者提出,建立稳定生长和连续传代培养的血吸虫细胞系,可为寻求新的防治技术提供基础和条件,但通过数十年的细胞培养技术探索,一直未能实现建立可连续传代生长的血吸虫细胞系目标。本研究受哺乳动物体细胞经转导外源永生化基因后成功建立永生化细胞系的启示,开展了采用逆转录病毒载体对日本血吸虫童虫细胞进行外源基因转导的生物学理论探索,制备了载有永生化基因（hTERT）的双嗜性逆转录病毒和泛嗜性逆转录病毒,并观察了这2种逆转录病毒载体转导外源基因到日本血吸虫童虫细胞或虫体后所发生的整合、转录和表达以及对Sj细胞增殖的影响。本研究目的在于为血吸虫细胞永生化研究提供理想的转导外源基因的载体,验证外源hTERT基因能否在血吸虫体内整合、表达及其表达部位,同时探索hTERT基因表达诱导细胞增殖的可行性。[目的]探讨用双嗜性逆转录病毒载体将外源基因导入日本血吸虫（Sj）细胞的生物学理论与实验依据。[方法]从GenBank中收集褐家鼠双嗜性逆转录病毒受体（rRam-1）的氨基酸序列,应用Blastp工具对其进行序列相似性搜索,并用Cluster W2工具对相似性较高的氨基酸序列进行同源性分析；采用RPS-blast与InterproScan在线工具对rRam-1受体及其同源的氨基酸序列进行保守区域分析；进一步应用多个在线分析工具对与rRam-1同源的Sj蛋白进行蛋白二级结构、疏水性、跨膜性、信号肽、亚细胞定位以及翻译后修饰点等进行分析与预测；在生物信息学预测的基础上采用含短片段外源基因的双嗜性逆转录病毒载体感染Sj-12d童虫细胞培养物,并应用PCR与RT-PCR方法检测外源基因在Sj细胞中的整合与表达。[结果]rRam-1氨基酸残基序列相似性搜索及同源性分析显示,其氨基酸序列与多种脊椎动物的钠离子依赖性的磷酸盐运载体家族的氨基酸序列有很高的同源性,一致性均在59%以上,其中,与中国仓鼠Ram-1受体（cRam-1）和人类Ram-1 （h Ram-1）受体的氨基酸序列一致性均为93%；此外,与多种无脊椎动物磷酸盐运载体家族的氨基酸序列也有较高的同源性,氨基酸一致性在42%以上；Sj中存在2种与rRam-1受体有较高同源性的蛋白SJCHGC09605和SjCHGC05362,它们与rRam-1受体之间的氨基酸序列一致性分别为54%和61%,相似性分别为74%和72%。2种血吸虫蛋白与人类、褐家鼠及中国仓鼠的Ram-1受体蛋白处于平行的进化分枝上。保守性分析显示,2种Sj蛋白与人类、褐家鼠及中国仓鼠的Ram-1受体存在相同的PH04 Superfamily保守结构域,均为磷酸盐运载体超家族成员；二级结构显示,SJCHGC09605和SJCHGC05362蛋白中,α螺旋分别占68.97%和39.22%,跨膜区预测显示分别有7个和5个可能的区域,与疏水性预测结果完全一致；亚细胞定位及翻译后修饰位点分析显示,2种蛋白均不含信号肽序列和亚细胞定位信号,也不含糖基化、磷酸化和脂酰化等翻译后修饰位点。利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫细胞后,经PCR与RT-PCR检测到目的基因存在与表达,扩增的目的片段大小为330 bp,与理论值相符。[结论]双嗜性逆转录病毒rRam-1受体与日本血吸虫细胞膜上起离子转运通道或受体蛋白作用的SjCHGC09605和SjCHGC05362两种跨膜蛋白成分存在较高同源性；用载有E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫细胞获得成功,推测SjCHGC09605和SjCHGC05362两种与rRam-1受体同源的蛋白可能是Sj感染过程中起作用的分子。该结果为下一步用双嗜性逆转录病毒载体转导永生化基因至Sj细胞提供了生物学理论与实验依据。[目的]建立含永生化基因（hTERT）的稳定产逆转录病毒细胞株,观察hTERT基因转导Sj童虫细胞后的整合和表达情况以及对细胞增殖作用的影响。[方法]将从美国引进的pBABE-puro-hTERT质粒经核酸内切酶酶切、PCR扩增和测序鉴定确认；倍比稀释测定PA317细胞和NIH3T3细胞对嘌呤霉素的最高耐受浓度；用脂质体将质粒转染至PA317细胞内,经嘌呤霉素筛选获得抗性克隆并扩大培养,并通过PCR、测序、免疫荧光、Western-blot及透射电镜对抗性细胞株进行鉴定,并以NIH3T3细胞测定收集的逆转录病毒液滴度。常规制备Sj-12d童虫细胞,并在体外培养中用BrudU-ELISA法检测细胞增殖情况,PCR法检测兔线粒体特异性基因确定无宿主来源细胞污染,倍比稀释法测定Sj细胞对嘌呤霉素的最高耐受浓度；用浓缩的双嗜性逆转录病毒感染Sj-12d童虫细胞并以嘌呤霉素连续筛选培养获得抗性Sj细胞克隆,扩大培养后用PCR、RT-PCR、Western-blot检测外源hTERT基因和puror基因在细胞内的整合与表达；用3H-TdR掺入法检测嘌呤霉素抗性Sj-12d细胞的增殖能力,利用细胞计数法绘制其生长曲线,并应用TRAP-ELISA法测定其端粒酶活性。[结果]pBABE-puro-hTERT质粒经酶切、PCR和测序鉴定为目的质粒；PA317细胞和NIH3T3细胞对嘌呤霉素的最高耐受浓度为6μg/ml和3μg/ml；嘌呤霉素抗性PA317克隆扩大培养物经PCR、测序、免疫荧光以及Western-blot检测到外源hTERT基因和puror基因的整合、转录及蛋白质表达；透射电镜检测到抗性PA317细胞的培养上清及胞浆内有逆转录病毒颗粒的存在,经浓缩后测得其滴度为2×105cfu/ml。Sj-12d童虫细胞培养3d后即可见部分细胞分裂相,10-14d后可见较多分裂相,BrdU-ELISA也显示培养14d后有明显的DNA合成与增殖,其对嘌呤霉素最高耐受浓度为0.5μg/ml;双嗜性逆转录病毒感染Sj-12d细胞后经嘌呤霉素连续筛选21d可见抗性克隆形成,对扩大培养后的抗性细胞做PCR、RT-PCR和Western blot,检测到外源hTERT基因和puror基因在抗性Sj-12d细胞内的整合、转录及蛋白表达,但整合的拷贝数少,转录水平低下；3H-TdR掺入法检测显示抗性Sj-12d细胞与常规培养的Sj-12d细胞均有一定增殖能力,但二者间差异无显着性（P>0.05）；TRAP-ELISA实验未能从抗性Sj-12d细胞内检测到端粒酶活性；在培养4周内的抗性Sj-12d细胞生长相对较快,此后生长逐渐减慢,死亡细胞和退变细胞的数目逐渐增多,最后全部死亡。[结论]用pBABE-puro-hTERT逆转录病毒质粒转染PA317细胞后,成功建立含hTERT基因稳定产双嗜性逆转录病毒颗粒的细胞株；该病毒感染Sj-12d童虫细胞后可检测到外源hTERT基因和puror基因的整合、转录及蛋白表达,但整合拷贝数少,转录水平低下,未能激活Sj-12d细胞的端粒酶活性和改善细胞的增殖能力。[目的]为提高逆转录病毒对血吸虫的感染能力,探讨应用pVSV-G质粒和pBABE-puro-hTERT质粒共转染包装细胞制备泛嗜性逆转录病毒的可行性,并观察该病毒感染Sj童虫后外源基因在虫体内的整合、转录、表达及具体的表达部位情况。[方法]将pVSV-G质粒和pBABE-puro-hTERT质粒共转染GP2-293包装细胞,转染后48h收集细胞培养上清,用浓缩的上清液与Polybrene混合液感染NIH3T3细胞系,经嘌呤霉素连续筛选12d后获得抗性克隆,计数抗性克隆数目并计算病毒滴度；挑取抗性NIH3T3克隆扩大培养,以PCR检测外源hTERT基因和puror基因在细胞内的整合,采用免疫细胞化学染色法检测hTERT基因在细胞内的表达情况；将泛嗜性逆转录病毒加入到体外培养的Sj-12d童虫,感染24h后更换培养基,将虫体连续培养6d；采用PCR和Southern杂交检测外源hTERT基因在虫体内的整合,同时应用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学染色检测外源hTERT基因在虫体内的转录、表达及定位情况。[结果]经计数后,泛嗜性逆转录病毒颗粒滴度为3.2×108,抗性NIH3T3细胞经PCR扩增出外源hTERT基因和puror基因特异性145bp和204bp目的条带,免疫细胞化学染色法检测到hTERT基因在细胞内发生了蛋白质表达,表达部位以细胞核内为主；泛嗜性逆转录病毒感染后的虫体经PCR和RT-PCR扩增出了外源hTERT基因和puror基因特异性145bp和204bp目的产物,其中,hTERT基因的转录水平较高,而puror基因的转录水平则较低,Southern杂交也显示出虫体内有外源hTERT基因的多个拷贝整合；Western blot实验显示病毒感染后的虫体内有外源hTERT基因的表达,其表达部位经免疫组织化学染色确定为在虫体的口吸盘、腹吸盘和后部体壁皮层下的表达量最多。[结论]用pVSV-G质粒和pBABE-puro-hTERT质粒共转染包装细胞后成功制备携带外源hTERT基因泛嗜性逆转录病毒,并证明该病毒感染Sj童虫活虫体后可在吸盘和后部体壁皮层下产生外源hTERT基因的多拷贝整合、转录与蛋白质表达。
尹光文[7]（2006）在《尖锐湿疣组织中survivin、bax、caspase-3和端粒酶逆转录酶的表达及其与细胞凋亡、临床预后关系研究》文中指出尖锐湿疣（condyloma acuminatum,CA）是由人类乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）感染引起的一种常见的性传播疾病（sexually transmitted disease,STD），发病率居性传播疾病第二位，并呈逐年升高的趋势。CAI临床表现多为生殖器部位菜花状或乳头状增生物，少数可在短期内因疣体过度增生而形成巨大型CA（Buschke-loewenstein肿瘤）。CA虽多为良性增生物，但少数具有恶性转化的潜能。该病传染性大，对社会和家庭危害极大，严重影响患者身心健康。临床上CA治疗困难，存在治疗后高复发率的难题，这对控制该病的传播及流行造成很大困难，因而已受到人们的重视。 近年来，在肿瘤研究领域中细胞凋亡和端粒酶一直是医学界研究的热点问题。越来越多的资料表明，肿瘤不仅是增殖、分化异常性疾病，同时也与细胞凋亡异常密切相关。细胞凋亡受多种基因控制，survivin是近年来新发现的最强凋亡抑制因子，并与细胞增殖和血管生成有关；bax是bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡基因；caspase-3是细胞凋亡下游的关键执行者之一，处于凋亡途径的核心环节。端粒酶的激活与肿瘤凋亡、增殖平衡失调密切相关，端粒酶活性越强，抗凋亡作用也越强。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）的表达水平与端粒酶活性和细胞凋亡有关。 CA具有生长快、且易复发等特点，可能与凋亡相关基因的表达及端粒酶活性异常有关。目前虽有少数CA组织中细胞凋亡及端粒酶活性的相关研究，但有关凋亡相关基因survivin、bax及caspase-3在CA组织中表达研究；CA组织中hTERT蛋白
韩烨[8]（2005）在《不同毒力的MDV引起的端粒酶活性变化及MDV特异序列在宿主细胞的定位研究》文中指出本研究首次定位了马立克氏病毒（MDV）整合在宿主细胞大、中染色体的端粒附近,从而提示马立克氏病（MD）的形成与宿主细胞端粒结构有着密切的关系。两种MDV 强毒株均引起MD 肿瘤病的发生,且鸡的端粒酶活性在没有临床症状和可视病变出现之前就被激活,并与病毒血症的动态呈显着正相关。马立克氏病淋巴瘤细胞系MDCC-MSB1 的高水平的酶活性,再次阐明端粒酶在禽类病毒性肿瘤疾病中的作用;同时对酶活性大小和催化亚基的表达强度做了相关分析。meq 基因是MDV 的主要致瘤基因,MDV 强毒株在潜伏感染阶段,可同时检测到meq 和L-meq 基因,而L-meq 的检出恰好是端粒酶水平较高的阶段。MD的发病进程、特别是MDV 的潜伏感染,在某种程度上与meq 基因的变化和端粒酶活性的动态具有一定关系;MDV 强毒株在CEF 上高次数传代,均未发生meq基因的改变。本文从宿主细胞和病毒本身入手,为阐明MD 的发病机理提供可靠的理论依据,这将有助于阐明人类肿瘤的发生机理,为预防和治疗肿瘤提供理论依据,必将产生较大的经济效益和社会效益。
郭莲[9]（2004）在《T-STAR对端粒酶活性影响的研究》文中研究指明目的：探讨肿瘤组织中T-STAR蛋白表达与hTERT蛋白表达和端粒酶活性表达的相关关系，以及正、反义T-STAR基因真核表达载体转染对不同体外培养的肿瘤细胞的生物学特性、T-STAR表达、hTERT蛋白和端粒酶活性的影响及其可能机制，为进一步深入研究端粒酶活性调控提供线索。 方法：1．收集肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌组织标本共46例，以及每一癌组织标本中相应正常组织共46例。分别用免疫组化染色法、western blot定量检测法、RT-PCR半定量检测法对所有组织中T-STAR的表达进行检测，同时用上述各种方法对癌组织中hTERT的表达进行检测，用PCR-ELISA法对癌组织的端粒酶活性进行检测，统计学分析T-STAR表达与hTERT表达和端粒酶活性的相关关系。2．应用分子生物学技术，构建反义T-STAR基因真核表达载体pneo-STAR；用脂质体介导转染法将正、反义T-STAR基因真核表达载体（pEGFP-c1／T-STAR和pneo-STAR），两种空质粒载体（pEGFP-cl，pcl-neo）分别转入体外培养的肺腺癌细胞株A549，胃癌细胞株SGC-7901，肝癌细胞HepG-2和结肠癌细胞株HCT-116细胞中，用G418筛选阳性转染细胞克隆后，对转染前后各株细胞的生物学特性、生长曲线进行观察，用免疫组化染色法、western blot定量检测法、RT-PCR半定量检测法以及PCR-ELISA法对各细胞株的T-STAR表达、hTERT表达、端粒酶活性进行定性、定量检测，统计学分析以上各检测指标的相关关系。 结果：1．T-STAR蛋白广泛表达于肺、胃、肝、结肠、直肠等组织中，但在这些部位的肿瘤组织中表达较之在正常组织中表达明显升高。 2．在T-STAR阳性表达的组织中，T-STAR主要表达于腺体细胞，既表达于胞浆，也表达于胞核，但以胞浆表达占多数。 3．成功构建了T-STAR反义基因真核表达载体pneo-STAR。 4．将正、反义T-STAR基因真核表达载体成功转染入肺腺癌细胞株A549，胃癌细胞株SGC7-901，肝癌细胞HepG-2和结肠癌细胞株HCT-116细胞等4种体外培养肿瘤细胞中，且有效表达，使正义基因转染细胞中T-STAR蛋白表达水平平均升高121.63％，使反义基因转染细胞中T-STAR蛋白表达水平平均降低78.06％。第三军医大学硕士学位论文 5.经G418筛选获得的阳性克隆中，稳定转染正义T一STAR基因真核表达载体的各株细胞均出现转化表型下降，如生长速度变慢，细胞克隆数减少，核浆比增加等表现，以及胞质突起增多;而稳定转染T一SrTAR反义基因真核表达载体的各株细胞均出现转化表型增加，如生长速度变快，细胞克隆数增加，核浆比减少等。 6.对肿瘤组织和体外培养细胞的研究表明:hTERT表达与端粒酶活性大多数情况下具有一致性。 7.T一STAR表达与hTERT表达和端粒酶活性变化呈同向变化趋势，T一STAR表达升高时hTERT表达和端粒酶活性增加，反之减少。 结论:1.T一51’AR广泛表达于肺、胃、肝、结肠及直肠等部位的正常组织和肿瘤组织的腺体细胞中，但在肿瘤组织中的表达较之在正常组织中表达明显升高。 2.成功构建了反义T一sTAR基因真核表达载体pneo一sTAR。将正、反义T一STAR基因真核表达载体成功转染入不同体外培养肿瘤细胞中，并有效表达，使T一STAR蛋白表达水平出现特异性升高或降低。 3.T一STAR参与了肿瘤细胞的胞内信号传导过程;T一STAR可使细胞转化表型下降，对细胞生长、克隆形成起抑制作用。 4.T一STAR对hTERT表达和端粒酶活性起正调控作用。T一STAR可能通过对hTERT蛋白的可逆性磷酸化调控和hTERT per一mRNA的选择性剪接两方面对端粒酶活性产生影响。
苗佩宏[10]（2004）在《hTERT蛋白表达及其模拟表位筛选》文中指出端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的DNA蛋白质结构，其长度的维持即正常的端粒功能依赖于端粒酶的激活，由于端粒酶的表达与肿瘤的密切相关使得端粒和端粒酶成为很有潜能的研究靶点。因此，有可能通过对端粒及端粒酶的结构和功能的探索寻找到理想的抗肿瘤以及衰老相关性疾病的有效治疗方法。 目前，组成人端粒酶复合物的3个主要成分已被鉴定，其中最重要的一种组分是人端粒酶催化亚基（hTERT），研究表明：hTERT是人端粒酶复合物的核心成分之一，其基因表达状态是细胞调控端粒酶活性的主要环节。hTERT在大部分恶性肿瘤细胞中表达，在正常组织中不表达，hTERT的表达与端粒酶活性密切相关，是端粒酶的催化亚基和酶活性的限速决定因子。hTERT属于逆转录酶家族的成员，包含7个保守的逆转录酶基序（RT motifs）和一个端粒酶特异的基序（T motif），它们是端粒酶发挥作用的必要条件。这些结果提示hTERT在细胞中的表达是决定端粒酶活性的主要因素，因此研究hTERT基因表达的调控机制并设计针对hTERT的小分子抑制剂是揭示端粒酶为开发靶点的一个关键步骤，可能对衰老、肿瘤发生等重大生物学问题的解决产生深远的影响。 噬菌体表面展示技术是一种对多肽功能非常有效的筛选技术，它将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因，所以说，噬菌体展示技术为筛选小分子活性物质提供了重要的技术支持。 本研究通过端粒酶逆转录功能区融合蛋白的表达，抗端粒酶催化亚基抗体的制备，并以此纯化抗体为靶分子筛选噬菌体线性十二肽库，从而获得模拟端粒酶逆转录功能区表位的短肽序列，为研究开发端粒酶逆转录酶的小分子抑制剂奠定基础，包括以下三个方面：一、用基因工程的方法表达出包含所有基序的端粒酶催化亚基: 自行设计引物，以pLPC一hTERT为模板扩增出长为1 3 1 obP的基因片段，此片段包括端粒酶发挥逆转录功能所需的全部8个基序。将PCR扩增的此片段克隆至带有6个连续组氨酸标签的原核表达载体pET一32a中，IPTG诱导表达后，用SDS一PAGE和W七stem一Blot检测确定表达出端粒酶逆转录功能区融合蛋白。以SM尿素溶解以包涵体形式存在的目的蛋白，然后用金属鳌合层析柱通过Ni与组氨酸的鳌合作用纯化融合蛋白并对之进行复性，获得具有生物活性的hTERT蛋白。二、制备鼠抗hTERT多克隆抗体: 用端粒酶逆转录功能区融合蛋白常规免疫昆明鼠制备鼠抗hTERT多克隆抗体，经SPG柱纯化后，Dot一ELISA鉴定此抗体与hTERT融合蛋白的结合，ELISA检测多克隆抗体的效价。结果表明制备的抗体能够特异地与hTERT蛋白结合，获得的鼠抗hTERT多抗血清效价达到l:64000，符合下一步作为靶分子筛选肤库的要求。三、模拟端粒酶逆转录功能区表位的筛选: 以纯化的鼠抗hTERT多抗和正常鼠IgG为靶，差减筛选噬菌体线性12肤库，获得模拟hTERT表位的短肤序列，所得阳性克隆通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验表明能够模拟hTERT的表位，搜索FASTA，BLAsT数据库，所获得的11个不同序列富含组氨酸（最高达41.6%）及亲水氨基酸（最高达91.67%），但它们没有共同的保守基序，且与己知序列无相似性，与hTERT序列亦无同源性，可能模拟的是hTERT的非线性表位，也为今后研制针对hTERT的小分抑制剂提供了实验依据。
二、hEST2逆转录功能区片段与端粒酶活性相关性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、hEST2逆转录功能区片段与端粒酶活性相关性（论文提纲范文）
（1）基于人胃黏膜端粒调控网络与衰老学说探讨固本通络汤治疗慢性萎缩性胃炎的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词索引 |
| 前言 |
| 附: 技术路线图 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 慢性萎缩性胃炎现代医学研究进展 |
| 1.1 GA、GIM、Dys |
| 1.2 病因学 |
| 1.3 临床表现 |
| 1.4 诊断 |
| 1.5 治疗 |
| 1.6 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 2. 慢性萎缩性胃炎的中医药研究进展 |
| 2.1 病名溯源 |
| 2.2 病因病机 |
| 2.3 中医药治疗 |
| 2.4 实验研究 |
| 2.5 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 3. 端粒调控网络与衰老及慢性萎缩性胃炎相关研究现状 |
| 3.1 端粒概述 |
| 3.2 端粒调控网络与衰老 |
| 3.3 端粒与慢性萎缩性胃炎相关研究 |
| 3.4 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 4. 周斌教授从“胃天年”论治慢性萎缩性胃炎经验述要 |
| 4.1 “胃天年”理论的创立及学术思想溯源 |
| 4.2 周斌教授基于“胃天年”理论治疗慢性萎缩性胃炎经验述要 |
| 4.3 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究 |
| 1. 临床资料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 固本通络汤治疗CAG的机制探讨 |
| 1. 临床资料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1. 全文结论 |
| 2. 创新点 |
| 3. 局限性与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录 |
（2）hTERT pre-mRNA选择性剪接在调控胶质瘤端粒酶活性中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、胶质瘤端粒酶活性与hTERT剪接变异体表达的相关性研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 材料 |
| 1.1.3 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 胶质瘤组织HE染色的病理特点 |
| 1.2.2 胶质瘤细胞系hTERT ASVs表达及端粒酶活性检测结果 |
| 1.2.3 胶质瘤细胞系hTERT ASVs表达与端粒酶活性的相关性 |
| 1.2.4 胶质瘤组织中hTERT ASVs表达与端粒酶活性的相关性 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 端粒及端粒酶的结构和功能 |
| 1.3.2 hTERT及hTERT pre-mRNA的选择性剪接 |
| 1.3.3 hTERT ASVs表达与端粒酶活性的关系 |
| 1.4 小结 |
| 二、反义寡核苷酸的设计合成及对hTERT剪接和端粒酶活性的调控作用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 材料 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 ESEFinder3.0预测hTERT pre-mRNA外显子剪接增强子 |
| 2.2.2 反义寡核苷酸转染U251胶质瘤细胞转染效率的评估 |
| 2.2.3 不同寡核苷酸对U251胶质瘤细胞生长的影响 |
| 2.2.4 反义寡核苷酸转染U251细胞对hTERT剪接变异体的影响 |
| 2.2.5 反义寡核苷酸转染U251细胞对端粒酶活性的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 ESEFinder预测外显子剪接增强子 |
| 2.3.2 反义寡核苷酸介导的外显子跳跃 |
| 2.3.3 反义寡核苷酸影响hTERT pre-mRNA选择性剪接调控端粒酶活性 |
| 2.4 小结 |
| 三、反义寡核苷酸对胶质瘤细胞增殖凋亡侵袭及其干细胞的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要实验试剂和材料 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 端粒酶活性检测结果 |
| 3.2.2 端粒长度检测结果 |
| 3.2.3 MTT法细胞增殖能力检测结果 |
| 3.2.4 平板克隆形成实验检测结果 |
| 3.2.5 流式细胞仪分析细胞周期结果 |
| 3.2.6 单细胞凝胶电泳检测结果 |
| 3.2.7 DNA ladder检测结果 |
| 3.2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 |
| 3.2.9 细胞体外粘附实验结果 |
| 3.2.10 细胞体外基质降解实验结果 |
| 3.2.11 细胞体外侵袭实验结果(Transwell实验) |
| 3.2.12 Western blot检测蛋白表达的结果 |
| 3.2.13 反义寡核苷酸对胶质瘤干细胞的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 反义寡核苷酸对胶质瘤细胞增殖的调控 |
| 3.3.2 反义寡核苷酸对胶质瘤细胞凋亡的调控 |
| 3.3.3 反义寡核苷酸对胶质瘤细胞侵袭迁移的调控 |
| 3.3.4 反义寡核苷酸对胶质瘤干细胞的影响 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 端粒与端粒酶及其在干细胞中的作用研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（3）TNKS1基因在人脑星形细胞瘤中的表达、作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语全称（英文全称中文全称） |
| 前言 |
| 第一章 TNKS1在人脑星形细胞瘤中的表达及临床意义 |
| 引言 |
| 第一节 免疫组化SP法检测TNKS1蛋白在人脑星形细胞瘤中的表达 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 RT-PCR法和Western Blot法检测人脑星形细胞瘤中TNKS1基因的转录与翻译表达 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 siRNA特异性沉默U251细胞中TNSK1基因的表达 |
| 引言 |
| 第一节 U251细胞的培养与TNKS1基因siRNA的设计、合成及有效靶点筛选 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 Western Blot法检测转染后TNKS1蛋白表达水平的改变 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 siRNA沉默TNKS1基因对U251细胞生物学 #56行为的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四章 TNKS1在人脑星形细胞瘤中的相关作用 #75机制的初步研究 |
| 引言 |
| 第一节 siRNA干扰下调TNKS1表达导致U251细胞生物学特性改变与HTERT和TRF1关系的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 星形细胞瘤中TNKS1与β-Catenin表达的 #80相关性研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 博士期间发表论文 |
（4）端粒酶逆转录酶C端重组质粒构建与表达及对细胞增殖和活力的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 端粒酶逆转录酶hTERT C197原核重组质粒构建与表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 小结 |
| 第二部分 端粒酶逆转录酶hTERT C197真核重组质粒构建与表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 小结 |
| 第三部分 hTERT C197对Hela和293T细胞的细胞增殖及细胞活力的影响 |
| 1 材料 |
| 2. 方法 |
| 3 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 一.端粒酶逆转录酶hTERT C197原核重组质粒构建与表达 |
| 二.端粒酶逆转录酶hTERT C197真核重组质粒构建与表达 |
| 三.hTERT C197对Hela和293T细胞的细胞增殖及细胞活力的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学合格证明 |
（5）hTERT调控相关miRNA的鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写对照 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 hTERT 调控相关的miRNA 的预测与筛选 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第一部分照片 |
| 第二部分 hTERT 调控相关的miRNA 的鉴定 |
| 第一章 表达调控实验 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第二章 双荧光素酶实验 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分照片 |
| 第三部分 hTERT 调控相关的miRNA 对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分照片 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 端粒酶活性调控研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文、申请的基金及专利 |
（6）载有hTERT基因逆转录病毒感染日本血吸虫童虫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 基金资助 |
| 缩写词表 |
| 前言 |
| 第一章 双嗜性逆转录病毒病毒感染日本血吸虫细胞的生物学理论和可行性探讨 |
| 引言 |
| 第一节 双嗜性逆转录病毒受体的生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 双嗜性逆转录病毒感染日本血吸虫细胞的可行性探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 稳定产双嗜性逆转录病毒细胞株的建立与转导的hTERT基因在sj童虫培养细胞内的表达 |
| 引言 |
| 第一节 逆转录病毒质粒的鉴定与稳定产逆转录病毒细胞株的建立 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本节结论 |
| 第二节 双嗜性逆转录病毒转导hTERT基因后在Sj童虫培养细胞内的表达及对细胞增殖作用的初步观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 泛嗜性逆转录病毒感染Sj童虫后外源基因在虫体内的整合、转录与表达 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果目录 |
（7）尖锐湿疣组织中survivin、bax、caspase-3和端粒酶逆转录酶的表达及其与细胞凋亡、临床预后关系研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一部分 尖锐湿疣组织中凋亡相关基因survivin、bax和caspase-3蛋白及mRNA的表达研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 尖锐湿疣组织中端粒酶逆转录酶蛋白和mRNA的表达及其与survivin、bax、caspase-3和细胞凋亡关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 尖锐湿疣组织中survivin、bax、caspase-3和端粒酶逆转录酶蛋白及mRNA表达与临床预后关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读博士期间发表论文情况 |
| 英文缩写词索引 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）不同毒力的MDV引起的端粒酶活性变化及MDV特异序列在宿主细胞的定位研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡马立克氏病的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 发病机理 |
| 3 MDV 基因组及其主要致瘤基因的分子生物学研究概况 |
| 第二章 端粒和端粒酶的研究进展 |
| 1 端粒的结构与生物学特性 |
| 2 端粒酶的组成及其活性调节机制 |
| 3 端粒、端粒酶与肿瘤 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 MDV-meq 基因序列在MD 宿主细胞染色体上的整合 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡染色体标本的制备 |
| 2.2 MDV-1 致瘤基因meq 基因的部分特异片段的扩增 |
| 2.3 以 MDV-meq 基因的部分核苷酸序列为探针的原位杂交 |
| 3 讨论 |
| 3.1 MDV 基因组特征及特异性探针的选择 |
| 3.2 原位杂交技术在实验室诊断MD 中的意义 |
| 3.3 提高荧光原位杂交技术的操作 |
| 3.4 MDV-meq 特异序列定位MD 宿主细胞染色体的意义 |
| 4 小结 |
| 第二章 感染不同毒力的MDV 后鸡的端粒酶活性及其病毒血症的动态研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 MDV 不同毒株的体外增殖特征的判定 |
| 2.2 MDV 不同毒株的致病性的差异 |
| 2.3 接种 MDV1 京-1 株、GA 株和 CV1988 的鸡脾脏端粒酶活性的检测 |
| 2.4 鸡感染不同毒株 MDV 后的病毒血症动态 |
| 3 讨论 |
| 3.1 MDV 强毒株的致病性 |
| 3.2 端粒酶活性测定方法的可靠性 |
| 3.3 病毒血症的消长 |
| 3.4 MD 的发生发展与端粒酶活性及病毒血症变化的关系 |
| 4 小结 |
| 第三章 马立克肿瘤细胞系与其它细胞(系)端粒酶活性的比较及TERT 基因的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同样本的端粒酶活性 |
| 2.2 TERT 基因的表达检测 |
| 2.3 端粒酶活性和端粒酶催化亚基表达的相关性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 端粒-端粒酶”假说 |
| 3.2 利用 TRAP 反应研究端粒酶酶学性质的意义 |
| 3.3 TERT 基因的意义 |
| 3.4 总 RNA 提取与 RT 反应 |
| 3.5 正常和肿瘤细胞的端粒酶的调控 |
| 4 小结 |
| 第四章 鸡接种 MDV 强毒株后meq 基因的动态监测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 感染MDV 强毒株的鸡中meq 基因的检测 |
| 2.2 MDV 强毒株的体外高次数传代 |
| 2.3 感染京-1 株和 GA 株后鸡的端粒酶活性的检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）T-STAR对端粒酶活性影响的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 T-STAR与端粒酶活性相关性研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 T-STAR与端粒酶活性相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 照片 |
| 第二部分 T-STAR反义真核表达载体的构建和鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 T-STAR对肿瘤细胞端粒酶活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 照片 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述一 hTERT的调控与端粒酶活性 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 T-STAR研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读研究学位期间撰写的论文及学术会议交流情况 |
（10）hTERT蛋白表达及其模拟表位筛选（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人端粒酶逆转录功能区基因的表达和纯化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 人端粒酶逆转录功能区蛋白抗体的制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 hTERT多表位模拟肽的筛选与鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述: 端粒、端粒酶和肿瘤的研究进展 |
| 致谢 |
| 附录: 学习期间完成论文情况 |
| 附图1: pET32a-hTERT的DNA序列 |
| 附图2: No.13噬菌体克隆的DNA序列 |
四、hEST2逆转录功能区片段与端粒酶活性相关性（论文参考文献）
- [1]基于人胃黏膜端粒调控网络与衰老学说探讨固本通络汤治疗慢性萎缩性胃炎的机制[D]. 赵兵. 中国中医科学院, 2020(01)
- [2]hTERT pre-mRNA选择性剪接在调控胶质瘤端粒酶活性中作用的研究[D]. 王菲. 天津医科大学, 2012(08)
- [3]TNKS1基因在人脑星形细胞瘤中的表达、作用及机制研究[D]. 唐斌. 中南大学, 2012(12)
- [4]端粒酶逆转录酶C端重组质粒构建与表达及对细胞增殖和活力的影响[D]. 卢钧雄. 南方医科大学, 2012(05)
- [5]hTERT调控相关miRNA的鉴定及功能研究[D]. 陈陵. 第三军医大学, 2011(12)
- [6]载有hTERT基因逆转录病毒感染日本血吸虫童虫的研究[D]. 杨胜辉. 中南大学, 2010(11)
- [7]尖锐湿疣组织中survivin、bax、caspase-3和端粒酶逆转录酶的表达及其与细胞凋亡、临床预后关系研究[D]. 尹光文. 郑州大学, 2006(11)
- [8]不同毒力的MDV引起的端粒酶活性变化及MDV特异序列在宿主细胞的定位研究[D]. 韩烨. 吉林大学, 2005(06)
- [9]T-STAR对端粒酶活性影响的研究[D]. 郭莲. 第三军医大学, 2004(01)
- [10]hTERT蛋白表达及其模拟表位筛选[D]. 苗佩宏. 第一军医大学, 2004(04)